Procedimiento que se utiliza para identificar plásmidos recombinantes

DETECCIÓN DE COLONIAS mediante complementación alfa. El sustrato cromogénico X-gal se mezcla con
BACTERIANAS CON X-GAL
LISISE el cultivo bacteriano, se combina con agar superior fundido y luego se esparce
IPTG: COMPLEMENTACIÓN
ALCALINA en placas de selección. Con recursos limitados, el volumen requerido de X-gal
con SDS puede ser esparcido sobre una placa de agar (protocolo alterno).
ALFA
9.-Seleccionar y cultivar colonias que porten
plásmidos recombinantes.
1.-Disperse alícuotas (de 3 ml para placas de 90
mm y de 7 ml para placas de 150 ml) de agar
superior fundido en tubos de 17 x 100 mm.
8.-Identificar las colonias que portan
1.5.-Coloque los tubos en un bloque plásmidos recombinantes.
calefactor a 45°C hasta que sean necesarios.

7.-Saque las placas de la incubadora y

2.-Retire el primer tubo y agregue 0.1 ml de
suspensión bacteriana con <3000 bacterias
viables para una placa de 90 mm y <10,000 para
una de 150 mm.
2.5.-Cierre la parte superior del tubo e
inviértalo varias veces para dispersar las
bacterias a través del agar fundido.
guárdelas durante varias horas a 4°C, para
permitir que se desarrolle el color azul.
6.-Endurecer agar sofi a temperatura ambiente.
Limpiar la tapa de las placas e incubar las placas
invertidas (12-16 horas a 37°C).

5.-Repetir los pasos 2 a 4 hasta que todas las

3.-Abra el tubo y agregue cantidades apropiadas de muestras se hayan plaqueado.
X-gal e IPTG (si es necesario).

3.5.-Cierre el tubo e inviértalo suavemente

4.- Verter rápido el agar superior fundido en el
varias veces para mezclar el contenido.
centro de una placa de agar endurecido con el
antibiótico apropiado y distribuir girando.
PROTOCOLO ALTERNATIVO: Preparación alternativa de agar esparciendo una solución
LISIS concentrada de X-gal en la superficie de una placa de agar
APLICACIÓN DIRECTA DE X-
ALCALINA
GAL E IPTG A PLACAScon
AGAR prefabricada, en lugar de incorporar el galactósido
SDS
halogenado en todo el volumen del medio de agar. Tener cuidado al esparcir la
solución X-gal. Las colonias en
el centro de la placa pueden
ser de un azul más profundo
1.-Pipetear 40 µl de X-gal al 2% y, si es necesario, 7
debido a variaciones en la
µl de IPTG al 20% en el centro de una placa de agar concentración de X-gal a través
de 90 mm prefabricada (LB o YT) con el antibiótico. de la placa.

1.5.-Para una placa de agar de 15 cm de

diámetro, transfiera 100 µl de X-gal y, si es
necesario, 20 µl de IPTG al centro de la placa.

6.-Identificar las colonias que portan plásmidos

recombinantes.
2.-Con un esparcidor estéril (o pipeta Pasteur
doblada con punta sellada en una llama) extender las
soluciones por toda la superficie de la placa e
incubar a 37°C hasta que se absorba todo el líquido.

2.5.-Debido a la baja volatilidad de la 5.-Saque la placa de la incubadora y guárdela a

dimetilformamida, este proceso puede tardar 4°C durante varias horas, durante las cuales el
hasta 3-4 horas si la placa está recién hecha. color azul se desarrolla en toda su extensión.

3.-Inocular placa con las bacterias a analizar;

sembrando con un asa bacteriana, colocando clones 4.- Una vez absorbido el inóculo, incubar la placa
con palillos de dientes o esparciendo hasta 100 µl de en posición invertida durante 12-19 horas a 37°C.
una suspensión bacteriana (50.000 celis/ml) sobre un
plato de agar de 90 mm o 200 µl en plato de 15 cm.
Reseña de Método
Detección de colonias bacterianas con X-gal e IPTG: complementación alfa

Este protocolo presenta métodos para identificar plásmidos recombinantes mediante

complementación alfa. El sustrato cromogénico X-gal se mezcla con el cultivo bacteriano, se
combina con agar superior fundido y luego se esparce en placas de selección. Si los recursos son
limitados, el volumen requerido de X-gal puede ser Esparcir sobre una placa de agar (protocolo
alterno con aplicación directa de X-gal e IPTG a las placas de agar).
IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido) es un análogo no fermentable de lactosa que inactiva el
represor lacZ y, por tanto, induce la transcripción del operón lac. La mayoría de las cepas de
bacteria comúnmente utilizadas (complementación alfa), sin embargo, no sintetiza cantidades
significativas de represor lac. En consecuencia, normalmente no hay necesidad de inducir la
síntesis de los fragmentos de β-galactosidasa codificados por el huésped y el plásmido para el
análisis histoquímico de colonias bacterianas. Si la cepa bacteriana lleva el alelo del represor lac
y/o si el plásmido lleva un gen lacl, debería usarse IPTG para inducir la síntesis de ambos
fragmentos de la enzima.
La eficiencia de transformación es ligeramente mayor cuando las bacterias se colocan en placas
de agar superior en lugar de en la superficie de las placas de agar. Quizás las bacterias
transformadas prefieren el estado ligeramente anaeróbico con el agar blando o la isosmolaridad
proporcionada por el medio de agar.
NOMBRE: PANTOJA GAMEZ KENIA IVETH
NÚMERO DE CUENTA: 15219828
GRADO-GRUPO:3-1
MATERIA: INGENIERIA GENETICA
FECHA: 20/12/2020
 BIBLIOGRAFÍA:

Sambrook J. & Green M. R., (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Vol. 1).
Cold Spring Harbor Laboratory Press. Protocol 27: Screening Bacterial Colonies Using X-
gal and IPTG: alfa-Complementation