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Microbiología (2005),151,3153–3159 DOI10.1099/mic.0.27924-0

Revisar Cultura continua: ¿regresando?

Pablo A. Hoskisson1y Glyn Hobbs2
Correspondencia 1Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de Aberdeen, Instituto de Ciencias
Glyn Hobbs Médicas, Foresterhill, Aberdeen AB25 2ZD, Reino Unido

g.hobbs@livjm.ac.uk 2Facultad de Ciencias Biomoleculares, Universidad John Moores de Liverpool, Byrom Street, Liverpool L3 3AF, Reino
Unido

El apogeo del cultivo continuo fue en la década de 1960, cuando su versatilidad y

reproducibilidad se utilizaron para abordar problemas fundamentales en diversos
campos microbiológicos como la bioquímica, la ecología, la genética y la fisiología. El
advenimiento de la genética molecular en las décadas de 1970 y 1980 condujo a una
disminución de la popularidad del cultivo continuo como herramienta estándar de
laboratorio. La tendencia actual de estudiar proteómica, transcriptómica y metabolómica
global requiere conjuntos de datos reproducibles, fiables y biológicamente homogéneos
con los que abordar un problema determinado. El uso de técnicas de cultivo continuo
puede ayudar a la adquisición de dichos datos, y los cultivos continuos ofrecen ventajas
sobre los cultivos por lotes biológicamente heterogéneos, donde el crecimiento
secundario y los efectos del estrés a menudo pueden enmascarar diferencias y
tendencias fisiológicas sutiles.

Introducción Conceptos básicos del cultivo de quimiostatos

La cinética del crecimiento microbiano es fundamental para todos los campos de la microbiología, ya sea
El trabajo de Monod (1942) sustenta la teoría de los
fisiología, genética, ecología o biotecnología. El desarrollo simultáneo del quimiostato por Monod (1950) y Novick
quimiostatos, mostrando la importancia de la relación entre la
& Szilard (1950) permitió a los fisiólogos microbianos diseccionar el crecimiento bacteriano independientemente
tasa de crecimiento específica (metro)de una población
del entorno fisicoquímico. El apogeo del quimiostato fue la década de 1960, durante la cual una multitud de
microbiana y la concentración de sustrato (s).Las conocidas
estudios investigaron la fisiología de varias especies bajo una amplia variedad de condiciones ambientales y de
fases de retraso, exponencial y estacionaria del crecimiento
crecimiento. Ahora hemos entrado en la era posgenómica, en la que tenemos conocimiento de los genomas
microbiano diseccionado por los trabajos seminales de Monod
(1942, 1949) se denominan ciclo de crecimiento. Sin embargo,
microbianos y la tecnología de vanguardia está disponible para estudiar los perfiles globales de proteínas, ARNm
esta progresión de eventos no es una propiedad inherente del
y metabolitos. Estas tecnologías denominadas "ómicas" brindan la posibilidad de caracterizar la fisiología celular
organismo sino el resultado de su interacción con el ambiente
a nivel molecular, proporcionando información temporal, información espacial e incluso en tiempo real. Una de
físico-químico en el que está creciendo (Tempest, 1969). El uso
las limitaciones de este enfoque se relaciona con el cultivo del organismo en cuestión. Para recopilar información
de sistemas de cultivo continuo para desacoplar el crecimiento
reproducible y significativa, la población celular debe crecer en un conjunto de condiciones fisicoquímicas
de las condiciones transitorias que se encuentran en el cultivo
definidas, idealmente constantes y controlables. La realización de tales experimentos en sistemas simples de
por lotes ofrece ventajas ilimitadas tanto para el investigador
'cultivo por lotes' da como resultado condiciones físico-químicas dinámicas, que producen patrones de datos
académico como para el industrial. El sistema y el término
complejos que a menudo son difíciles o imposibles de interpretar. El sistema experimental ideal para este tipo de
quimiostato fueron inventados por Novick & Szilard (1950),
estudios es, por lo tanto, el quimiostato, un sistema de cultivo continuo que proporciona un entorno ambiental
aunque de forma simultánea e independiente el 'bactogène',
constante. Para recopilar información reproducible y significativa, la población celular debe crecer en un
un dispositivo prácticamente idéntico, fue desarrollado por
conjunto de condiciones fisicoquímicas definidas, idealmente constantes y controlables. La realización de tales
Monod (1950). La base de ambos es que la tasa de crecimiento
experimentos en sistemas simples de 'cultivo por lotes' da como resultado condiciones físico-químicas
específica de un organismo, relativa a su máximo teórico,
dinámicas, que producen patrones de datos complejos que a menudo son difíciles o imposibles de interpretar. El

sistema experimental ideal para este tipo de estudios es, por lo tanto, el quimiostato, un sistema de cultivo

continuo que proporciona un entorno ambiental constante. Para recopilar información reproducible y
significativa, la población celular debe crecer en un conjunto de condiciones fisicoquímicas definidas, idealmente
constantes y controlables. La realización de tales experimentos en sistemas simples de 'cultivo por lotes' da
como resultado condiciones físico-químicas dinámicas, que producen patrones de datos complejos que a
menudo son difíciles o imposibles de interpretar. El sistema experimental ideal para este tipo de estudios es, por
lo tanto, el quimiostato, un sistema de cultivo continuo que proporciona un entorno ambiental constante.
Todos los sistemas de cultivo continuo comienzan su vida como un cultivo por
lotes, donde el crecimiento procede a través del ciclo de crecimiento familiar.
La adición de medio fresco repleto de nutrientes a dicho cultivo durante el
crecimiento exponencial a una velocidad adecuada permitiría que el
crecimiento prosiguiera indefinidamente a una velocidad dada. Como
consecuencia de esto, el volumen de cultivo y la biomasa aumentarían
exponencialmente sin la eliminación del cultivo en el

0002-7924GRAMO2005 SGMImpreso en Gran Bretaña 3153

PA Hoskisson y G. Hobbs

tasa de entrada de medio fresco, como ocurre en el cultivo

continuo. La ventaja de este sistema es que la población microbiana (a)
dentro del recipiente crece a un ritmo constante en un entorno
constante y asume un "estado estable". El investigador puede variar
y controlar los factores ambientales como el pH, la concentración
de nutrientes (incluidos el oxígeno y la luz) y los productos
metabólicos. En configuraciones experimentales, el recipiente en el
que crece el cultivo se mezcla bien para garantizar que el cultivo en
su conjunto sea homogéneo y que las diversas adiciones al
recipiente no produzcan gradientes químicos. La mezcla es, en la
mayoría de los casos, facilitada por impulsores accionados
mecánicamente que proporcionan tiempos de mezcla de menos de
5 s. Tales configuraciones proporcionan cultivos en estados
estacionarios homogéneos y esta es la forma más común de cultivo
continuo.

El sistema de cultivo continuo se desarrolló a partir del trabajo

anterior de Monod. En este sistema, la entrada de medio estéril
desde un reservorio se equilibra con la salida de medio gastado,
(b)
células vivas y desechos celulares, lo que permite que el
crecimiento se produzca en equilibrio, con el crecimiento de nuevas
células equilibrado por el lavado (Fig. 1 ). Por lo tanto, el crecimiento
de nueva biomasa es igual a la velocidad a la que se diluye el
cultivo. La tasa de flujo del medio en el recipiente está relacionada
con su volumen y se define por la tasa de dilución,D:

D~F=V
dóndeFes el caudal yVes el volumen de cultivo.

El cambio en la biomasa (X)a lo largo del tiempo durante el crecimiento en estado

estacionario se puede expresar como

dx=dt ~kx{Dx

En estado estacionario la concentración de biomasa es constante:

dx=dt ~0, por lo tantokx{Dx~0 ok~D

Por lo tanto, en estado estacionario, la tasa de crecimiento puede

manipularse en función de la tasa de dilución, siempre que la tasa
de crecimiento esté por debajo de la tasa de dilución crítica (DC), la
velocidad a la que la concentración de biomasa en estado
estacionario es cero. Eso es,DCes superior a la tasa de crecimiento
específica máxima (metromáximo) del organismo en las condiciones
Figura 1. (a) Representación esquemática de un quimiostato simple. Las
dadas, y el cultivo se elimina del recipiente.
flechas indican la dirección del flujo del medio. La bomba regula el
En el trabajo anterior de Monod (Monod, 1942) se demostró la caudal medio (f)en relación con el volumen de trabajo (V )del recipiente
relación simple entre el crecimiento y la utilización del sustrato. para determinar la tasa de dilución (D)y por lo tanto la tasa de
Como el crecimiento de microorganismos en cultivo continuo está crecimiento específico de la cultura (metro).Srrepresenta la

gobernado porD,el factor limitante es la tasa de suministro de un
nutriente limitante del crecimiento. Para relacionar la biomasa de
un cultivo en estado estacionario con la concentración de sustrato
limitante residual y la tasa de dilución, Monod (1942) utilizó la
siguiente ecuación:
k~kmáximoS=(KszS)
dóndeSes la concentración de sustrato residual ykses la constante de
saturación de tasa media, es decir, igual aScuando el crecimiento
concentración del nutriente limitante en el depósito de alimentación,X es
la concentración de biomasa en el fermentador ysrepresenta la
concentración del nutriente limitante residual en el fermentador. (b)
Fotografía de un quimiostato operando en estado estacionario. El
fermentador tiene un volumen de trabajo de 1,5 l mantenido a este nivel
con un vertedero sumergido (no visible en la imagen). El fermentador se
alimenta desde un depósito de vidrio de 20 l a través de una bomba
peristáltica. En este caso, las variables temperatura y pH se controlan y
el estado estacionario del cultivo se monitorea a través de un analizador
de gases de escape.

3154 Microbiología151

tasa es 0?5metromáximo. Por lo tanto, cuando se aplica a la cultura
continua,
D ~ DCS=(KszS)
El modelo de Monod del comportamiento del quimiostato no es
ideal y es el resultado de la observación empírica de la relación
entre la tasa de crecimiento y la concentración de sustrato. Como
consecuencia, ha habido muchas modificaciones al modelo, por
ejemplo por Droop (1968, 1973, 1974), Fredricksonet al. (1970) y
Goldman y McCarthy (1978). Sin embargo, el modelo de Monod
sigue siendo el que se utiliza con mayor frecuencia y facilidad y, a
menudo, es suficiente para la mayoría de los estudios cinéticos.
El quimiostato y los retos actuales
Las raíces históricas del uso de quimiostatos han estado dentro de
los campos de la fisiología microbiana básica, bioquímica y ecología
microbiana, donde la simplificación de las condiciones de
crecimiento, permitiendo la manipulación de una sola variable, ha
permitido grandes avances en nuestra comprensión de los
procesos microbianos elementales (ver Monod , 1949; Herbert et
al.,1956; Pirt, 1966, 1975; Dykhuizen & Hartl, 1983, y referencias
allí). La explosión de la investigación en biología molecular en los
últimos 30 años resultó en una disminución en el uso del
quimiostato como herramienta fundamental en microbiología. Sin
embargo, recientemente, la tendencia hacia evaluaciones globales
(posgenómicas) de los procesos microbianos ha llevado al
resurgimiento del uso de cultivos quimiostáticos para estudiar el
crecimiento, la limitación de nutrientes y las respuestas al estrés a
nivel de todo el organismo. El valor del quimiostato en los estudios
de tales procesos radica en la eliminación de los efectos de
crecimiento secundarios que pueden enmascarar cambios
fisiológicos sutiles, revelando tendencias reales biológicamente
relevantes y brindando confianza en los datos obtenidos. A veces se
cuestiona la relevancia biológica del cultivo de quimiostatos; sin
embargo, muchos sistemas microbianos naturales, como la boca y
el intestino,
El quimiostato se ha empleado en muchas situaciones
industriales y académicas, y éstas se han abordado en varias
revisiones que abarcan la selección (Dykhuizen & Hartl, 1983),
la evolución (Hartl & Dykhuizen, 1979; Dykhuizen & Hartl, 1981)
y la producción de proteínas unicelulares. (Solomons, 1983;
Trinci, 1991, 1994), y en volúmenes de simposios (Deanet al.,
1976; Malek & Fencl, 1966). Con los avances más recientes en la
tecnología experimental, hay un resurgimiento en el uso del
quimiostato como base del diseño experimental debido a las
ventajas que ofrece en el control ambiental, la reproducibilidad
y el modelado, proporcionando una poderosa herramienta
para el microbiólogo.
Análisis de flujo y el quimiostato
El desarrollo de técnicas de biología molecular y su
aplicación a la manipulación de rutas metabólicas ha
revolucionado la mejora de las propiedades y productividad
de los microorganismos utilizados en procesos industriales.
La determinación de los flujos metabólicosen vivoy
http://mic.sgmjournals.org
Cultura continua: ¿regresando?
los análisis de flujo metabólico subsiguientes se realizan mejor en
condiciones de estado estacionario. La eliminación de los efectos de
crecimiento transitorios permite una estimación más realista de los
efectos de las eliminaciones o mejoras de las vías metabólicas. El
uso de medidas de metabolitos, aunado a la estequiometría de
reacciones, ha sido aplicado principalmente en la validación de
redes metabólicas. Sin embargo, tales enfoques no pueden
diferenciar entre controles metabólicos, y el control de flujo de
punto de ramificación clave no puede estudiarse en detalle
(Stephanopoulos, 1999). La naturaleza dinámica de estas redes
requiere la aplicación de un cultivo continuo, en el que se puede
perturbar el crecimiento en estado estacionario y evaluar la
influencia de un solo componente del medio mientras todos los
demás factores permanecen constantes.
Varios grupos han aplicado el análisis de flujo a la producción de
antibióticos enStreptomycesespecies, intentando correlacionar el flujo a
través de vías específicas con la producción de antibióticos, y predecir
estrategias racionales para la manipulación de vías para aumentar la
producción. Aviñón-Rossaet al. (2002) empleó el cultivo de quimiostatos
bajo limitación de fosfato para examinar el flujo de carbono a diferentes
tasas de crecimiento en relación con la producción de antibióticos. El
aumento de las tasas de crecimiento dio como resultado un aumento en
el flujo de la vía glucolítica y de las pentosas fosfato, lo que se
correlacionó inversamente con la producción de los antibióticos
actinorrodina y undecilprodigiosina. Curiosamente, estudios adicionales
sobre la producción de antibióticos han sugerido que la limitación de
carbono reduce la capacidad de reacciones anapleróticas, minimizando
la biosíntesis extensa derivada del ciclo TCA (Kirket al.,2000). Esto indica
que al emplear el análisis de flujo metabólico de cultivos cultivados con
quimiostatos, se pueden identificar cuellos de botella metabólicos
indirectos dentro de un sistema que impactan en la formación del
producto.
Investigación de la producción de etanol enSaccharomyces cerevisiae
durante el cultivo en quimiostato aeróbico reveló la influencia de la
fuente de nitrógeno en la capacidad de producir etanol (Aon & Cortassa,
2001). El suministro de aminoácidos, en lugar de amoníaco, como fuente
de nitrógeno resultó en la producción de etanol a tasas de crecimiento
más bajas. Curiosamente, el análisis de flujo metabólico reveló que gran
parte del carbono de la biomasa se sintetizó a partir de rutas
gluconeogénicas, a partir del catabolismo de aminoácidos, mientras que
la glucosa se fermentó casi por completo a etanol. Se determinó una
tasa específica de absorción de glucosa para varias fuentes de nitrógeno
y se encontró que era independiente de la limitación nutricional. Los
autores sugirieron que los flujos anabólicos relacionados con el
nitrógeno determinan cuándo se alcanza la tasa de consumo de glucosa
umbral, después de lo cual se desencadena la producción de etanol.
Los investigadores ahora están aprovechando los sistemas de
cultivo continuo, en combinación con las técnicas de análisis de
flujo metabólico, para el análisis de vías durante el crecimiento en
estado estacionario, lo que debería generar nuevos conocimientos
sobre la fisiología de los organismos industriales, además de
conducir a un mayor potencial de productividad. Combinando este
tipo de análisis con en silicoEl análisis de promotores puede ayudar
en la predicción de genes y reguladores sensibles a metabolitos
(Daran-Lapujadeet al.,2004).
3155
PA Hoskisson y G. Hobbs
Aplicación del quimiostato a la era
funcionalgenómica
La genómica funcional tiene como objetivo identificar los
roles que juegan los genes en la biología de los organismos
con genomas secuenciados. El campo abarca diversas
técnicas que permiten el estudio biológico en múltiples
niveles. El transcriptoma, el análisis de moléculas de ARNm
con el uso de micromatrices de genoma completo, no es
una medida directa de la funcionalidad, sino una medida
del potencial de traducción. El proteoma es una
"instantánea" de la proteína celular total, que en la
actualidad utiliza principalmente electroforesis en gel
bidimensional y el posterior análisis de manchas de gel
mediante técnicas de espectrometría de masas. El análisis
global de proteínas (proteómica) es una verdadera medida
de la funcionalidad celular. El metaboloma, cuyo objetivo es
analizar el perfil de metabolitos en un punto dado dentro
de una célula, es independiente del genoma. et al.,2001). Es
el uso de estos enfoques lo que permitirá la formación de
una biología integrada de organismos cuyo genoma esté
completamente secuenciado.
Un problema subyacente en la genómica funcional es con las
condiciones fisiológicas utilizadas para recolectar material para el
análisis. El análisis global de la funcionalidad requiere una fisiología
celular cuidadosamente definida y regulada y, como tal, las limitaciones
del cultivo por lotes son evidentes. Se ha demostrado enS. cerevisiaeque
la tasa de crecimiento específica tiene un efecto dramático sobre la
regulación de la expresión génica (Ter Lindeet al.,1999), y como
resultado, la interpretación de datos genómicos funcionales de cultivos
por lotes requiere precaución. Sin embargo, se están logrando avances
en el uso del cultivo de quimiostatos para la explotación de la genómica
funcional. El efecto de los factores dependientes de la tasa de
crecimiento puede oscurecer las observaciones realizadas en el cultivo
por lotes, como lo demostró elegantemente Hayeset al. (2002). El factor
de transcripción Mcm1 está implicado en la regulación del ciclo celular
enS. cerevisiae.Por comparación de células de tipo salvaje y unamcm1
mutante defectuoso en la capacidad de unión al ADN y, en consecuencia,
de crecimiento más lento, se demostró que en el cultivo por lotes, la
mayoría de los genes estaban regulados a la baja en elmcm1mutante
con respecto al tipo salvaje. En el cultivo de quimiostatos, donde los
cultivos se mantuvieron a la misma tasa de crecimiento específica, se
encontró que un conjunto de genes estaba regulado al alza en elmcm1
mutante que estaba completamente enmascarado en los experimentos
de cultivo por lotes. Este estudio demuestra el poder del quimiostato
para el perfil transcripcional al revelar conjuntos de genes ocultos por
efectos de crecimiento secundarios. Posteriormente, el perfil
transcripcional de cultivos cultivados con quimiostatos a partir de
cultivos limitados en nitrógeno o carbono, a dos tasas de crecimiento
específicas diferentes, mostró que los perfiles de expresión obtenidos a
partir de genes conocidos pueden explotarse para obtener una mayor
comprensión de las funciones de genes desconocidos y de la estructura
molecular. base del control de la tasa de crecimiento (Hayeset al.,2002).
El análisis de las respuestas transcripcionales a nutrientes
específicos en el cultivo de quimiostatos deS. cerevisiaeestaba
3156
investigado por Boeret al. (2003) para determinar las funciones de genes
desconocidos y mapear regulones desconocidos que se correlacionan
con la limitación de nutrientes. Las respuestas transcripcionales a la
limitación de carbono, nitrógeno, fósforo o azufre se estudiaron en
cultivos cultivados con glucosa a una tasa de dilución de 0 x 1 hora.21. Se
demostró que la transcripción del 31% del genoma anotado cambió en
al menos dos de las limitaciones estudiadas, alterando los procesos
metabólicos celulares para cumplir con los requisitos de crecimiento de
la limitación de nutrientes. Estas estrategias incluyeron una expresión
elevada de transportadores de alta afinidad para cada nutriente
específico, o la explotación de fuentes alternativas del nutriente
limitante, como la regulación al alza de los transportadores de
aminoácidos durante la limitación de carbono, nitrógeno y azufre para
utilizar el esqueleto de carbono, la fracción de nitrógeno o grupos de
azufre de los aminoácidos. Una tercera estrategia fue la regulación al
alza de genes implicados en la movilización y utilización de materiales de
almacenamiento.
Estudios cuidadosamente diseñados como los de Boeret al. (2003) han
permitido eliminar la ambigüedad de los conjuntos de datos
experimentales. Los cultivos de quimiostatos proporcionan condiciones
limitantes de nutrientes específicas para un solo nutriente en un medio
que tiene niveles estables de los componentes no limitantes. También
significa que ningún componente se agota realmente, evitando así la
transcripción de la respuesta al estrés que podría enmascarar los
efectos resultantes específicamente de la limitación de nutrientes
(Werner-Washburne et al.,1996; Baudouin-Cornuet al.,2001). Estos
estudios también permiten el análisis de regiones aguas arriba de genes
coexpresados y la identificación de motivos reconocidos por factores de
transcripción específicos para controlar la expresión génica en las
condiciones fisiológicas empleadas. Wuet al. (2004) identificaron un
subconjunto de 17 genes enS. cerevisiaeregulado positivamente en
respuesta a la inanición en todas las condiciones de inanición de
nutrientes estudiadas, sin embargo, estos genes no contienen
elementos aguas arriba inducidos por el estrés.
El cultivo continuo como ayuda para la reproducibilidad y las
comparaciones funcionales
Utilizando cultivos de quimiostatos deS. cerevisiae,Gaiteroet al. (2002)
examinó la reproducibilidad de los datos de micromatrices entre
laboratorios. Cultivando cultivos en condiciones limitadas de glucosa
definidas, se llevaron a cabo tres experimentos replicados
independientes en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Los datos
revelaron un coeficiente de variación entre laboratorios de 0?23. Este es
un nivel de variación significativamente más bajo que el informado
anteriormente para cultivos en matraces agitados, lo que refleja el
control de crecimiento superior que se puede obtener mediante el uso
de sistemas de cultivo continuo sobre cultivos por lotes.
El análisis proteómico de cultivos cultivados con quimiostatos se ha
quedado atrás con respecto al análisis transcriptómico, a pesar de la
disponibilidad de la tecnología de electroforesis en gel bidimensional
desde la década de 1970. Sin embargo, la identificación de manchas de
gel se ha acelerado y simplificado gracias a los avances recientes en las
técnicas de espectrometría de masas. Las correlaciones entre el
transcriptoma y el proteoma han sido difíciles de lograr, con una
variación de hasta 20 veces observada enS. cerevisiae (Gigi et al.,1999).
El desafío de los experimentos proteómicos es
Microbiología151

comparar los niveles de proteína y la composición de las células en
determinados puntos durante el crecimiento. De hecho, los intentos de
correlacionar los niveles de proteína entre los estados genéticos, de
desarrollo o fisiológicos con los perfiles de expresión génica global a
menudo no logran mostrar congruencia (Delneriet al.,2001). Prattet al. (
2002) abordó un problema fundamental, el análisis del proceso
antagónico del recambio proteico. Esto se llevó a cabo mediante el uso
de aminoácidos marcados con isótopos estables y el análisis de la
descomposición de proteínas individuales mediante cambios de masa de
digestión tríptica. En cultivos de quimiostatos limitados en glucosa deS.
cerevisiaese demostró que la tasa de degradación de proteínas
promedio de 50 proteínas fue de 2?2% h21. Aunque se encontró que
algunas proteínas se renuevan a tasas del 10% h21, otros exhibieron
tasas de rotación indetectables. La dinámica del recambio de proteínas,
especialmente cuando se correlaciona con el ARNm afín, es una variable
importante y, a menudo, se pasa por alto al considerar los datos
genómicos funcionales.
Recientemente, con las consideraciones anteriores en mente, Kolkman
et al. (2004) comparó los proteomas deS. cerevisiaedurante la limitación
de glucosa o etanol en cultivo quimiostático. Se demostró que los
cultivos de quimiostatos ofrecían ventajas sobre los cultivos por lotes,
tanto en la reproducibilidad como en la precisión de los datos.
Regulación positiva de las proteínas de choque térmico y la maquinaria
de síntesis de proteínas, un hallazgo importante en el estudio del
proteoma de crecimiento por lotes de Futcheret al. (1999), se encontró
que era una anomalía del sistema de cultivo. Sin embargo, varios
cambios en el metabolismo central del carbono fueron consistentes
tanto en sistemas discontinuos como continuos. kolkmanet al. (2004)
compararon sus datos de proteoma con los obtenidos por Daran-
Lapujadeet al. (2004) y encontró que se correlacionaban bien. Por
ejemplo, la mayoría de las enzimas glucolíticas, con la excepción de
HxK1p, estaban reguladas a nivel de proteína, y las transcripciones
mostraban poca variación durante el crecimiento limitado por carbono.
Sin embargo, se encontró que HxK1p estaba regulado al alza tanto a
nivel del transcriptoma como del proteoma, lo que sugiere que este
primer paso glucolítico está controlado transcripcionalmente. Los datos
obtenidos para la gluconeogénesis y las enzimas del ciclo del glioxilato
confirmaron los mecanismos de regulación transcripcional conocidos.
Este tipo de estudio muestra el poder del cultivo de quimiostatos, como
estudios de cultivo por lotes (por ejemplo, Futcheret al.,1999) no han
podido mostrar una congruencia convincente entre los datos del
transcriptoma y el proteoma libres de crecimiento secundario y efectos
de estrés.
Al combinar el uso del cultivo de quimiostatos con la proteómica para
estudiar los procesos celulares en las eubacterias, Wicket al. (2001)
Tabla 1.Uso de cultivo continuo en algunos estudios posgenómicos recientes
Acercarse Solicitud
proteómica Mayor reproducibilidad Proteómica
comparativa superior Transcripción
transcriptómica global
Mayor reproducibilidad
Análisis de flujo Análisis de flujo de carbono
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Cultura continua: ¿regresando?
investigó los cambios en la cinética de absorción de sustrato y
el proteoma deEscherichia colilimitante de la glucosa y
- condiciones suficientes, proporcionando información que no se
desprende de los experimentos de cultivo por lotes. Esto se logró
transfiriendo células en crecimiento exponencial desde un medio con
exceso de glucosa a cultivos de quimiostatos con glucosa limitada y
cultivando durante 217 generaciones. Las consecuencias fisiológicas del
cambio descendente de glucosa fueron un aumento en la capacidad de
las células para eliminar sustratos, a través de aumentos en la
abundancia de varias proteínas involucradas en la unión, absorción y
catabolismo de carbohidratos (MglB, MalE, LivJ y UgpB). Las 217
generaciones de evolución cultural condujeron a un aumento de diez
veces en la afinidad por la glucosa a través de una mayor expresión de
mglB ymasculino,que previamente se ha demostrado que están
involucrados en la captación de glucosa en condiciones de glucosa
limitada (Notley-McRobb & Ferenci, 1999).
El uso de sistemas de cultivo continuo para estudiar la formación de
biopelículas enPseudomonas aeruginosa,utilizando quimiostatos y
células de flujo de biopelículas de cultivo continuo, ha demostrado
correlaciones entre la expresión de proteínas en cultivos planctónicos y
durante las etapas de formación de biopelículas (Saueret al.,2002). Se
encontró que más de 800 proteínas mostraban un cambio de seis veces
o más en los niveles de expresión entre cultivos planctónicos y de
biopelícula. Muchos de los genes regulados positivamente estaban
involucrados en el catabolismo del carbono y el metabolismo de los
aminoácidos, y aunque no se especificó el nutriente limitante, la
prevalencia de tales proteínas sugeriría una limitación del carbono. Este
trabajo sirve para ilustrar que las condiciones de cultivo aparentemente
desvinculadas físicamente pueden estudiarse utilizando estrategias de
cultivo continuo.
La combinación de cultivos de quimiostatos en estado estacionario
y técnicas genómicas funcionales proporciona una base
experimental sólida para el análisis de procesos biológicos en
microorganismos (Tabla 1). Estudios como los de Hayeset al. (2002),
Kolkmannet al. (2004), gaiteroet al. (2002) y Wu et al. (2004)
destacan la reproducibilidad mejorada de los datos de
transcriptoma, proteoma, metaboloma e ingeniería metabólica
obtenidos de cultivos de quimiostatos en estado estacionario. Las
condiciones fisiológicas cuidadosamente controladas y definidas
que se pueden obtener en los cultivos de quimiostatos permiten la
adquisición de muestras biológicas confiables para el análisis
mediante múltiples técnicas genómicas funcionales, lo que resulta,
parafraseando a Delneriet al. (2001), 'una biología verdaderamente
integradora de organismos modelo'.
Referencia
Mechaet al. (2001) Kolkmann
et al. (2004) Bóeret al. (2003)
Gaiteroet al. (2002) Aviñón-
Rossaet al. (2002)
3157
PA Hoskisson y G. Hobbs
Perspectivas y futuro
Las ventajas de los sistemas de cultivo continuo en estado
estacionario como medio de investigación biológica han sido
reconocidas desde su invención en la década de 1950. Un
resurgimiento en los estudios de las respuestas evolutivas a la
variación ambiental (Suiter et al.,2003) y de genes mutadores
(Notley-McRobbet al., 2003) facilitado por el quimiostato está
comenzando a brindar importantes conocimientos biológicos sobre
las funciones y mecanismos de dichos genes y sus implicaciones
obvias en procesos como la resistencia antimicrobiana adquirida.
Los avances recientes en los métodos biológicos aplicados a nivel
mundial han llevado a la necesidad de datos reproducibles,
biológicamente homogéneos y confiables, y esto a su vez ha llevado
a un resurgimiento del uso del quimiostato. Las ventajas de los
sistemas de cultivo continuo están demostradas en disciplinas
como la bioquímica y la fisiología sobre la base del análisis gen por
gen; sin embargo, recién ahora estamos descubriendo el poder de
esta técnica a nivel de todo el organismo. Por supuesto, en el
mundo natural, los microorganismos no viven en condiciones
ideales, bien mezcladas y homogéneas. En este punto nos gustaría
reconocer una modificación del quimiostato denominada
'gradostato' que permite cultivar cultivos en presencia de
gradientes de soluto (Wimpenny, 1988, 1989). Actualmente no
tenemos conocimiento de ningún estudio 'ómico' que utilice este
sistema; sin embargo, puede ser solo una cuestión de tiempo antes
de que se realicen experimentos espaciales y temporales
significativos en condiciones ecológicamente más relevantes.
Referencias
Aon, JC y Cortassa, S. (2001).Implicación del metabolismo del nitrógeno en el
desencadenamiento de la fermentación de etanol en cultivos de quimiostatos
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