Alvarado - Casas Maira Lyseth 2021

Expresión de factores de virulencia de Candida auris como contribuyentes en la
patogenicidad
Maira Lyseth Alvarado Casas
Universidad El Bosque
Facultad de Ciencias
Bogotá, Colombia
2021
1
Expresión de factores de virulencia de Candida auris como contribuyentes en la
patogenicidad
Maira Lyseth Alvarado Casas
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Msc. en Ciencias Basicas Biomedicas
Directora
Msc. Patricia Escandón
Grupo de Investigación:
Grupo de Microbiología
Dirección de Investigación en Salud Pública
Instituto Nacional de Salud
Universidad El Bosque
Facultad de Ciencias
Bogotá, Colombia
2021
2
Probatus
3
Nota de Salvedad de responsabilidad institucional: " La Universidad El Bosque, no se
hace responsable de los conceptos emitidos por los investigadores en su trabajo, sólo
velará por el rigor científico, metodológico y ético de este en aras de la búsqueda de la
verdad y la justicia".
4
DEDICATORIA
Este trabajo se lo dedico a mi hijita Abiagail Medina Alvarado quien es mi fuerza y

razón para ser cada día mejor persona.
AGRADECIMIENTOS
• Principamente agradezco a Dios por darme la salud, fortaleza, motivación, y

sabiduria para culminar una meta más en mi vida.
• A mi directora de tesis Patricia Escandón, por darme la oportunidad de formarme
junto a ella y creer en mi como persona y profesional, por compartir conmigo
durante todo este tiempo sus conocimientos, sabiduria, brindarme su tiempo, y
tenerme tanta paciencia a pesar de todas las dificultades de salud que tuve.
• Al Instituto Nacional de Salud (INS) por ser mi segundo hogar, mi academia, mi
escuela durante tantos años.
• Gracias a mi familia por apoyarmen en todos mis sueños, por darmen fuerza
cada vez que la necesite para seguir adelante, por su paciencia, por la formacion
que me inculcaron desde pequeña que hoy me hace la persona y profesional
que soy, por todos sus esfuerzos y dedicacion que tuvieron conmigo, mil y mil
gracias.
• A mi amiga y colega Norida Vélez por toda su colaboración con los análisis
estadísticos.
• A la Universidad El Bosque, la cual me brindo todas las bases necesarias, todo
el conocimiento y me formo durante estos dos años para ser mejor cada día en
el área de la investigación en Ciencias básicas Biomédicas.
5
Tabla de contenido
1. RESUMEN .......................................................................................................... 11
2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 15
3. MARCO TEORICO ............................................................................................. 17
4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 31
4.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 31

4.1.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS.................................................................... 32
5. METODOLOGIA ................................................................................................. 32
5.1 Diseño metodológico ................................................................................ 32
5.2 Criterios de inclusión y exclusión ............................................................ 33

5.2.1 Inclusión .................................................................................................. 33
5.2.2 Exclusión ................................................................................................. 33
5.3 Consideraciones éticas............................................................................. 33
5.4 Evaluación morfológica ............................................................................ 34
5.5 Actividad enzimática ................................................................................. 35

5.5.1 Proteasas y fosfolipasas .......................................................................... 35
5.5.2 Hemolisina............................................................................................... 36
5.6 Formación de biopelículas ....................................................................... 36
5.7 Ensayos de adherencia ............................................................................. 37
5.8 Susceptibilidad antifúngica ...................................................................... 37
5.9 Patogenicidad de C. auris en modelo invertebrado G. mellonella ......... 39

5.9.1 Selección de las larvas ............................................................................ 39
5.9.2 Preparación del inóculo ........................................................................... 39
5.9.3 Inoculación del patógeno ......................................................................... 39
5.9.4 Grupos control de virulencia .................................................................... 40
5.9.5 Grupos control del modelo ....................................................................... 40
5.10 Asociación de factores de virulencia con patogenicidad y evolución

pacientes. .............................................................................................................. 40
5.11 Análisis estadístico ................................................................................... 41
6. RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................................... 41
6.1 Objetivo específico Nº 1:........................................................................... 41
6
6.3 Capacidad de adherencia ......................................................................... 46
6.4 Formación de biopelículas ....................................................................... 47
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................... 65
8. ANEXOS ............................................................................................................. 68
Anexo 1. ................................................................................................................. 68
Anexo 2. ................................................................................................................. 69
Anexo 3. ................................................................................................................. 70
9. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 78
7
Tablas
Tabla 1 Funciones de las proteasas en especies de Candida. ................................... 21
Tabla 2 Puntos de corte tentativos establecidos por el CDC para C. auris para las
diferentes clases de antifúngicos (azoles, polienos y equinocandinas) y la resistencia
presentada en algunos países. ................................................................................... 28
Tabla 3 Aislamientos clínicos de C. auris recuperados en dos departamentos de

Colombia 2016-2018, provenientes de procesos invasivos y colonización. ................. 33
Tabla 4 Tipo de proceso, morfología, actividad enzimática, actividad metabólica de la

biopelícula y su relación de acuerdo al origen de los 107 aislamientos de C. auris. .... 45
Tabla 5 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos invasivos en el modelo

de invertebrados de G. mellonella. Se utilizó la prueba de log-rank (Mantel-Cox). (A) baja
patogenicidad, (B) alta patogenicidad. ........................................................................ 73
Tabla 6 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos de colonización en el

modelo de invertebrados de G. mellonella. Se utilizó la prueba de log-rank (Mantel-Cox).
(A) baja patogenicidad, (B) alta patogenicidad. ........................................................... 75
Tabla 7 Patogenicidad en G. mellonella, tipo de morfologia y su relación de acuerdo al

tipo de procesos (invasivo o de colonización) de los aislamientos de C. auris. ........... 59
Tabla 8 Datos clínicos, factores de virulencia, patogenicidad en G. mellonella,

susceptibilidad antifúngica de los aislamientos de C. auris y su relacion de acuerdo a la
evolución clínica del paciente (vivo o muerto). ............................................................ 64
8
Figuras
Figura 1 Esquema de las concentraciones (g/mL) correspondientes de AND, AMB y

VOR en las placas. ..................................................................................................... 38
Figura 2 Esquema de las concentraciones (g/ml) correspondientes de FCZ en las
placas. ........................................................................................................................ 38
Figura 3 Punto de corte de susceptibilidad antifúngica para las cepas ATCC control.
...................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 4 Tipo de morfología de aislamientos de C. auris: (A) morfología agregada (B)
morfología simple o individual. .................................................................................... 42
Figura 5 Evaluación de enzimas extracelulares en aislamientos de C. auris. (A) actividad
enzimática hemolítica (B) actividad enzimática fosfolipasa (C) actividad enzimática
proteasa...................................................................................................................... 44
Figura 6 Capacidad de adherencia a material siliconado de los aislamientos de C. auris
(A) provenientes de procesos invasivos y (B) provenientes de procesos de colonización.
................................................................................................................................... 47
Figura 7 Lecturas colorimétricas (valores de D.O. 490 nm) de ensayos de reducción
XTT de biopelículas formadas por C. auris (A) de procesos invasivos y (B) procesos de
colonización……………………………………………………………………..…………… 48
Figura 8 Actividad metabólica de las células dentro de la biopelícula formada por los
aislamientos de C. auris en función de la reducción XTT y la cepa control C. albicans,
provenientes de procesos invasivos y de colonización…………………………………... 49
Figura 9A1Actividad de diferentes concentraciones de anfotericina B frente a
biopelículas preformadas de aislamientos de C. auris de origen
invasivo…………………………………………………………………………………….…. 50
Figura 9A2 Actividad de diferentes concentraciones de anfotericina B frente a
biopelículas preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador.
………………………………………………………………………………………………….50
Figura 9B1 Actividad de diferentes concentraciones de fluconazol frente a biopelículas
preformadas de aislamientos de C. auris de origen invasivo……………………………. 51
Figura 9B2 Actividad de diferentes concentraciones de fluconazol frente a biopelículas
preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador……………………….. 51
Figura 9C1 Actividad de diferentes concentraciones de voriconazol frente a biopelículas
preformadas de aislamientos de C. auris de origen invasivo……………………………..52
Figura 9C2 Actividad de diferentes concentraciones de voriconazol frente a biopelículas
preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador………………………... 52
9
Figura 9D1 Actividad de diferentes concentraciones de anidulafungina frente a
biopelículas preformadas de aislamientos de C. auris de origen invasivo……………... 52

biopelículas preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador…………. 53
Figura 10 Curva de supervivencia de G. mellonella infectada con aislamientos de C.
auris provenientes de procesos invasivos. .................................................................. 56
Figura 11 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos invasivos que
mostraron baja virulencia en el modelo invertebrado G. mellonella, que presentaron
diferencias estadísticamente significaticas con respecto a la cepa control SC5314. ... 56
mostraron alta virulencia en el modelo invertebrado G. mellonella, que presentaron
auris provenientes de procesos de colonización. ........................................................ 58
Figura 14 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos de colonización que
Figura 16 Susceptibilidad de aislamientos de C. auris provenientes de procesos
invasivos a cuatro clases de antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLZ),
voriconazol (VOR), anidulafungina (AND). Color verde (sensible), color rojo (resistente).
...................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 17 Susceptibilidad de aislamientos de C. auris provenientes de procesos de
colonización a cuatro clases de antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLZ),
voriconazol (VOR), anidulafungina (AND). Color verde (sensible), color rojo (resistente),
color gris (no identificado). .......................................................................................... 76
10
1. RESUMEN
Las infecciones causadas por levaduras del género Candida se clasifican como
infecciones sistémicas, que han surgido como un problema en salud pública a nivel
mundial. De las 150 especies hasta el momento descritas, algunas hacen parte del
microbioma normal del humano y se sabe que aproximadamente el 10% es responsable
de las infecciones en humanos, siendo C. albicans el agente más frecuente.
En el 2009 surge una nueva levadura emergente, Candida auris, aislada por primera
vez de una paciente japonésa con infección en el canal auditivo; esta levadura se
encuentra relacionada con otras especies cercanas filogenéticamente como C.
haemulonii, y ha sido reportada en aproximadamente 33 países de seis continentes. En
Colombia, aunque la notificación de infecciones por C. auris es obligatoria a partir del
2016, mediante un estudio retrospectivo se confirmó la circulación de C. auris en la costa
norte y centro del país desde el año 2013, en pacientes en unidad de cuidado intensivo
(UCI). En una revisión sistemática y un meta-análisis exhaustivo realizado en el 2017
por Osei Sekyere et al., sobre los estudios realizados en C. auris con un número de 742
aislamientos provenientes de cinco continentes y 16 países que han reportado casos
provenientes de Norte América (Canadá y Estados Unidos), Sur América (Colombia y
Venezuela), Europa (Alemania, Noruega, España, Reino Unido), África (Sur África), y
Asia (India, Israel, Japón, Kuwait, Omán, Pakistán, Corea del Sur), sugirieron que la
mortalidad por infecciones asociadas a C. auris puede variar de un 33,33% a 100% en
todo el mundo. La emergencia global por la emergencia de este patógeno se dió por la
aparición casi simultánea en cuatro clados geográficamente restringidos (este y sur de
Asia, África, América del sur), con transmisión clonal identificada intra e inter-
hospitalaria, propagación rápida de forma horizontal en los hospitales desde pacientes
colonizados/infectados a otros pacientes de forma directa o indirecta a partir de
personas colonizadas u objetos o dispositivos médicos contaminados, causando
infecciones complejas en pacientes críticos y observándose resistencia a más de una
clase de antifúngicos, como azoles y polienos, en algunos países; sin embargo, este
perfil de multirresistencia aún no ha sido reportado en Colombia.
Debido a la emergencia de infecciones por C. auris como una levadura con un alto perfil
de tolerancia a la salinidad, capacidad de crecer a 42 ºC y potencial multirresistencia a
los antifúngicos disponibles en Colombia y el mundo, y teniendo en cuenta el poco
conocimiento que se tiene sobre su comportamiento, el propósito de este estudio fue
desarrollar una investigación de corte transversal con una colección de aislamientos
clínicos de C. auris (n=107) asociados a procesos invasivos y de colonización, en los
11
departamentos del Cesar (Valledupar) y Bolívar (Cartagena), enfocado a la
determinación in vitro de la expresión de factores asociados con la virulencia que han
sido poco abordados, entre los cuales se encuentran la expresión de enzimas como
proteasas, fosfolipasas y hemolisina, capacidad de adherencia a materiales siliconado,
formación de biopelículas, tipo de morfología y patogenicidad mediante la evaluación in
vivo en el modelo invertebrado Galleria mellonella.
Adicionalmente, se evaluaron perfiles de susceptibilidad a antifúngicos, y se
correlacionaron todos estos datos obtenidos tanto in vitro como in vivo con el desenlace
de los pacientes, para lo cual también se implementó una encuesta que nos brindó datos
importantes relacionados con las características clínicas del paciente.
Se encontró que la morfología más frecuente en los dos procesos (invasivo y
colonización) fue simple; en relación con los aislamientos provenientes de procesos de
colonización, el sitio anatómico más frecuente para recuperar C. auris fue oídos. En
cuanto a la actividad enzimática, el 68,22% tuvo algún tipo de actividad hemolítica (baja-
media-alta) y ésta se relacionó con el proceso de colonización p=0.000; el 67,3%
presentaron actividad fosfolipasas y el 100% actividad proteolítica. Adicionalmente,
todos los aislamientos tuvieron la capacidad de adherirse al material siliconado,
observándose que los aislamientos de procesos de colonización eran los que mayor
capacidad de adherencia tenían. El promedio de la actividad metabólica de las
biopelículas formadas por los aislamientos de C. auris fue de (DO490nm=0,116), con
mayor producción en los de procesos de colonización y en los cuales tres aislamientos
fueron comparables con la cepa de referencia C. albicans; es importante resaltar que
algunas de estas biopelículas no fueron totalmente susceptibles a las diferentes clases
de antifúngicos evaluados (AMB, FLZ, VOR y AND), además se encontró una relación
entre la formación de biopelícula y la actividad enzimática hemolítica, fosfolipasas con
un p=0,000 y proteasas, siendo estadísticamente significativo con un p=0,033. Por otro
lado, en cuanto a la patogenicidad de C. auris evaluada en el modelo invertebrado G.
mellonella, se observó que los aislamientos de procesos de colonización tuvieron mayor
patogenicidad en comparación con los de procesos invasivos, sin embargo, se encontro
una relación entre los aislamientos que tuvieron una patogenicidad baja con que fueran
provenientes de procesos invasivos y esto fue estadísticamente significativa p=0,011.
Sin embargo, en los dos procesos se observaron aislamientos con patogenicidad alta y
baja en relación con la cepa de referencia C. albicans. C. auris fue sensible a la mayoría
de las clases de antifúngicos evaluados, sin embargo, se observó resistencia de algunos
aislamientos a los azoles (fluconazol y voriconazol) y a polienos (anfotericina B). En
relación con los datos clínicos de los pacientes, la mayoría de éstos se encontraban en
los grupos de primera infancia con un 42,1% y adulto con un 21,5%, donde la relación
12
mujer-hombre fue casí 1:1. Los principales factores de riesgo fueron uso de sonda,
catéter, ventilación mecánica, tratamiento antifúngico, cirugía en los últimos 60 días,
entre otros.
Este estudio nos permitió acercarnos más al entendimiento del comportamiento de esta
levadura en el hospedero, ver su importante relación con algunos factores de virulencia
como lo son la actividad de enzimas de hemolisina y proteasas, su resistencia a
tratamientos antifúngicos y capacidad de adherencia a material siliconado, que hacen
de esta levadura un patógeno capaz de evadir el sistema inmune, dañar tejidos e invadir
órganos, causando graves cuadros clínicos en los pacientes.
Palabras clave
Candida auris, infección, colonización, virulencia, resistencia.
ABSTRACT
Infections caused by the yeast of the genus Candida are classified as systemic
infections, which have emerged as a public health problem worldwide. Of the 150
species described so far, some are part of the normal human microbioma and it is known
that approximately 10% are responsible for infections in humans, with C. albicans being
the most frequent agent.
In 2009, a new emerging yeast Candida auris emerged, isolated for the first time from a
Japanese patient with an infection in the ear canal; this yeast that is related to other
phylogenetically close species such as C. haemulonii, and has been reported in
approximately 33 countries on six continents. In Colombia, although notification is
mandatory as of 2016, a retrospective study confirmed the presence of C. auris in the
North Coast and central region since the year 2013in patients in intensive care unit (ICU).
In a systematic review and an exhaustive meta-analysis carried out in 2017 by Osei
Sekyere et al., on the studies carried out in C. auris with a number of 742 isolates from
five continents and 16 countries that have reported cases from North America (Canada
and the United States), South America (Colombia and Venezuela), Europe (Germany,
Norway, Spain, United Kingdom), Africa (South Africa), and Asia (India, Israel, Japan,
Kuwait, Oman, Pakistan, Korea Sur), suggested that mortality from infections associated
with C. auris can vary from 33.33% to 100% worldwide. This global emergency occurred
due to the almost simultaneous appearance in four geographically restricted clades (East
and South Asia, Africa, South America), with clonal transmission identified intra and inter-
hospital, rapid spread horizontally in hospitals from colonized patients/infected other
patients directly or indirectly from colonized people or contaminated objects or medical
13
devices, causing complex infections in critically ill patients and observing resistance to
more than one class of antifungals, such as azoles and polyenes, in some countries;
however, this multidrug resistance profile has not yet been reported in Colombia.
Due to the emergence of infections by C. auris as a yeast with a high profile of tolerance
to salinity, ability to grow at 42 ºC and multi-resistance to antifungals available in
Colombia and the world, and taking into account the scarce knowledge available, the
purpose of this study was to develop a cross-sectional investigation with a collection of
clinical isolates of C. auris (n = 107) associated with invasive and colonization processes,
in the departments of Cesar (Valledupar) and Bolívar (Cartagena), focused on the in vitro
determination of the expression of factors associated with virulence that have been little
addressed such as enzymes like proteases, phospholipases and hemolysin, adhesion
capacity to silicone material, biofilm formation, type of morphology and its pathogenicity
by in vivo evaluation in the Galleria mellonella invertebrate model.
Additionally, antifungal susceptibility profiles were evaluated, and all these data obtained
both in vitro and in vivo were correlated with the outcome of the patients, for which a
survey was also implemented that provided us with important data related to the clinical
characteristics of the patient.
It was found that the most frequent morphology in the two processes (invasive and
colonization) was simple; in relation to the isolates from colonization processes, the most
frequent anatomical site to recover C. auris was the ears. Regarding the enzymatic
activity, 68.22% had some type of hemolytic activity (low-medium-high) and this is related
to the colonization process p = 0.000; 67.3% phospholipase activity and 100% proteolytic
activity. Additionally, all the isolates had the ability to adhere to the silicone material,
observing that the isolates from colonization processes were the ones with the highest
adherence capacity. The average metabolic activity of the biofilms formed by the C. auris
isolates was (OD490nm = 0.116), with higher production in the colonization processes
and where three isolates were comparable with the reference strain C. albicans; it is
important to highlight that some of these biofilms were not totally susceptible to the
different classes of antifungals evaluated (AMB, FLZ, VOR and AND), in addition, a
relationship was found between biofilm formation and hemolytic enzyme activity,
phospholipases with a p =0,000 and proteases and this was statistically significant and
the latter with a p = 0.033. On the other hand, regarding the pathogenicity of C. auris
evaluated in the invertebrate model G. mellonella, it was observed that the isolates from
colonization processes had greater pathogenicity compared to those from invasive
processes. However, a relationship was found between the isolates that had a low
pathogenicity with those that came from invasive processes and this was statistically
significant (p = 0.011). However, in the two processes, isolates with high and low
14
pathogenicity were observed in relation to the reference strain C. albicans. C. auris was
sensitive to most of the classes of antifungals evaluated, however, resistance of some
isolates to azoles (fluconazole and voriconazole) and polyenes (amphotericin B) was
observed. Regarding the clinical data of the patients, most of the patients were in the
early childhood groups with 42.15% and adult with 21.5%, where the female-male ratio
was almost 1: 1. The main risk factors were probe use, catheter, mechanical ventilation,
antifungal treatment, surgery in the last 60 days, among others.
This study allowed us to get closer to understanding the behavior of this yeast in the
host, to see its important relationship with some virulence factors such as the activity of
hemolysin and protease enzymes, its resistance to antifungal treatments and its ability
to adhere to silicone material, which make this yeast a pathogen capable of evading the
immune system, damaging tissues and invading organs, causing serious clinical pictures
in patients.
Keywords
Candida auris, infection, colonization, virulence, resistance.
2. INTRODUCCIÓN
El género Candida se ha convertido en un problema asociado con infecciones
hospitalarias, y cuya incidencia aumenta de manera dramática, donde el 85% de las
infecciones fúngicas en UCI corresponden a infecciones por Candida spp. y su
mortalidad es cercana al 40% (1,2). La fuente de infección por Candida spp. puede darse
de manera endógena, a partir de la microbiota gastrointestinal, oral o de la colonización
mucocutánea, o exógena a partir de las manos de personal profesional en salud,
equipos, camas, entre otros elementos contaminados (3-7).
Candida spp. se considera un microorganismo oportunista y se ha asociado
principalmente con pacientes inmunosuprimidos, pacientes con dispositivos invasores
como sondas, catéteres y tratamientos antimicrobianos prolongados. Otros factores de
riesgo pueden incluir duración de la estancia hospitalaria, múltiples comorbilidades,
cirugía mayor y permanencia prolongada en UCI (8,9).
Es así como una nueva especie del genero Candida, C. auris, emergió en los últimos
años como un hongo que representa una amenaza mundial para el ambiente
intrahospitalario (10).
C. auris es una levadura emergente multiresistente, que se encuentra filogenéticamente
relacionada con otras especies del genero Candida como C. krusei, C. lusitanie y C.
haemulonii, lo que ha generado inconvenientes para su identificación o que ésta se
realice de forma errónea cuando se utilizan métodos de identificación convencionales
15
(11). Por lo tanto, se requiere de métodos de identificación más precisos como MALDI-
TOF o PCR (12). C. auris fue reportada por primera vez en el año 2009 en Japón, a
partir del aislamiento de la secreción de oído de un paciente (10); desde entonces se
han reportado casos, especialmente fungemias, en diferentes países del mundo, como
India (13-16), Pakistán (9), Corea del Sur (17), Malasia (18), Sudáfrica (19,20), Omán
(21,22), Kenia (23), Kuwait (24), Israel (25), Emiratos Árabes Unidos (26), Arabia
Saudita (27), China (28), Colombia (29-31), Venezuela (4), Estados Unidos (5, 32-34),
Rusia (35), Canadá (36), Panamá (37), el Reino Unido (6,38) y Europa continental (39-
45). Debido a las alertas emitidas a nivel mundial tanto por el Reino Unido como por los
Centers for Disease Control and Prevention (CDC) de Atlanta (46,47), y de acuerdo al
surgimiento de casos en diferentes departamentos del territorio Colombiano, en el año
2016 el Instituto Nacional de Salud, emitió la “Alerta por emergencia global de
infecciones invasivas causadas por la levadura multirresistente Candida auris”, con el
fin de socializar y alarmar sobre la aparición de este patógeno en el país (48). Desde la
publicación de este lineamiento, se han recibido aproximadamente 1720 aislamientos
clínicos asociados a infección y colonización por la levadura multiresistente C. auris, de
los cuales cerca de un 30% presentan resistencia a algún antifúngico, sea polienos o
azoles (comunicación personal, INS-Microbiología).
Con lo anterior, se ha logrado caracterizar diferentes brotes en instituciones médicas en
varios departamentos del país, con una mortalidad no atribuible a la infección por C.
auris superior al 50%, en pacientes tanto pediátricos como de avanzada edad; la
caracterización de estos brotes ha permitido recuperar la levadura del ambiente
hospitalario, lo que demuestra que este patógeno tiene la capacidad de contaminar
diferentes ambientes alrededor del paciente y de adaptarse a tensiones impuestas por
el hospedero que se producen durante el proceso de infección convirtiéndose en una
levadura de alta importancia clínica asociada al grupo de las infecciones a la atención
en salud (49).
Entre los factores de virulencia que determinan la relación de Candida con el hospedero
se ha identificado la capacidad que tiene para adherirse a los tejidos y a las superficies
abióticas (catéteres o prótesis), que le confiere capacidad de colonizar y formar una
biopelícula que limita la acción de los antifúngicos (50). Otros factores que se han
observado como posibles determinantes en la invasión y diseminación a los tejidos son
la producción de enzimas hidrolíticas como las proteasas y fosfolipasas, enzimas como
la hemolisina y el cambio morfológico de levadura a pseudohifa (7,28,51,52).
Teniendo en cuenta lo anterior, es importante responder las siguientes preguntas:
• ¿Existen diferencias en la expresión de factores de virulencia entre aislamientos
de C. auris provenientes de procesos de colonización y procesos invasivos?
16
• ¿Existen diferencias en cuanto a la patogenicidad, evaluada en modelos in vivo
(Galleria mellonella) entre aislamientos provenientes de procesos de
colonización e invasivos y esto se relaciona con la expresión de algún factor de
virulencia?
• ¿La virulencia, patogenicidad en modelos in vivo y perfiles de resistencia a uno
o varios antifúngicos evaluados en aislamientos de C. auris se puede
correlacionar con peores desenlaces en pacientes?
A pesar de los avances de los diferentes grupos de investigación a nivel mundial

encaminados a entender las características de esta levadura, y el por qué ha surgido
como un microorganismo emergente, los vacíos en el conocimiento de ésta son
considerables. Uno de estos vacíos es el estudio de los factores asociados con la
virulencia del patógeno y su comportamiento en modelos in vivo, que aunque se ha
observado en algunos estudios que puede tener una patogenicidad igual a C. albicans,
aún falta mayor información o conocimiento, que nos permita entender un poco más la
interacción hospedero-patógeno y la capacidad de la levadura de sobrepasar la barrera
de la colonización e infectar el hospedero, que permita conocer la etiología y la
epidemiología de estas candidiasis y conocer las características que contribuyen a su
virulencia y así poder asociarlas con la evolución clínica de los pacientes, y por ende
brindar un mejor manejo y tratamiento oportuno.
Por lo anterior, nos planteamos la siguiente hipótesis nula y alterna:
H0= No existe asociación entre la expresión de factores de virulencia y los aislamientos
de C. auris provenientes de procesos de colonización y procesos invasivos.
H1= Existen diferencias en la expresión de los factores de virulencia entre aislamientos
invasivos y colonizadores de C. auris?
3. MARCO TEORICO
Generalidades
C. auris es una especie emergente de Candida nosocomial que se puede encontrar

colonizando pacientes hasta causando infecciones profundas y candidemia
(14,15,17,51-53), observándose brotes en todo el mundo, asociados principalmente a
pacientes inmunocomprometidos y otras afecciones como diabetes, enfermedades
cardiovasculares y/o pulmonares, sepsis o tratamiento previo con antibióticos que
también pueden ser factores de riesgo importantes (8,9). C. auris se ha destacado por
la aparición de cuatro clados específicos que difieren por la presencia de miles de
17
polimorfismos de un solo nucleótido, pero entre clados la diferencias son mínimas (<60
SNP): clado I: Asia oriental, clado II: Asia meridional, clado III: Sudáfrica y clado IV:
América del Sur (9), sin embargo, en el 2018 se reportó y sugirió un nuevo clado, debido
a la aparición de un aislamiento de un paciente Iraní, que difirió en miles SNPs de los
otros clados (54, 55). Esta levadura es un organismo haploide, con un genoma que
oscila aproximadamente entre 12.1 y 12.7 Mb, con cerca de 5,500 genes codificantes
de proteínas (56,57), por lo cual una diferencia en pocos SNPs dentro de un mismo
clado indica que estos aislamientos son casi clonales, lo que corrobora su transmisión
a través de continentes (9,58).
En cuanto a la epidemiologia y la prevalencia real de C. auris siguen siendo inciertas;

sin embargo, hasta el momento se cree que esta levadura surgió independientemente
en cada área reportada; en la actualidad, se han reportado casos por infecciones con
C. auris en aproximadamente 39 países a nivel mundial. El primer reporte de C. auris
se originó en Japón de un paciente con infección de oído, en el 2009, sin embargo, ese
mismo año se reportaron 15 casos mas en corea del sur, y otros reportes adicionales
en el 2011 (10,17,59,60). Además, se han descrito brotes que persisten durante meses,
lo que aumenta su transmisibilidad, llevando al cierre de las UCI (4,6, 42). Aún más con
la dificultad que se mantiene para identificar de forma correcta esta levadura (8,15, 60-
64), se han propuesto varias teorías sobre su aparición, relacionados con algunos
rasgos biológicos, con sugerencias de contribución de factores antropogénicos que se
cree juegan un papel importante (65).
En Estado Unidos se convirtió de notificación obligatoria a nivel nacional, y hasta
diciembre de 2020 se reportaron 1678 casos confirmados en 24 estados (47),
especialmente en pacientes críticos (13); como también se observó en el Reino Unido
e Irán (38,55,58,66), sugiriendo que estos aislamientos se introdujeron del extranjero.
En Europa entre el año 2013 al 2017 se reportaron al Centro Europeo para la Prevención
y el Control de Enfermedades (ECDC) 620 casos de C. auris en seis países, que incluyó
información suministrada por 29 países (39). En Sudáfrica la tasa de prevalencia es de
aproximadamente 0,3% (19), en India es de 5 al 30% de todos los casos de candidemia
en algunas instituciones (13-16) y como el quinto patógeno más común de candidemia
en UCI de la India (13,67).
C. auris se ha convertido en el sexto patógeno más común de infección del torrente
sanguíneo en hospitales en Venezuela (4). En Colombia se han confirmado casos de C.
auris del año 2013, gracias a estudios retrospectivos realizados de aislamientos
identificados como especies filogenéticamente cercanas (29-31).
Esta levadura ha sido considerada una amenaza para la salud mundial debido a varias
18
razones, como lo es la resistencia a múltiples antifúngicos, la dificultad para identificar
en laboratorio y la facilidad de trasmisión entre pacientes en entornos intrahospitalarios,
que puede llevar a causar brotes (68) y se encuentra asociada con una amplia gama de
manifestaciones clínicas, que incluyen infecciones del torrente sanguíneo, candidiasis
intraabdominal, infecciones del tracto urinario, otitis, infecciones de heridas quirúrgicas,
abscesos de la piel, miocarditis, meningitis e infecciones óseas (13,69-72), con altas
tasas de mortalidad que van del 30 al 72% (8,9,16,42,73), afectando principalmente a
adultos y/o pacientes en cuidados críticos, especialmente pacientes que se encuentran
en UCI; actualmente, los pacientes pediátricos solo se han notificado en Asia y América
del Sur (74,75).
La capacidad de C. auris para desencadenar brotes hospitalarios está probablemente
relacionada con la colonización persistente, ya que a diferencia de otras especies de
Candida, C. auris puede propagarse fácilmente en entornos hospitalarios (salas, camas,
ventanales, pisos, mesas, baños, entre otros), por trasmisión manual del personal
profesional o equipos de atención médica, persistiendo hasta 6 meses en material inerte
(5-7,49). Se estima que ≥4 horas es el período mínimo de contacto para la adquisición
de C. auris de una persona o superficie infectada (6).
Por tanto, para lograr una identificación exacta de esta levadura emergente C. auris fue
necesario la actualización de los enfoques de diagnóstico y el trabajo en nuevos
métodos como VITEK, espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) o PCR (12), ya que
era identificada erróneamente con especies que son filogenéticamente relacionadas
como C. ruelliae, C. pseudohaemulonii, Candida duobushaemulonii, Candida vulturna,
C. heveicola, Candida konsanensis, Candida chanthaburiensis, C. haemulonii, and
Candida haemulonis var. vulnera (11, 76).
De acuerdo a lo descrito por algunos autores sobre su relación con el cambio climático
observado en los últimos años a nivel mundial, debido a las intervenciones inadecuadas
realizadas por los humanos, esto produjo que se diera el principio de selección natural
para estas especies fúngicas y probablemente esto permitió que esta levadura patógena
hiciera una transición de lo ambiental a un patógeno nosocomial, donde pudo tener
hospederos intermedios como hospederos aviares (77); esto ha sugerido que C. auris
es una levadura ambiental que se ha convertido en oportunista para los humanos,
principalmente en sitios fríos y salados de la piel (78).
Existen una serie de factores que hacen a este patógeno un hongo de fácil persistencia
en el ambiente, como lo es la adaptación a diferentes nichos ecológicos, estrategias
importantes para la mayoría de patógenos humanos. Para C. auris la adaptación rápida
a temperaturas elevadas o termorresistencia (30-42 ºC) y tolerancia a altas
19
concentraciones de sal (10% p/vol.), la hacen única en este genero de Candida (67),
curiosamente se ha reportado que esta capacidad le permite formar células alargadas
similares a pseudohifas; sin embargo, la información acerca de los mecanismos
biológicos que intervienen y sus funciones específicas es aún escasa (7,28,52). Los
nichos colonizados dentro del hospedero humano son dinámicos, mostrando
fluctuaciones en la osmolaridad, pH, especies reactivo de oxígeno y nitrógeno y la
disponibilidad de macro y micronutrientes (79). Además, en ciertos nichos, como en el
intestino, se encuentra un ambiente anaeróbico. En la actualidad no se conoce cuál es
el reservorio ambiental de C. auris fuera de los hospitales, sin embargo, se han
encontrado algunos factores probables para adquirir la infección, como la demografía
humana, el uso inadecuado de antifúngicos como el fluconazol en UCIs y el control
deficiente de las infecciones, combinado con los viajes internacionales y la globalización
(34,38,42,58).
Factores de virulencia y resistencia a antifúngicos

La primera descripción que arrojo información relevante acerca de la virulencia de C.
auris se reportó en 2015, donde analizaron la expresión de enzimas como las proteasas,
fosfolipasas y hemolisina, que han jugado un papel importante en otras especies de
levaduras (51).
Las células fúngicas pueden secretar enzimas hidrolíticas como peptidasas y
fosfolipasas, que juegan un papel clave en la virulencia de Candida. Dentro de las
peptidasas encontramos las endopeptidasas extracelulares de la clase proteasa
aspártica que degradan numerosas moléculas proteicas dentro del hospedero y
constituyen el grupo más variable de factores de virulencia de Candida, éstas se pueden
clasificar en dos: las Candida-pepsinas “proteasas aspárticas secretadas” (Sap),
proteínas monoméricas con una estructura global altamente conservada, y por otro lado,
encontramos las proteasas de yasina; proteasas aspárticas expuestas en la superficie
de la pared celular (80). En el genoma de C. albicans se han encontrado 10 genes de
Sap, y a partir de estos se han encontrado algunos genes ortólogos para las otras
especies de Candida, como C. parapsilosis, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata.
Los mecanismos de inducción de síntesis y secreción de proteasas, se realiza mediante
la traducción de señales transmembrana en la que los receptores de la superficie celular
se unen a moléculas de ligando proteico, señalando así la inducción de la síntesis de
proteasas, o también mediante el transporte a través de las permeasas peptídicas,
donde los péptidos liberados de la proteína en el medio debido al nivel basal de
producción de proteinasa se transportan por éstas, permitiendo así que los péptidos
intracelulares acumulados desencadenen un aumento en la síntesis y secreción de
20
proteasas (81). Una vez modificadas y activadas, estas proteasas son transportadas a
través de un complejo sistema de vesículas internas a través del aparato de Golgi a la
membrana plasmática, donde las proteínas transmembrana y las proteínas ancladas a
GPI (glucosil-fosfatidil-inositol) pueden retenerse o continuar uniéndose covalentemente
a la pared celular o secretarse en el medio extracelular (80). Las proteínas secretoras
solubles se liberan en la región periplásmica desde donde se difunden a los diferentes
sitios de acción. Se ha descrito que las proteasas Sap1-Sap3 son las más comunes y
son secretadas por la forma morfológica de levadura (unicelular), las Sap4-Sap6 son
secretadas por la forma filamentosa (hifal), Sap8 es un importante modulador de
biopelículas y Sap9 y Sap10 influyen en la integridad de la pared celular mediante el
procesamiento de adhesinas involucradas en la formación de las biopelículas, Sap9
interactúa con adhesinas fúngicas que regulan la comunicación celular o formación de
biopelículas de especies mixtas (82). El pH óptimo de las proteasas para su
funcionamiento es 3-5, sin embargo, existen algunas Sap como Sap4, Sap6, Sap7,
Sap9, Sap10 que pueden actuar en pH mas neutros 5-7, la producción de varias
isoenzimas de Sap con un pH óptimo distinto puede promover la colonización e infección
de Candida de diferentes tejidos y ambientes. Las proteinasas extracelulares son
proteínas multifuncionales que pueden desempeñar diversos papeles
independientemente de su actividad proteolítica como lo es su mediación en la unión de
integrinas en células epiteliales (Sap 4-6) y la agregación de células para causar
infección en candidiasis oral (Sap 6). Existen diferentes blancos del hospedero para la
acción proteolítica de las Sap de Candida, entre ellos encontramos (80) (Tabla 1).
Tabla 1 Funciones de las proteasas en especies de Candida.
Blancos Función Ejemplos Sap

involucrada
Principales proteínas Adquisición Degradación de la albumina,
de tejidos internos y de nutrientes hemoglobina, etc.
fluidos corporales
Principales proteínas Invasión y Degradación de las proteínas de la
estructurales internas daño tisular, matriz extracelular.
diseminación
de Candida.
Proteínas de superficie Invasión del Facilita la penetración de los tejidos Sap 2, Sap 5
de las barreras hospedero. por la degradación de la mucina
externas del (principal componente de las
hospedero. mucosas).
21
Daño epitelial a través de la
degradación de la cadherina E
(glucoproteínas transmembranas
importantes en la adhesión).
Proteínas de defensa Evasión del Degradación de inmunoglobulinas, Saps o
sistema lactoferrina, lactoperoxidasa, etc. Sapp1
inmune.
Componentes y Evasión del Respuestas fungicidas reducidas Sap2
reguladores del sistema sistema debido a la proteólisis del factor H
de complemento. inmune. (entre las proteínas reguladoras del
complemento, tal vez la mas
importante sea el factor H(FH), una
abundante glicoproteína
plasmática que regula el
complemento en ase fluida y sobre
las superficies celulares) y los
receptores celulares (CR3, CR4 y
FHR-1).
Componentes de Desregulación Formación patológica de coágulos Sap2,
cascadas proteolíticas de la de fibrina (activación de los Sapp1
reguladoras. homeostasis factores X, XII y protrombina). Saps,
del Aumento de la permeabilización 22xcept
hospedero, de los vasos sanguíneos a través sap10
diseminación de la generación de quinina
de patógenos. (activación de factor XII y
degradación de HK y LK).
Inhibidores de las Daño tisular, Daño del tejido del hospedero por Sap1-Sap4
proteasas del diseminación. sus propias enzimas, como y Sap9
hospedero resultado de la degradación de la
2-acroglobulina, la cistatina A y la
inhibición de 1-proteasa.
Péptidos antimicóticos Evasión del Degradación e inactivación de la Sap 1- Sap4
sistema histatina 5 y catelicidina LL-37. y Sap 7-
inmune Sap10
Células de defensa del Evasión del Disminución de la fagocitosis. Sap1-Sap3
hospedero sistema
inmune
Células de defensa del Activación de Activación directa de interleucina-
hospedero la respuesta 1,
inflamatoria
22
HK, quininógeno de alta masa molecular, Lk, cininógeno de baja masa molecular.
Aunque no se han descrito las proteasas específicamente para C. auris, si se ha descrito

la expresión de proteasas que se ha visto asociada a cambios en temperatura (25-42
C), donde el tipo levaduriforme expresa mas Sap a temperaturas bajas 25 C y el tipo
pseudohifal a 37 C (28). Las temperaturas de la piel de los mamíferos son relativamente
bajas, lo que hace que la colonización de la piel conduzca a la expresión del fenotipo
filamentoso por C. auris. Además, las células filamentosas de C. auris secretan menos
SAP que las células de levadura típicas a bajas temperaturas, lo que facilita aún más un
estilo de vida comensal en la piel (83). Las regiones promotoras implicadas en la
expresión de los genes SAP son distintivas, lo que no solo permite la regulación de
genes individuales de SAP por varios reguladores transcripcionales, sino también la
expresión coordinada de genes SAP con otros atributos de virulencia, incluida la
formación de hifas y el cambio fenotípico (84).
Por su parte, las fosfolipasas son capaces de catalizar la hidrólisis de uno o más enlaces
éster en glicerofosfolípidos que son componentes principales de la membrana celular,
donde el producto de esta reacción, los lisofosfolípidos, dañan las membranas celulares
(85,86), además, estas enzimas actúan invadiendo y causando daño tisular en las
células del hospedero, rompiendo las membranas de las células epiteliales y
permitiendo que las especies que forman hifas puedan estas penetrar el citoplasma (51,
87,88). Se han identificado siete genes de fosfolipasa (PLA, PLB1, PLB2, PLC1, PLC2,
PLC3 y PLD1) pero solo cuatro han sido bien caracterizados (PLB1, PLB2, PLC1 y
PLD1) (89). Aunque todas las fosfolipasas se dirigen a los fosfolípidos como sustratos,
cada enzima tiene la capacidad de escindir un enlace éster específico, por lo tanto, las
letras de calificación, como A, B, C y D, se usan para diferenciar entre las fosfolipasas
y para indicar el enlace específico dirigido en la molécula de fosfolípidos (90).
Es importante enfatizar que en relación con C. albicans, las especies no albicans

secretan cantidades significativamente menores de fosfolipasa y se han reportado
estudios en los cuales se informa un aumento en su producción en aislamientos
recuperados de sangre en comparación con aislamientos comensales (91). Además de
las funciones ya descritas, los productos derivados de lípidos generados por las
fosfolipasas que actúan sobre los fosfolípidos de las membranas de las células del
hospedero tiene otras funciones como la mediación en la traducciones de señales y
activación de proteínas quinasa (87, 92, 93).De igual manera se ha descrito que la
expresión génica de enzimas hidrolíticas como PLB3 y SAP5 son reguladas
positivamente en la formación de biopelículas, lo que sugiere que esta regulación de
23
enzimas le puede conferir mayor capacidad de invadir y por consiguiente ser mas
virulenta (94).
La capacidad de los patógenos para obtener hierro es fundamental para la supervivencia

y persistencia en el hospedero, sin embargo, su disponibilidad en éste es limitada debido
a que se encuentra asociada con proteínas del hospedero, como la hemoglobina, entre
otras (95,96). La producción de hemolisina es un factor de virulencia importante en la
patogénesis de Candida, la secreción de hemolisina, seguida de la adquisición de hierro,
facilita la invasión hifal en la diseminación, se ha observado que éstas presentan mayor
actividad hemolítica que las células levaduriformes, por lo anterior este factor permite
degradar los eritrocitos del hospedero y tomar de la hemoglobina el hierro para usarlo
en el crecimiento comensal y el metabolismo en casos de infecciones sistemáticas y
superficiales (97-99). Watanabe et al. en 1999 realizaron una caracterización del factor
hemolítico producido por C. albicans y describieron que este factor contiene residuos de
azucares (mananos) de la pared celular, y éstos se unen a una proteína llamada Banda
3 en la membrana de los eritrocitos, que hace que se de la disrupción de esta (100). Se
ha descrito que la actividad hemolítica es regulada por diferentes factores dentro de
estos encontramos, la disponibilidad de fuentes de carbono como la glucosa o manosa,
suplementos como la sangre o iones (CaCl 2), temperatura y periodos de incubación
(101-107). La capacidad hemolítica puede diferir entre las especies de Candida. En un
estudio realizado por Luo et al. en el 2001 se informó que C. albicans, C. dubliniensis,
C. kefyr y C. tropicalis tuvieron actividades hemolíticas más altas que las descritas por
Yigit et al. en el 2011 para las especies de C. glabrata, C. krusei y C. lusitaniae y por
Kumar et al. en el 2015 para C. auris (51, 108,109).
Los hongos poseen un tipo de interruptor morfogénico que les permite a las células
pasar de un tipo levaduriformes a pseudohifas o hifas verdaderas, lo cual pueden ser
activados por múltiples factores ambientales (temperatura, pH, como inanición de
nutrientes, entre otros) (110,111) y aunque no se conoce bien la capacidad de producir
hifas verdaderas de C. auris, se ha observado tres tipos celulares distintos: levadura
típica, levadura FC (filamentación-competente) y una forma filamentosa, siendo todos
estos tipos celulares hereditarios en términos de potencial de filamentación, donde
influyen de forma importante los cambios de temperatura (83) y por ende se estimulan
los cambios fenotípicos de la levadura; estas formaciones tubulares se han encontrado
asociadas a un retraso en la progresión del ciclo celular y la extensión posterior del
periodo de crecimiento apical, que indica una flexibilidad y adaptabilidad de esta
levadura, para realizar cambio morfológico durante diferentes fases de la infección
(112). Sin embargo, hasta el momento no se conocen bien los mecanismos implicados
24
en este proceso (113). Posteriormente se realizaron estudios acerca del estado
morfológico de C. auris y se distinguieron dos tipos de morfología celular que pueden
ser simples (individuales) o agregados y se ha sugerido que estas células agregadas se
forman debido a la reducción de la liberación de células hijas después de la gemación y
no por la floculación de las células individuales en gemación. La morfología celular
agregada tiene la capacidad de producir grandes agregados y mantenerlos tanto in-vivo
como in-vitro, sin embargo, los aislamientos con morfología simple (individual) han
exhibido mayor virulencia comparable con la virulencia de C. albicans. Estas
observaciones han arrogado hipótesis que la agregación puede estar relacionada a
resistencia a detergentes, luz ultravioleta y métodos de limpieza en general (114,115).
A partir de este estudio se dió base para evaluar una de las características principales
que puede conferirle el nombre de levadura infecciosa ya que tiene la capacidad de
sobrevivir y diseminarse en entornos nosocomiales (76) y esto podría deberse a la
capacidad de C. auris para formar estructuras organizadas (biopelículas), una forma de
crecimiento en comunidad en la que las células se encuentran unidas o agrupadas
protegidas por una matriz de glucano, y producción de matriz extracelular (ECM) que le
proporciona un andamio estructural para que se de la adhesión célula – célula, asi como
también con distintas superficies, además de brindarle una barrera entre las células de
la biopelícula y el entorno externo, que le confiere alto grado de resistencia (50). La
formación de estas biopelículas es un proceso multifacético: en la fase temprana se da
la adherencia de las células a una superficie, conformando una colonia pequeña (in vitro
11 h), esta adhesión involucra varias proteínas de la pared celular de
glucosilfosfatidilinositol (GPI), las adhesinas como lo son las ALS, HWP1, HWP2, Rbt1,
Eap1 y Ywp1 descritas para C. albicans y en general para hongos (116-119), estas
adhesinas están compuestas por un ancla GPI, un dominio de serina/treonina y un
dominio de unión a carbohidratos o péptidos, que van a unir las células tanto a las
células epiteliales como a otras comunidades microbianas, o superficies abióticas
uniéndose a aminoácidos específicos o residuos de azucares (120). Posteriormente se
da la fase intermedia en la cual las células se organizan y empiezan a producir y secretar
sustancias poliméricas extracelulares, compuestas por carbohidratos (glucosa y
hexosamina), proteínas, fosforo y ácido urónico, estas sustancias les van a permitir
madurar a una estructura tridimensional hidratada (biopelícula), que les confiere defensa
contra la fagocitosis y prevención de la difusión de fármacos (in vitro 12 a 30 h). Luego,
se da una maduración de la biopelícula donde se desarrolla unas capas gruesas de las
sustancias secretadas formando una red densa (in vitro 32-72 h). Finalmente llega la
fase de dispersión, donde se liberan las células hijas o nuevas para expandir la
colonización e infección (121). Estas estructuras organizadas contienen canales de
25
agua que rodean las micro colonias formadas, esta biopelícula le permite adherirse a
diferentes materiales bióticos y abióticos; sin embargo, para C. auris se ha observado
que estas son mucho mas delgadas y menos complejas que las de C. albicans,
observándose mayor producción en aislamientos invasivos en comparación con
aislamientos no invasivos (7,114,122-124).
Los microorganismos que conforman este tipo de comunidad muestran tasas de
crecimiento mas bajas y la capacidad de adherirse a muchos tipos de superficies les
permite formar biopelículas en dispositivos médicos (catéteres, prótesis, reemplazo de
articulaciones y hasta diferentes sitios anatómicos (oído, ingle, axila, manos, nariz) del
hospedero, uniendo estas biopelículas con una colonización persistente y potencian la
infección (125-127). Estudios más recientes han demostrado que esta capacidad de
formación de agregados puede ser inducida por concentraciones de algunos
antifúngicos, como equinocandinas y triazoles, como también otros atributos como las
manosil transferasas y oligopéptidos transportadores (12,57,128). Además de contribuir
con la resistencia a antifúngicos, se encuentra relacionada con altas tasas de morbilidad
y mortalidad (115, 129-133). A pesar de la falta de nutrientes, estas comunidades se
adaptan para sobrevivir tanto al calor como a los tratamientos de desinfección en
comparación con células plantónicas (134).
La capacidad de formación de biopelículas puede diferir dependiendo la especie de
Candida, en cuanto a su morfología, características de la matriz extracelular y su
resistencia antifúngica (135), como también de condiciones ambientales como los
sustratos (poliestireno, polimetilmetacrilato, cloruro de polivinilo, filtros cilíndricos de
celulosa, acrílico, materiales dentales) siendo más efectivos los materiales de silicona y
látex (136-140). Otro factor importante es la fuente de carbono que se encuentre
disponible como sacarosa, galactosa y glucosa siendo esta última la que mejores
resultados ha obtenido (141).
La formación de biopelículas se ha visto asociada con la resistencia a antifúngicos, y
esto se encuentra ligado a varios factores, primero por el aumento de la actividad
metabólica que se da en la fase temprana de desarrollo de la biopelícula y a la
adherencia celular (142). Otro factor es la secreción de sustancias poliméricas
extracelulares que impiden la difusión de los antifúngicos (135). Algunos estudios han
descrito que C. auris puede formar biopelículas comparables con C. albicans y que la
matriz extracelular de las biopelículas está compuesta por glucano y manano; también
se encontró relacionada con aislamientos provenientes de procesos de colonización y
su fenotipo prevalente fue agregados (143,144). Estudios realizados han demostrado
que la producción de matriz extracelular le brinda mayor protección contra los
antifúngicos, logrando atrapar del 50-90% del antifúngico, especialmente el fluconazol.
26
Por lo anterior, se ha propuesto que las biopelículas en C. auris podrían tener una
función ambiental que le permite sobrevivir y persistir en ambientes bióticos y abióticos
(plástico, acero) por largo tiempo, aproximadamente 6 meses, tolerando métodos de
desinfección, haciendo que estas estructuras se puedan regenerar con el tiempo,
dándose una regulación positiva de genes importantes en adherencia, formación de
biopelículas, matriz extracelular y resistencia a medicamentos, lo que hace que la
biopelícula sea parte fundamental del estilo de vida de C. auris (65,7,145-147).
El estrés producido por el microambiente del hospedero y la exposición a los
antifúngicos puede llevar a alteraciones en la pared celular de la levadura, un
componente indispensable en la homeostasis de las células fúngicas, abarcando el 40%
del volumen total de la célula, que forma un andamio con una variedad de proteínas y
componentes superficiales con carbohidratos fibrosos que interactúa directamente con
el ambiente (148,149). La pared celular contiene dos capas: una interna y otra externa:
la interna es el componente estructural de la pared que soporta la presión hidrostática
interna ejercida por el citoplasma y la membrana, esta capa esta compuesta por quitina
y glucano. La capa externa esta compuesta por glicoproteínas manosiladas (148). Estas
alteraciones se han visto relacionadas con la resistencia a los medicamentos impidiendo
que los antígenos de la pared celular hagan reconocimiento inmunitario por parte del
hospedero impidiendo así la fagocitosis (150,151) como también las modificaciones
genéticas que se basan en aquellas que cambian el objetivo del antifúngico, activan la
salida de este e influyen en los mecanismos que causan la resistencia de los cuales aún
se conoce muy poco (9,57,152-155).
Los mecanismos implicados en la tolerancia de concentraciones de antifúngicos de C.
auris, parece ser análogo al descrito para C. albicans, para la resistencia a los azoles:
primero ocurre una sobreexpresión de las bombas de eflujo MFS y ABC; estas bombas
son proteínas que transportan diferentes moléculas a través de la membrana celular,
como lo es la salida de antifúngicos de la célula. Existen dos familias de bombas de
eflujo asociadas a la resistencia: el transportador de unión ATP (ABC) y transportadores
de superfamilias facilitadoras MFS. Estudios realizados han mostrado que C. auris
puede expresar genes ortólogos a los transportadores ABC y MFS de C. albicans
(12,56,94,156,157-159). Otro mecanismo de resistencia, son las mutaciones puntuales
en ERG11, este gen codifica la enzima lanosterol 14-alfa-desmetilasa (LD) que sintetiza
el ergosterol, que es un componente fundamental de la membrana celular; esta enzima
LD es el blanco principal de los azoles que tienen como función inhibir esta enzima y
por tanto no hay biosíntesis del ergosterol, afectando la integridad de la membrana
(160,161).
27
Estudios realizados con C. auris han descrito mutaciones del ERG11 (Y132F o K143R)
descritas ya para otras especies de Candida (154,162).
En relación con el mecanismo de resistencia a las equinocandinas, este antifúngico esta
dirigido a inhibir la enzima beta (1,3) D-glucano sintasa codificada por los genes FKS1
y FKS2, estos genes sintetizan la beta (1,3) D-glucano que es un componente
importante de la pared celular (163). Para C. auris también se han encontrado
mutaciones en estos dos genes FKS1 y FKS2 y fueron nombrados “puntos calientes”
(HS1 y HS2); estas mutaciones se han encontrado en los aminoácidos S639F, S639Y y
S639P (38,154). Finalmente, los mecanismos de resistencia a los polienos son 5 SNP
en diferentes loci genómicos asociados con la susceptibilidad, estos antifúngicos están
dirigidos a las moléculas de ergosterol de la membrana citoplasmática, afectando la
permeabilidad de la membrana al formar poros multiméricos que causan daño oxidativo.
El conocimiento acerca de la resistencia a los antifúngicos es importante para que se
realice un diagnóstico adecuado y oportuno después de la identificación de especies y
poder brindar un seguimiento durante su respectivo tratamiento, tanto para seleccionar
y adaptar los tratamientos que sean los más efectivos y poder contrarrestar esta
resistencia que se esta observando (164).
Debido a esto y a causa de la preocupación por la multi-drogo resistencia (MDR), y
aunque no se han reportado puntos de corte específicamente para especies de C. auris,
el CDC ha establecido algunos puntos de corte tentativos teniendo en cuenta la
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) para otras especies del género relacionadas con
esta levadura. Adicionalmente se ha observado en diferentes países como en Canadá,
Colombia, Venezuela, India y Reino Unido, entre otros, una resistencia a uno o varios
antifúngicos, como se observa en la tabla 2 (8,165).
Tabla 2 Puntos de corte tentativos establecidos por el CDC para C. auris con las
diferentes clases de antifúngicos (azoles, polienos y equinocandinas) y la resistencia
presentada en algunos países.
Puntos
de cortes
Clase de Reino
tentativos Comentarios Canadá Colombia Venezuela India
medicamento Unido
CIM
(ug/mL)
Azoles
32 La concentración inhibitoria 128 16 y 64 64 g/ml 4 y 64 8 y 64
Fluconazol mínima (CIM) para g/ml g/ml g/ml g/ml
fluconazol entre los
28
aislamientos evaluados en
el CDC fue ≥256; Se
demostró que los
aislamientos con CIM ≥32
tenían una mutación de
resistencia en el gen Erg11,
por lo que es poco probable
que respondan al
fluconazol.
Polienos
2 El análisis farmacocinético / 2 g/ml 8 y 16 2 g/ml 0,125 y
farmacodinámico reciente g/ml 8 g/ml
de C. auris en un modelo de
infección en ratones indica
que, bajo la dosis estándar,
el punto de corte para la
anfotericina B debe ser 1 o
1.5, similar a lo que se ha
determinado para otras
Anfotericina B
especies de Candida. Por lo
tanto, los aislamientos con
un CIM de ≥2 ahora deben
considerarse resistentes. Si
se usa E-test para
anfotericina B y se
determina un CIM de 1.5,
ese valor debe redondearse
a 2.
Equinocandinas
4 Los puntos de corte 0,015 y
tentativos se basan en la 8 g/ml
distribución modal de las
Anidulafungina CIM de equinocandina de
aproximadamente 100
aislamientos de diversas
ubicaciones geográficas.
Caspofungina 2
Micafungina 4
CDC (2017)
29
Modelo in vivo para la determinación de la virulencia en aislamientos de C. auris
Para la evaluación de patogenicidad de C. auris de han utilizado diferentes modelos in

vivo, y teniendo en cuenta que muchos de los patógenos fúngicos afectan
especialmente personas inmunosuprimidas es necesario evaluar estas interacciones
hospedero-patógeno en modelos que permitan imitar estas situaciones de la vida real:
se han utilizado modelos murinos que han sido los más utilizados para investigación; en
los últimos años se han realizado algunos estudios para evaluar la patogenicidad de C.
auris, observándose que la supervivencia depende de la cepa y que puede ser afectada
por la variabilidad genética que pueda tener cada aislamiento según su origen
geográfico, igual a lo visto con el modelo invertebrado Galleria mellonella (28,156,
166,167) y el modelo con peces (Danio rerio). Estos modelos tienen una ventaja sobre
otros ya que comparten una estructura anatómica, fisiológica, genética e inmune muy
parecidas con los mamíferos; aunque no se han realizado muchos ensayos con C. auris,
se han reportado estudios con otros hongos patógenos como especies de Candida,
Cryptococcus y Aspergillus (168,169). Modelos invertebrados como G. mellonella no
tienen implicaciones éticas para su manejo, es de fácil manipulación, no necesita de
equipos técnicos, se puede suministrar concentraciones de inóculos específicos, puede
sobrevivir a altas temperaturas y comparte moléculas del sistema inmune innato
comparable con la de los mamíferos (170,171). Borman y colaboradores utilizaron este
modelo para evaluar diferentes estados de morfología (simples o agregadas) (115), en
este tipo de modelo se ha observado que la patogenicidad entre C. auris y C. albicans
es bastante similar; sin embargo, las condiciones en cuanto a concentraciones no han
sido iguales (114). Sheehan y Kavanagh observaron que las larvas tienen dos
respuestas contra la infección de C. albicans, una respuesta celular inicial durante las
primeras seis horas dada por liberación de péptidos antimicrobianos y hemocitos
(enocitoides) que contiene fenoloxidasa participando en procesos de melanización y una
respuesta tardía especifica dirigida por hemocitos, en la cual se da una respuesta
exacerbada de estas células inmunes que finalmente causan la muerte de la larva de
G. mellonella, pero hasta el momento no se conoce con respecto a C. auris (170,172).
Otro modelo es la mosca Drosophila melanogaster una limitación de este modelo es la
respuesta inmune, específicamente la tasa de fagocitosis tan baja, con deficiencia en
T1 (65), un estudio realizado en el 2019 con cuatro aislamientos de C. auris provenientes
de los cuatro clados geográficos, demostraron que estos eran más virulentos que C.
albicans, sin encontrar asociación entre el estado de morfología (simple o agregado)
(173,174). Recientemente se ha incluido un nuevo modelo porcino donde infectaron la
piel y se observó una proliferación celular de C. auris y formación de biopelículas
30
multicapas (78). El uso de estos modelos in vivo para el estudio de infecciones fúngicas
y en especial de C. auris, ha brindado información relevante sobre la virulencia y
patogenicidad de esta levadura, aunque aún se necesitan muchos más estudios que
mejoren nuestro conocimiento sobre los factores que incluyen en la patogenicidad en el
hospedero, procesos biológicos y vías de señalización implicadas en ésta.
El control de esta levadura necesita mayor conocimiento de su biología, de la
implementación de una vigilancia activa, en la cual se pueda realizar una identificación
oportuna, con el inicio de un tratamiento óptimo y con la implementación de medidas de
control y prevención, así como educación en colaboración como equipos
multidisciplinarios.
El estudio de los factores asociados con la virulencia de las especies de C. auris ha sido
muy poco abordado en Colombia, siendo un tema de gran relevancia, teniendo en
cuenta que la patogenicidad de las diferentes especies está relacionada con la
combinación de estos factores activados por el ambiente que contribuyen con su
virulencia y que se han reportado en otros países y anteriormente descritos, como la
gemación, la capacidad de existir como agregados o células no agregadas, la
adherencia, producción de ciertas enzimas (proteinasas, fosfolipasas y hemolisina) y
quinasas codificadas por genes Hog1 importantes para invadir e infectar al hospedero,
formación de estructuras filamentosas, la formación de biopelículas, la colonización y
trasmisión en centros de salud, así como el estudio de la virulencia de los aislamientos
en modelos in-vivo, que permiten acercarnos al entendimiento del comportamiento de
esta levadura en el hospedero, como lo ha sido el uso de modelo invertebrado G.
mellonella. Adicionalmente, es importante determinar los perfiles de susceptibilidad a
los diferentes antifúngicos, como al establecimiento de una posible asociación entre la
evolución clínica del paciente y ciertos determinantes de virulencia de la levadura
(9,60,73,114,123,175-180).
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la expresión in-vitro de factores asociados con la virulencia, la patogenicidad in-

vivo en el modelo invertebrado Galleria mellonella, la susceptibilidad antifúngica de
aislamientos clínicos (asociados con colonizaciones e infecciones) de la levadura
emergente Candida auris, recuperados durante el período 2016-2018 en dos
departamentos de Colombia, y determinar su relación con la evolución clínica del
paciente.
31
4.1.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS
4.1.1.1 Determinar la presencia de células en estado agregado o simple en aislamientos

de C. auris provenientes de procesos invasivos y de colonización.
4.1.1.2 Determinar la expresión in-vitro de la actividad enzimática (proteasa, fosfolipasa,

hemolisina), la capacidad de adherencia y la formación de biopelículas de
aislamientos clínicos de C. auris provenientes de infecciones invasivas y de
procesos de colonización.
4.1.1.3 Evaluar la patogenicidad de aislamientos clínicos colombianos de C. auris

provenientes de infecciones invasivas y de procesos de colonización en el
modelo invertebrado de Galleria mellonella.
4.1.1.4 Determinar el perfil de susceptibilidad de aislamientos clínicos colombianos de

C. auris provenientes de infecciones invasivas y de procesos de colonización.
4.1.1.5 Determinar si existe asociación entre la expresión de los diferentes factores

contribuyentes con la virulencia y la susceptibilidad antifúngica de C. auris, y su
relación con la evolución clínica del paciente.
5. METODOLOGIA
5.1 Diseño metodológico
Estudio de corte transversal. Los aislamientos clínicos invasivos de C. auris se

seleccionaron de la colección del Grupo de Microbiología del INS, recibidos durante los
años 2016-2018, recuperados a partir de procesos de infección y colonización,
provenientes de 5 instituciones médicas de dos departamentos del país; Valledupar,
Cesar: Clínica Laura Daniela (CLD), Clínica Médicos S.A. (CM), Clínica Santa Isabel
Ltda. (CSI), Clínica Erasmo (CE), y de una institución ubicada en la ciudad de
Cartagena, Bolívar: Fundación UCI Doña Pilar (FUDP), de pacientes con datos de
evolución clínica (tabla 3), que se recopilaron a través de una encuesta (Anexo 1). Se
determinaron características fenotípicas asociadas con la virulencia, patogenicidad en
un modelo invertebrado y susceptibilidad a un grupo de antifúngicos. Con lo anterior, se
analizó si existen diferencias en la expresión y características de los aislamientos
provenientes de procesos de colonización e invasivos, así como su relación con el
desenlace del paciente. Los aislamientos fueron conservados en criopreservación en
32
viales con glicerol al 10% almacenados a – 70 °C, en los biobancos del Grupo de
Microbiología del INS.
Tabla 3 Aislamientos clínicos de Candida auris recuperados en dos departamentos de

Colombia 2016-2018, provenientes de procesos invasivos y colonización.
Procedencia Infección invasiva Colonización Total

Valledupar 31 27 58
Cartagena 26 23 49
Total 57 50 107
5.2 Criterios de inclusión y exclusión
5.2.1 Inclusión
5.2.1.1 Infección invasiva: aislamientos recuperados de hemocultivo o líquidos

estériles, identificados como C. auris por MALDI-TOF o PCR.
5.2.1.2 Colonización: aislamientos provenientes de muestras positivas para C.
auris recuperadas de sitios anatómicos como manos, ingle, axila, nariz,
oído, boca, recto.
5.2.2 Exclusión
5.2.2.1 Infección invasiva: muestras de pacientes que se encuentraban

contaminadas o que no fueron confirmadas como C. auris mediante PCR
o MALDI-TOF.
5.2.2.2 Colonización: muestras de pacientes en las cuales no se haya
recuperado C. auris.
5.3 Consideraciones éticas
Los proyectos de investigación en el campo de la salud humana, o aquellos en los que

haya experimentación con animales, deberán ajustarse a las Normas Científicas,
Técnicas y Administrativas para la Investigación en Salud establecidas en la
Resolución No. 008430 de 1993 del Ministerio de Salud y considerar de manera
especial los aspectos éticos involucrados, Título II, de la investigación en seres
33
humanos, y Título V, la investigación biomédica con animales. En el caso de
organismos genéticamente modificados, el proyecto deberá acogerse a la regulación
vigente sobre bioseguridad.
Este proyecto no requiere ningún tipo de experimentación en animales vertebrados o
humanos, ni conllevará la utilización de organismos modificados genéticamente, sin
embargo, se usaron muestras clínicas de pacientes de las cuales contamos con
consentimiento informado de acuerdo con lo que dispone la ley. Las larvas fueron
mantenidas en el Grupo de Microbiología debido a que no existe un protocolo de manejo
de invertebrados en el bioterio del Instituto Nacional de Salud. Sin embargo, los
investigadores somos conocedores de la declaración universal de los derechos de los
animales proclamada por la liga internacional de derechos del animal (Ginebra, Suzia,
1989), y los principios éticos de la experimentación animal enunciados por ICLAS
(International Council for Laboratory Animal Science) (Biomédica 1997; 17(4):325).
El manejo, procesamiento, almacenamiento y eliminación, tanto de las muestras como
de los elementos, material biológico y reactivos empleados durante la ejecución de las
metodologías cumplían con las normas establecidas en los protocolos de bioseguridad
de cada los laboratorios del INS y de las instituciones involucradas de manera directa e
indirecta en esta investigación. El manejo de los animales de experimentación se hizo
siguiendo las normas establecidas por las leyes colombianas y las leyes internacionales
anteriormente descritas en las consideraciones éticas.
Los aislamientos clínicos fueron recolectados en el marco de la vigilancia nacional de

C. auris en Colombia, liderada por el INS. El formato de recolección de datos de los
pacientes fue diligenciado por personal de salud en cada institución, mediante la revisión
de la historia clínica. Este proyecto hace parte de un macroproyecto que fue avalado por
el comité ético del INS (Anexo 2).
En relación, al uso de los datos y muestras de los pacientes dentro del proyecto se utilizó
el formato de consentimiento informado descrito en el anexo (Anexo 3).
5.4 Evaluación morfológica
Se evaluó el tipo de morfología, simple (células individuales) o agregada (células que

se encuentren en grupos), mediante visualización en microscopio en campo claro con
el objetivo 40x, empleando una preparación con agua destilada estéril entre lámina y
laminilla, para evaluar si existía una relación entre el tipo de morfología y la virulencia
de C. auris.
34
5.5 Actividad enzimática
5.5.1 Proteasas y fosfolipasas
La producción de proteasas y fosfolipasas se evaluó según los protocolos de Leone et

al., (181) y Price et al., (86), respectivamente.
Para la producción de proteasas se inició con un cultivo en agar glucosado de
Sabouraud que se incubó durante 72 horas a 27 °C para preparar una suspensión en
solución salina al 0,85% ajustada de forma visual al patrón 3 de la escala de McFarland.
Se inocularon 5 L de la suspensión de la levadura ajustada en agar Base Carbón
Levadura (YCB) suplementado con albúmina sérica bovina y polipeptona. Se incubó a
37 °C durante 10 días. Posteriormente se delimitó el diámetro de la colonia y se adicionó
5 mL de ácido tricloroacético, se dejó reposar durante una hora, se descartó el ácido y
se lavó con agua destilada para luego adicionar 5 mL de azul brillante de coomassie.
Finalmente se decoloró para observar un halo de hidrolisis alrededor de la colonia que
nos indicaría la actividad proteasa (181).
Para la determinación de la actividad de fosfolipasas se empleó la misma metodología
anteriormente descrita usando agar suplementado con yema de huevo en lugar de agar
YCB suplementado (86).
La visualización de la actividad de la fosfolipasa se evidenció mediante halos

precipitados con los valores mencionados de Pz (86).
Para todos los ensayos se utilizaron cepas de referencias de C. albicans debido a que
hasta el momento no se cuenta con cepas de referencia para C. auris, por lo tanto, en
los estudios desarrollados con C. auris se compararon con cepas de otras especies de
Candida, en especial C. albicans, que es la especie mejor caracterizada. En estos
ensayos se empleó la cepa ATCC 90028 de C. albicans como control positivo de cada
ensayo, así como las siguientes cepas de Cryptococcus neoformans: C. neoformans
(H0058-I-550) de actividad alta y C. gattii (H0058-I-755) de actividad baja para
fosfolipasas y Cryptococcus neoformans: C. neoformans (H0058-I-743) de actividad
media y C. gattii (H0058-I-860) de actividad baja para proteasas (86).
35
5.5.2 Hemolisina
La actividad de esta enzima se determinó en agar Sabouraud Dextrosa Agar con 3% de

glucosa y 7% de sangre de cordero. Se preparó un inóculo de cada aislamiento a una
concentración de 108 células/mL, el cual fue sembrado en el medio. Las cajas se
incubaron a 37 ºC en una atmosfera de 5% de CO 2 durante 48 horas. El radio del
diámetro de la colonia con respecto al diámetro de la zona translucida de la hemolisis
(en mm) fue empleado como el índice de hemolisis (Hz). Como cepas control se
emplearon las cepas referencia de C. albicans ATCC 90028 y C. parapsilosis ATCC
22019. Adicionalmente, se emplearon cepas de Streptococcus pneumoniae como
control de beta y alfa hemolisis (182).
5.6 Formación de biopelículas
Para cada aislamiento de C. auris se cuantificó la biomasa de biopelícula formada.

Brevemente, se sembraron los aislamientos en agar Sabouraud por 24 horas a 30 ºC,
luego se tomó una asada y se puso en crecimiento en 20 mL de caldo Destroxa Peptona
Levadura YEPD líquido, se incubó toda la noche en un agitador (150-180 rpm) a 30 ºC,
posteriormente se centrifugó (3000g por 5 min a 4 ºC), se removió el sobrenadante y el
pellet se lavó con PBS 1X, se centrifugó nuevamente y el pellet se suspendió en RPMI
previamente calentado a 37 ºC, se ajustó a una concentración de 1 x106 células/ml y se
adicionó a micro placas de 96 pozos de fondo plano, las cuales se incubaron a 37 ºC
durante 72 horas, después de lo cual se eliminó con cuidado el medio; se realizaron dos
lavados de la placa con PBS, luego se adicionaron100 L de (2,3-bis (2-metoxi-4- nitro-
5-sulfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilida) XTT/menadiona a cada pozo y se cubrió con
papel aluminio la placa, se incubó a 37 ºC por 3 horas, y finalmente se transfirió a una
nueva micro placa 80l de solución de cada pozo y se cuantificó a una DO490nm; se
determinaron los valores de absorbancia los cuales son proporcionales a la cantidad de
biomasa presente en la placa (114,183-185). Se utilizó como cepa de referencia la
SC5314 C. albicans, como cepa formadora de biopelícula. Adicionalmente, se hizo la
evaluación de la capacidad de disgregación de las biopelículas de C. auris formadas
sobre las microplacas anteriormente descritas para establecer el efecto de los agentes
antifúngicos contra las células de las biopelículas. Brevemente, después de la formación
de la biopelícula sobre la microplaca incubadas por 72 horas a 37 ºC, se adicionaron
diluciones seriadas de fluconazol, voriconazol, anidulafungina y anfotericina B y las
placas se incubaron durante 24 horas a 37 ºC. La determinación de la CIM de cada
aislamiento se hizo empleando el ensayo de reducción con XTT/menadiona para lo cual
36
se lavaron los pozos 2 veces con PBS 1X, se adicionaron 100l del XTT/menadiona; se
cubrió con papel aluminio la placa, se incubó a 37 ºC por 3 horas, y finalmente se
transfirió a una nueva microplaca 80L de solución de cada pozo y se cuantificó a una
DO490nm (183).
5.7 Ensayos de adherencia
La adhesión de cada cepa de C. auris fue evaluada empleando un material de silicona

empleado rutinariamente en la fabricación de los catéteres. Para determinar la habilidad
de cada aislamiento para adherirse a las superficies, se seguieron los protocolos
descritos por Al-Fouzan AF et al., (175). Brevemente, la cepa fue cultivada en 10 mL de
caldo Sabouraud y se incubó toda la noche en un agitador (150 rpm) a 37 ºC;
posteriormente se ajustó un inoculo a 1.3x107 células/ml por espectrofotometría a una
DO540nm a una absorbancia de 0.5, luego se le adicionaron 4 discos de silicona (0,3mm)
y se incubó durante 90 minutos a 37 ºC y 75 rpm, los discos se transfirieron a un nuevo
tubo, donde se le realizaron 3 lavados con PBS 1X, y se hicieron diluciones 1:100 y 1:10,
para llegar a una dilución de 1.3 x 10 4 células/mL; de esta última se sembraron 100 L
en agar Sabouraud, las placas se incubaron a 37 ºC y se realizó el conteo de unidades
formadoras de colonia para C. auris. Para la verificación de la adherencia de C. auris en
los discos de catéter se realizaron 2 lavados de los discos con PBS 1X y se sembraron
en agar Sabouraud (175). Se utilizó como cepa de referencia la SC5314 C. albicans.
5.8 Susceptibilidad antifúngica
Se implementó la técnica de microdilución en caldo para determinar la CMI de los

ailsmaintos de C. auris en placas previamente sensibilizadas con fluconazol (FCZ),
anidulafungina (AND), anfotericina B (AmB) y voriconazol (VOR), en placas de 96 pozos
con medio RPMI, siguiendo los protocolos establecidos por el CLSI(M27A3) (186).
Las concentraciones finales de los antifúngicos fueron las siguientes: 0,03 a 16 μg/mL
para AmB, AND y VOR, y de 0,125-64 μg/ml para FCZ. Se adicionaron a cada pocillo
un volumen de 100 μL de las concentraciones finales anteriormente mencionadas para
cada antifúngico teniendo en cuenta que la columna 1 corresponde a la mayor
concentración y la columna 10 corresponde a la menor concentración. La columna 11
corresponde a control de crecimiento (100 l de RPMI y 100 l de la cepa) y la columna
12 al control de esterilidad (200 l de RPMI) (Imagen 1 y 2).
37
Figura 1 Esquema de las concentraciones(g/mL) correspondientes de AND, AMB y
VOR en las placas.
Figura 2 Esquema de las concentraciones (g/ml) correspondientes de FCZ en las

placas.
Las suspensiones de inóculo (0,5 McFarland) se prepararon mediante el método

espectrofotométrico a 530 nm de longitud de onda estimando una transmitancia del 85%
y teniendo en cuenta que los aislamientos fueron repicados en agar Sabouraud y se
incubó a 35-37 ºC por 24 previamente. Se inocularon del pozo 1 al 11 con 100 L de la
cepa, el pozo 12 no llevará inóculo porque es el control de esterilidad del ensayo. Se
agitó durante 3 minutos y se incubó a 35-37 ºC por 24 h .
Las lecturas de la CIM en las placas se realizaron de la siguiente manera:
38
• Para AmB se leyó como la concentración más baja que completa la inhibición de
cualquier crecimiento perceptible (100%).
• Para FCZ, AND y VOR se leyó como la concentración más baja que inhibe el 50% del
crecimiento en comparación con el control de crecimiento.
Se utilizaron dos cepas de referencia como controles, C. krusei (ATCC 6258) y C.

parapsilopsis (ATCC 22019).
5.9 Patogenicidad de C. auris en modelo invertebrado G. mellonella
La determinación de la patogenicidad se realizó para todos los aislamientos de C. auris

incluidos en este estudio, tanto aquellos recuperados de procesos invasivos, como los
asociados a procesos de colonización.
5.9.1 Selección de las larvas
Los criterios de selección fueron larvas sin ningún tipo de marcas ni coloración de la
cutícula, ya que pueden indicar larvas infectadas por hongos u otros microorganismos,
además, se escogieron larvas de últimos estadios (quinto y sexto) con un peso entre
250mg a 400mg y una longitud de aproximadamente 2 cm.
5.9.2 Preparación del inóculo
La metodología se desarrolló según parámetros establecidos por Fuchs et al., (187).
5.9.2.1 Se inició con un cultivo de los aislamientos sembrados en agar

Sabouraud por 24h a 30 ºC, se realizó una suspensión en PBS 1X, a una
concentración de 1x108 células/mL.
5.9.2.2 La concentración se ajustó en cámara de Neubauer.
5.9.2.3 La viabilidad del inóculo se evaluó mediante diluciones seriadas en base
10, en agar glucosado de Sabouraud y contando las UFC después de 3
días de incubación a 30 ºC.
5.9.3 Inoculación del patógeno
39
5.9.3.1 Se seleccionaron 10 larvas para la inoculación exponiendo su parte
ventral.
5.9.3.2 Las larvas fueron desinfectadas con hipoclorito al 0.1%.
5.9.3.3 Se tomaron 10 μL del inóculo y se inyectó directamente en el hemocele
de la larva a través de la última pro-pata izquierda con el empleo de una
jeringa Hamilton calibre 26 con capacidad de 10μL o con jeringa de
insulina calibre 29 estéril.
5.9.3.4 Las larvas se incubaron en placas de Petri a 37 ºC durante 10-15 días y
fueron revisadas diariamente para evaluar supervivencia mediante
estímulos físicos. Las larvas muertas se eliminaron de la caja de Petri y
se registró su muerte.
5.9.4 Grupos control de virulencia
5.9.4.1 Grupos de 10 larvas se inocularon con la cepa control de C. albicans

SC5314 (alta patogenicidad) (188).
5.9.5 Grupos control del modelo
5.9.5.1 Control de calidad: un grupo de 10 larvas se incubó sin realizarles ningún

tipo de intervención.
5.9.5.2 Control desinfección: un grupo de 10 larvas se desinfectó y se incubó
para su seguimiento.
5.9.5.3 Control inoculación: un grupo de 10 larvas se inoculó con PBS para vigilar
efectos de trauma o lesión generados tras la inoculación.
Cada experimentó se realizó por triplicado.
Las curvas de supervivencia de las larvas se analizaron por GraphPad Prism versión
6.0 empleando la prueba Logrank, Gehan-Breslow-Wilcoxon.
5.10 Asociación de factores de virulencia con patogenicidad y evolución

pacientes.
Los resultados de las pruebas fenotípicas de los aislamientos al igual que los resultados
de patogenicidad en el modelo invertebrado fueron comparados con los datos de
evolución de los pacientes (desenlace) y se estableció si existen diferencias en su
40
expresión. Para cumplir con este objetivo se aplicó el formato de recolección de datos
de Evolución de pacientes con infección por C. auris, en la cual se incluyen los datos
demográficos del paciente, diagnóstico, factores clínicos y desenlace (fallecimiento)
(Anexo 1).
5.11 Análisis estadístico
La recolección de los datos se realizó en el programa Excel ® Microsoft Corporation; el

análisis estadístico se realizó con el software Stata versión 11.0, las variables numéricas
se desarrollaron mediante medidas de tendencia central, se uso la prueba de Chi
cuadrado y/o prueba exacta de Fisher para variables categóricas, con un nivel de
confianza del 95%, los datos descriptivos se presentaron en forma de tablas de
frecuencias y porcentajes para las variables cualitativas, y medias, desviación estándar,
mediana y rango para las variables cuantitativas. El análisis de supervivencia se realizó
mediante GraphPad Prism para el modelo invertebrado G. mellonella. Se empleó un
modelo de regresión múltiple para comparar las características sociodemográficas,
clínicas y estudios de biología celular, se evaluaron con las variables independientes en
aquellas que hayan resultado estadísticamente significativas, se utilizó el método de
Backward para el ingreso de las variables al modelo de predicción.
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Objetivo específico Nº 1:
Determinar la presencia de células en estado agregado o simple en aislamientos

de C. auris provenientes de procesos invasivos y de colonización.
De un total de 107 aislamientos de C. auris, 57 aislamientos fueron recuperados de

procesos invasivos y 50 aislamientos fueron recuperados de procesos de colonización,
en dos departamentos, Valledupar y Cartagena, entre los periodos 2016-2018 (tabla 3).
El tipo de morfología más prevalente en los dos procesos tanto invasivo como
colonizado fue morfología simple (individual) (Figura 4). Del 53,3% (57/107) del total de
los aislamientos de C. auris que correspondían a procesos invasivos; 37,4% (40/57) de
los aislamientos tuvieron un tipo de morfología simple (individual) y 15,9% (17/57) de los
aislamientos un tipo de morfología agregada. En cuanto al 46,7% (50/107) del total de
aislamientos provenientes de procesos de colonización, 64% (32/50) de los aislamientos
tuvieron morfología simple (individual), siendo los sitios anatómicos donde más se
41
recuperó C. auris la nariz y los oídos con el 16% (8/50) respectivamente, seguido de
ingle con el 12% (6/50), boca con el 8% (4/50), axila con el 6% (3/50) y sin dato 3
aislamientos 6% (n=3). Por otro lado, el 36% (18/50) de los aislamientos tuvieron
morfología agregada, siendo los sitios anatómicos de mayor recuperación C. auris los
oídos con un 10% (5/50), seguido de axila, boca y nariz con el 6% (3/50) cada uno, ingle
con el 4% (2/50) y recto con el 2% (1/50), sin dato 1 aislamiento 2% . Sin embargo, la
relación entre tipo de proceso (invasivo o colonizado) y tipo de morfología (simple o
agregadas) no fue estadísticamente significativo P=0,497.
Figura 3 Tipo de morfología de aislamientos de C. auris: (A) morfología agregada (B)

morfología simple o individual.
A B
(A) Morfología agregada: células en grandes grupos. (B) Morfología simple: células individuales.
En los últimos años se ha incrementado considerablemente el interés por el

conocimiento de los factores y mecanismos de virulencia de Candida, especialmente C.
auris, con el objetivo de dar respuesta al creciente número de infecciones provocadas
por esta especie en todo el mundo. C. auris como otras especies de Candida, también
puede tener diferentes fenotipos morfológicos (28, 60, 83, 189), aunque las funciones
de cada morfología y sus mecanismos de regulación aún son en gran medida
desconocidos. Una observación interesante que se presentó en algunos de los
aislamientos de C. auris provenientes tanto de procesos invasivos como de procesos de
colonización fue su crecimiento en grupos (agregados); que hace referencia a que se
produce un proceso de gemación pero las células hijas no pueden ser liberadas, lo que
hace que se formen grandes agregados que son difíciles de alterar de forma in vitro, lo
que concuerda con lo observado por Borman y colaboradores en el estudio realizado en
42
el 2016, en el cual compararon la patogenicidad de aislamientos de C. auris con otras
especies de Candidas observando estos dos tipos de morfologías (115).
4.1.1.6 Determinar la expresión in-vitro de la actividad enzimática (proteasa, fosfolipasa,

hemolisina), la capacidad de adherencia y la formación de biopelículas de
aislamientos clínicos de C. auris provenientes de infecciones invasivas y de
procesos de colonización.
Actividad enzimática: Proteasas

De los 107 aislamientos de C. auris en los cuales se evaluó la actividad enzimática de
proteasas se observó que el 100% presento algún tipo de actividad, donde el 57,9%
(n=62) presentaron una actividad enzimática media; del cual el 51,6% (n=32) eran de
procesos invasivos y 48,4% (n=30) de procesos de colonización; el 36,4% (n=39)
actividad baja; siendo el 56,4% (n=22) de procesos invasivos y 43,6% (n=17) de
procesos de colonización, y solo el 5,6% (n=6) presentó un actividad alta; donde se
observó el mismo porcentaje tanto para procesos invasivos como de colonización, con
un 50% (n=3) (Figura 5A, tabla 4), lo cual no fue estadísticamente significativo P=0.883.
Actividad enzimática: Fosfolipasas

De los 107 aislamientos de C. auris evaluados en la actividad enzimática de fosfolipasas
se observó que el 67,3% (n=72) presento algún tipo de actividad (baja-media-alta),
donde el 95,8% (n=69) presentaron una actividad enzimática baja; del cual el 52,2%
(n=36) eran de procesos invasivos y 47,8% (n=33) de procesos de colonización, el 1,9%
(n=2) actividad media provenientes de procesos de colonización y solo el 0,9% presentó
una actividad alta que eran provenientes de procesos de colonización (Figura 5B, tabla
4). Sin embargo, esto no fue estadísticamente significativo P=0,252.
Actividad enzimática: Hemolisina

De los 107 aislamientos de C. auris evaluados con respecto a la actividad enzimática de
hemolisina se observó que solo el 68,2% (n=73) presentó algún tipo de actividad (baja-
media-alta), donde el 54,8% (n=40) presentaron una actividad enzimática baja; del cual
el 50% (n=20) eran de procesos invasivos y 50% (n=20) de procesos de colonización,
el 38,4% (n=28) actividad media; donde el 89,3% (n=25) eran de procesos de
colonización y el 10,7% (n=3) de procesos invasivos, y solo el 6,8% (n=5) presentó una
actividad alta provenientes de proceso de colonización (Figura 5C, tabla 4). Se encontró
43
relación entre los aislamientos provenientes de procesos de colonización y presentar
actividad hemolítica, siendo estadísticamente significativo P=0.000.
Figura 4 Evaluación de enzimas extracelulares en aislamientos de C. auris. (A) actividad

enzimática hemolítica (B) actividad enzimática fosfolipasa (C) actividad enzimática
proteasa.
44
Tabla 4 Tipo de proceso, morfología, actividad enzimática y su relación de acuerdo al
origen de los 107 aislamientos de C. auris.
*Se determinaron los rangos de actividad enzimática con los valores del índice Pz= A/B (A= diámetro de la célula y B=
diámetro de la célula más la cápsula) de la siguiente forma: Pz = 1, actividad negativa; Pz = 0,7-0,99, baja actividad
enzimática; Pz= 0,5-0,69, actividad enzimática media, y Pz < 0,5, actividad enzimática alta.
Las enzimas juegan un papel importante en la patogenicidad de las levaduras porque

están involucradas en la destrucción de los tejidos del hospedero y proporcionan acceso
a los nutrientes para las levaduras, facilitando el proceso de colonización (98, 190). Es
así, como con el desarrollo de diferentes estudios ha logrado demostrar que C. auris es
similar a C. albicans y puede expresar diferentes enzimas entre esas las proteasas, para
degradar e invadir los tejidos del hospedero (28, 83). La secreción de fosfolipasa
extracelular en especies de Candida ha sido informada desde 1968 por Costa et al.
(191) y por Ghannoum en 2000 (87), quienes corroboraron su potencial en virulencia y
patogénesis fúngica. Nuestros resultados mostraron una actividad (fosfolipasas y
proteasas) similar tanto para aislamientos provenientes de procesos invasivos como de
procesos de colonización; en general, el 67,3% de los aislamientos tenían actividad de
fosfolipasa, lo cual se observó como resultado de la formación de un complejo de calcio
con ácidos grasos que son liberados por la acción de la fosfolipasa, indicando que C.
auris produce esta enzima hidrolítica en respuesta al estrés ambiental, que contribuye
a la supervivencia y éxito en la colonización e invasión de tejidos (192), demostrando
así su función como posible factor asociado a la virulencia. En 2018, Canela et al.
evaluaron la actividad enzimática de fosfolipasas, proteasas y hemolisinas de aislados
de pacientes en un hospital de Brasil con infección del torrente sanguíneo por diferentes
especies de Candida, y encontraron que C. albicans fue la única que presentó actividad
fosfolipasa, con un índice Pz = 0.48 ± 0,11, lo que indica una alta actividad de esta
enzima (193). Nuestros resultados reflejan una producción sustancial de proteasas
(100%), con una distribución comparable de los valores de proteasas dentro de los
grupos de virulencia y tipo de proceso. De hecho, como describen Subramaya et al.
(194), solo el 75% de los aislamientos de C. albicans tenían actividad proteinasa, con
solo el 30% para las especies de Candida no albicans; Gokce y col. (195) observaron
que el 89,7% de los aislamientos de C. albicans tenían actividad proteinasa, pero solo
el 25,8% de los aislamientos de Candida no albicans. En comparación con el estudio
realizado por Canela et al en 2018 (193), se observó una actividad proteolítica de C.
45
auris igual a la reportada para C. albicans (Pz = 0.51 ± 0.16), C. tropicalis (Pz = 0.78 ±
0.13) y C. parapsilosis (Pz = 0,91 ± 0,15), lo que demuestra que las aspartil proteasas
secretadas por Candida desempeñan un papel importante en la virulencia, ya que las
funciones de esta enzima pueden variar desde la simple absorción de nutrientes hasta
la digestión de las inmunoglobulinas del huésped y la resistencia del sistema
inmunológico (196-198). Nuestros resultados mostraron que la mayoría de los
aislamientos (68,22%) pueden degradar la hemoglobina mediante la lisis de los
eritrocitos para liberar hierro, que se utiliza para el crecimiento y el metabolismo en el
caso de infecciones sistémicas (199). Los aislamientos de C. auris de nuestro estudio
reflejaron una actividad hemolítica menor a la reportada para C. albicans, pero similar o
igual a la reportada para otras especies de Candida, según reportó Canela en 2018, así
como de otros estudios realizados con C. auris, lo que confirma su potencial como factor
de virulencia que influye en la patogenicidad (193). Finalmente se logró observar la
expresión de todas las enzimas extracelulares (fosfolipasas, proteasas) y hemolisina,
que como se mencionó anteriormente, cumplen funciones esenciales en la patología.
6.3 Capacidad de adherencia
El 100% de los aislamientos de C. auris presentaron capacidad de adherencia a material

siliconado, observándose mayor capacidad de adherencia en aislamientos provenientes
de procesos de colonización: en cuanto a los aislamientos provenientes de procesos
invasivos el 46% (26/57) tuvieron una capacidad leve (+), seguido de un 42% (24/57)
con una capacidad moderada (++) y un 12% (7/57) con una capacidad abundante (+++).
En relación con los aislamientos provenientes de procesos de colonización el 46%
(23/50) tuvieron una capacidad moderada (++), seguido de un 30% (15/50) con una
capacidad leve (+) y un 24% (12/50) con una capacidad abundante (+++) (Figura 6). Sin
embargo, no fue estadísticamente significativo el presentar algún grado de adherencia
con el tipo de proceso (invasivo o colonizado) P=0,146.
46
Figura 5 Capacidad de adherencia a material siliconado de los aislamientos de C. auris
(A) provenientes de procesos invasivos y (B) provenientes de procesos de colonización.
A B
*Capacidad de adherencia leve: bajo crecimiento; Capacidad de adherencia moderada: crecimiento medio; Capacidad
de adherencia abundante: crecimiento alta.
Se observó que todos los aislamientos de C. auris tienen la capacidad de adherirse al

elastómero de silicona, lo que concuerda con lo descrito por Mayer et al. y Sherry et al.
que refieren que C. auris está adaptada a la adherencia superficial, así como a los
dispositivos protésicos, incluidos los catéteres urinarios y los dispositivos
intravasculares (114, 200), sin embargo, los aislamientos provenientes de procesos de
colonización tuvieron mayor nivel de adherencia (moderado y abundante) en
comparación con los aislamientos provenientes de procesos invasivos. Esta capacidad
ha sido asociada a dos características únicas en C. auris como lo son la termo tolerancia
y la osmotolerancia que contribuyen a la persistencia y supervivencia de esta levadura
en diversas superficies durante largos periodos de tiempo, lo que puede contribuir a su
transmisión intrahospitalaria como se encontró en una UCI en un hospital del Reino
unido donde el uso frecuente de dispositivos de temperatura axilar se vió asociado con
la ocurrencia del brote dentro de las instalaciones (8, 66,132, 145).
6.4 Formación de biopeliculas
La actividad metabólica de las biopelículas de los aislamientos de C. auris evaluados

tuvieron un promedio en general de (DO490nm=0,116) con valores (DO490nm=0,003-0,990),
observándose mayor producción de biopelícula en los aislamientos provenientes de
procesos de colonización con un promedio de (DO 490nm=0,174) con valores
(DO490nm=0,003-0,990), resaltando los aislamientos H0059-13-696, H0059-13-723 y
47
H0059-13-725; en comparación con los aislamientos provenientes de procesos
invasivos con un promedio de (DO490nm=0,066) con valores (DO490nm=0,005-0,309) y con
respecto a la cepa control SC5314 (DO490nm= 0,520), aunque estos hallazgos no fueron
estadísticamente significativos P=0,061. Sin embargo, si se encontró una relación entre
la formación de biopelícula y la actividad enzimática hemolítica, fosfolipasas y proteasas
y esto fue estadísticamente significativo p=0,000, ésta última con un P=0,033. Los
resultados se presentan en la (Tabla 4, Figura 7A;7B y Figura 8).
Figura 7 Lecturas colorimétricas (valores de D.O. 490 nm) de ensayos de reducción

XTT de biopelículas formadas por C. auris (A) de procesos invasivos y (B) procesos de
colonización.
48
B
Figura 8 Actividad metabólica de las células dentro de la biopelícula formada por los
aislamientos de C. auris en función de la reducción XTT y la cepa control C. albicans,
provenientes de procesos invasivos y de colonización.
49
Con relación a la susceptibilidad de las biopelículas a las diferentes concentraciones de
los antifúngicos evaluados (anfotericina B, fluconazol, voriconazol y anidulafungina) en
las biopelículas preformadas por los aislamientos de C. auris tanto de procesos
invasivos como de procesos de colonización, se observó que para el caso de las
biopelículas que fueron expuestas a diferentes concentraciones de anfotericina B, el
crecimiento de la mayoría de los aislamientos en todas las concentraciones evaluadas
fue igual o menor al crecimiento control de cada aislamiento, observándose un
decrecimiento a medida que aumentaba la concentración de la anfotericina B; sin
embargo, hubo algunos aislamientos que tuvieron un crecimiento de 300 a 600 veces
más altas a su crecimiento normal, siendo más frecuente observar resistencia en las
biopelículas en aislamientos provenientes de procesos invasivos para todas las
concentraciones de anfotericina B, en los cuales se pueden resaltar dos aislamientos
que tuvieron un crecimiento casi de 600 veces más alta, que fueron H-0059-13-202 y H-
0059-13-120; por el contrario, en las biopelículas de aislamientos provenientes de
procesos de colonización, aunque se observó que algunos aislamientos tuvieron un
crecimiento hasta de casi 600 veces más alto, también se vio que a medida que aumento
la concentración de la anfotericina B, esta resistencia desapareció (Figura 9A1 y 9A2).
Con relación a las biopelículas que fueron expuestas a diferentes concentraciones de
fluconazol, se observó que aproximadamente la mitad de los aislamientos tuvieron un
crecimiento igual o menor que su crecimiento control, el cual disminuyó a medida que
aumentó la concentración del antifúngico, y la otra mitad tuvieron un crecimiento
aproximadamente de 200 a 400 veces más alta a su control que aunque disminuyó un
poco al aumentar la concentración, siguió siendo mucho más alta en comparación con
su crecimiento control, inclusive en las concentraciones más altas del antifúngico
(Figuras 9B1 y 9B2). Cabe resaltar que la resistencia de estas biopelículas fue mucho
más elevada en los aislamientos provenientes de procesos de colonización, lo contrario
a lo observado con la anfotericina B donde la mayor resistencia se observó en
aislamientos provenientes de procesos invasivos.
Para los antifúngicos voriconazol y anidulafungina, fue similar a los descrito en
fluconazol, sin embargo, el crecimiento de algunas biopelículas fue aproximadamente
de 200 a 250 veces más alta en comparación con su crecimiento control (Figuras 9C 1 y
2
a 9D1 y 2).
50
Figura 9A1 Actividad de diferentes concentraciones de anfoterina B frente a biopliculas
preformadas de aislamientos de C. auris de origen invasivo.
Figura 9A2 Actividad de diferentes concentraciones de anfotericina B frente a

biopeliculas preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador.
Figura 9B1 Actividad de diferentes concentraciones de fluconazol frente a biopeliculas

51
Figura 9B2 Actividad de diferentes concentraciones de fluconazol frente a biopeliculas
preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador.
Figura 9C1 Actividad de diferentes concentraciones de voriconazol frente a biopeliculas

Figura 9C2 Actividad de diferentes concentraciones de voriconazol frente a biopeliculas

preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador.
52
biopeliculas preformadas de aislamientos de C. auris de origen invasivo.

biopeliculas preformadas de aislamientos de C. auris de origen colonizador.
53
Aunque C.auris puede adherirse a superficies bióticas y abióticas y formar biopelículas,
éstas pueden variar dependiendo la cepa y el clado al que pertenezcan; en este estudio
se encontró que esta capacidad se redujo significativamente en la mayoría de
aislamientos provenientes tanto de procesos invasivos como de procesos de
colonización en relación con la cepa de referencia C. albicans, lo que concuerda con
información encontrada por diferentes grupos de investigación donde la formación de
biopelícula de C. auris fue muy baja en comparación con otras especies de Candida
que, según lo descrito, puede ser hasta del 50% de espesor en comparación con el
biofilm de C. albicans (60,83,114,123,143). Sin embargo, en el entorno clínico estas
biopelículas pueden servir como una fuente de infección que puede colonizar otras
partes del cuerpo, causando graves cuadros clínicos (201).
Por otro lado, tres aislamientos presentaron igual o mayor capacidad de formación de
biopelícula en comparación con la cepa de referencia C. albicans, lo que puede estar
asociado con el tipo y comportamiento fenotípico de los aislamientos como fue descrito
por Singh y colaboradores en el 2019 (143). Sin embargo, en este estudio, las
proporciones entre la morfología simple y agregada entre los aislamientos provenientes
de los dos procesos fue muy similar. Aunque se ha descrito que los aislamientos que
presentan una formación de biopelícula similar a la formada por C. albicans suelen ser
más resistentes a los agentes antifúngicos, en este estudio de los tres aislamientos, solo
un aislamiento presento resistencia al voriconazol, los otros aislamientos fueron
sensibles a los antifúngicos evaluados, lo que difiere un poco con lo descrito por Du y
colaboradores (202).
Las biopelículas preformadas por la mayoría de aislamientos de C. auris no mostraron

susceptibilidad a ningún agente antifúngico, con concentraciones mínimas de
erradicación de biopelículas que fueron hasta 600 veces más altas que las CIM, lo que
concuerda con estudios realizados que demuestran que la formación de biopelículas en
especies de Candida son responsables de una mayor resistencia a los antifúngicos,
brindándole mayor supervivencia en ambientes y probablemente en el hospedero
(133,202,203,). Además, estas resistencias superaron la susceptibilidad observada en
la cepa de referencia C. albicans, lo que hace pensar que esta resistencia de las
biopelículas probablemente se deba a la resistencia a la muerte fagocítica que aunque
no se ha comprobado muy bien la influencia de estas biopelículas en la inmunidad en
C. auris si se ha descrito para otras especies de Candida y esto podría contribuir
fuertemente a su virulencia, puesto que todo el sistema inmunológico está involucrado
en la respuesta por infecciones por Candida (204-209).
54
Los resultados obtenidos en este estudio resaltan la importancia de estudiar más a fondo
la formación y caracterización de las biopelículas en C. auris ya que es una factor
patogénico clave para el desarrollo de infecciones invasivas en pacientes
inmunosuprimidos y/o con dispositivos médicos siliconados que han sido considerados
como un factor de riesgo clave para que se desarrolle una infección por especies de
Candida, ya que brindan una superficie y soporte para el desarrollo de biopelículas.
Además, la resistencia a las diferentes clases de antifúngicos (azoles, polienos y
equinocandinas) que presentan las biopelículas de C. auris contribuirá a su virulencia,
transmisión y supervivencia en las instalaciones hospitalarias, incrementando su
probabilidad de propagación y la aparición de nuevos brotes (133,142,210-212).
Evaluar la patogenicidad de aislamientos clínicos colombianos de C. auris provenientes

de infecciones invasivas y de procesos de colonización en el modelo invertebrado de
Galleria mellonella.
La virulencia de C. auris en G. mellonella revelo mayor patogenicidad de los

aislamientos provenientes de procesos de colonización en comparación con los
aislamientos provenientes de procesos invasivos (Figuras 10 y 13 Anexo 5 y 7). En
relación a la virulencia de los aislamientos invasivos (n= 57), donde la muerte promedio
fue al 5 día (p<0,05): los aislamientos que tuvieron una alta virulencia (n=8) comparable
con la cepa de referencia SC5314 fueron H0059-13-107, H0059-13-129, H0059-13-202,
H0059-13-261, H0059-13-262, H0059-13-267, H0059-13-269 y H0059-13-461, los
cuales causaron una mortalidad de la larva G. mellonella en menos o máximo al quinto
día (Figura 12 ), y los aislamientos en los que se observó una baja virulencia (n=17)
fueron H0059-13-166, H0059-13-239, H0059-13-240, H0059-13-241, H0059-13-242,
H0059-13-244, H0059-13-248, H0059-13-249, H0059-13-251, H0059-13-252, H0059-
13-257, H0059-13-258, H0059-13-281, H0059-13-282, H0059-13-284, H0059-13-285 y
H0059-13-420, los cuales revelaron una mortalidad de la larva G. mellonella entre 6 a
15 días (Figura 11), estos resultados mostraron una relación entre los aislamientos
provenientes de procesos invasivos y la patogenicidad baja en G. mellonella siendo
estadísticamente significativo p=0,011 (Tabla 7). La patogenicidad de los demas
aislamientos de C. auris se muestra en el Anexo 4.
55
auris provenientes de procesos invasivos.

diferencias estadisticamente significaticas con respecto a la cepa control SC5314.
56
En relación a la virulencia de los aislamientos provenientes de procesos de colonización

(n= 50), donde la muerte promedio fue al 5 día (p<0,05), los aislamientos que tuvieron
una alta virulencia (n=16) comparable con la cepa de referencia fueron H0059-13-294,
H0059-13-299, H0059-13-421, H0059-13-520, H0059-13-592, H0059-13-596, H0059-
13-597, H0059-13-659, H0059-13-661, H0059-13-673, H0059-13-677, H0059-13-684,
H0059-13-693, H0059-13-694, H0059-13-698 y H0059-13-765, los cuales causaron una
mortalidad de la larva G. mellonella en menos de cinco días (Figura 15), y los
aislamientos en los que se observó una baja virulencia (n=6) fueron H0059-13-536,
H0059-13-660, H0059-13-725, H0059-13-726 y H0059-13-733, H0059-13-752, los
cuales revelaron una mortalidad de la larva G. mellonella entre 6 a 15 días (Figura 14).
La patogenicidad de los demas aislamientos de C. auris se muestra en el Anexo 6.
57
auris provenientes de procesos de colonización.


58
Tabla 5 Patogenicidad en G. mellonella, tipo de morfologia y su relacion de acuerdo al
tipo de procesos (invasivo o de colonizacion) de los aislamientos de C. auris.
Aislamientos de C. auris-proceso de
Aislamientos de C. auris-proceso invasivo
colonización
Patogenicidad baja_G. Patogenicidad alta_G. Patogenicidad baja_G. Patogenicidad alta_G.
mellonella mellonella mellonella mellonella
Morfología Morfología Morfología Morfología Morfología Morfología Morfología Morfología
S A S A S A S A
30 13 10 4 20 7 12 11
Total =57 Total =50
S: Morfología simple, A: Morfología agregada.
G. mellonella se ha utilizado como un modelo invertebrado confiable en la evaluación

de la patogénesis y las infecciones fúngicas invasivas, lo que ha ayudado a contribuir al
conocimiento y comprensión de la patogénesis y los mecanismos de defensa del
hospedero. En el presente estudio, la patogenicidad de C. auris se evaluó en las larvas
de la polilla G. mellonella y se encontró que algunas cepas de C. auris eran
considerablemente más virulentas que otras cepas, a un nivel comparable con la cepa
de referencia C. albicans, similar a lo descrito en el estudio de Borman en el 2016 (115).
En el modelo invertebrado de G. mellonella, se encontró que las cepas formadoras de

agregados fueron significativamente menos patógenas que las cepas con morfología
simple como se observa en la tabla 7, similar a lo reportado por Borman. Además, los
aislamientos de C. auris que mostraron una patogenicidad similar a la de la cepa de
referencia C. albicans tuvieron una morfología simple o individual lo que concuerda con
59
los reportado en ese mismo estudio de Borman, siendo esta ultima la morfología más
virulenta (115).Sin embargo, se ha descrito que la agregación de las células fúngicas de
C. auris podría contribuir a eludir del sistema inmune del hospedero, obstaculizando la
respuesta inmune innata al no permitir el reconocimiento por los neutrófilos, creando
una barrera física protectora para las células de C. auris contra el ambiente, y así poder
persistir en los tejidos y crear mayores niveles de tolerancia antifúngica (166).
Existe una gran variabilidad en la capacidad patogénica entre los aislamientos, la cual
fue alta en algunos aislamientos de C. auris. Sin embargo, este potencial exhibido por
los aislamientos del proceso invasivo no fue mayor que el de los aislamientos del
proceso de colonización; ambos grupos contenían aislamientos de alta y baja
patogenicidad (28,115,166), sin embargo, hubo aislamientos de C. auris que
presentaron una patogenicidad similar o incluso mayor que la cepa de referencia C.
albicans SC5314, aunque se ha informado que C. albicans es más patógena que otras
especies de Candida porque tiene genes únicos que codifican proteínas asociadas con
la invasión de tejidos y proporcionan un mejor desarrollo de la infección (166, 213, 214).
Adicionalmente, se observó mayor actividad proteolítica en los aislamientos que
presentaron baja virulencia en el modelo invertebrado G. mellonella que la reportada por
otros grupos de investigación en otras especies de Candida (193-195).
Nuestros resultados concuerdan con lo reportado previamente en este modelo y en otros
modelos in vivo, lo que sugiere una patogenicidad similar que se acerca a la observada
con C. albicans (28,115,215).
Determinar el perfil de susceptibilidad de aislamientos clínicos colombianos de C. auris

provenientes de infecciones invasivas y de procesos de colonización.
De los 107 aislamientos evaluados de C. auris el 97,2% (n=104) fue sensible a

anfotericina B, el 2,8% (n=3) de los aislamientos fueron resistentes a este antifúngico
(CIM ≥ 2 µg/ml), los cuales eran provenientes de procesos invasivos, aunque su relación
con el tipo de proceso no fue estadísticamente significativo P=0,100. El 72,9% (n=78)
fue sensible al fluconazol y el 26,1% (n=28) fue resistente a éste (CIM ≥ 32 µg/ml); de
los cuales el 67,8% (n=19) provenían de procesos invasivos y el 32,2% (n=9) de
procesos de colonización, aunque su relación con el tipo de proceso no fue
estadísticamente significativo p=0,081; solo en un aislamiento no fue posible identificar
su susceptibilidad a este azol. El 86% (n=92) fue sensible al voriconazol y el 14% (n=15)
60
presentó resistencia a este antifúngico (CIM ≥ 4 µg/ml); de los cuales el 60% (n=9)
provenían de procesos de colonización y el 40% (n=6) de procesos invasivos, aunque
su relación con el tipo de proceso no fue estadísticamente significativo P=0,267. El
98,1% (n=105) fueron sensibles a la anidulafungina; solo en 2 aislamientos provenientes
de procesos de colonización no se pudo evaluar la susceptibilidad a esta clase de
antifúngico. Finalmente, se observó mayor resistencia a los azoles en aislamientos
provenientes de procesos invasivos (n=26) en comparacion con los aislamientos
provenientes de procesos de colonización (n=16), además se observaron CIM muy
elevadas (FLZ >32 hasta >256; VOR >4 hasta >18) a los azoles en comparación con las
otras clases de antifúngicos evaluadas. Es importante resaltar que en cuatro
aislamientos se observó resistencia a dos antifúngicos; en este caso a los azoles
(fluconazol y voriconazol); dos provenientes de procesos invasivos (H0059-13-267 y
H0059-13-269) y dos de procesos de colonización (H0059-13-687 y H0059-13-744)
(Figuras 16 y 17; Anexo 8).
Figura 16 Susceptibilidad de aislamientos de C. auris provenientes de procesos

invasivos a cuatro antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLZ), voriconazol
(VOR), anidulafungina (AND). Color verte (sensible), color rojo (resistente)
Figura 24 Susceptibilidad de aislamientos de C. auris provenientes de procesos de

colonización a cuatro clases de antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FLZ),
voriconazol (VOR), anidulafungina (AND). Color verte (sensible), color rojo (resistente)
Aunque C. auris no se encuentra muy relacionada con especies como C. albicans o C.

glabata, si se encuentra estrechamente relacionada con especies del clado de C.
haemulonii que han mostrado alto grado de multiresistencia a polienos como lo es a la
61
anfotericina B, azoles como el fluconazol y voriconazol y a las equinocandinas. Además,
se ha demostrado que C. auris contiene genes únicos que están ausentes en las demás
especies de clado CTG estrechamente relacionadas. Estos genes específicos de C.
auris incluyen genes que codifican oligopéptidos y transportadores de casete de unión
a ATP (ABC), lo que contribuye aún más a su naturaleza intrínseca resistente a los
antifúngicos (57,216). En este estudio se observó resistencia a los azoles (FLZ y VOR)
aunque en proporciones mucho mas bajas a las resistencias observadas en muchos
casos donde se muestran CIM altas (>64 mg/l) en mas del 90% de los casos, que podria
estar dada por el aumento de la transcripcion o la variacion del numero de copias en el
gen ERG11, y la presencia de bombas eflujo, similar a lo observado en C. albicans (217)
y C. neoformans (218), lo cual hasta el momento es motivo de investigación en esta
especie, aunque ya estudios han reportado su importancia en C. auris (6,9,14,38,219-
223).
Además, se observó, aunque en menor proporcion resistencia a la anfotericina B, lo que

puede indicar que estos aislamientos pueden estar desarrollando mecanismos
moleculares que contribuyan a esta resistencia, mediante el desarrollo de mutaciones
puntuales implicadas en la biosintesis del ergosterol, un componente clave de la
membrana celular fungica como fue descrito por Vandeputte et al., y Hull et al. (224,
225). Por otro lado, Escandón y colaboradores en el 2019,ademas encontraron que esta
resistencia a la anfotericina B se presentaba con predominio en algunas regiones del
país y aunque en el presente estudio todos los aislamientos eran de la región norte, se
encontró diferencia en la resistencia a la anfotericina B entre los dos departamentos
(Bolivar y Cesar), ya que los tres aislamientos de C. auris resistentes a este antifúngico
pertenecían al departamento de Bolivar (Cartagena), lo cual probablemente también
podría estar relacionado con el uso de este antifungico en hospitales y diferencias entre
la poblacion de pacientes, como se ha reportanto en otros estudios donde sustituciones
involucradas en la resisitencia antifungica pueden estar asociadas estrechamente con
clados geográficos específicos de cada país y probablemente inducible bajo presión
antifúngica (8,9,44,49). Sin embargo, otros autores han encontrado que los mecanismos
de resistencia a estos antifúngicos pueden ser más epigenéticos que basados en
mutaciones, puesto que encontraron que había una respuesta transcripcional al
voriconazol y a la anfotericina B, con un pequeño número de genes expresados
diferencialmente después de la exposición a ambos fármacos (57).
Cabe resaltar que nuestros aislamientos de C. auris no presentaron resistencia a las

equinocandinas (anidulafungina) como si se ha descrito en otros estudios, en los cuales
62
se ha asociado con polimorfismos en el gen FKS1, causando preocupación ya que
debido a la susceptibilidad tan diversa que se ha reportado para los azoles y polienos a
nivel mundial, las recomendaciones dadas en salud pública han sido utilizar las
equinocandinas como tratamiento de primera línea de acción contra este tipo de
infecciones (154,226).
Aunque a nivel mundial se ha reportado la resistencia de C. auris a multiples antifungicos

(resistentes a ≥ 2 clases de antifúngicos), en nuestro estudio no fue tan común encontrar
este tipo de resistencias; los pocos aislamientos que mostraron este comportamiento
fueron resistentes a los azoles como se ha descrito en diversos estudios
(9,13,114,154,227).
Por otro lado, encontramos que la resistencia a las diferentes clases de antifungicos
(anfotericina B, fluconazol y voriconazol) fue más frecuente en aislamientos que
presentaron una morfología simple en comparacion con los aislamientos que tuvieron
una morfología agregada, lo que difiere con lo descrito por Borman, donde encontraron
que los aislamientos agregados fueron más tolerantes a los agentes antifúngicos (115).
Determinar si existe asociación entre la expresión de los diferentes factores

contribuyentes a la virulencia y la susceptibilidad antifúngica de C. auris, y su relación
con la evolución clínica del paciente.
Con relación a los datos clínicos de los pacientes, se observó que el 42,1% (n=45) se
encontraban en el grupo de la primera infacia (0-5 años), el 4,7% (n=5) en el grupo de
infancia (6-11años), luego el 6,5% (n=7) en el grupo de adolecencia (12-18 años),
seguido del 21,5% (n=23) en el grupo de adulto (19-59 años) y el 15,9% (n=17) en el
grupo mayores de 60 años, y solo el 9,3% (n=10) no tenian dato. El 53,3% (n=57) eran
mujeres y el 42,9% (n=46) eran hombres, solo el 3,8% (n=4) no tenían dato. Con
respecto a los factores de riesgo, se observó que los pacientes podían presentar más
de un factor de riesgo ,sin embargo los más frecuentes fueron el uso de sonda con un
75,7% (n=81), seguido del uso de catéter con el 72,9 % (n=78), ventilación mecánica
67,3% (n=72), tratamiento antifúngico 60,7% (n=65) donde los medicamentos más
comunes fueron anfotericina B, fluconazol, voriconazol y caspofungina, cirugia en los
ultimos 60 dias 54,2% (n=58), transfusiones multiples con el 51,4% (n=55); uso de
corticosteroides/inmunosupresores con el 44,9% (n=48), exposición previa a
antifúngicos con el 20,6% (n=22) e insuficiencia renal con el 14,0% (n=15) (Tabla 8).
63
Tabla 6 Datos clinicos, factores de virulencia, patogenicidad en G. mellonella,
susceptibilidad antifungica de los aislamientos de C. auris y su relacion de acuerdo a la
evolucion clinica del paciente (vivo o muerto).
64
En cuanto a la asociación de los diferentes factores de virulencia con la evolución clínica
del paciente (vivo o muerto), no se logró establecer una asociación estadísticamente
significativa entre la expresión de cada uno de estos factores (morfología p=0,630,
actividad enzimática (hemolítica p=0,315, fosfolipasas p=0,476 y proteasas p=0,189,
capacidad de adherencia p=0,411, formación de biopelícula p=0,690) y susceptibilidad
antifúngica (AMB p=0,110, FLZ p=0,090 y VOR p=0,273 ) con el desenlace del paciente.
Sin embargo, es importante resaltar la relación que se encontró entre los factores de
virulencia con el tipo de proceso (invasivo o colonizado) descritos en los otros objetivos.
Las infecciones por C. auris pueden ocurrir en diferentes sitios del cuerpo, incluida la
piel, el tracto urogenital y el tracto respiratorio de los seres humanos. Las infecciones
por C. auris pueden diseminarse al torrente sanguíneo y, cuando esto ocurre, causan
altas tasas de mortalidad que pueden ir del 30% al 60 % (42,73,228-230).
Fue frecuente encontrar C. auris en pacientes de todas las edades, entre los 0 años
hasta pacientes mayores de 60 años, en la mayoría de casos, la presentación clínica
fue inespecífica; además, la mayoría de los casos fueron aislados de hemocultivos y de
sitios de infección asociados a pacientes con dispositivos invasivos y catéteres (8).
C. auris parece ser que tiene una predileccion por colonizar la piel; se ha descrito que
es más frecuente aislar C. auris de sitios anatomicos como la axila y la ingle, seguido
de las fosas nasales y en menor proporcion del recto; sin embargo, difiere un poco con
lo encontrado en nuestro estudio donde los sitios más frecuentes para el aislamiento de
C. auris fueron oídos, fosas nasales, ingle, boca, axila y recto (73,76,209). La baja
frecuencia en boca puede deberse a la presencia del peptido cationico salival, histidina
5, para la cual C. auris ha sido reportado sensible (231).
Como ya se ha reportado en otros estudios fue frecuente encontrar que los pacientes
infectados o colonizados por C. auris presentaran algunas comorbilidades o factores de
riesgo como lo son uso de sonda y/o catéter, ventilación mecánica, transfusiones
múltiples, cirugías y factores iatrogénicos como lo es la exposición previa a antifúngicos
(13,28,34,42,228,232,233).
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
▪ C. auris es una nueva amenaza para la salud pública mundial, que aunque no
se ha confirmado, se cree que posiblemente las actividades humanas, como las
65
que han causado el calentamiento global, pueden ser entornos de apoyo que
permiten la evolución de los hongos que conducen a la colonización e infección
del huésped, por eso es necesario la educacion y consientizacion acerca de las
actividades que realizamos que perjudican nuestro medio ambiente y modifican
el cliclo normal de todo, así como dar un buen uso a los tratamientos con
medicamentos ya que el uso indiscriminado y erróneo puede causar resistencias
a éstos.
▪ La morfologia simple fue la mas frecuente entre los aislamientos de C. auris,
tanto de procesos invasivos como de colonización, resaltando su importancia
como factor de alta virulencia.
▪ La actividad enzimática se observó en la mayoria de los aislamientos de C. auris,
siendo un factor importante que contribuye a la virulencia, permitiendole el daño
de tejidos, facilitando la invasión, absorción de nutrientes y supervivencia en el
hospedero.
▪ La capacidad de adherencia se observó en todos los aislamientos de C. auris,
caracteristica que la hace un patógeno exitoso en la colonización de superficies
bióticas y abióticas por largos periodos de tiempo, que junto a la formación de
biopeliculas, que aunque para la mayoria de aislamientos fue baja, si se observó
algunos aislamientos que formaron biopeliculas similiares a C. albicans, lo que
le permite protegerse del exterior, resistir a tratamientos antifungicos y evadir el
reconocimiento por sistema inmune del hospedero.
▪ Se logró identificar aislamientos de C. auris de baja y alta patogenicidad en el
modelo invertebrado G. mellonella, información importante que permitirá en un
futuro desarrollar nuevos experimentos en modelos in vivo que brinden con más
exactitud cuáles son los mecanismos implicados en estos niveles de
patogenicidad.
▪ La mayoria de los aislamientos de C. auris fueron sensibles a los polienos y
equinocandinas, sin embargo se observó resistencia a los azoles, resistencia
que ha visto asociada con la expresion de bombas eflujo o mutaciones en el gen
ERG11 que cumple una funcion clave en la biosintesis del ergosterol un
componente indispensable en la membrana celular fungica. Cabe resaltar que
no se observó multiresistencia a las tres clases de antifungicos, como si se ha
descrito en otros paises.
▪ Por otro lado, este estudio contribuye al conocimiento de la biología y el
comportamiento de C. auris, que unido con la informacion de diversos grupos de
investigación permitirá en un futuro no muy lejano desarrollar métodos de
detección rápidos y precisos para distinguir C. auris de otras especies de
66
Candida, lo que ayudará a diagnosticar las infecciones por C. auris y así, poder
abordar estos casos de pacientes con infección o colonizacion por C. auris de
forma óptima, para poder elegir una terapia antifungica inicial más precisa para
el tipo de caso, ya que como vimos debemos tener en cuenta diferentes factores
importantes, como lo son la fuente infeccion, gravedad de la enfermedad,
evidencia de presencia de algunos de los factores de riesgo de los pacientes y
factores que contribuyen a la virulencia de C. auris, comorbilidades, trastornos
subyacentes como lo es la inmunosupresion y patrones de susceptibilidad de los
aislamientos que miminicen el uso innecesario de antibioticos, todo este conjunto
de informacion nos brindara una mejor atencion y más acertada para los
pacientes, y así ayudar a prevenir este tipo de infecciones y evitar su transmision.
▪ Es necesario realizar más proyectos de secuenciación del genoma completo de
C. auris que permitan conocer mas los mecanismos de resistencia y factores de
virulencia, y que estos estudios sean validados en modelos in vitro e in vivo.
Además, deben realizarsen más estudios seriados sobre la susceptibilidad a los
antifúngicos que permitan establecer los puntos de corte clínico para los
diferentes antifúngicos.
▪ A pesar que ya se ha venido estudiando esta levadura, aún queda mucho por
estudiar y explorar en C. auris. Para ello, es importante seguir desarrollando
proyectos de investigación para el descubrimiento del nicho ecológico de esta
levadura, una mayor comprensión de genes específicos que puedan estar
asociados con la virulencia que puedan ser utilizados a futuro como dianas
antifungicas y estudio de marcadores geneticos del paciente que puedan estar
asociados con un peor resultado.
67
8. ANEXOS
Anexo 1. Formato de recolección de datos de evolución clínica de pacientes con
infección por C. auris.
68
Anexo 2. Formato de carta aval otorgada por el comité de ética del Instituto Nacional de
Salud.
69
Anexo 3. Formato de consentimiento informado para uso de datos y muestras de los
pacientes en el proyecto.
70
71
Anexo 4. Patogenicidad de todos los aislamientos de C. auris de procesos invasivos en
el modelo de invertebrados de G. mellonella. Se utilizó la prueba de log-rank (Mantel-
Cox). (A) baja patogenicidad, (B) alta patogenicidad.
72
Anexo 7 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos invasivos en el modelo
de invertebrados de G. mellonella. Se utilizó la prueba de log-rank (Mantel-Cox). (A) baja
patogenicidad, (B) alta patogenicidad.
A
Aislamientos Log-rank
C. (Mantel-
auris_Proceso cox) - P.
invasivo value
B
H0059-13-166 0,0048
H0059-13-239 P<0,0001
H0059-13-240 0,031
H0059-13-241 0,0399
H0059-13-242 0,0017
H0059-13-244 P<0,0001
H0059-13-248 0,0027
H0059-13-249 P<0,0001
H0059-13-251 0,0001
H0059-13-252 0,0075
H0059-13-257 P<0,0001
H0059-13-258 P<0,0001
H0059-13-281 P<0,0001
H0059-13-282 P<0,0001
H0059-13-284 P<0,0001
H0059-13-285 P<0,0001
H0059-13-420 0,0227
73
Anexo 6. Patogenicidad de todos los aislamientos de C. auris de procesos de
colonización en el modelo de invertebrados de G. mellonella. Se utilizó la prueba de log-
rank (Mantel-Cox). (A) baja patogenicidad, (B) alta patogenicidad.
74
Anezo 7 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos de colonización en el
(A) baja patogenicidad, (B) alta patogenicidad.
A
Aislamientos C. Log-rank
auris_Proceso de (Mantel-cox) – B
colonización P. value
H0059-13-294 0,0032
H0059-13-299 0,0035
H0059-13-421 0,0446
H0059-13-520 0,015
H0059-13-592 0,0046
H0059-13-596 0,037
H0059-13-597 P<0,0001
H0059-13-659 0,0006
H0059-13-661 0,0022
H0059-13-673 0,001
H0059-13-677 0,0157
H0059-13-684 0,0281
H0059-13-693 0,0478
H0059-13-694 0,0016
H0059-13-698 0,0081
H0059-13-765 0,0005
75
Anexo 8 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos de colonización en el
(A) baja patogenicidad, (B) alta patogenicidad.
A. Susceptibilidad de aislamientos de C. auris B. Susceptibilidad de aislamientos de C. auris

provenientes de procesos invasivos a cuatro provenientes de procesos de colonización a cuatro
clases de antifungicos: anfotericina B (AMB), clases de antifungicos: anfotericina B (AMB),
fluconazol (FLZ), voriconazol (VOR), fluconazol (FLZ), voriconazol (VOR), anidulafungina
anidulafungina (AND). Color verte (sensible), (AND). Color verte (sensible), color rojo (resistente),
color rojo (resistente). color gris (no identificado).
76
Anexo 9 Indice Pz para actividad enzimatica de fosfolipasas y proteasas de los 107
aislamientos de C. auris tanto de proceso invasivo como de colonización.
Consecutivo Aislamiento Tipo de proceso A. Fosfolipasas Pz= A/B A. fosfo_inter A. proteasas Pz= A/B A. prote_inter
1 H0059-13-87 Invasivo 0,98 Bajo 0,90 Bajo
2 H0059-13-101 Invasivo 1,00 Negativo 0,65 Medio
3 H0059-13-103 Invasivo 1,00 Negativo 0,80 Bajo
9 H0059-13-239 Invasivo 0,98 Bajo 0,69 Medio
33 H0059-13-263 Invasivo 0,95 Bajo 0,46 Alto
44 H0059-13-284 Invasivo 0,84 Bajo 0,39 Alto
45 H0059-13-285 Invasivo 1,00 Negativo 0,43 Alto
58 H0059-13-294 Colonizador 0,96 Bajo 0,62 Medio
61 H0059-13-513 Colonizador 1,00 Negativo 0,56 Medio
65 H0059-13-534 Colonizador 0,86 Bajo 0,74 Bajo
74 H0059-13-592 Colonizador 1,00 Negativo 0,78 Bajo
94 H0059-13-696 Colonizador 0,46 Alto 0,86 Bajo
100 H0059-13-725 Colonizador 0,54 Medio 0,39 Alto
106 H0059-13-759 Colonizador 0,50 Medio 0,46 Alto
107 H0059-13-765 Colonizador 0,89 Bajo 0,49 Alto
77
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Alvarado - Casas Maira Lyseth 2021

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Expresión de factores de virulencia de Candida auris como contribuyentes en la

Maira Lyseth Alvarado Casas

Maira Lyseth Alvarado Casas

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Este trabajo se lo dedico a mi hijita Abiagail Medina Alvarado quien es mi fuerza y

• Principamente agradezco a Dios por darme la salud, fortaleza, motivación, y

3. MARCO TEORICO ............................................................................................. 17

4.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 31

5.1 Diseño metodológico ................................................................................ 32

5.2 Criterios de inclusión y exclusión ............................................................ 33

5.3 Consideraciones éticas............................................................................. 33

5.4 Evaluación morfológica ............................................................................ 34

5.5 Actividad enzimática ................................................................................. 35

5.6 Formación de biopelículas ....................................................................... 36

5.7 Ensayos de adherencia ............................................................................. 37

5.8 Susceptibilidad antifúngica ...................................................................... 37

5.9 Patogenicidad de C. auris en modelo invertebrado G. mellonella ......... 39

5.10 Asociación de factores de virulencia con patogenicidad y evolución

5.11 Análisis estadístico ................................................................................... 41

6. RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................................... 41

6.1 Objetivo específico Nº 1:........................................................................... 41

6.3 Capacidad de adherencia ......................................................................... 46

6.4 Formación de biopelículas ....................................................................... 47

6.5 Objetivo específico Nº 3:........................................................................... 55

6.6 Objetivo específico Nº 4:........................................................................... 60

6.7 Objetivo específico Nº 5:........................................................................... 63

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................... 65

Tabla 1 Funciones de las proteasas en especies de Candida. ................................... 21

Tabla 3 Aislamientos clínicos de C. auris recuperados en dos departamentos de

Tabla 4 Tipo de proceso, morfología, actividad enzimática, actividad metabólica de la

Tabla 5 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos invasivos en el modelo

Tabla 6 Patogenicidad de aislamientos de C. auris de procesos de colonización en el

Tabla 7 Patogenicidad en G. mellonella, tipo de morfologia y su relación de acuerdo al

Tabla 8 Datos clínicos, factores de virulencia, patogenicidad en G. mellonella,

Figura 1 Esquema de las concentraciones (g/mL) correspondientes de AND, AMB y

Figura 9D2 Actividad de diferentes concentraciones de anidulafungina frente a

A pesar de los avances de los diferentes grupos de investigación a nivel mundial

C. auris es una especie emergente de Candida nosocomial que se puede encontrar

En cuanto a la epidemiologia y la prevalencia real de C. auris siguen siendo inciertas;

Factores de virulencia y resistencia a antifúngicos

Tabla 1 Funciones de las proteasas en especies de Candida.

Blancos Función Ejemplos Sap

Aunque no se han descrito las proteasas específicamente para C. auris, si se ha descrito

Es importante enfatizar que en relación con C. albicans, las especies no albicans

La capacidad de los patógenos para obtener hierro es fundamental para la supervivencia

Para la evaluación de patogenicidad de C. auris de han utilizado diferentes modelos in

Evaluar la expresión in-vitro de factores asociados con la virulencia, la patogenicidad in-

4.1.1.1 Determinar la presencia de células en estado agregado o simple en aislamientos

4.1.1.2 Determinar la expresión in-vitro de la actividad enzimática (proteasa, fosfolipasa,

4.1.1.3 Evaluar la patogenicidad de aislamientos clínicos colombianos de C. auris

4.1.1.4 Determinar el perfil de susceptibilidad de aislamientos clínicos colombianos de

4.1.1.5 Determinar si existe asociación entre la expresión de los diferentes factores

Estudio de corte transversal. Los aislamientos clínicos invasivos de C. auris se

Tabla 3 Aislamientos clínicos de Candida auris recuperados en dos departamentos de

Procedencia Infección invasiva Colonización Total

5.2 Criterios de inclusión y exclusión

5.2.1.1 Infección invasiva: aislamientos recuperados de hemocultivo o líquidos

5.2.2.1 Infección invasiva: muestras de pacientes que se encuentraban

5.3 Consideraciones éticas

Los proyectos de investigación en el campo de la salud humana, o aquellos en los que

Los aislamientos clínicos fueron recolectados en el marco de la vigilancia nacional de

5.4 Evaluación morfológica

Se evaluó el tipo de morfología, simple (células individuales) o agregada (células que