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com
Editado por:
Paul E. Verslues,
Academia Sínica, Taiwán
Revisado por:
Tyler Dowd,
centro de ciencia vegetal donald danforth,
Estados Unidos
Bhaskara Govinal Badiger,
Universidad de Texas en Austin,
Estados Unidos
* Correspondencia:
ManzhongLiang
1962liang@163.com
Liangbi Chen
chenliangbi@126.com
Sección de especialidades:
Este artículo fue enviado a
Estrés abiótico vegetal,
una sección de la revista
Frontiers in Plant Science
Recibió:07 noviembre 2017
Aceptado:29 enero 2018
Publicado:06 marzo 2018
Citación:
Huang Y, Guo Y, Liu Y, Zhang F,
Wang Z, Wang H, Wang F, Li D,
Mao D, Luan S, Liang M y Chen L
(2018) 9-cis-Epoxycarotenoid
Dioxygenase 3 regula el crecimiento
de las plantas y mejora el multi-abiótico
Tolerancia al estrés en arroz.
Frente. ciencia de las plantas
9:162. doi: 10.3389/fpls.2018.00162
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INVESTIGACION ORIGINAL
publicado: 06 de marzo de
2018 doi: 10.3389/fpls.2018.00162
9-cis-La dioxigenasa epoxicarotenoide 3
regula el crecimiento de las plantas y mejora
la tolerancia al estrés multiabiótico en el
arroz
Yuan Huang, Yiming Guo, Yuting Liu, Feng Zhang, Zhikui Wang, Hongyan Wang, Feng Wang,
Dongping Li, Dandan Mao, Sheng Luan, Manzhong Liang* y Liangbi Chen*
Provincia de Hunan Laboratorio clave de innovación y aplicación de recursos de germoplasma estéril de cultivos, Facultad de Ciencias de la Vida,
Universidad Normal de Hunan, Changsha, China
Aunque el ácido abscísico (ABA) es una hormona importante que regula la latencia de la semilla, el cierre
de estomas, el desarrollo de la planta, así como las respuestas a los estímulos ambientales, los
mecanismos fisiológicos de la respuesta del ABA al estrés múltiple en el arroz siguen sin comprenderse
bien. En la vía biosintética de ABA, 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa (NCED) es la enzima limitante clave.
Aquí, reportamos funciones importantes deOsNCED3 en la tolerancia al estrés multi-abiótico en el arroz.
ElOsNCED3se expresa constitutivamente en varios tejidos en condiciones normales, su expresión es
altamente inducida por NaCl, PEG y H2O2estrés, sugiriendo los roles paraOsNCED3en respuesta a la
tolerancia al estrés multi-abiótico en el arroz. En comparación con las plantas de tipo salvaje,nced3Los
mutantes tuvieron una germinación de semillas más temprana, un crecimiento de plántulas posterior a la
germinación más largo, una mayor sensibilidad al estrés hídrico y H2O2estrés y aumento de la apertura de
los estomas bajo estrés hídrico y retraso en la senescencia de las hojas. Un análisis posterior encontró que
nced3los mutantes contenían un contenido de ABA más bajo en comparación con las plantas de tipo
salvaje, la sobreexpresión deOsNCED3en plantas transgénicas podría mejorar la tolerancia al estrés
hídrico, promover la senescencia de las hojas y aumentar el contenido de ABA. Concluimos queOsNCED3
media la latencia de las semillas, el crecimiento de las plantas, la tolerancia al estrés abiótico y la
senescencia de las hojas al regular la biosíntesis de ABA en el arroz; y puede proporcionar una nueva
estrategia para mejorar la calidad del cultivo.
Palabras clave:OsNCED3,ácido abscísico (ABA), sistema CRISPR/Cas9, germinación de semillas, crecimiento, estrés abiótico,
senescencia de hojas
INTRODUCCIÓN
El ácido abscísico (ABA) es un sesquiterpenoide que juega un papel fundamental en la latencia de las semillas, el
cierre de estomas, el desarrollo de la planta y la tolerancia al estrés biótico/abiótico durante el ciclo de vida de la
planta.Nambara y Marion-Poll, 2005). Además, los niveles de ABA en los tejidos vegetales suelen ser dinámicos
para responder a cambios fisiológicos y estímulos ambientales. Por ejemplo, en relación con el crecimiento de
brotes y raíces, el ABA generalmente se considera un inhibidor en condiciones de riego abundante, pero los
niveles normales de ABA son necesarios para mantener el crecimiento de las raíces (envp5ovp14mutantes) bajo
estrés hídrico, y los niveles normales de ABA son necesarios para el desarrollo de los brotes, particularmente para
la expansión de las hojas (en fl.Coaba2mutantes) en condiciones de riego abundante (Sharp et al., 2000; Sharp y
LeNoble, 2002; LeNoble et al., 2004). Bajo estrés hídrico, el ABA aumenta dramáticamente y regula
1 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al.
cierre de estomas en las plantas para reducir la pérdida de agua. Este es
un mecanismo dependiente de ABA, que implica la activación de H2O2
producción, que posteriormente aumenta los niveles de calcio en las
células protectoras, lo que desencadena el cierre de los poros estomáticos
(Tardieu y Davies, 1992; Wang y Song, 2008; Yao et al., 2013). Aunque la
importancia fisiológica del ABA en el crecimiento de las plantas y la
tolerancia al estrés abiótico ha sido bien reconocida, los mecanismos
moleculares de la respuesta del ABA al estrés múltiple en el arroz siguen
sin comprenderse bien.
La concentración endógena de ABA en los tejidos vegetales está
regulada por la biosíntesis de ABA (Ng et al., 2014). se produce ABA de
novoen la ruta de biosíntesis de ABA, que se origina a partir de la catálisis
de precursores de carotenoides para varias enzimas que se encuentran en
las plantas superiores (Xu et al., 2013). Hasta la fecha, la mayoría de los
genes de biosíntesis de ABA han sido descubiertos y clonados, incluidos los
de la zeaxantina epoxidasa.ZEP),9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa
(NCED),y aldehído oxidasa abscísica (AAO) (Taylor et al., 2000; Hauser et al.,
2011). El primer paso comprometido de la biosíntesis de ABA es la escisión
de 9-cis-violaxantina o 9-cis-neoxantina por NCED para producir xantoxina
(C15) (Tan et al., 1997; Milborrow, 2001). La primeraNCEDel gen a ser
identificado y clonado fueVP14 en maíz (Schwartz et al., 1997), y
posteriormente,NCEDgenes fueron aislados de otras especies de plantas (
Priya y Shiva, 2015) como el tomate (Burbidge et al., 1999), palta (Chernys y
Zeevaart, 2000),Arabidopsis (Roca y Zeevaart, 1991; Tan et al., 2003), malus
(Xia et al., 2014), yBrassica napus (Xu y Cai, 2017).
Estudios previos han demostrado que el aumentoNCEDlos niveles
de transcripción podrían promover la biosíntesis de ABA y aumentar
la acumulación de ABA en las plantas (Qin y Zeevaart, 2002; Martínez-
Andújar et al., 2011). VariosNCEDse han identificado y estudiado
mutantes; muchos tienen resistencia reducida a condiciones
ambientales severas o morfología anormal y defectuosa. ElVP14del
maíz se expresa en embriones y raíces y es fuertemente inducida en
hojas por estrés hídrico. VP14del maíz es responsable de promover la
latencia de las semillas y la resistencia al estrés hídrico al controlar los
niveles de ABA en las plantas (Tan et al., 1997; Sharp y LeNoble, 2002).
Además, BnNCED3fue aislado deBrassica napus,y expresado
ectópicamente en Arabidopsis. Los autores encontraron que la
sobreexpresión deBnNCED3niveles elevados de ABA en las plantas,
retraso en la germinación de semillas, reducción de iniciaciones de
raíces laterales y promoción de la senescencia de las hojas y un
tiempo de floración temprano (Xu y Cai, 2017). Además,NCEDes una
familia multigénica; hay cincoNCED miembros confirmados en
Arabidopsis, cada uno de los cuales se encuentra en tejidos
específicos, donde controlan la biosíntesis de ABA y regulan el
desarrollo (Tan et al., 2003). Sin embargo, muchas de estas proteínas
comparten funciones redundantes (Finkelstein, 2013). enNCED6se
expresa constitutivamente en el endospermo (Lefebvre et al., 2006;
Martínez-Andújar et al., 2011), peroenNCED9se expresa tanto en el
embrión como en el endospermo durante el desarrollo de la semilla (
Toh et al., 2007; SEO et al., 2016).enNCED5también se expresa en la
semilla en períodos posteriores de desarrollo.en NCED5, en NCED6,y
enNCED9co-regulan el desarrollo y la latencia de las semillas (Frey et
al., 2012).EnNCED3es predominantemente inducida por el estrés
hídrico y controla el contenido de ABA endógeno en condiciones de
estrés hídrico (Endo et al., 2008; Hao et al., 2009), y por lo tanto, la
EnNCED3El mutante de inserción de T-DNA tiene un agua
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OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA
fenotipo sensible a la deficiencia (Iuchi et al., 2001).enNCED5y
EnNCED3participar juntos en la respuesta al estrés hídrico en las
plantas; además,nced3ynced5mutantes suprimen el crecimiento
vegetativo de Arabidopsis (Frey et al., 2012).
Hasta la fecha, cincoNCEDSe han encontrado genes implicados en la
biosíntesis de ABA en arroz (Zhu et al., 2009). El análisis de la expresión
génica mostró queOsNCED1tiene el nivel de expresión más alto en las
hojas de arroz y actúa como el gen de limpieza en condiciones normales,
pero es significativamente suprimido por el estrés hídrico (Ye et al., 2011).
Los niveles de expresión deOsNCED2 yOsNCED3ambos están relacionados
con el retraso en la germinación de las semillas (Zhu et al., 2009; Canción
et al., 2012). Además,OsNCED3, OsNCED4,yOsNCED5son inducidas por el
estrés por deficiencia de agua (Teng et al., 2014; Zhang et al., 2015). A
pesar deOsNCED3 se expresó ectópicamente en Arabidopsis y contribuye a
aumentar la acumulación de ABA, mejorar la tolerancia a la sequía y alterar
la morfología de la hoja (Hwang et al., 2010), la función nativa deOsNCED3
en el arroz aún no está claro. En este estudio, investigamos las funciones
fisiológicas deOsNCED3usando el golpe de gracianced3 mutantes y
OsNCED3-sobreexpresión de plantas transgénicas de arroz. Nuestros
resultados sugieren queOsNCED3regula la latencia de las semillas, la
apertura de los estomas, el crecimiento de las plantas, la tolerancia al
estrés abiótico y la senescencia de las hojas al alterar la acumulación de
ABA en el arroz.
MATERIALES Y MÉTODOS
Métodos de generación de mutantes
Se aplicó el sistema CRISPR/Cas9 (proporcionado por el profesor Lijia Qu)
para generarnced3mutantes ElOsNCED3Se seleccionó la secuencia de
codificación para guiar el diseño del ARN. Según el análisis NCBI blast
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y la herramienta CRISPR GE
(http://skl.scau.edu.cn/), las secuencias espaciadoras específicas de 20 pb
( GCCGCCCGCGCGCGCGCTGC) inmediatamente antes de una secuencia
PAM (5′-NGG-3′) fueron seleccionados y sintetizados sobre la base del
protocolo (proporcionado por el profesor Lijia Qu) conBsaI secuencias de
sitios de restricción en los extremos de los pares de secuencias. Los
espaciadores de doble cadena se generaron por recocido y se insertaron
en elBsaVector pOS-sgRNA digerido con I. Luego, este pOS-sgRNA
construido se implementó con el vector de destino pH-Ubi-Cas9 a través de
la reacción LR de clonación de puerta de enlace (Invitrogen, Shanghai, EE.
UU.). Los plásmidos resultantes fueron secuenciados.
Las construcciones de pH-Ubi-Cas9 completadas se transformaron
luego en arroz (O. sativa L. japonica)porAgrobacterium- mediado Las
plántulas transgénicas se cultivaron en una cámara a 28◦C bajo un ciclo de
14 h luz/10 h oscuridad o en un invernadero con luz natural. Para la
detección de mutaciones, se extrajo ADN genómico de plántulas mutantes
completas utilizando el kit de ADN PlantGen (CWbiotech, Beijing, China). El
ADN genómico se amplificó usando cebadores de detección de mutaciones
que se diseñaron para flanquear el sitio objetivo designado. Luego, los
cromatogramas de secuencia fueron analizados por la herramienta
DSDecode (http://dsdecode.scgene.com/) para verificar el genotipo de las
plantas transgénicas. El 35T0
Las plantas transgénicas resistentes a higromicina tienen tres genotipos
que incluyen líneas homocigóticas, bialélicas y heterocigóticas. Las dos
líneas mutantes homocigóticas independientes de la T1generación que
fueron nombradasnced3-1ynced3-2utilizado para futuros estudios.
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Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

Los cebadores utilizados para CRISPR/Cas9 (U3-NCED3-F/R) y instrucciones (Invitrogen, Shanghai, EE. UU.). Aproximadamente 1µSe
detección de mutaciones (NCED3-JF/R) se enumeran en la Tabla S3. utilizaron g de ARN total para la síntesis de ADNc de primera cadena con el
El análisis de los efectos fuera del objetivo de las plantas transgénicas se kit de síntesis (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los productos de reacción
realizó sobre la base de la herramienta CRISPR GE (http://skl.scau.edu.cn/). Los se diluyeron diez veces y se usaron como molde para PCR en tiempo real
posibles sitios fuera del objetivo se detectaron mediante PCR genómica con tres réplicas biológicas usando el kit SYBR Premix Ex Taq (Takara,
específica del sitio y se secuenciaron para determinar si los posibles sitios fuera Dalian, China). La qRT-PCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real
del objetivo también se editaron. Los cebadores específicos del sitio se Applied Biosystems Quant Studio 5 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los
enumeran en la Tabla S3. cebadores específicos de genes utilizados en el análisis qRT-PCR se
enumeran en la Tabla S3.
Condición y tratamiento del crecimiento de las plantas
Todos los experimentos se realizaron utilizandoO sativalrosal japonés Generación deOsNCED3Líneas de
semillas de las mismas condiciones de cosecha y almacenamiento. Las
sobreexpresión
semillas se esterilizaron superficialmente en etanol al 75 % (v/v) durante 2
La secuencia de codificación deOsNCED3fue amplificado por los
min y se enjuagaron dos veces en agua bidestilada estéril y luego en
cebadores pHB-NCED3-F/R (Tabla S3) y luego insertado en el
NaClO al 2,5 % (v/v) durante 30 min. A continuación, las semillas se
vector binario pHB detrás de 2×promotor 35S. La construcción
enjuagaron cinco veces en agua bidestilada estéril. Las semillas
recombinante pHB-35S::OsNCED3se transformó en calli deO.
esterilizadas se remojaron en agua a 30◦C por 2 d y luego germinó por 3 d
sativa L. japonicaa través deagrobacteriatransformación
a 28◦C. Las plántulas se cultivaron en solución de cultivo de Hoagland
mediada. La t2Se seleccionaron semillas transgénicas de
como se describió anteriormente (Li y Cheng, 2015). Las plantas se
generación sembradas en medio MS que contenía 50µg/L de
cultivaron en una cámara de crecimiento a 28◦C bajo un fotoperíodo de 14
higromicina (Hgr) durante 7 d. El 100% de resistencia a Hgr se
h luz/10 h oscuridad. Para el estrés abiótico, las plántulas en etapa de tres
seleccionó como líneas homocigóticas.
hojas se colocaron en soluciones con concentraciones finales de 25 % de
PEG6000 (−0,51 Mpa, la solución se aireó en el sistema experimental), NaCl
Ensayo de localización subcelular y tinción de
150 mM y H 100 mM2O2. Todos los tratamientos se repitieron más de tres
veces. Las plántulas se recolectaron para aislamiento de ARN o análisis de
Gus
Para el análisis histoquímico, elOsNCED3promotor, se amplificó
fenotipo.
mediante PCR un fragmento de ADN genómico de 2,27 kb de la
Para los tratamientos de sequía en la etapa de plántula, las plántulas
región aguas arriba del sitio de iniciación de la transcripción
germinadas se trasplantaron a un medio de mezcla de suelo (2:1
utilizando los cebadores 1301-OsNCED3-F/R (Tabla S3) y se fusionó en
suelo:vermiculita) en macetas oblongas de resina blanca (L33×W19×H14
el vector pCambia1301 para impulsar el gen informador β-
cm). El suelo era suelo de arroz aluvial de río recolectado del campo
glucuronidasa (GUS). El PRONCED3-La construcción GUS se transformó
experimental de la Universidad Normal de Hunan, Changsha, 28◦11′49"
en arroz (O. sativa L. japonica).El PRONCED3-GUS plantas transgénicas
norte, 112◦58′42"E, provincia de Hunan, China. Las plántulas se cultivaron
(T1) se utilizaron para el análisis de tinción histoquímica. La tinción
hasta la etapa de tres hojas y luego se sometieron a retención de agua
histoquímica se realizó como se describió anteriormente (Li et al.,
durante 15 días y se fotografiaron, luego se reanudó el riego durante 7
2015). Los tejidos de ProNCED3-GUS plantas transgénicas (T1) se
días. Las plantas se fotografiaron de nuevo y se anotó el número de
incubaron en la solución de tinción GUS (fosfato de sodio 50 mM a pH
plantas supervivientes. Durante la etapa reproductiva de estrés hídrico, las
7,0, EDTA 10 mM, ferricianuro de potasio 0,5 mM, ferrocianuro de
plántulas se cultivaron en macetas balde (40 cm de diámetro, 40 cm de
potasio 0,5 mM, metanol al 10 %, Triton X-100 al 0,1 % y 1 mg ml−1de
altura) hasta que apareció el meristema de la inflorescencia; luego
X-Gluc (Sangon, Shanghái, China) disuelto en N,N-dimetilformamida)
suspendimos el riego durante 7 d hasta que las hojas rodaron.
a 37◦C durante 10 h, las muestras se incubaron en etanol al 75 % (v/v)
Fotografiamos las plantas en este momento y luego reanudamos el riego
para aclarar la clorofila. Las muestras libres de clorofila se observaron
hasta la etapa madura y evaluamos estadísticamente la tasa de formación
y tomaron imágenes con el microscopio OLYMPUS SZX7 y BX51.
de semillas.

Análisis de germinación de semillas Para investigar la ubicación subcelular de OsNCED3, la secuencia

Las semillas cosechadas denced3mutantes y plantas de arroz WT se esterilizaron
superficialmente y se sembraron directamente en los papeles de filtro estériles
para un ensayo de germinación de semillas. Las semillas se colocaron en una
caja de germinación de polimetilmetacrilato y se cultivaron en una cámara de
crecimiento (ZHUJIANG, Guangzhou, China) y se mantuvieron a 30◦C. La tasa de
germinación se basó en radículas de más de 1 mm y se registró después de 2
días de imbibición. Además, determinamos la longitud del brote y la raíz. Para
este análisis se realizaron tres experimentos independientes.
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo de plántulas de arroz o tejidos específicos en la etapa
reproductiva utilizando Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
de codificación deOsNCED3se amplificó y se ligó en el vector pEZS-
eGFP. El vector recombinante pEZS-OsNCED3-eGFP se transformó en
protoplastos de Arabidopsis de acuerdo con un protocolo descrito
previamente (Meng et al., 2014). La fluorescencia de GFP en los
protoplastos transformados se visualizó con un microscopio de
fluorescencia confocal (Nikon A1, Japón).
Análisis de contenido de prolina, fuga de
electrolitos y tasa de pérdida de agua
El contenido de prolina determinado como se describió anteriormente (
Bates et al., 1973). Muestras de segmentos de hoja de aproximadamente
0,5 g de plantas transgénicas y WT se homogeneizaron en 6 ml de ácido
sulfosalicílico acuoso al 3 % y se centrifugaron a 4000×g para

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 3 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al.
10 minutos. Luego, se incubaron 2 mL del sobrenadante con 2 mL de
ninhidrina ácida y 2 mL de ácido acético glacial en agua hirviendo durante
40 min y se enfrió en hielo para detener la reacción. Para cada reacción, se
añadieron 4 mL de tolueno y la solución de reacción se osciló durante 30
min a temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 520 nm con un
espectrofotómetro.
Las mediciones relativas de fuga de electrolitos se recopilaron como se
describió anteriormente (Lou et al., 2017) con una ligera modificación. Las
hojas se colocaron en tubos que contenían 20 mL de agua desionizada y
luego se colocaron al vacío durante 1 h. A continuación, las muestras se
sellaron y se colocaron a 28◦C en una incubadora durante 5 h. La
conductancia del agua se midió con un medidor de conductividad.
Las tasas de pérdida de agua se midieron en hojas desprendidas
colocadas en platos a la luz a temperatura ambiente. El peso fresco se
midió en tiempos establecidos de 0 a 7 h. La proporción del peso fresco
inicial representó la tasa de pérdida de agua.
Ensayo de actividad de superóxido
dismutasa (SOD) y peroxidasa de hidrógeno
(CAT) y tinción DAB
H2O2La tinción en hojas se realizó siguiendo un protocolo
previamente descrito (Hu et al., 2005). Las hojas desprendidas se
infiltraron con 1mg mL−13,3′-solución de diaminobencidina (DAB)
(contiene Tween al 0,05 % y Na 10 mM2HPO4, pH 3,8) a 25◦C
durante 8 h en la oscuridad. Luego, las hojas se sumergieron en
etanol hirviendo al 96% durante 15 minutos para romper la
clorofila. Las muestras se transfirieron a etanol fresco y se
fotografiaron. La SOD y CAT se extrajeron de muestras de hojas
de 0,2 g moliéndolas en 2 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) a
4◦C. SOD y CAT se determinaron utilizando kits de ensayo
comerciales adquiridos del Nanjing Jiancheng Bioengineering
Institute (Nanjing, China), siguiendo las instrucciones del
fabricante. La absorbancia de SOD y CAT se midió a 550 y 240 nm,
respectivamente. Todas las medidas fueron similares en las tres
réplicas individuales.
Análisis de Estomas de Arroz por Microscopía
Electrónica de Barrido
Hojas de tipo salvaje ynced3plantas mutantes (1 mes de edad) fueron
tratadas con estrés hídrico o 100 mM H2O2y luego se fijó inmediatamente
con glutaraldehído al 3 % en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) a 4◦C
durante 5 h, seguido de lavado dos veces con tampón de fosfato 0,1 M
durante 10 min. Posteriormente, estas muestras se fijaron con tetróxido
de osmio al 1% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) a 4◦C durante 2 h, se lavó
dos veces con tampón de fosfato 0,1 M durante 10 min, se deshidrató en
serie en una solución de etanol al 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 % durante 20
min cada uno, y luego se secó con un secador de punto crítico (Zhang et
al., 2011). Las muestras se recubrieron con oro y se monitorearon
mediante microscopía electrónica de barrido (SU8010, Hitachi, Japón).
Medición de clorofila
La clorofila se extrajo de 0,15 g de tejido de hoja bandera de
arroz con acetona helada al 80% y su contenido se midió
según la absorbancia a 663 nm y 645 nm con un UV2400
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OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA
Espectrofotómetro UV/VIS basado en el protocolo descrito por
Lichtenthaler (1987).
Medición del contenido de ABA
Se trituraron tejidos de hoja (300 mg) en nitrógeno líquido. El polvo se
extrajo con 1,5 mL de solución de extracción (metanol:H2ácido
O:metanoico en una proporción de 7,9:2:0,1) y se mantuvo durante la
noche a 4◦C. Las muestras se centrifugaron a 12.000×gramo por
20min a las 4◦C. Se recogió el sobrenadante, se secó bajo gas
nitrógeno y se disolvió en 2 ml de solución de amoníaco 0,1 M. Los
extractos crudos se purificaron utilizando una columna MAX que se
pretrató con 2 ml de metanol y luego con 2 ml de solución de
amoníaco 0,1 M. Después de cargar el sobrenadante en la columna
MAX, la columna se lavó con 2 ml de solución de amoníaco 0,1 M y
luego con 2 ml de metanol. El ABA se eluyó con 4 ml de metanol que
contenía ácido fórmico al 1%. El eluyente se secó bajo gas nitrógeno y
se disolvió en 0,2 ml de metanol y luego se filtró a través de un filtro
de 0,2µm membrana de nailon. [2H6Se utilizó ]ABA como patrón
interno. Los niveles de ABA se cuantificaron mediante cromatografía
líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con tres
réplicas biológicas.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron en al menos tres réplicas biológicas
para cada tratamiento. Los datos se consideraron estadísticamente
significativos en unp<0,05utilizando el estudiantet-prueba. Los datos son la
media ±SD de tres experimentos independientes.
RESULTADOS
OsNCED3Patrón de expresión y localización
de proteínas
Observar los patrones de expresión temporal y espacial de OsNCED3
en varios tejidos de plantas de arroz, utilizamos la región aguas arriba
de 2,27 kb de laOsNCED3sitio de iniciación de la transcripción como
promotor para impulsar el gen reportero β-glucuronidasa (GUS).
Tinción inmunohistoquímica de plantas transgénicas que expresan
ProNCED3-GUS demostró queOsNCED3se expresó en todos los tejidos
que probamos, que incluyeron embrión, coleoptilo, raíz, hoja, culmo,
nudo, flor, estigma y polen, con una expresión especialmente alta en
flores y raíces (Figura 1A). El análisis cuantitativo de RT-PCR (qRT-PCR)
también mostró que OsNCED3se detectaron transcripciones en los
tejidos anteriores y la más altaOsNCED3expresión en flores y raíces (
Figura 1B). Además,OsNCED3los niveles de expresión aumentaron
significativamente bajo tratamiento con NaCl y PEG durante 1 hora.
También encontramos que H2O2podría inducir rápidamente el
aumento de OsNCED3niveles de transcripción (Figura 1C). Además, la
actividad de GUS aumentó significativamente en hojas, vainas y raíces
bajo deshidratación, NaCl y H2O2estrés, respectivamente (Figura S1).
Estos resultados sugieren queOsNCED3podría desempeñar un papel
en la tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico en el arroz.
Estudios previos informaron que la escisión oxidativa de la cis-
violaxantina y la cis-neoxantina en xantoxina de la 9-
cisepoxicarotenoide dioxigenasa (NCED) se produjo en el cloroplasto
y otros plástidos (Ye et al., 2012). Para identificar el subcelular
4 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 1 |Análisis de expresión y localización subcelular deOsNCED3. (A)Tinción histoquímica de ProNCED3-Plantas transgénicas GUS, incluida la semilla madura (a), la vaina de la yema (b), la
raíz (c), la hoja (d), el culmo y el nudo (e), la flor (f), el estigma (g), el polen (h). Barras = 20µM. (B)Nivel de transcripción deOsNCED3en diferentes órganos. E (embrión), R (raíz), L (hoja), C (culmo),
N (nudo), F (flor). (C)OsNCED3expresión en estrés abiótico por qRT-PCR. Las plántulas en etapa de tres hojas se sometieron a tratamiento con NaCl 150 mM, manitol 250 mM, PEG al 25 % y
H2O2 100 mM, respectivamente. Las muestras de plántulas se recolectaron paraOsNCED3análisis de expresiones. Los datos son la media± SD para tres repeticiones.

localización de OsNCED3, construimos una proteína de fusión
35S::NCED3-eGFP y protoplastos de Arabidopsis transformados
transitoriamente. La visualización microscópica confocal
demostró que la señal verde fluorescente de NCED3-eGFP co-
localizó con la autofluorescencia de la clorofila, lo que mostró que
OsNCED3 estaba dirigido a los cloroplastos (Figura 2).
OsNCED3Regula la latencia de las semillas y el crecimiento
de las plantas después de la germinación en el arroz
OsNCED3se expresa constitutivamente en varios tejidos y es inducida
significativamente por múltiples factores de estrés abióticos. Para
investigar al nativoOsNCED3función en el crecimiento de las plantas
de arroz y el estrés abiótico, utilizamos el sistema CRISPR/Cas9 para

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Huang et al.
FIGURA 2 |Ubicación subcelular de las proteínas OsNCED3. Proteína de fusión osNCED3-eGFP expresada transitoriamente en cloroplasto de Arabidopsis y visualizada mediante
microscopía confocal, barras = 20µmetro.
exprés pCRISPR-NCED3construcciones, y arroz transformado con
Agrobacterium tumefaciens-transformación mediada. Obtuvimos 35
plantas transgénicas resistentes a la higromicina, incluidas 32 nced3
mutantes El análisis de secuencia indicó que el 22,9, el 3,7 y el 64,8 % de
estas 35 plantas transgénicas eran líneas homocigóticas, bialélicas y
heterocigóticas, respectivamente (Tabla S1). Dos líneas homocigóticas
independientes (nced3-1ynced3-2)fueron utilizados para estudios
posteriores. Elnced3-1mutante tiene una deleción de 54 pb que resulta en
una deleción de 18 aminoácidos en la proteína, y elnced3-2 El mutante
tiene una inserción de un nucleótido que da como resultado una mutación
de cambio de marco que promueve la terminación temprana de la
traducción de proteínas (Figura 3A, Figuras S2, S8).
Para confirmar que elOsNCED3los fenotipos mutantes no fueron un efecto
fuera del objetivo de la edición CRISPR/Cas9, encontramos siete loci con la
clasificación más alta para el potencial fuera del objetivo (Tabla S2) según la
predicción de la herramienta CRISPR-GE, y diseñamos cebadores para amplificar
estas regiones . Como se muestra en la Figura S3, no se detectaron mutaciones
en los posibles loci fuera del objetivo en el genoma del arroz en estas líneas
mutantes obtenidas.
Para investigar siOsNCED3expresión afecta la germinación de semillas
de arroz, las semillas recién cosechadas se utilizaron para la comparación
de tipo salvaje ynced3tasas de germinación mediante conteo a los 7 días
después del remojo. Las tasas de germinación denced3- 1ynced3-2
mutantes fueron ligeramente más altos que los del tipo salvaje (Figura 3B
). Además, el post-germinadonced3 mutantes exhibieron un crecimiento
más temprano de raíces y brotes en comparación con las plántulas de tipo
salvaje, y las raíces y brotes de ambosnced3 mutantes fueron
significativamente más largos que los de tipo salvaje (Figuras 3C–E). En la
etapa de tres hojas,nced3-1ynced3-2 raíces y brotes mutantes eran todavía
más largos que los de la
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OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA
tipo salvaje (Figuras 3F,G). Sin embargo, los mutantes no tenían diferencias
obvias después de la etapa de macollamiento en comparación con el tipo salvaje
cuando las plantas se cultivaron después de esta misma etapa de desarrollo (no
se muestran los datos). Estos resultados indican que la eliminación de OsNCED3
puede alterar el crecimiento de la planta en la etapa de plántula.
En comparación con el arroz de tipo salvaje,nced3
Los mutantes son más sensibles al NaCl, al PEG y al
estrés por oxidación
Nuestro análisis qRT-PCR mostró queOsNCED3la expresión fue notablemente
inducida por el estrés con NaCl y PEG. Por lo tanto, tratamos a niños de 2
semanasnced3plántulas mutantes y de tipo salvaje con solución nutritiva de
Hoagland que contenía NaCl 150 mM o PEG al 25%. Después de 5 días de estrés
con NaCl, más hojas de los dos nced3mutantes se habían marchitado en
comparación con las plantas de tipo salvaje. Después del tratamiento con alto
contenido de sal, las plantas se transfirieron a condiciones normales de
nutrientes para recuperarse durante 5 días. La recuperación fue del 48% para
nced3-1y 32,7% paranced3-2,que fue inferior al 66,6% observado para el tipo
salvaje (Figuras 4A,B). Además, de 2 semanas de edadnced3Los mutantes y las
plántulas de tipo salvaje se sometieron a tratamientos con PEG al 25% durante
15 días, después de lo cual la mayoría de los nced3las hojas mutantes se
marchitaron, mientras que el tipo salvaje mostró una ligera respuesta. Luego,
las plántulas se transfirieron a condiciones normales y se dejaron recuperar
durante 7 días, pero solo el 69,7 % y el 55,2 % de lanced3-1ynced3-2las plántulas
sobrevivieron, respectivamente, que fueron significativamente más bajas que el
88,4% de supervivencia observado para el tipo salvaje (Figuras 4A,C). Estos
resultados indican que la nced3los mutantes tenían una menor capacidad para
la alta salinidad y la tolerancia al estrés osmótico.
6 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 3 |Mutación inducida por CRISPR/Cas9 deOsNCED3y el fenotipo de germinación de semillas y crecimiento temprano de plántulas ennced3mutantes (A)Mutagénesis dirigida de la
OsNCED3gene. ElOsNCED3el sitio de mutación se muestra en la estructura del gen. La secuencia en el cuadro rojo representa laOsNCED3espaciador, y PAM está etiquetado por subrayado. Los
indels se muestran en guiones o letras rojas. (B)Tasa de germinación de tipo salvaje ynced3mutantes Los datos son la media±SD para tres réplicas (cada réplica contiene 100 semillas). (C)
Estado de crecimiento después de la germinación 2 d, 3 d y 4 d para tipo salvaje ynced3. (D)raíz y (MI)longitud de los brotes de las plantas después de la germinación 4 d. (F)Características de
las plántulas en la etapa de tres hojas. (GRAMO)Medida de longitud de (MI)plántulas Los datos mostrados son±DAKOTA DEL SUR (norte=14). Resultados similares en tres experimentos
individuales.asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas (Student'st-prueba; *PAG<0,05, **PAG<0,01).

OsNCED3también respondió a H2O2tratamiento. Para examinar si
OsNCED3confiere tolerancia a ROS,nced3Los mutantes y las plántulas de
tipo salvaje se sometieron a H2O2tratamiento durante 2 d en la etapa de
tres hojas. Considerando que casi todos losnced3las hojas se habían
marchitado bajo estas condiciones, las hojas de tipo salvaje generalmente
no se vieron afectadas (Figura 5A). Usando la tinción DAB, no detectamos
diferencias en las hojas no tratadas denced3-1, nced3-2y arroz de tipo
silvestre, mientras que las hojas denced3-1ynced3-2 las plantas tenían una
decoloración marrón oscura en comparación con las hojas de tipo salvaje,
que solo tenían unas pocas regiones marrones en los ápices de las hojas
(Figura 5B). Estas observaciones sugieren queOsNCED3Las plantas
mutantes con pérdida de función eran susceptibles a H2O2estrés. H2O2
es una molécula de señalización de estrés vital en las plantas y puede aumentar
la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) y la peroxidasa de hidrógeno
(CAT) en las hojas (Hu et al., 2005). Para determinar sinced3 mutantes habían
alterado la actividad de la enzima antioxidante durante H2O2
tratamiento, se midió la actividad de SOD y CAT. La actividad de estas
dos enzimas antioxidantes ennced3mutantes y plantas de tipo salvaje
se mejoraron durante H2O2tratamiento en comparación con las
condiciones de control, pero la actividad SOD y CAT denced3

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 7 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 4 |Elnced3los mutantes mostraron una disminución de la tolerancia al estrés por sal y PEG. (A)El fenotipo de las plántulas en etapa de tres hojas denced3mutantes y de tipo salvaje bajo estrés con NaCl
y PEG. (ANTES DE CRISTO)Estadísticas de la tasa de supervivencia después del estrés por sal y PEG. Se muestra el número de plantas supervivientes como proporción del total de plantas. Los datos mostrados
son±SD de tres réplicas independientes.asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas (Student'st-prueba; **PAG<0,01).

mutantes fue menor que el de las plántulas de tipo salvaje bajo H2O2
estrés (Figura 5C). Estos resultados indican queOsNCED3podría promover
la actividad de la enzima antioxidante cuando las plantas están expuestas
al daño oxidativo.
nced3El arroz mutante había disminuido la
tolerancia al estrés hídrico y el cierre de estomas
Elnced3mutantes y plántulas de tipo salvaje se cultivaron hasta la etapa de
tres hojas en el suelo antes de suspender el riego durante 15 días, y luego
se reanudó el riego durante 7 días. Aproximadamente el 83,2 % de las
plantas de tipo salvaje se recuperaron de este tratamiento de estrés
hídrico, pero solo el 40,2 y el 20 % de lasnced3-1ynced3-2plantas
recuperadas, respectivamente (Figuras 6A,B). La sensibilidad al estrés
hídrico de la nced3Los mutantes también se probaron en la etapa
reproductiva. Observamos que 76.7 y 85.9% de losnced3-1ynced3-2hojas
mutantes enrolladas, respectivamente, que fue más de lo que se observó
en el tipo salvaje (35,3 %) bajo estrés hídrico (Figuras S5A-C). Después del
estrés hídrico, la semilla establece tasas denced3-1ynced3-2mutantes
fueron solo 55,8 y 47,7%, que fue claramente más bajo que la tasa de
establecimiento de semillas del 70,7% medida en el tipo silvestre (Figuras
S5D,E). Dado que el mecanismo fisiológico alterado es posiblemente el
responsable de la adaptación al estrés hídrico. examinamos el contenido
de prolina y la fuga relativa de electrolitos en los tejidos de las hojas. En
condiciones normales, estos dos factores fueron muy bajos y no hubo
diferencias entre el tipo salvaje ynced3mutantes Después de 10 días de
estrés hídrico, el contenido de prolina en las hojas aumentó
significativamente en el tipo salvaje y en los dosnced3mutantes; sin
embargo, elnced3las hojas mutantes acumularon menos prolina que el
tipo salvaje (Figura 6C). Al mismo tiempo, la fuga relativa de electrolitos
fue mayor ennced3mutantes que en el tipo salvaje bajo estrés por sequía (
Figura 6D). También evaluamos la evitación de pérdidas de agua ennced3y
plantas de tipo salvaje por análisis de tasa de pérdida de agua. Las hojas
sueltas denced3mutantes perdían agua más rápido que los del tipo salvaje
(Figura 6E). Estos resultados indican queOsNCED3juega un papel vital en
la tolerancia al estrés hídrico en el arroz.

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 8 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 5 |Análisis de acumulación de H2O2 y enzimas oxidativas en condiciones de estrés por H2O2. (A)fenotipo denced3y hojas de tipo salvaje después del tratamiento con H2O2 100 mM
durante 2 días. (B)Tinción DAB de acumulación de H2O2. Se realizaron tres réplicas independientes. (C)Actividades SOD y CAT denced3y plántulas en estado de tres hojas de tipo salvaje bajo
tratamiento con H2O2 100 mM durante 24 h. Los datos mostrados son±SD de tres réplicas independientes.asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas (Student'st-prueba; *
PAG<0,05).

Para analizar más a fondo que la tasa de pérdida de agua ennced3los
mutantes eran más rápidos que los de tipo salvaje. Investigamos la apertura y
densidad estomática ennced3-2plantas mutantes y de tipo salvaje. En
condiciones normales, los porcentajes de estomas completamente abiertos en
lasnced3-2Las plantas mutantes eran un poco más altas que las plantas de tipo
salvaje, pero otros estomas de dos tipos no tienen diferencia entrenced3-2
mutante y de tipo salvaje (Figuras 7A,B). Sin embargo, en condiciones de estrés
hídrico, el 66,1 % de los estomas se cerraron por completo en las plantas de tipo
silvestre, mientras que solo el 43,6 % se cerraron por completo en las plantas
silvestres.nced3-2plantas mutantes. Además, solo el 26,1 % de los estomas
estaban parcialmente abiertos en las plantas de tipo silvestre, pero el 45,7 % lo
estaban parcialmente en las plantas silvestres.nced3-2plantas mutantes.
Además, el 10,7% de los estomas estaban completamente abiertos ennced3-2
plantas mutantes, y no se observaron diferencias significativas en comparación
con el 7,8% de estomas completamente abiertos en plantas de tipo salvaje (
Figura 7A,B). También observamos la densidad estomática y confirmamos que
no había diferencias evidentes entrenced3-2mutante y de tipo salvaje
plantas (Figura 7C). Estos resultados indican queOsNCED3controla el
movimiento de los estomas en condiciones de estrés hídrico.
OsNCED3Afecta la acumulación de ABA y la
expresión génica relacionada con ABA
ABA se describió bien como regula el crecimiento de las plantas y mejora la
adaptación al estrés hídrico, y NCED cataliza el paso regulador clave en la
biosíntesis de ABA (Ng et al., 2014). Por lo tanto, medimos el contenido de
ABA de brotes y raíces en la etapa de tres hojas y encontramos que los
niveles de ABA en los brotes de mutantes (5.5 ng/g paranced3-1 y 6,2 ng/g
paranced3-2)y raíces de mutantes (1,7 ng/g paranced3-1y 1,4 ng/g para
nced3-2)fueron notablemente inferiores a las de las plantas de tipo
silvestre (10,2 ng/g en los brotes y 3,2 ng/g en las raíces) (Figura 8A). Por
lo tanto,nced3los mutantes tenían brotes y raíces más largos que las
plantas de tipo salvaje, posiblemente debido a una disminución en el
contenido de ABA. Además, los niveles de ABA en las hojas denced3
mutantes y de tipo salvaje también se investigaron bajo

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 9 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 6 |Tolerancia al estrés hídrico denced3plántulas (A)fenotipo denced3en estrés hídrico. (B)Tasa de supervivencia después del estrés por sequía. Se muestra el número de plantas supervivientes como
proporción del total de plantas. (CD)Determinación de la fuga de prolina y electrolitos relativos después del tratamiento del agua. Los datos mostrados son±SD de tres réplicas independientes. (MI)Medición de
la tasa de pérdida de agua en tipo salvaje,nced3-1, ynced3-2plántulas Los valores son la media±DAKOTA DEL SUR (norte=6 plantas). Se obtuvieron resultados similares a partir de tres réplicas independientes.
asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas (Student'st-prueba; *PAG<0,05, **PAG<0,01).

condiciones de crecimiento normales y con estrés hídrico. En condiciones
normales, los niveles de ABA en elnced3mutantes (6,3 ng/g paranced3-1 y 6,6
ng/g paranced3-2)fueron aproximadamente el 50% de los del tipo salvaje (13,3
ng/g). Después del tratamiento de estrés hídrico, el contenido de ABA ennced3y
las plántulas de tipo salvaje aumentaron significativamente, pero el
el contenido de ABA de tipo salvaje (1429,4 ng/g) fue 2,3 veces mayor
que nced3mutantes (650,9 ng/g paranced3-1y 601,9 ng/g paranced3-
2) (Figura 8B). Por lo tanto, la mayor sensibilidad al estrés hídrico en
elnced3plántulas mutantes se correlaciona con la mutación en
OsNCED3,lo que podría reducir la biosíntesis endógena de ABA.

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 10 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al.
FIGURA 7 |Cierre de estomas denced3mutante bajo estrés hídrico. (A)Imágenes de microscopía electrónica de barrido de tres niveles de aberturas estomáticas, Barras = 10µmetro. (B) El
porcentaje de tres niveles de aberturas estomáticas ennced3-2Las plantas mutantes y de tipo salvaje se calcularon en condiciones normales y de estrés hídrico (norte=105 estomas para tipo
salvaje;norte=98 estomas paranced3-2mutante). (C)Se contó el número de estomas por mm2 en hojas medias denced3-2plantas mutantes y de tipo salvaje, respectivamente. Los datos
mostrados son±SD desde allí réplica independiente.
Además, determinamos los niveles de transcripción de los genes
catabólicos de ABA y los genes de la vía de señalización de ABA bajo estrés
hídrico. De acuerdo con el aumento en los niveles de ABA después del
tratamiento de estrés hídrico, la expresión deOsABA8ox1, OsABA8ox3,
OsPP2C68, OsABI2, OsRab21,yOsDREB2A genes fueron notablemente
inducidos en todas las plantas, peronced3 Las plántulas mutantes tuvieron
un aumento menor en comparación con los niveles de expresión medidos
en las plántulas de tipo salvaje (Figura 8C). Estos resultados sugieren que
OsNCED3juega un papel importante en la biosíntesis de ABA e
indirectamente regula positivamente la transcripción de genes
relacionados con ABA en condiciones de crecimiento con estrés hídrico.
Sobreexpresión deOsNCED3Tolerancia
mejorada al estrés hídrico y al NaCl y
mayor contenido endógeno de ABA
Para confirmar la función deOsNCED3en respuesta al NaCl y estrés hídrico,
líneas transgénicas (OE1, OE2) deOsNCED3- Se obtuvieron plantas que
sobreexpresaban (Figura S6). el crecimiento de OsNCED3-las plantas que
sobreexpresaban eran similares a las plantas de tipo salvaje. Sin embargo,
OsNCED3-Las plantas que sobreexpresaron fueron más tolerantes al estrés por
alta salinidad en comparación con las plantas de tipo salvaje (Figura 9A). La tasa
de supervivencia de OE1 y OE2 fue del 64,9 y 81,6 %, respectivamente, pero la
tasa de supervivencia del tipo salvaje fue solo del 54,1 % (Figura 9B). Además, el
OsNCED3-las plántulas que sobreexpresan y las plántulas de tipo salvaje se
cultivaron en suelo y se retuvo el agua para el análisis de estrés hídrico. Después
de retener el agua durante 18 días y volver a regar, elOsNCED3-las plantas que
sobreexpresan tenían una mayor tolerancia al estrés hídrico en comparación
con el tipo salvaje (Figura 9C). Aproximadamente el 57,8% de las plantas de tipo
salvaje recuperadas de
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OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA
condiciones de estrés hídrico, pero se recuperaron 69.1 y 84.3% de las
plantas transgénicas OE1 y OE2, respectivamente (Figura 9D).
Además, se midió el contenido de ABA endógeno en las hojas de
OsNCED3-plantas sobreexpresadas y de tipo salvaje en condiciones
normales y de estrés hídrico. En condiciones normales, el contenido de
ABA enOsNCED3-las plantas que sobreexpresaron (15,4 ng/g) fue mayor
que en las plantas de tipo salvaje (13,3 ng/g). Después del estrés hídrico
durante 10 días, la cantidad de ABA endógeno acumulado en ambos
OsNCED3-sobreexpresión y plantas de tipo salvaje, pero el contenido de
ABA enOsNCED3-plantas de sobreexpresión (1702,8 ng/g) fue mucho
mayor que en las plantas de tipo salvaje (1429,4 ng/g) (Figura 9E).
Consistentemente, los niveles de transcripción de genes relacionados con
ABA se indujeron significativamente enOsNCED3-sobreexpresión y plantas
de tipo salvaje en condiciones de estrés hídrico, pero los niveles de
expresión fueron mucho más altos enOsNCED3-plantas que
sobreexpresan que en las plantas de tipo salvaje (Figura 9F).
Curiosamente, los niveles de transcripción deABA8OX1yABA8OX3también
fueron más altos enOsNCED3- plantas que sobreexpresan que en plantas
de tipo salvaje en condiciones normales, pero otros genes no eran
obviamente diferentes entre OsNCED3-sobreexpresión y plantas de tipo
salvaje. Estos resultados indican además queOsNCED3podría promover la
acumulación endógena de ABA y mejorar la tolerancia al estrés hídrico.
OsNCED3Promueve la senescencia de las hojas en
hojas de arroz desprendidas
ABA es un regulador positivo de la senescencia de las hojas (Lee et al., 2011). El
tratamiento oscuro es un método eficaz para acelerar la senescencia de las hojas
y la biosíntesis de ABA (Mao et al., 2017).OsNCED3 es un gen fundamental de
biosíntesis de ABA y su nivel de transcripción en las hojas se induce fuertemente
en el tratamiento oscuro en comparación con
11 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 8 |Acumulación de ABA y expresión génica relacionada con ABA ennced3mutantes (A)El contenido de ABA de brotes y raíces en condiciones normales, (B)El contenido de ABA de la
hoja bajo estrés hídrico, (C)La expresión de genes relacionados con ABA de hoja en tipo salvaje ynced3plántulas mutantes en etapa de tres hojas bajo estrés hídrico durante 5 días. Los
datos mostrados son±SD desde allí réplica independiente.asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas (Student'st-prueba; *PAG<0,05, **PAG<0,01).

condiciones normales de luz (Figura 10A). De acuerdo con los resultados de la
qRT-PCR, la actividad de la β-glucuronidasa fue más abundante en las hojas
después de 3 días de tratamiento oscuro que en las hojas en condiciones de
control (Figura S7). Los segmentos de hojas denced3 Los mutantes mostraron
senescencia de hoja menor en la oscuridad, mientras que OsNCED3-la
sobreexpresión en las plantas transgénicas OE1 y OE2 tuvo un fenotipo de
senescencia foliar significativo en comparación con las plantas de tipo salvaje en
las mismas condiciones (Figura 10B). La oscuridad condujo a una pérdida
significativa del contenido de clorofila en las hojas desprendidas OE1 y OE2, pero
la disminución en el contenido de clorofila en nced3mutantes fue
significativamente menor que en el tipo salvaje después de 3 días de
tratamiento oscuro (Figura 10C).
Examinamos más a fondo el H2O2y niveles de expresión de genes
marcadores de senescencia en hojas tratadas con oscuridad. Las hojas
desprendidas OE1 y OE2 acumularon cantidades significativamente
mayores de H2O2que el tipo salvaje por tinción DAB, mientras que el H2O2
acumulación ennced3mutantes fue menor que en el tipo salvaje (Figura 10D).
Como era de esperar, los niveles de transcripción de los genes marcadores de
senescenciaOsSGR, OsNAP, OsI85,yOsNAC2en las hojas tratadas con oscuridad
OE1 y OE2 fueron significativamente más altas en comparación con las del tipo
salvaje, mientras que estos genes mostraron una expresión mucho menor en las
hojas tratadas con oscuridad.nced3líneas que en el tipo salvaje (Figura 10E). De
este modo,OsNCED3es un regulador positivo de la biosíntesis de ABA, que está
relacionado con la senescencia de las hojas de las plantas.

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 12 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 9 |El fenotipo deOsNCED3-sobreexpresión de plantas y contenido de ABA y niveles de transcripción de genes relacionados con ABA. (A)El fenotipo de las plántulas en etapa de tres hojas deOsNCED3-
sobreexpresado y de tipo salvaje bajo estrés con NaCl 150 mM. (B)Estadísticas de la tasa de supervivencia después del estrés salino. El número de plantas sobrevivientes como
(Continuado)

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 13 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al.
FIGURA 9 |se muestra la proporción del total de plantas. (C)El fenotipo de las plántulas en etapa de tres hojas deOsNCED3-Sobreexpresión y tipo salvaje bajo estrés hídrico.
(D)Estadísticas de tasa de supervivencia después del estrés hídrico. (MI)contenido de ABA y (F)Expresión de genes relacionados con ABA enOsNCED3- plántulas en estado de tres hojas con sobreexpresión y de
tipo salvaje bajo estrés hídrico durante 5 días. Los datos mostrados son±SD desde allí réplica independiente.asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas (Student'st-prueba; *PAG <0,05, **PAG<
0,01).
DISCUSIÓN
ABA es una hormona esencial para la latencia de las semillas, la
apertura de los estomas, el desarrollo de las plantas y la tolerancia al
estrés abiótico. Los niveles de ABA en las plantas están regulados por
sude novo biosíntesis. NCED es la enzima limitante de la velocidad
crítica en la vía biosintética de ABA.OsNCED3es miembro deNCED
familia de genes en el arroz, y aunque la función parcial deOsNCED3
ha sido informado, sus características funcionales nativas en arroz
aún no están claras. Aquí, estudiamos las características funcionales
deOsNCED3al crear con éxitonced3lineas mutantes y OsNCED3-
plantas que sobreexpresan.
Los niveles elevados de ABA o la inhibición de la degradación de
ABA pueden mantener la latencia de las semillas en las plantas (
Martínez-Andújar et al., 2011). ElOsNCED3ortólogo en maíz,VP14,se
expresa específicamente en embriones maduros, y su mutación
resultó en nced3líneas mutantes que mostraron germinación
temprana de semillas (Figura 3B). Estos fenotipos fueron similares al
maíz.vp14 mutante (Schwartz et al., 2003). Otros mutantes deficientes
en la biosíntesis de ABA, incluidososaba1en arroz (Agrawal et al., 2001
) yAtencion6yAtencion9en Arabidopsis, contribuyen a la germinación
de semillas (Lefebvre et al., 2006). Sobreexpresión de genes de la vía
biosintética de ABA, incluidosNpZEP (Frey et al., 2006), Tanced2 (Hijo
et al., 2016),LENCED1 (Tung et al., 2008), y GINCADO1 (Zhu et al., 2007
), ocurre en muchas plantas superiores y promueve la latencia de las
semillas. De este modo,OsNCED3podría regular las enzimas de
biosíntesis de ABA necesarias para la latencia de las semillas
mediante el aumento del contenido de ABA en las semillas.
El ABA endógeno actúa como un modulador dual para el crecimiento y
desarrollo de las plantas. Cuando se acumula un exceso de ABA en los
órganos de la planta, puede inhibir el desarrollo de la planta, pero los
niveles bajos de ABA endógeno a veces pueden promover el crecimiento
de la planta (Cheng et al., 2002). Elnced3líneas mutantes redujeron el
contenido de ABA en las plántulas (Figura 8A), y los brotes y las raíces eran
significativamente más largos que en el tipo salvaje (Figuras 3C–G), pero el
crecimiento deOsNCED3-las líneas que sobreexpresaban no eran
diferentes de las de tipo salvaje, aunque el contenido de ABA era mayor en
OsNCED3- líneas de sobreexpresión (Figura S6 yFigura 9E). Sin embargo, la
expresión ectópica deOsNCED3en Arabidopsis dio como resultado hojas y
nervios centrales más pequeños y redondos en comparación con las
plantas de tipo salvaje (Hwang et al., 2010). Es posible queOsNCED3regula
el desarrollo vegetal en arroz o Arabidopsis a través de diferentes
mecanismos. Además, la Arabidopsis ABA-deficienteaba1 yaba2los
mutantes están marchitos y son pequeños en relación con el tipo salvaje, y
el ABA exógeno podría promover el crecimiento de las plantas enaba1y
aba2plantas mutantes (Barrero et al., 2005; Lin et al., 2007). El arroznced3
los mutantes mostraron un fenotipo diferente, en comparación con los
mutantes deficientes en ABA de Arabidopsis. La abertura superior de los
estomas ennced3mutante posiblemente alteró la transpiración y la
fotosíntesis, por lo tanto produjo este fenotipo diverso. Nuestro
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OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA
Los resultados indican que la modulación precisa de los niveles de ABA juega un
papel importante y positivo en la regulación del crecimiento de las plantas en
condiciones ambientales normales.
ElNCEDLos genes contribuyen a aumentar los niveles de ABA, lo que
promueve la tolerancia al estrés abiótico en las plantas (Bang et al., 2013).
Nuestro estudio muestra que la expresión deOsNCED3fue inducida
significativamente por NaCl y estrés osmótico (Figura 1C). Del mismo
modo, elnced3mutantes eran hipersensibles al estrés por NaCl y PEG (
Figura 4), y exhibió una disminución significativa en la tolerancia al estrés
hídrico (Figura 6A). Además,OsNCED3- las plantas que sobreexpresaban
habían mejorado la tolerancia al estrés hídrico y al NaCl (Figuras 9A–D).
Varios otrosNCEDgenes, incluyendo VP14 (Bronceado et al., 1997),
EnNCED3 (Frey et al., 2012),CsNCED3 (Pedrosa et al., 2017),SGNCADO (
Yang y Guo, 2007), y LENCED1 (Tung et al., 2008) se informó previamente
que alteran la sensibilidad al estrés hídrico si la expresión se inhibe o se
sobreexpresa en las plantas. En condiciones de estrés hídrico, las plantas
sufrieron una transformación fisiológica para adaptarse a las severas
condiciones ambientales. La prolina es un osmolito que puede facilitar la
adaptación a condiciones de deficiencia de agua (Voetberg y Sharp, 1991),
y la fuga de electrolitos es un índice fisiológico que indica la capacidad de
las plantas para resistir el estrés hídrico (Jiang et al., 2016). Nuestros
resultados sugieren que lanced3Los mutantes eran sensibles al estrés
hídrico, lo que posiblemente se puede atribuir al hecho de que tenían un
bajo contenido de prolina y una alta pérdida relativa de electrolitos.
Figuras 5C,D). Los resultados fueron confirmados además por la mayor
tolerancia al estrés hídrico deOsNCED3-plantas que sobreexpresan (Figura
9C). Se observaron observaciones similares en BnNCED3plantas
transgénicas (Xu y Cai, 2017). Además, ABA reduce la pérdida de agua al
regular el cierre de estomas para aclimatarse al estrés hídrico (Finkelstein,
2013). El porcentaje de estomas completamente cerrados ennced3mutante
es mucho menor que las plantas de tipo salvaje bajo estrés hídrico. Esto es
consistente con estudios previos que encontraron quesapk2mutantes
afectan el movimiento estomático dependiente de ABA (Lou et al., 2017).
Este resultado indica que OsNCED3regula positivamente la tolerancia al
estrés hídrico al reducir la pérdida de agua al facilitar el cierre de los
estomas. Además, el contenido de ABA ennced3mutantes fue mucho más
bajo que el medido en plantas de tipo salvaje bajo condiciones de estrés
hídrico (Figura 8B), peroOsNCED3-las plantas que sobreexpresan
acumularon niveles más altos de ABA en comparación con las plantas de
tipo salvaje (Figura 9E) lo cual es consistente con la observación de que
EnNCED3y enNCED5regular la acumulación de ABA bajo estrés hídrico (
Frey et al., 2012). Por otro lado, la transcripción de genes catabólicos ABA
comoosABA8ox1yOsABA8ox3 (Shi et al., 2015), y genes de vías de
señalización comoOsPP2C68, OsABI2, OsRab21,yOsDREB2Ase induce
significativamente para mejorar la adaptación al estrés hídrico en el arroz (
Cui et al., 2011; Chen et al., 2014). Nuestro estudio mostró que los niveles
de expresión de estos genes eran significativamente más bajos ennced3
mutantes, pero obviamente más altos
14 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al. OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA

FIGURA 10 |Fenotipo de senescencia foliar inducida por la oscuridad de secciones de hojas ennced3mutante yOsNCED3-plantas que sobreexpresan. (A)Análisis PCR cuantitativo en tiempo real deOsNCED3
expresión después de 3 días de tratamiento oscuro. Los datos son la media±SD para tres repeticiones. (B)Fenotipo de senescencia de hoja de 8 semanas de edadnced3-1,2
(Continuado)

Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org 15 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162
Huang et al.
FIGURA 10 |y plantas OE-1,2 después de un tratamiento de oscuridad de 3 días. (C)Medición del contenido de clorofila en el niño de 8 semanasnced3-1,2y hojas OE-1,2 después del
tratamiento oscuro. (D)Tinción DAB de desprendimientonced3-1,2y hojas OE-1,2 después del tratamiento oscuro. (MI)Expresión relativa deOsSGR,OsNAP,OsI85, yOsNAC2genes después del
tratamiento oscuro de 3 días en separadonced3-1,2y hojas OE-1,2. Los datos mostrados son±SD de tres réplicas independientes.asteriscosindican diferencias estadísticamente significativas
(Student'st-prueba; *PAG<0,05, **PAG<0,01).
enOsNCED3-plantas sobreexpresadas en comparación con plantas de tipo
salvaje bajo estrés hídrico. Estos resultados indican queOsNCED3 es
responsable de la acumulación de ABA y puede estar regulando
indirectamente la expresión de genes relacionados con el estrés hídrico
dependientes de ABA bajo estrés hídrico.
Un estudio previo mostró que el ABA inducido por el estrés hídrico
desencadenó una elevación de ROS en las plantas para regular la apertura
de los estomas (Yao et al., 2013); Bajo H exógeno2O2tratamiento, el
porcentaje de estomas completamente cerrados ennced3mutante fue
mucho menor que las plantas de tipo salvaje (Figura S4), lo que es
consistente con la observación de quenced3mutantes tenían menor
tolerancia al estrés por oxidación que las plantas de tipo salvaje.
Normalmente, H excesiva2O2estimula el sistema dual de eliminación de
ROS inducido por ABA para resistir el daño por oxidación (Desikan et al.,
2004; Ozfidan et al., 2012). La actividad de SOD y CAT en hojas de tipo
silvestre fue mayor que la actividad enzimática medida ennced3hojas
mutantes bajo H exógeno2O2tratamiento (Figuras 5C,D). Esto es similar a
la observación de que la expresión reducida de la OsABA8ox3resultó en
una disminución de la actividad de la enzima antioxidante y un aumento
del daño oxidativo (Cai et al., 2015). Los resultados para la deficiencia de
ABA en elnced3mutantes indican que estas plantas normalmente evitan el
daño oxidativo aumentando la biosíntesis de ABA a través de una vía que
requiereOsNCED3función de los genes durante el estrés oxidativo.
ABA es un regulador positivo de la senescencia de las hojas. Estudios
previos han demostrado queOsNAC2se une directamente a los
promotores de los genes relacionados con el metabolismo ABAOsNCED3,
OsZEP1,y osABA8ox1,que controlan la producción de ABA en las plantas y
regulan la senescencia de las hojas dependiente de ABA (Mao et al., 2017).
Nuestro estudio indica que la expresión deOsNCED3fue significativamente
inducida por el tratamiento oscuro, y las secciones de hojas de nced3
mutantes tenían hojas más verdes en la oscuridad, peroOsNCED3-
secciones de hojas sobreexpresadas rápidamente se volvieron amarillas en
la oscuridad (Figura 10A,B). Además, los factores de transcripciónOsNAC2
yOsNAPparticipó en el proceso de envejecimiento dependiente de la
biosíntesis de ABA y los genes marcadores de senescencia foliarOsI85y
OsSGR (Chen et al., 2014; Mao et al., 2017). Los niveles de transcripción de
estos genes en hojas tratadas con oscuridad de laOsNCED3- las líneas de
sobreexpresión fueron notablemente más altas que las del nced3mutantes
(Figura 10E). Esto es similar a la observación de que la sobreexpresión de
BnNCED3en Arabidopsis promueve
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Fronteras en la ciencia de las plantas | www.frontiersin.org
OsNCED3 mejora las respuestas de estrés ABA
senescencia de la hoja (Xu y Cai, 2017). En consecuencia, nuestros resultados
confirman aún más queOsNCED3actúa como un regulador clave de la biosíntesis
de ABA y vincula la producción de ABA con la senescencia de la hoja.
Colectivamente, nuestras observaciones encontraron queOsNCED3
controla los niveles de ABA en el arroz para garantizar la latencia, el
crecimiento y la apertura de los estomas de las semillas, al tiempo que
contribuye a las respuestas a las condiciones ambientales severas, lo que
mostróOsNCED3es el regulador clave de la biosíntesis de ABA en el arroz.
Por lo tanto,OsNCED3es fundamental para la mejora de los cultivos.
Además, futuras investigaciones deOsNCED3incluirá determinar cómo
OsNCEDgenes, junto conOsNCED3,participar en otras funciones
fisiológicas que no pudimos observar en elnced3mutante único. Además,
otras nuevas funciones reguladoras deOsNCED3 podría estudiarse
mediante la identificación de sus proteínas que interactúan.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
YH y ML diseñaron los experimentos. YH realizó los experimentos
y escribió el manuscrito. YG, YL y FZ generaron los materiales
transgénicos. ZW, FW y HW brindaron asistencia en el
experimento de preselección de estrés abiótico. DL, SL y DM
modificaron el manuscrito. ML y LC analizaron los datos y
editaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el
borrador final del manuscrito.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos al Dr. Lijia Qu (Facultad de Ciencias de la Vida,
Universidad de Pekín, China) por proporcionar el sistema CRISPR/
Cas9. Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de
Ciencias Naturales de China (Nº 31171473), el Plan de Investigación y
Desarrollo Clave de la Provincia de Hunan (Nº 2016JC2023), el
Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Nº
2016yFD0101107), la Provincia de Hunan Fundación Innovación para
Postgrado (CX2016B171).
MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material complementario de este artículo se puede encontrar en
línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.
00162/full#material-suplementario
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Declaracion de conflicto de interes:Los autores declaran que la investigación se
realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera
interpretarse como un potencial conflicto de interés.
Copyright © 2018 Huang, Guo, Liu, Zhang, Wang, Wang, Wang, Li, Mao, Luan, Liang y
Chen. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de Creative
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18 marzo 2018 | Volumen 9 | Artículo 162