UT. 10.

CULTIVOS CELULARES

1. INTRODUCCIÓN
Nos referimos a células de origen de mamíferos, de humanos, primates, lo ponemos a crecer en
intro no en su ambiente biológico fuera del organismo.

<1.1. TIPOS DE CULTIVOS CELULARES>

Los tipos de diferentes vienen , durante la embriogénesis a partir de hay ay un programa genetico
se dividen en 2,4, 8 16... hasta que al cabo de unos días obtenemos un embrión. Tiposde células
diferenciadas.

La etapa de blastocitos: a las células se les llama blastómeros. El citoa morula tenemos
blastómeros, continua y se llena de líquido, en este estadio se llama blastoctos. En los blastocitos
se distinguen 2 tipsos de células diferentes, unas células externaspeadas a un caparazón se
laman TROFOLASTO (Dan lugar a células extraembionario, corion, placenta)

Las masa células interna son las células que dan lugar a todos los tejido intraembrionarios (el feto
entero.)

Todos proceden de la masa celular interna, todos lo blascocitos se van formando... y

diferenciando. En cualquier organismo, especialmente eucariota tenemos 2 tipos de células
diferentes.

HAY 4 TIPOS DE CÉLULAS MADRE:

• Totipotentes: es una cell madre q puede dar lugar a tejidos intra y extra embrionarios.Es decir a
todos las cells que pueden lar lugar desde el embrionario podemos dar lugar a un organismo
adulto. Porque no podemos generar un embrión viable sin placenta
• Pluripotentes: es una cell madre que pueden dar lugar a todos los tejidos intraembrionarios,
pero no extraembrionarios. (ES cells).
• Multipotentes: son aquellas células madre que peden dar lugar a todas de su tejido y de algún
tejido más. Ejemplo: las células madre ematopoyéticas (HSCs)
• Unipotentes: son cells madres que dan lugar a células de un único tejido. Ejemplo células
basales de la piel solo pueden dar lugar a células de la piel (melanocitos).
HAY 3 TIPOS DE CELULAS DIFERENCIADAS

• Pobremente: hay células poco especializadas llamadas células plasticas (PLASTICIDAD-

Capacidad de realizar muchas fx de las células diferenciadas) ejemplo fibroblastos, pueden
servir de tejido de relleno de un tejido conectivo conjuntivo.
• Moderadamente: pertenecen a un tejido y no están altamente diferenciadas. Ejemplo: un
hematocito (células del hígado)....
• Altamente: es una cell muy muy especializada. Ejemplo: una neurona(impulso nervioso,
neurotransmisores)

Multipotentes y unipotentes son células AScells células de los adultos.

Las células pobremente y moderadamente se pueden poner en cultivo

A medida que avanzamos, perdemos la potencialidad de max a min, son altamente especializadas
pero muy poco potencializadas. Porque las cells totipotentes.

<1.2. APLICACIONES DE LOS CULTIVOS CELULARES>

Vamos a hacer un cultivo celular de levaduras o porque sin microorganimos celulares y so

microorganismo biológicos.--> EXAMEN

<1.1. TIPOS DE CULTIVOS>

Conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos in

vitro, preservando máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas

A. Cultivo de órganos

Mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medo de cultivo artificial y una
atmósfera controlada. La matriz extracelular está formada por colágeno y medio de cultivos. Los
nutrientes van por difusión

1. Tiempo limitado
2. No propagación
3. Crecimiento de células indiferenciadas
4. Estudio de interacciones y relaciones intercelulares
5. Baja reproducibilidad, capa elemento es único, cada cultivo es único en investigación.

Ponemos el órgano entre el medio de cultivo y la atmósfera

B. Cultivos de explantes
Adherir un fragmento de tejido a una superficie (placa frasco de cultivo) y nutrirlo con un medio de
cultivo.

Vamos a diseccionar el órgano y tejido que queremos estudiar.

Explante: fragmento de tejido que produce de un órgano por disección. Separamos el tejido que
queremos estudiar y lo ponemos en cultivo. Lo ponemos en el soporte sólido y en el medio de
cultivo porque lo sumergimos. Crecen cell en un explante.

Crecen las células que están en l periferia que migran a la placa, en monocapa, pegadas van
migrando. Al cabo de unos días podemos quedar con las cellas de tejido.

Desventaja: solo tiempo limitado, solo crecen las células de la periferia, Se adhiere al sustrato (el
sustrato de la placa). Interfase sólido- líquido. Fragmentos de tejidos u órgano. Adhesión al
sustrato. Las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar.

1. Después de la disección después de un proceso de disgregación (va después de la

disección ) Disgregación: Proceso por el cual a partir de un explante, liberamos las células de un
tejido, todas las cells y obtenemos células individuales. Y ponemos las células individuales en
cultivo (todas las células).

CARACTERÍSTICAS:

• Interfase sólido-líquido
• Fragmentos de tejido u órganos
• Adhesión al sustrato
• Las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar

TIPOS DE CULTIVOS

1. Cultivo de órganos
2. Cultivo de explante
3. Cultivo de células de desigregación
4. Cultivo órganotípico: cosiste en cocultivar
diferentes tipos de cells individuales juntas.
Con o sin una matriz orgánica (ej de
colágeno)...

La matriz es un andamio de células. Se formaron una piel capaces de regenerar.

Hay 2 tipos de cultivos:

A. Cultivo celular primario: es la 1ª vez que las ponemos las cells in vitro proceden directamente
del órgano del explante o de disgregación. Fuera de su ambiente fisiológico.

...
Confuencia: es el porcentaje de la superficie de la placa que está ocupado por células. 100%
significa que las células ocupan el 100% en la placa y caben ninguna más.

Las células que crecen en monocapa sufren un proceso de inhibición lateral ya que mandan
señales de que dejen de crecer porque las aplastas.
Cuando las cells hacen una confuencia podemos hacer 2 cosas.

1. Un pase: las cambiamos de placa, las despegamos y la ponemos en 2 placas y dejamos que
crezcan. Cuando llegan a confuencia cambiamos de placa y se deben vovler a activar a partir
del 1er paso hablamos de cultivo 2º.

B. Cultivo secundario: aquel cultivo que procede de un cultivo primario. Podemos mantener un
tiempo dependiendo del tipo de célula.
Hacemos varios cultivos secundario, dependiendo de las células.
A medida que hacemos pases observamos hay el predominio d 1o 2 tipos de células. A lo largo
del tiempo, las células que menos proliferan se van murieron se produce un proceso de selección
celular, al final con el tiempo obtenemos una linea célula primaria.
Linea celular 1a: lo decimos cuando tenemos un tipo de células, células indiferencidas, se han
seleccionado las mejores células. Ha sido selecciona y crece mejor in vitro

Una línea celular 1ia (primaria)es un cultivo secundario.

Llegamos a un punto donde llegan a ala FASE SENESCENCIA (Proceso de envejecimiento,

dejan de crecer, crecen lento, cambian morfológicamente y mueren).
La senescencia depende del tipo de célula.
Los pases son semanas y semanas de cultivo e incluso meses.

Hay alguna manera de alargar el cultivo, en cada pase vamos congelando, células que todavía no
han envejecimiento. Una la usamos para seguir trabajando con ellas y otras para congelar ese vial
(crio tubos). Desde el cultivo primario podemos trabajar para varios años. En cada pase las
células van envejeciendo un poco en el vial tenemos que poner que pase es (pase 1, pase 2,
pase 3).

Como podemos congelar, a partir de la línea 1ia obtenemos una línea celular continua
(TRANSFORMACIÓN O INMORTALIZACIÓN). Y estas células crecen in vitro for ever y nunca
esta en Senescencia.

Hay muchas células que no soportan la inmortalización y cambian funcionalmente.

Ambos tipos de líneas celulares son cultivos secundarios

<1.2. APLICACIONES DE LOS CULTIVOS CELULARES>

• EN INVESTIGACIÓN BÁSICA:

La investigación básica: son investigaciones para ampliar el conocimiento de algo. (Sobre una
patología).

• EN INVESTIGACIÓN APLICADA:
Buscamos una aplicación concreta, un nuevo tratamiento, un nuevo fármaco.

• APLICACIONES MODERNAS:
La medicina regenerativa, cultivos organotípicos o de los organoides.

2. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVOS

<2.1. LA CURVA DEL CRECIMIENTO DEL CULTIVO> IMPORTANTE EXAMEN

Curva de crecimiento-> representación gráfica de la dinámica del crecimiento de un cultivo es
decir, la relación concentración de células y los días de cultivo.
La curva de crecimiento siempre se hace, cada vez que ponemos un nuevo cultivo.
FASE DE LATENCIA: Ponemos células in vitro, las células se están adaptando, alguna células es
posible que se mueran.
FASE EXPONENCIAL: un crecimiento exponencial, las células están continuamente en mitosis y
empiezan a dividirse.
FASE ESTACIONARIA: las células dejan de crecer porque agotamiento del medio de cultivo no
hay más nutrientes, se hiperconcentran las sustancias de desecho. Llegan a confluencia y paran
el crecimiento, se relentizan y para el crecimiento.

Hacemos un subcultivo un pase antes de que llegue a la fase estacionaria (80% de confuencia),
cambiamos de placa. Cada vez que hacemos un pase empezamos de 0, las células deben
hacerse al nuevo medio (24 h). La curva de crecimiento se repite después de cada pase.

<2.2. FORMAS DE CRECIMIENTO>

• CRECIMIENTO EN MONOCAPA:
◦Células dependientes de anclaje: si una cell epitelial que depende del anclaje se despega,
muere por apoptosis llamada anoikis. (Es un tipo especial de apoptosis que se dispara
en las celulas epiteiales cuando pierden el anclaje)

◦Etapas de desarollo:

1. Adhesión a una superficie: corresponde ala fase de latencia, las células por su propio peso
decantan, sedimentan, dependiendo del tamaño de la célula tarda más o menos.
PARAMETRO QUE DEPENDE: Tamaño celular. Cuando son pequeñas mas tardan en
sedimentar, sino sedimentan en 16h mueren. A su vez esta fase fase tiene 3 subetapas:

A. Cell attachment: es el anclaje, las cell sedimentan y se anclan.

B. Cell spreading: una vez anclado al sustrato, el sustrato es parecido a la matiz extracelular.
Tratamos que la base se parezca a la matriz extracelular a células con su citoesqueleto
intenta formar focos de adhesión. No son uniones fuertes. Una vez que se ....
C. Cell adhesión: unión intima entre la célula y el sustrato. Es una unión fuerte, se forma
complejos de proteínas (Focal Adhesión o adhesión focal).
D. Cell De-Adhesion:

2. Proliferación y formación de colonias: coincide con la fase exponencial, las células monocapas
crecen formando colonias. Hasta que llegan 100% de confluencia. 16 a 24 horas.
3. Inhibición por contacto: hasta que llegan 100% de confluencia , activan un programa
informático. Cada célula hace un procesos de inhibición lateral ( es un proceso por el cual se
envían señales de no crecimiento a todas las células vecinas)

Las células tumorales forman focos de crecimiento, es decir crecen hacia otras partes, no sufren
inhibición por contacto o lateral.
• CRECIMIENTO POR SUSPENSIÓN:

◦ETAPAS DE DESAROLLO:

1. Adaptación al medio de cultivo (8-12h)

2. Proliferación en suspensión
3. Inhibición por densidad (cel/ml). Se envían señales inhibidoras por densidad

No entran en Anoikis porque no se pueden adherir. Los macrofagos no se adherien solo migran
por la superficie

Tabla comparativa de formas de cultivo¡¡¡¡

<2.3. COMPORTAMIENTO VITAL TRAS SUCESIVOS

PASES>

• Línea celular primaria:

Comportamiento vital de pases sucesivos

Un vial es un criotubo

En cada pase empieza una nueva curva, es idéntico para

células en suspensión y adhesión.

• Cultivo primario de osteoblastos

• Cultivo de osteoblastos envejecido

• Línea celular continua

◦Transformación de las células normales en inmortales
◦Características de las células transformadas

1. Crecimiento indefinido
2. No son dependiente de anclaje
3. No sufren inhibición por contacto
4. Capacidad invasiva
5. Acumulación de anomalías genéticas
 ◦Métodos de inducción de líneas celulares continuas
◦Si les inducioos ...
‣ Métodos físicos--> Irradiación
‣ Químicos--> Carcinógenos
‣ Genéticos --> Virus (SV-40). Introducir una parte de un genoma viral.

3. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO

<3.1. EL SOPORTE FÍSICO>

• Materiales para cultivo: tiene que estar cargados positivamente, para que se forman las
adhesiones focales
◦Vidrio (Óxido de silicio)
◦Plástico desechable--> Poliestireno
◦Matrices tridimensionales (Colágeno o gelatina para el cultivo de explantes y órganos, las
células van colonizando el colágeno.)
◦Microesferas de sephadex o poliacrilamida, (son microesferas recubiertas de un material que
simula la matriz extracelular, se utiliza para crecer células en monocapa, pero en suspensión.
) ◦Metales (Acero, alu¡iminio, no se usan tanto)

Matrices tridimensionales: Esponjas de celulosa, los andamios de gea¡latina y los coágulos de

plasma.

TRATAMIENTO DE LAS SUPERFICIES

Hay que conocer las células para saber en que soporte ponerlo. Para potenciarmaás la adhesión.

• Proteínas de la MEC: colágeno, laminina, vironectina, fibronectina

• Gelatina, Poli-L-Lisina

<3.2. COMPOSICIÓN Y PROPIEDADES DEL MEDIO DE CULTIVO>--> Examen

1. Aporta todo lo necesario para el completo desarrollo.

2. Generar condiciones microambientales.Condiciones fisicoquímicas para que se desarollen las
células.
3. Acumular temporalmente productos de desecho.

Composición del medio de cultivo:

• Sales minerales: Aportan fuerza iónica, la ósmosis. Semejamos la concentración del liquido
extracelular, linfa.. un medio de cultivo isotónico o ligeramente hipotónico (la célula se hinchan),
medio hipertónico (la célula se deshidrata).

• Tampón/ tampón HEPES y BICARBONATO: el pH neutro a nivel fisiológico, sistemas tampón

para que se mantengan los mas constante posible. A medida que las células crecen y llevan
más días, lo normal es que el cultivo se acidifica, disminuye el Ph paulatinamente. ... sustancias
de desecho.
• Glucosa: (Nutrientes) lo ponemos porque es la fuente de energía.
• Aminoácidos: (Nutrientes), las células sintetizan proteínas.
Los aa esenciales siempre van al medo de cultivo. Los no esenciales.. (falta escribir)

• Vitaminas: muchas actúan como cofactores (B).

• Suplementos orgánicos de bajo peso molecular: el gliceraldehido, piruato.
• Indicador de pH: mirar si ha virado el color o no se usa la fenofltaleína. Si es de color amarillo
se tiene que lavar.

• Hormonas y factores de crecimiento/medio (Mitógenos. Son compuestos químicos que

activan la mitosis en las células)--> Suero descomplementado no definidos no ofrece hormonas
y factores de crecimiento. Se usa 2 tipos de suero (FCS y FBS ). Sistema de complemento es
un sistema de proteínas plasmáticas que destruye las células extrañas. Se incuban 45min a
65ºC así conseguimos que las proteínas desnaturalizan , las de complemento ...

FBS suero bobino fenal a porta proteínas plasmáticas que van ...

Se fijan a la membrana se pegan, las proteínas se reorganizan formando canales en la membrana

abriendo buquetes, y entra una cantidad de agua fluido extracelular.

Tenemos FDS para cultivar células de vaca, hace falta descomplementarlo, no hace falta
descomplementar.

• Antibióticos y antifúngicos (Gentamicina--> Antifúngico, Penicilina/Estreptomicina,

Anfotericina B). Para inhibir bacterias por no haber seguido la esterilidad, es opcional ponerlo
o no, es lo único.
Hay que añadir porque crecen mejor, porque son microorganismos unicelulares.

Ponemos suero porque aporta mitógenos…tenemos que inhibir el suero descomplementado.

<3.2. COMPOSICION Y PROPIEDADES DEL MEDIO DE CULTIVO>

DMEM: multiplica por cuatro la concentración de aa y vitaminas del medio BME Muy útil para
cultivo de hibridoma. Medio de cultivo en general para cualquier célula

PRMI: Estudio de linfocitos, células linfoides estimuladas. Células leucémicas. Con suplementos ..
El medio de cultivo nos permite controlar 4 características fisicoquímicas:

1. PH Se fija con tampones (HEPES +CO2/ HCO3-) y se controla con un indicador de pH. Una
molécula de CO2 se combina con una de agua para formar el ácido carbónico, en solución acq
se disocia y pierde un protón. Cada molécula de CO2, se libera protón y baja el pH y ión
bicarbonato. Se combina para formar el sistema tampón.
Hacemos que se mantenga constante el CO2 con el incubador de CO2.
Todos los sistemas buffer tienen un límite que se van acumulando los H+ y vienen del medio y
hace que se acidifique y tendríamos que cambiar el medio de cultivo.
2. Osmolaridad Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos.
3. Viscosidad no suele ser un parámetro limitante para el crecimiento de las células. Depende
principalmente de la concentración de suero que se use. La concentración del suero suele ser
del
10% para que tengan viscosidad media, podemos subir al 15% o bajar al 5%
4. Tensión superficial Debe mantenerse baja. Es que no se formen burbujas, y las células o
aguanta y revientan, los procedimientos deben ser suaves.

<3.3. ATMÓSFERA GASEOSA>

Es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos; sus dos componentes más importantes
son el oxígeno y el CO2.
Los componentes de la atmósfera del cultivo son controlados por el incubador.

• Oxígeno-> en general, la concentración de oxígeno atmosférico es suficiente para cubrir las

necesidades de cualquier cultivo celular.
• Co2-> la concentración más habituales del 4'5-5%, con un rango entre 2% y 8%. Los
incubadores llevan acopadas botellas de CO2 y un dispositivo de control.
N2-> 78%
O2-> 21%
• - - ->1% (He, CO2, H2O)

<3.4. CONDICIONES DE INCUBACIÓN>

• Control por parte del incubador de las condiciones ambientales óptimas:

◦Temperatura-> Tª = Tasa de crecimiento
◦Humedad-> Objetivo: Evitar evaporación del H2O del medio de cultivo. Si se evapora el H20
se hiperconcentra la glucosa, los aa..
‣ 1. Evitar la hiperconcentración
‣ 2. Evitar la hiperosmolaridad
‣ 3. Evitar variaciones de pH

4. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR

<4.1. DISGREGACIÓN CELULAR>

Objetivo-> separar las células entre sí y de la matriz extracelular en la que se encuentran

inmersas. Requiere de 2 procesos sucesivos:
1. La disgregación celular
2. La selección de células

A. Métodos de disgregación celular.

Los métodos mecánicos se basan en cortar, picar e incluso triturar suavemente fragmentos de
órgano o tejido colocados en una placa de Petri con tampón o medio de cultivo, en el que se
recogen las células disgregadas tras filtrarlo para retirar los restos de tejido.

Disgregación celular = disociación celular

• Entre las proteasas más utilizadas están la tripsina, la proteinasa K, la colagenasa, la dispasa,
la papaína, la elastasa y la pronasa.
• Las soluciones enzimáticas se pueden combinar con EDTA (se usa para retirar el magnesio),
que al retirar los cationes de Ca2+ que estabilizan las uniones entre las proteínas de matriz y
las células, favorece su disgregación.

Las proteínas de unión necesitan calcio, si añadimos EDTA retiramos poco a poco todo el Ca del
medio, y debilitamos las uniones, ademas de las proteasas, retiramos el calcio que debilita las
uniones.

B. Selección de las células

Se basa en:
• Propiedades específicas de las células-> se separan por su distancia adhesión a sustratos.
• Métodos inmunológicos de selección de células-> Uso de anticuerpos espécificos que
reconocen ..

<4.2. RECUENTO Y VIABILIDAD CELULAR>

Una vez obtenida la suspensión celular de partida, para iniciar el cultivo celular es
imperativo conocer su densidad celular, es decir, el número de células por mL. Para ello:

1. Se utiliza un colorante vital-> Azul tripán (0,4% en PBS) siempre

2. Se realiza el contaje en cámara de Neubauer.

Se hace una dilución, obtenemos una alicuota más diluida, y hay menos células y añadimos un
vol=20microL + el mismo vol de Tripán Blue (20microL)

Procedimiento:
1. Diluir la suspensión celular al 50% con una disolución

<4.3. OTROS PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR>

La descongelación debe ser paulatina
• Descongelación de células: Es un procedimiento habitual del lab de cultivos celulares para
iniciar cultivos secundarios, a partir de líneas celulares mantenidas en congelación, en N2
líquido o a -80ºC.
• Inicio del cultivo (siembra): partiendo de una suspensión celular obtenida por disgregación,
selección o descongelación, el cultivo se inicia sembrando un número determinado de células.
• Mantenimiento del cultivo: el mantenimiento de los cultivos consiste en diferentes operaciones
para el control de su viabilidad y crecimiento. Las operaciones más habituales son
◦Control periódico microscópico: se controlan con la periocidad que se estimula oportuna (1 y
3 días), para lo cual se retiran del incubador (si son cultivos ventilados hay que cerrarlos) y se
examinan con un microscopio invertido para observar el aspecto y el crecimiento de las
células.
◦Cambio de medio: la operación de mantenimiento es el cambio de medio de cultivo, para
renovar los nutrientes consumidos por las células y retirar los productos de desecho
generados por el metabolismo celular.
◦Subcultivo o pase: tras un cierto tiempo de cultivo (6-7 días), los cultivos en monocapa se
encuentran en situación de confluencia y los cultivos en suspensión alcanzan una densidad
crítica. En ambos casos el crecimiento se detiene y hay que realizar un subcultivo o pase
‣ Cultivos en suspensión: se realiza un recuento de viables y se calcula el factor de
dilución necesario para que la densidad celular sea la adecuada para reiniciar el
crecimiento.
‣ Cultivo e monocapa/tripsinización: es necesario despegar las células de la superficie
del recipiente para poder hacer el pase. Esto se puede hacer por métodos mecánicos,
con un rascador, pero el procedimiento más habitual es la tripsinizacion.
Tripsinización: es el procedimiento de despegado de una monocapa de células de la
superficie del recipiente mediante una solución de tripsina/ EDTA.
• Conservación de células -> en suero animal + 10% de DMSO. Congelación progresiva

1. Congelación - en N2 a -196ºC
Medio de congelación:

◦Medio de cultivo + DMSO (10%)

◦FBS + 10% DMSO

COOLER: Es una cubeta tapa a rosca, se mete los viales o crioviales, y lo llenamos con
Isopropanol
• Isopropanol a -80ºC-> de 37ºC a -80ºC las células pasan de 37ºC a -80ºC paulatinamente,
0'1ºC/ min con el cooler mínimo 24-48h.,...
A las 48h aprox nos lo llevamos al tanquede N2 y pueden estar durante años.

Para llevarla a cabo se hace un recuento de viables. Se retira el medio de cultivo por
centrifugación y se sustituye por un volumen adecuado de suero animal y un 10% de DMSO. Una
densidad celular final en el medio de congelación aceptables es alrededor de 106 células/ml. Esta
suspensión se alícuota en criotubos y se procede a congelación progresiva;
 -20ºC durante 24h
  -80ºC durante 24h más
 Nitrógeno líquido indefinidamente

DESCONGELACIÓN
Pasamos -196ºC a 37ºC, a baño a 37ºc aprox 1 min ,descongelación rápida tiene que ser
rápida por el DMSO es tóxico a tª ambiente, recogemos las cells y se ponen e 50 ml de
medio de cultivo ayuda a diluir DMSO, lo mezclamos y deja de ser tóxico.

Cultivos celulares

Micoplasmas: bacterias pequeñas no tienen pared celular y son difíciles