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Vacuna 39 (2021) 2110–2116

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Vacuna

página de inicio de la revista: www.elsevier.com/localize/vaccine

Evaluación de las respuestas de células T CD4 (+) y CD8 (+) específicas de SARS-CoV-2
utilizando tetrámeros MHC de clase I y II

Yuri Poluektova, Marybeth Jorgeb, Pirouz Daftarianb, Marc C. Delcommennea,⇑

aMBL International, 15A Constitution Way, Woburn, MA 01801, Estados Unidos
bJSR Life Sciences, 1280 N Mathilda Ave, Sunnyvale, CA 94089, Estados Unidos

información del artículo abstracto

Historial del artículo: El éxito de las vacunas contra el SARS-CoV-2 (CoV-2) se mide por su capacidad para generar respuestas de memoria
Recibido el 4 de julio de 2020 inmunitaria que son duraderas. Para lograr este objetivo, es importante identificar sustitutos de la protección
Recibido en forma revisada el 28 de febrero de 2021
inmunológica, a saber, fragmentos/epítopos inmunodominantes de CoV-2 MHC Clase I y II y metodologías para
Aceptado el 2 de marzo de 2021
medirlos. Aquí, presentamos los resultados de QuickSwitch MHC Clase I y II basado en citometría de flujoTM
Disponible en línea el 5 de marzo de 2021
plataformas para evaluar las afinidades de unión del péptido SARS-CoV-2 a varios alelos humanos, así como al alelo
de ratón H-2 Kb. Múltiples aglutinantes potenciales del MHC del SARS-CoV-2 fueron examinados y validados
Palabras clave:
mediante pruebas QuickSwitch. La selección incluyó 31 péptidos MHC Clase I y 19 MHC Clase II predichos como
SARS-CoV-2
buenos aglutinantes por el recurso web IEDB proporcionado por NIAID. Mientras que varios péptidos pronosticados
Vacuna
CMH con una Kd teórica aceptable mostraron ocupaciones de MHC deficientes, catorce péptidos de MHC de clase II y tres
péptido de MHC de clase I mostraron promiscuidad en el sentido de que se unen a múltiples tipos de moléculas de MHC.
Cambio rápido Además de proporcionar datos importantes para el estudio del virus SARS-CoV-2 y sus epítopos antigénicos
Intercambio de péptidos presentados, los péptidos identificados en este estudio pueden usarse en la plataforma QuickSwitch para generar
tetrámeros MHC. Con esos tetrámeros,
- 2021 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción
Si bien varios medicamentos antivirales o terapias con anticuerpos
pasivos son enfoques atractivos como puente hacia una vacuna, el consenso
es que la inmunización y el desarrollo de una memoria inmune duradera
contra el SARS-CoV-2 es una tarea inevitable que enfrenta la comunidad
científica actual.[1]. La investigación básica para descubrir los mecanismos
exactos de cómo el sistema inmunitario humano percibe y contrarresta el
virus SARS-CoV-2 ha sido más difícil. En el esfuerzo por combatir este brote,
se necesita una mayor comprensión de cómo las proteínas virales y sus
péptidos procesados estimulan las respuestas inmunitarias mediadas por
los linfocitos T CD8+ y CD4+. Si bien se ha llevado a cabo una gran
investigación con una rapidez impresionante para determinar los péptidos
virales específicos que conducen a una respuesta eficaz de las células T,
muchas de las células T reactivas al SARS-CoV-2 identificadas también se
encontraron en donantes sanos.[2,3]. Esto, a su vez, plantea aún más
preguntas sobre la naturaleza de los péptidos virales necesarios para
generar una respuesta inmunitaria eficaz. En
Abreviaturas:PEF, Factor de intercambio de péptidos.
⇑Autor para correspondencia en: MBL International, 15A Constitution Way, Woburn,
MA 01801, Estados Unidos.
Dirección de correo electrónico:marc.delcommenne@mblintl.com (MC Delcommenne).
Además, esto crea una necesidad vital de una forma rápida y efectiva de
generar varios tetrámeros de MHC necesarios para detectar las numerosas
células T específicas que se investigarán mientras se intenta determinar los
mejores péptidos virales posibles que estimularían las células T más
efectivas.
La capacidad de un péptido para estimular el sistema inmunitario se deriva de
propiedades tales como la disponibilidad del receptor de células T adecuado, la
capacidad de procesamiento del antígeno por parte del sistema de procesamiento
del antígeno que podría generar el péptido en cuestión y la capacidad del péptido
para ocupar la hendidura del MHC. molécula[4,5]. Se ha observado que más del
80% de los péptidos unidos a MHC de clase I derivados de un virus pueden ser
inmunogénicos[6]. Al menos en el caso de los péptidos virales, los péptidos que
tienen una alta afinidad de unión a las moléculas MHC Clase I también tienden a
ser inmunogénicos.[7,8]. Para ello, utilizamos la plataforma de presentación de
antígenos QuickSwitch (MBL International) basada en el principio de intercambio
de péptidos[9]. Esta plataforma permite a los usuarios cuantificar la capacidad
relativa de las moléculas del MHC para unirse a un péptido en particular, así como
generar un tetrámero del MHC que se puede usar para teñir las células T en
experimentos de citometría de flujo. El sistema se basa en un péptido de unión
débil e irrelevante, llamado péptido de salida, que viene precargado en la
molécula MHC recombinante que desea estudiar. Cuando la molécula QuickSwitch
MHC se presenta con un competidor

https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2021.03.008 0264-410X/-
2021 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
Y. Poluektov, M. George, P. Daftarian et al.
péptido, el péptido existente será reemplazado proporcionalmente a la
afinidad de unión al MHC del péptido competidor. Además, en cada kit se
incluye un anticuerpo marcado con FITC contra el péptido existente para
que la extensión del intercambio de péptidos se pueda medir mediante un
procedimiento de citometría de flujo simple con perlas magnéticas
específicas para la molécula MHC que se está analizando. En este breve
estudio, nos gustaría informar cómo se puede usar la plataforma
QuickSwitch para evaluar la capacidad de los péptidos del SARS-CoV-2 para
unirse a varias moléculas MHC. Esta breve recopilación de hallazgos ayuda a
evitar experimentos innecesarios con péptidos del SARS-CoV-2 que las
moléculas del MHC no pueden presentar y permite la construcción de
tetrámeros del MHC en funcionamiento que se pueden usar para la tinción
productiva de células CD8+ y CD4+.
2. Materiales y métodos
Las pruebas de unión de péptidos para determinar la afinidad del
péptido por un haplotipo MHC específico se realizaron en 50metrog/mL
(concentración de MHC) solución de tetrámeros para las moléculas de MHC
Clase I o una solución de 100metroSolución g/mL de moléculas MHC
biotiniladas recombinantes para MHC Clase II. Si bien es posible obtener
resultados de intercambio de péptidos válidos al disminuir aún más la
concentración de tetrámero o monómero, no se recomienda, ya que
algunos haplotipos de MHC son mucho más sensibles a la dilución que otros
y generan resultados diferentes según la concentración de MHC.
2.1. Procedimientos de intercambio de péptidos MHC Clase I
Todos los intercambios de Clase I se realizaron de acuerdo con los
procedimientos estándar diseñados para cada kit QuickSwitch. Brevemente,
50metroL del tetrámero a 50metrog/ml se mezcló con 1metroL de péptido
diluido a 1 mM en H2O y 1metroL del Factor de Intercambio de Péptidos
(PEF) patentado correspondiente al haplotipo MHC particular. HLA-A*02:01,
HLA-A*24:02 y H-2 Kb recibidos 1metroL de factor de intercambio peptídico
n.º 1 (PEF n.º 1) (MBLI: KXT-T07050). HLA-A*11:01 recibió 1metroL de factor
de intercambio peptídico n.° 2 (PEF n.° 2) (MBLI: KXT-T07051). Y HLA-A*03:01
recibió 1metroL de factor de intercambio peptídico n.° 3 (PEF n.° 3) (MBLI:
KXT-T07052). La solución resultante, que contiene 50metrog/mL tetrámero,
20metroPéptido M para ser cargado en la molécula MHC y 1metroL del
factor de intercambio peptídico se incubó en una placa de PCR de 96 pocillos
de fondo cónico durante 4 ha temperatura ambiente (-22ºC). Puede
encontrar una descripción más detallada de los procedimientos estándar en
MBL International QuickSwitchTM
Hoja de datos del kit Quant Tetramer.
2.2. Ensayo de captura para determinar la afinidad de unión de un péptido por un
haplotipo MHC particular
Después de la incubación, se determinó el porcentaje de moléculas de
MHC que se cargaron con el péptido de prueba del total de moléculas de
MHC que contenían el péptido existente realizando un ensayo de captura
descrito en MBL International QuickSwitchTMHoja de datos del kit Quant
Tetramer. Brevemente, 20metroL de perlas magnéticas unidas con un
anticuerpo anti HLA-ABC (MBLI: KXT-T07100 proporcionado en el kit) se
agregaron a los pocillos de muestra de una placa de microtitulación de 96
pocillos con fondo en V con 5metroL de la solución de intercambio de
péptidos tetrámeros (de los 52metroL volumen total). La microplaca se agitó
durante 45 min a 550 RPM, se protegió de la luz con una lámina de papel de
aluminio. Después de la incubación con agitación, todos los pocillos de las
muestras se lavaron con 150metroL de tampón de ensayo (MBLI: KXT-
T07000 proporcionado en el kit, debe diluirse 1:10 antes de su uso),
utilizando las cualidades magnéticas de las perlas dejándolas sedimentar
mientras la placa está inmovilizada en una bandeja magnética. El exceso de
tampón se decantó fuera de la placa agitándolo mientras se sujetaba
firmemente a la bandeja magnética. Después del enjuague cada pocillo
2111
Vacuna 39 (2021) 2110–2116
recibido 25metroL de solución de FITC-anticuerpo peptídico existente (MBLI:
KXT-T07200 proporcionado en el kit, debe diluirse 1:25 antes de su uso). La
microplaca que contenía las perlas magnéticas con los tetrámeros MHC
unidos y el anticuerpo peptídico saliente se volvió a agitar durante 45 min a
550 RPM, protegida de la luz con una hoja de papel de aluminio. Las
muestras se lavaron con otras 150metroL de volumen de tampón de ensayo
y resuspendido en 150metroL de tampón de ensayo antes de registrar las
señales fluorescentes de cada muestra en un citómetro de flujo.
2.3. Procedimientos de intercambio de péptidos MHC Clase II
Para el intercambio de péptidos MHC Clase II, seguimos los
parámetros de los kits de tetrámeros QuickSwitch Quant HLA-
DRB1*01:01, HLA-DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01. 25metroL de 100
metroSe mezcló g/mL de molécula QuickSwitch MHC Clase II biotinilada
con 3metroL de stock de péptido diluido a 10 mM en DMSO al 100 % y 2
metroL de emulsionante n.º 1 (MBLI: KXT-T07070 incluido en el kit). La
solución resultante, que contiene 100metrog/ml Molécula MHC Clase II,
péptido 1 mM (o diluciones diez veces) para cargar en la molécula MHC
Clase II y 2metroSe incubó L del Emulsifier #1 patentado en una placa
de PCR de 96 pocillos de fondo cónico durante la noche (>10 h) a 37 °C.
El ensayo de captura se realizó con procedimientos casi idénticos a los
utilizados para los tetrámeros MHC Clase I. 25metroSe usaron L de perlas
magnéticas conjugadas con estreptavidina (MBLI: KXT-T07101 proporcionada en el
kit) para capturar 1metroL de los 30metroL MHC Clase II reacción de intercambio
de péptidos. Las moléculas de MHC fueron capturadas por las perlas magnéticas
después de agitar la placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo en V
durante 45 min a 550 RPM. Siguiendo un 150metroL lave con tampón de ensayo
de intercambio de péptidos n.º 2 (MBLI: KXT-T07001 proporcionado en el kit, debe
diluirse 1:10 antes de usar) las moléculas de MHC Clase II intercambiadas se
tiñeron con 25metroL del anticuerpo peptídico existente-FITC (MBLI: KXT-T07201
proporcionado en el kit). Se permitió que el anticuerpo tiñera las moléculas de
MHC Clase II capturadas agitando la placa durante 45 min a 550 RPM. A
continuación, las cuentas se lavaron con otros 150metroL de tampón de ensayo de
intercambio de péptidos n.º 2 y resuspendido en 150metroL de tampón de ensayo
antes de registrar las señales fluorescentes de cada muestra en un citómetro de
flujo.
2.4. Cuantificación del intercambio de péptidos por citometría de flujo
Los experimentos se realizaron en el instrumento de citometría de
flujo CytoFLEX LX (Beckman Coulter). Los voltajes, ganancias y umbrales
de FSC y SSC se ajustaron de modo que las perlas magnéticas utilizadas
para el ensayo de captura se detectaran como una población única
separada de las señales de fondo. A continuación, se usó el citómetro
de flujo para medir la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la
señal de FITC que resultó de la unión del anticuerpo peptídico existente
a los tetrámeros de MHC capturados en las perlas magnéticas.
2.5. péptidos
Todos los péptidos para estos experimentos sintetizados al nivel de
pureza del 95 % se adquirieron de KareBay Biochem, Monmouth NJ. Los
péptidos se diluyeron a stocks 10 mM en DMSO al 100 % y se almacenaron a
-20ºC. Se realizaron más diluciones de péptidos antes de cada experimento
de unión con HPLC de grado H2o
2.6. Predicción in silico de afinidades de unión de péptidos para moléculas MHC
Todas las afinidades de unión teóricas se derivaron del recurso web
Immune Epitope Database (IEDB) financiado por NIAID. Este sitio web
cataloga datos experimentales sobre anticuerpos y epítopos de células
T resultantes de numerosos estudios en el contexto de enfermedades
infecciosas, alergias, autoinmunidad y trasplantes. Los datos
acumulados luego se compilan y analizan para permitir la pre-
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dicción de las afinidades de unión de péptidos para moléculas MHC combatir infecciones o enfermedades, especialmente cuando se trata de
específicas. Los métodos IEDB ANN y SMM-align se utilizaron moléculas MHC Clase II[12]. Los siguientes resultados, obtenidos con moléculas
respectivamente para la predicción de MHC de clase I y II.[10,11]. MHC recombinantes (MBL International), pueden usarse en el futuro para
determinar la naturaleza de las respuestas inmunes de las células T al SARS-CoV-2
Tabla de recursos clave sin cuestionar qué secuencias de péptidos virales pueden presentarse por qué
moléculas MHC. Además, simplificará la generación de tetrámeros MHC
REACTIVO FUENTE PRODUCTO
personalizados con péptidos que han demostrado ser buenos aglutinantes. Si bien
NÚMERO
la plataforma QuickSwitch solo puede modelar los procesos reales de
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7300-K1 presentación de antígenos que ocurren dentro de una célula, un informe técnico
HLA-A*02:01 Tetrámero Corporación reciente que describe la respuesta inmune del ratón a una proteína recombinante
Kit-PE Spike-Fc del SARS-CoV-2 ha demostrado que la mayoría de los tetrámeros H-2 Kb
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7306-K1 QuickSwitch intercambiado con péptidos SARS-Cov2 reaccionado con células T
HLA-A*03:01 Tetrámero Corporación CD8 de estos ratones[13].
Kit-PE Uso de HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, HLA-A*11:01 y H-2
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7304-K1 Kb QuickSwitchTMQuant Tetramer Kits, pudimos identificar una serie de
HLA-A*11:01 tetrámero Corporación péptidos que se unían a cada haplotipo MHC (tabla 1). Los péptidos del
Kit-PE SARS-CoV-2 identificados desplazaron efectivamente al péptido
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7302-K1 existente que se seleccionó para cada haplotipo de MHC individual para
HLA-A*24:02 Tetrámero Corporación disociarse fácilmente de la molécula de MHC para permitir la unión de
Kit-PE péptidos incluso moderadamente fuertes. Cuando más del 75% del
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7400-K1 péptido existente se intercambia con un péptido diana, el tetrámero
Tetrámero H-2 Kb Corporación resultante puede usarse para la tinción de células T CD8+. Una tasa de
Kit-PE intercambio superior al 90 % corresponde a afinidades de unión en el
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7500-K1 rango nanomolar bajo, mientras que las tasas de intercambio inferiores
HLA-DRB1*01:01 Corporación al 65 % son indicativas de interacciones péptido-MHC débiles (datos no
Kit Tetrámero-PE mostrados). En contraste con los péptidos de unión a MHC de clase II,
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7502-K1 existe muy poca promiscuidad de unión entre los alelos de clase I con
HLA-DRB1*04:01 Corporación una notable excepción: HLA-A3 y HLA-A11.
Kit Tetrámero-PE
Cambio rápidoTMcantidad MBL Internacional TB-7506-K1
HLA-DRB1*15:01 Corporación Para abordar estudios similares en modelos de ratón, intentamos evaluar la
Kit Tetrámero-PE utilidad de la plataforma en un haplotipo MHC de ratón. Se ensayó un conjunto de
péptidos de unión fuerte predichos en cuanto a su capacidad para cargar en
tetrámeros MHC H-2 Kb. Los péptidos de SARS-CoV-2 específicos de H-2 Kb de
ratón se pueden usar para el inmunomonitoreo de células T en modelos de ratón
de estudios de COVID-19[12]. Curiosamente, también se determinó que dos de los
2.6.1. Preparación de tetrámeros MHC de clase II con monómeros intercambiados con péptidos H-2 Kb identificados eran buenos aglutinantes de HLA-A*02:01 (Tabla 2).
péptidos
25metroL de monómeros MHC Clase II QuickSwitch se mezclaron con 2 Las relaciones de intercambio exactas de las moléculas de tetrámero-PE HLA-
metroL de emulsionante, 3metroL de péptidos COVID-19 10 mM así como el A*02:01 analizadas con cada péptido del SARS-CoV-2 se pueden visualizar en
control negativo, el péptido CLIP. Cada monómero de intercambio peptídico Figura 1. Todas las relaciones de intercambio de HLA-A*02:01 después de una
(30metroL) se mezcló con 10metroL estreptavidina-PE. Luego se mezclaron incubación de 4 horas se pueden comparar con la relación de intercambio del
los tetrámeros con 10metroL Neutralizador. péptido de referencia HLA-A*02:01 (Figura 1, última barra del gráfico). Este
péptido ha sido específicamente seleccionado y diseñado para tener una de las
2.6.2. Estimulación de PBMC y tinción de células T CD4+ con tetrámeros MHC de interacciones más fuertes con el surco de unión del péptido de la molécula HLA-
clase II A*02:01. El péptido de referencia puede intercambiar una cantidad significativa
Se cultivaron PBMC de donantes sanos que expresaban HLA- del péptido existente incluso cuando menos de 1metroM de él se utiliza para la
DRB1*01:01, HLA-DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01 durante 2 semanas a reacción de intercambio.
1 106células por ml en medio Aim V (Thermofisher) con IL-2 Como ilustración de la eficacia de los algoritmos de predicción in silico,
suplementado a 50 U/ml y suero AB humano al 5 % y estimulado con comparamos la afinidad de unión teórica de los péptidos estudiados
péptidos SARS-CoV-2 cada uno a 10metrog/mL. determinada por IEDB y la relación de intercambio de péptidos resultante
del ensayo QuickSwitch. Si bien la mayoría de los péptidos que se determinó
3. Resultados que tienen valores de Kd nanomolar bajos se intercambian fácilmente con el
péptido existente de la molécula HLA-A*02:01, incluso entre los péptidos
Se probó la capacidad de varios péptidos derivados del virus SARS-CoV-2 que hemos probado hay algunas excepciones. Algunos péptidos con valores
como aglutinantes potenciales para las moléculas MHC. Usando los métodos de Kd teóricos bajos muestran una baja capacidad de unión al ensayo
SMMAlign y ANN del recurso web IEDB, se determinaron las afinidades de QuickSwitch HLA-A*02:01 y algunos péptidos que teóricamente deberían ser
unión teóricas IC50 de los péptidos derivados del proteoma viral a cada una malos aglutinantes muestran una alta capacidad de unión a HLA-A*02:01 (
de las moléculas MHC analizadas.[10,11]. Luego, se cargaron algunos Figura 2). Son esos valores atípicos, los que pueden contener la mayor
péptidos específicos del SARS-CoV-2 con una alta afinidad de unión teórica información sobre cómo el sistema inmunitario puede estar sesgado para
por las moléculas del MHC en cuestión en las moléculas del MHC utilizando resolver una infección o patología y nuestra plataforma QuickSwitch
los parámetros de los kits QuickSwitch. proporciona un mecanismo eficaz para identificarlos.
La predicción in silico, si bien es una herramienta indispensable para los Probamos 19 péptidos SARS-CoV-2 seleccionados con el recurso web
estudios modernos sobre la estimulación de células T, no siempre predice el IEDB por su capacidad para unirse a moléculas recombinantes HLA-
péptido correcto que podría unirse al surco de unión de péptidos de la DRB1*01:01, HLA-DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01. Todos los péptidos
molécula MHC, sin mencionar, estimular las células T necesarias para seleccionados tenían 15 aminoácidos de longitud con varios enlaces

2112
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tabla 1
Resumen de la unión del péptido SARS-CoV-2 a moléculas MHC de clase I humanas.

HLA-A2 HLA-A3 HLA-A11 HLA-A24

FLAHIQWMV SARS-CoV-2 ORF1ab (3122–3130) SARS-CoV-2 ORF1ab +

FLLNKEMYL (3183–3191) SARS-CoV-2 ORF1ab (6749–6758) SARS- +
LLLDDFVEI CoV-2 ORF3a proteína (139–147) SARS-CoV-2 ORF1ab +
LLYDANYFL (3732–3740) SARS-CoV-2 ORF1ab (3710–3718) SARS- + +
SMWALIISV CoV-2 ORF1ab (6419–6427) SARS-CoV-2 ORF1ab (6851– +
TLMNVLTLV 6859) SARS-CoV-2 ORF3a proteína (107–115 ) Cadena A +
YLDAYNMMI del SARS-CoV-2, glicoproteína espiga (424–433) +
YLNTLTLAV Poliproteína ORF1ab del SARS-CoV-2 (5583–5591) +
YLYALVYFL ORF1ab del SARS-CoV-2 (2192–2200) +
KLPDDFTGCV +
ISDEFSSNV +
ASMPTTIAK + +
KSAGFPFNK SARS-CoV-2 ORF1ab (4892–4900) + +
KTFPPTEPK Fosfoproteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 (362–370) + +
STFNVPMEK SARS-CoV-2 ORF1ab (2600–2608) + +
TTIKPVTYK SARS-CoV-2 ORF1ab (1875–1883) + +
DYVYNPFMI SARS-CoV-2 ORF1ab (6159–6167) +
FYGGWHNML SARS-CoV-2 ORF1ab (4986–4994) +
NYLKRRVVF SARS-CoV-2 ORF1ab (3159–3167) +

Tabla 2
Resumen de la unión del péptido SARS-CoV-2 a moléculas MHC H-2 Kb de ratón.

H-2 Kb HLA-A*02:01

VNFNFNGL SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (539–546) +

MAYRFNGI SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (902–909) +
INITRQTL SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (233–241) +
VVLSFELL SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (511–518) +
SIVRFPNI SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (325–332) +
GNYNYLYRL SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (447–455) +
VVFLHVTYV SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína de pico (1060–1068) + +
SIIAYTMSL SARS-CoV-2 Cadena A, glicoproteína espiga (691–699) + +
VTQLYLGGM SARS-CoV-2 ORF1ab poliproteína (5385–5393) SARS-CoV-2 +
ITGLYPTL ORF1ab poliproteína (5573–5580) SARS-CoV-2 Cadena A, +
AAYYVGYL glicoproteína de pico (263–270) SARS-CoV-2 Cadena A, +
YNYLYRLF glicoproteína de pico (449–456) +

ing afinidad a cada una de las tres moléculas de Clase II. A diferencia de la
plataforma QuickSwitch de clase I, el intercambio de péptidos de clase II no
se puede probar directamente en un tetrámero conjugado con fluorocromo
y el intercambio de péptidos debe realizarse en moléculas MHC de clase II
recombinantes biotiniladas antes de tetramerizarlas siguiendo las pautas del
kit. Como péptido de referencia para todas las moléculas HLA-DR analizadas,
utilizamos la secuencia corta del CLIP87-101
péptido – PVSKMRMATPLLMQA. Aunque generalmente se cree que CLIP es
un aglutinante moderado de moléculas MHC Clase II[14], hemos encontrado
consistentemente que su forma corta de 15 aminoácidos interactúa
fuertemente con las moléculas recombinantes HLA-DRB1*01:01, HLA-
DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01 utilizadas para producir tetrámeros MHC. La
mayoría de los péptidos probados se unieron igualmente bien a las tres
moléculas de Clase II (Fig. 3). Algunos de los intercambios de péptidos se
repitieron con 100 y 10metroM del péptido competidor. Los péptidos
RAMPNMLRI-MASLVL y SEFSSLPSYAAFATA se intercambian igualmente bien
a 10metroM y 1 mM, lo que indica que se unen fuertemente a los tres alelos
(datos no mostrados). Por el contrario, los péptidos IWLGFIAGLIAIVMV,
LLLLDRLNQLESKMS y LAFVVFLLVTLAILT solo se unieron a algunas de las
moléculas HLA-DR cuando se usaron a la concentración de 1 mM para la
reacción de intercambio (Fig. 3) y no mostró cambio en el 100 o 10metro
Concentración de M (datos no mostrados). Las moléculas HLA-DR parecen
tener menos restricciones para la unión de péptidos que las moléculas MHC
Clase I que hemos probado. No todos los péptidos se presentarán por igual
en las moléculas MHC de origen natural, ya que algunos de ellos se
seleccionarán frente al sistema de procesamiento y presentación de
antígenos. Para imitar completamente los péptidos naturales, se tendrá que
usar alguna forma de modelo bioquímico de procesamiento de antígenos in
vitro para determinar qué péptidos pueden realmente
ser presentado por el sistema de presentación de antígenos[15–17].
Los monómeros de MHC de clase II generados por el intercambio de
péptidos con péptidos del SARS-CoV-2 se usaron para hacer tetrámeros
de MHC efectivos para la tinción de células T CD4+. Se usaron cultivos
estimulados con péptido SARS-CoV-2 de PMBC de individuos sanos para
la tinción de tetrámero (Figura 4). El porcentaje de linfocitos T CD4+
positivos para tetrámero de 3 donantes sanos diferentes teñidos con
tetrámeros HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01
construidos con el péptido de pico TRFQTLLALHRSYLT fue
significativamente mayor que con tetrámeros construidos con otros
péptidos SARS-CoV-2, lo que confirma que este péptido es promiscuo
entre individuos[18]. Los tetrámeros HLA-DRB1*01:01 teñían un mayor
porcentaje de células T CD4+ en comparación con los tetrámeros HLA-
DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01 creados con los mismos péptidos del
SARS-CoV-2. Esto puede deberse a la mayor afinidad de unión teórica
de estos cinco péptidos hacia HLA-DRB1*01:01 que hacia los otros dos
alelos del MHC de clase II, lo que lleva a una activación y expansión más
vigorosa de las células T en HLA-DRB1*01:01 individuos La presencia de
células T específicas de SARS-CoV-2 de individuos sanos, como se
muestra en estos datos de tinción, podría explicarse por la reactividad
cruzada de TcR contra péptidos de coronavirus endémicos comunes[3].
4. Discusión
Existe la preocupación de que algunos investigadores de vacunas se centren
solo en las respuestas humorales para establecer la potencia y la eficacia de sus
vacunas CoV-2. Esta preocupación se deriva del hecho de que la durabilidad y la
potencia de las vacunas contra el SARS-CoV-2 están determinadas parcialmente

2113
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Figura 1.Intercambio de péptidos de SARS-CoV-2 con moléculas QuickSwitch HLA-A*02:01 Tetramer-PE. 50metroSe usaron moléculas de HLA-A*02:01 acopladas con g/mL tetramerizadas y R-ficoeritrina
para el experimento de intercambio de péptidos. Todas las moléculas HLA-A*02:01 se cargaron con un péptido existente y se incubaron con 20metroM de péptidos competitivos de SARS-CoV-2 durante
4 h a temperatura ambiente (-23 °C) en presencia de un volumen determinado por el kit del Factor de intercambio de péptidos n.º 1 (PEF n.º 1). A continuación, se determinó la cantidad de péptido
existente eliminado de la molécula de MHC siguiendo un ensayo de captura y se representó en el eje vertical para cada péptido probado.

Figura 2.Afinidad de unión teórica de los péptidos del SARS-CoV-2 a HLA-A*02:01 en comparación con la unión práctica a una molécula MHC recombinante tetramerizada. Los valores
teóricos de Kd de la unión del péptido SARS-CoV-2 a las moléculas HLA-A*02:01 según lo determinado por el recurso web IEDB se representaron frente a los valores de intercambio del
péptido HLA-A*02:01 Tetramer-PE resultante. Los péptidos resaltados en círculos rojos son YLYALVYFL (Kd teórico = 2,67 nM, tasa de intercambio práctica = 85%); SVLLFLAFV (Kd teórico
= 44,91 nM, Tipo de cambio práctico = 57,5%) e ISDEFSSNV (Kd teórico = 908,9 nM, Tipo de cambio práctico = 93,5%). (Para la interpretación de las referencias al color en la leyenda de
esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

por respuestas inmunitarias de células T provocadas. No examinar el
inmunomonitoreo de células T CoV-2 puede dar lugar a vacunas que inducen
respuestas humorales de corta duración en ausencia de respuestas de memoria
de células T adecuadas[19–24]. Además de los huéspedes sanos, también es
importante analizar las respuestas de células T específicas de CoV-2 en ciertas
subpoblaciones vacunadas, como los ancianos y los huéspedes que padecen
afecciones subyacentes que se espera que afecten el sistema inmunitario, como la
diabetes. Para comprender mejor la respiración de las respuestas inmunitarias de
las células T, es necesario interrogar tres pasos esenciales: i) es necesario
identificar fragmentos de proteínas (péptidos) que puedan procesarse en
vías de procesamiento de antígenos, ii) para identificar aquellos que
pueden interactuar con el surco de las moléculas del MHC, y iii) para
validar esos péptidos con PBMC humanas para garantizar que haya
clonotipos de células T que reconozcan estos péptidos en el contexto
del propio MHC. Esta breve comunicación aborda el segundo elemento,
que es la prueba de ocupación de MHC de conjuntos seleccionados de
péptidos que se informaron en los últimos meses en función de
modelos de predicción in silico y/o después de la validación en PBMC
de hosts. Estos péptidos deben validarse en un sistema diferente al que
se prevé en[25]. La plataforma QuickSwitch para la generación de

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Fig. 3.Intercambio de péptidos de SARS-CoV-2 con moléculas QuickSwitch HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*04:01 y HLA-DRB1*15:01. 100metroSe usaron moléculas de HLA-DRB1*01:01 (barras azules), HLA-
DRB1*04:01 (barras naranjas) y HLA-DRB1*15:01 (barras grises) recombinantes g/mL para el experimento de intercambio de péptidos. Todas las moléculas de MHC de clase II se cargaron con un
péptido de salida QuickSwitch y se incubaron con 1 mM de péptidos de SARS-CoV-2 competidores durante la noche (más de 10 h) a 37 °C. Luego se determinó el porcentaje de péptido existente
eliminado de la molécula de MHC después de un ensayo de captura y se representó en el eje vertical para cada péptido probado. (Para la interpretación de las referencias al color en la leyenda de esta
figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

Figura 4.Las células estimuladas con péptido se incubaron primero con un bloque de suero AB humano al 10% antes de la tinción. Las células se trataron con Dasatinib 50 nM y se tiñeron con tetrámeros
durante 2 h a 37 °C seguido de una tinción de 20 min con anticuerpos anti CD3, CD4 y CD8 (anti CD3 FITC, anti CD8-BV510, anti CD4 BV785). Las células teñidas se corrieron en un citómetro de flujo
Fortessa (Becton Dickinson) y la tinción se analizó con FlowJo.

los tetrámeros personalizados han demostrado ser una herramienta
sólida para la identificación de péptidos que pueden formar un
complejo estable con moléculas MHC de Clase I y Clase II, así como
para la tinción de células T. A diferencia de los sistemas in-silico, la
plataforma utilizada para este estudio implica la cuantificación de la
unión de péptidos reales a moléculas MHC recombinantes que luego
pueden usarse para producir tetrámeros y teñir células T. Esto permite
a los usuarios concentrarse en encontrar poblaciones de células T que
reaccionen a un péptido viral específico sin preocuparse de si este
péptido puede ser presentado por las moléculas del MHC o si el
tetrámero del MHC que están utilizando es defectuoso. Además, los
péptidos de unión fuerte que descubrimos en este breve estudio se
pueden usar para múltiples aplicaciones y ensayos.
Declaración de interés en competencia
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en
competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber
influido en el trabajo informado en este documento.
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