Dra.

Carolina Quezada
Depto. de Química Ambiental
Bioquímica

Guía de laboratorio Trabajo Práctico 2

Cuantificación de glucosa por espectrofotometría

I. INTRODUCCIÓN

Se denominan azúcares reductores aquellos azúcares que tienen el grupo hidroxilo del
carbono anomérico disponible para reaccionar como reductor de otras moléculas que
actuarán como oxidantes. Algunos azúcares reductores importantes son la glucosa
(monosacárido reductor más abundante en el organismo) y algunos disacáridos como la
maltosa, la lactosa o la celobiosa. El método del ácido 3,5 dinitro-salicílico (DNS) o método de
Miller, permite detectar azúcares reductores en distintos tipos de muestras (1). Este método
se basa en la reacción de óxido-reducción que ocurre entre los azúcares reductores presentes
en la muestra y el DNS, siendo un método espectrofotométrico que confiere alta sensibilidad.
El método se basa en la reducción del DNS (de color amarillo), transformándose en ácido 3-
amino-5- nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), el cual se puede cuantificar por absorbancia a
540 nm (Figura 1) (2). Por medirse por espectrofotometría, no es recomendable para
muestras altamente coloreadas (3).

Figura 1. Conversión del DNS en ácido 3-amino-5-nitrosalicílico por la presencia

de un azúcar reductor (glucosa) en la muestra.

II. TRABAJO PRÁCTICO

II. 1. Objetivos

Objetivo General:

Determinar la concentración de azúcares reductores presentes en distintos jugos en polvo de

marca comercial.

1
Objetivos Específicos:

1) Validar el método del DNS para determinar la concentración de azúcares reductores de

jugos en polvo de marca comercial.

2) Comparar la cantidad de azúcares reductores presentes en jugos de frutas diferentes y de

marcas distintas, con y sin azúcar añadida.

II. 2. Materiales

Reactivos necesarios:
• Reactivo DNS
• Agua destilada
• Estándar de glucosa
• Muestra problema (Concentración desconocida de glucosa)
• Jugo en polvo

Materiales necesarios:
• Micropipeta 1000 µl
• Micropipeta 200 µl
• Tubos falcon 15 ml
• Pipeta total 5 mL  
• Cuvetas para espectrofotómetro de 2 mL
• Matraces volumétricos 50 mL
• Puntas micropipeta p1000 y p200
• Vasos precipitados 100 ml
• Gradilla tubos falcon 15 ml

II. 3. Procedimientos

***Recordar que antes de preparar cualquier solución y añadir soluciones en cualquier tubo
o vaso debe rotular previamente con su número de grupo, el contenido y concentración de la
muestra***

Preparación jugo en polvo:

• Prepare 10 ml de jugo en polvo que fue entregado a su grupo en un vaso precipitado.
• Utilice la misma relación de concentración indicada en el envase, es decir, el contenido
completo del sobre (ver cantidad exacta en el envase) en un litro de agua.
• Agregue 500 µl de jugo preparado en un tubo falcon de 15 ml.

2
Curva de calibrado de glucosa:
Utilizando el estándar de glucosa a una concentración de 2 g/L realice las siguientes diluciones
para confeccionar su curva de calibrado:

• 0.0 g/L
• 0.2 g/L
• 0.4 g/L
• 0.6 g/L
• 0.8 g/L
• 1.0 g/L
• 1.2 g/L
• 1.4 g/L

Para cada punto necesita preparar 500 µl de solución de glucosa. Para calcular la cantidad de
estándar de glucosa y agua que debe agregar en cada punto recuerde el uso de la siguiente
ecuación:
C1 * V1 = C2 * V2
Donde:
• C1 es la concentración de glucosa del estándar (2 g/L).
• V1 es el volumen del estándar de glucosa de 2 g/L que debe utilizar.
• C2 es la concentración que usted desea preparar.
• V2 es el volumen de la dilución que desea prepara, en este caso 500 µl.
*Recordar que luego de agregar la cantidad de estándar de glucosa calculada para cada
concentración (V1), debe agregar agua destilada hasta obtener los 500 µl.
• Preparar cada disolución en tubos falcon de 15 ml.

Preparación de muestra problema (Concentración desconocida de glucosa)

• Tome 500 µl de la muestra problema que le fue entregada y agréguela en un tubo
falcon de 15 ml.

**Para este momento debe tener 10 tubos falcon de 15 ml con 500 µl cada uno (8 tubos de
la curva de calibrado, 1 tubo de la muestra problema y 1 tubo con el jugo preparado)**

Protocolo DNS:
• Añadir 500 µl de reactivo DNS a cada tubo falcon de 15 ml preparado anteriormente.
• Agitar las muestras en vortex por 5 segundos.
• Dejar las muestras por 5 minutos a 100 °C.
• Bajar temperatura de los tubos con agua fría (baño maría inverso).
• Agregar a cada tubo 5 ml de agua destilada.
• Agitar las muestras en vortex por 5 segundos.
• Agregar 1 ml del tubo falcon a una cuveta de espectrofotómetro (previamente
rotulada) (**esto para cada muestra**).
• Medir absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. (Medir
cada punto por triplicado en el equipo)

3
*** SI SE DA EL CASO QUE LOS VALORES DE ABSORBANCIA QUE OBTUVO DEL ANALISIS DEL
JUGO EN POLVO ESTA FUERA DE LOS RANGOS DE SU CURVA DE CALIBRADO DEBERA HACER
LAS DILUCIONES CORRESPONDIENTES Y REALIZAR NUEVAMENTE EL PROCEDIMIENTO DEL
DNS PARA ESTA MUESTRA DILUIDA***

Actividades:
• Con los datos obtenidos construya la curva de calibrado. Encuentre la ecuación de la
recta y el R2.
• Utilizando la ecuación de la recta determine la concentración de glucosa de su
muestra problema.
• Utilizando la ecuación de la recta determine la concentración de glucosa de su
muestra de jugo en polvo.
• Resolver las preguntas importantes de la guía

III. PREGUNTAS IMPORTANTES

1.- ¿Cuál es el indicador que me permite saber cuánto se ajustan mis datos obtenidos en la
curva de calibración a una línea recta? ¿Qué tanto se ajustan estos datos en mi curva
obtenida?
2. ¿Qué factores pueden estar interfiriendo en la medición de mi muestra que pueden
exacerbar el valor de las mediciones obtenidas?
3. Mencione y explique otro método para cuantificar azúcar, que no sea espectrofotométrico.
4. ¿Cuándo convendría usar el Método de DNS y cuándo el otro método no
espectrofotométrico que su grupo menciona?
5. a) En los jugos Zuko hay 20 g de contenido total que se disuelven en 1 litro de agua. De
acuerdo a la concentración que usted obtuvo en su muestra, ¿Cuál sería el porcentaje en
masa de azúcares reductores presentes en esos 20 g de jugo en polvo?
b) En los jugos Vivo el contenido total que se vierte en 1 litro de agua es de 7 g. Calcule el
porcentaje en masa de azúcares reductores presentes en su muestra en esos 7 g.

IV. BIBLIOGRAFÍA

1. Miller, Gail Lorenz. "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar." Analytical chemistry 31.3 (1959): 426-428.

2. Diaz Causil, Yacelis María. “Determinación del contenido de azucares, proteínas y nitrógeno
presentes en medios de cultivos modificados para el crecimiento in vitro del hongo
Colletotrichum sp fitopatógeno del ñame (Dioscórea alata) en Montería-Córdoba. 2020.
Trabajo de grado. https://repositorio.unicordoba.edu.co/handle/ucordoba/3172

3.- Bello Gil, Daniel; Carrera Bocourt, Emilia; Díaz Maqueira, Yuset. “Determinación de
azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del
ácido 3,5 dinitrosalicílico”. 2006. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. XL,
núm. 2:45-50.

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¿QUÉ DEBE CONTENER LA PRESENTACIÓN?

La presentación debe durar 12 minutos + 3-5 min de preguntas.

- Nombre de los integrantes del equipo, nombre del práctico, nombre del curso, nombre del
docente y fecha en la portada.
- Introducción (3-4 diapositivas) en que se entregue información sobre la importancia de
poder cuantificar glucosa y sobre el método utilizado.
- Descripción de la metodología, los procedimientos realizados y cálculos. Incluir
observaciones y errores cometidos (2-3 diapositivas).
- Resultados obtenidos (4-5 diapositivas).
- Análisis y discusión de los resultados (3-4 diapositivas). Comentar sobre las razones que
llevaron a tomar decisiones tomadas en cada caso, los resultados obtenidos y qué es lo que
se espera de acuerdo a la información bibliográfica. Incluir respuesta a las preguntas
planeadas en la guía.
- Conclusiones que resuman los resultados obtenidos y lo concluido de la discusión (1
diapositiva).

- Bibliografía (1 diapositiva), que puede ir en dos formatos:

1. Poner entre paréntesis el apellido del primer autor y año de publicación al final de cada
oración de la cual se obtuvo la cita. Poner una lista al final del informe en orden alfabético,
considerando el apellido del primer autor de cada artículo para ordenarlos. Agregar los otros
autores, año de publicación, título del artículo, Nombre de la revista (volumen, páginas) y link
(DOI).

2.- Agregando números al final de cada oración de la cual se obtuvo la cita y luego poner una
lista con esos números correlativos describiendo autor(es), año de publicación, título del
artículo, Nombre de la revista (volumen, páginas) y link (DOI)