UNIVERSIDAD NACIONAL “PEDRO RUIZ GALLO”

FACULTAD DE INGENIERÍA ZOOTECNIA

UNIDAD DE INVESTIGACIÓN PECUARIA

PROYECTO DE TESIS

I. INFORMACIÓN GENERAL:
1.1. Título del Proyecto : Evaluación espermática, antes y después de la
congelación, según tres diluyentes comerciales en la
raza vacuna Gyr
1.2. Código del Proyecto :
1.3. Responsable : Bach. Diana Bernilla Carrillo
1.4. Asesor : Ing. Pedro Antonio Del Carpio Ramos, Dr.
1.5. Línea de investigación priorizada: Ciencias Agrícolas
1.5.1. Línea de investigación FIZ : Genética – Reproducción – Manejo
1.6. Área de investigación : Rumiantes
1.7. Lugar de ejecución : Tarapoto, San Martín
1.8. Duración estimada : Tres (03) meses
1.9. Fecha de inicio : marzo de 2023
1.10. Fecha de término : mayo de 2023
1.11. Aprobado por :

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Responsable Asesor

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Decano F. I. Z. Unidad de Investigación Pecuaria

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Jurado (presidente) Jurado (secretario)

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Jurado (vocal)
Lambayeque, febrero de 2023.
II. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN
2.1. Síntesis de la situación problemática
Casi con certeza se puede decir que no hay herramienta más poderosa que la inseminación
artificial para lograr la mejora genética del ganado (Bustani y Baiee, 2021); debido a que,
además de introducir genes positivos para los fines productivos, permite lograr eficiente
reproducción para que el rebaño crezca y pueda sostener las estrategias de mejora. A pesar
que no es una técnica nueva, aún se realiza investigación innovadora para perfeccionarla.
Como se ha indicado, preservar las habilidades fundamentales de los
espermatozoides durante el largo y exigente proceso de producción de dosis de
inseminación puede proporcionar un mayor nivel de tasas de preñez en las vacas; así
mismo, reduce el consumo de pajuelas, acorta el intérvalo entre partos y mejora la eficacia
económica de la cría en sí. Por lo que, el objetivo principal es conseguir una tasa de preñez
con semen congelado similar a la que se obtiene con semen fresco o simplemente con
crianza natural (Vodicka et al., 2022).
También se sabe que el proceso de crioconservación generalmente reduce la
viabilidad del semen y daña todas las estructuras de los espermatozoides, lo que afecta la
capacidad de fertilización. Durante la producción de pajuelas de inseminación, el estado
funcional de los espermatozoides se ve afectado por muchos factores, como el pH, la
presión osmótica y el estrés asociado con los cambios de temperatura. Estos factores de
estrés provocan la producción de especies reactivas de oxígeno y la peroxidación lipídica
de la membrana celular, lo que afecta desfavorablemente a los espermatozoides. La
eliminación de estos efectos negativos se obtiene con la adición de crioprotectores
adecuados en los diluyentes de semen, por su interacción con la individualidad de los toros,
por el proceso controlado de enfriamiento y por el uso de curvas de congelación óptimas
(Beran et al., 2013; Vodicka et al., 2022).
La composición de los diluyentes afecta la viabilidad y la capacidad de fertilización
de los espermatozoides en la dosis de inseminación; por lo tanto, los medios de protección
más adecuados se buscan y desarrollan continuamente.
Por otro lado, la región San Martín tiene un potencial ganadero trascendentes; sin
embargo, para desarrollar el potencial ganadero de San Martín se requiere de ganado
procedente de zonas tropicales (cebuinos) o invertir enormes cantidades de dinero en
proporcionar el ambiente adecuado para ganado procedente de zonas templadas, esto último
es inviable en la actualidad. Por tal motivo, el empleo de ganado de razas cebuinas, como el
Gyr, es una opción técnica de primera línea.
El ganado cebuino tiene sus propias peculiaridades que no se conocen a plenitud
como si ocurre en el ganado originario de zonas templadas que ha sido ampliamente
investigado
2.1.1. Formulación del problema de investigación
¿cuál es la calidad espermática del semen en la raza vacuna Gyr, antes y después de la
congelación, en la zona de Tarapoto al emplear tres diluyentes comerciales diferentes?
2.1.2. Hipótesis
No se ve afectada la calidad espermática de la raza vacuna Gyr, antes y después de la
congelación, en la zona de Tarapoto al emplear tres diluyentes comerciales diferentes.
Justificación del Proyecto
La ejecución del presente proyecto se justifica porque es necesario disponer de
información sobre la calidad espermática de razas cebuinas que permitan la introducción de
genes productivos de animales naturalmente adaptados a las zonas tropicales.
Con los resultados de la evaluación de los diluyentes se pretende, además,
incrementar el conocimiento al respecto para implementar acciones viables de mejora
reproductiva y genética.
Así, la acción sobre el productor rural será positiva porque permitirá mejorar la
calidad de su ganado y de su productividad, lo que debería reflejarse en la mejora de sus
condiciones de vida.
2.1.3. Objetivos
Objetivo General
Evaluar el efecto de los diluyentes comerciales sobre la calidad espermática de la
raza vacuna Gyr, antes y después de la congelación, en la zona de Tarapoto.
Objetivos Específicos
- Comparar la motilidad individual progresiva de los espermatozoides.
- Comparar la integridad de la membrana citoplasmática de los espermatozoides.
- Comparar la viabilidad de los espermatozoides.
2.1.4. Marco Teórico
2.1.4.1. Antecedentes
Bustani y Baiee (2021) consideraron los indicadores a través de los que se evalúa el semen
a emplear en la inseminación artificial, mencionando a la motilidad, la viabilidad y la
morfología. Reportan que la motilidad de los espermatozoides es el parámetro más crítico
para evaluar la fertilidad potencial del macho; esta incluye la motilidad general total, la
motilidad progresiva y los parámetros cinemáticos. Las células espermáticas deben mostrar
un alto mantenimiento de la motilidad para garantizar la máxima fertilidad potencial; los
espermatozoides inmóviles y los trastornos de la motilidad indican fallas en la fertilidad del
macho, una prueba estándar para indicar la fertilidad del macho es el examen microscópico
y la estimación del porcentaje de avance de los espermatozoides. Con relación a la
viabilidad consideran que el éxito de la fertilización es proporcional a los espermatozoides
vivos, lo que es esencial para la motilidad y la capacidad de fertilización; indican que la
cantidad de espermatozoides que no toman la tinción de eosina-negrosina permite estimar
el porcentaje de espermatozoides vivos. Respecto a la morfología mencionan que depende
de la espermiogénesis o de los eventos que ocurren después de la espermiación; el manejo
inadecuado de muestras de semen, debido a la falta de experiencia, puede causar desafíos
durante los procesos de enfriamiento y congelación que pueden provocar daños en el
acrosoma y en las colas. Anomalías frecuentes incluyen defectos de la cabeza (micro y
macrocefalia), defectos de la pieza intermedia, como las gotitas citoplásmicas proximales,
los reflejos de limpieza intermedia distal y la aplasia segmentaria de la vaina mitocondrial.
En tanto que, Raheja et al. (2018) consideran que un diluyente (también
denominado dilutor dentro del medio vinculado a la reproducción animal) de semen es un
medio químico utilizado para la preservación, extensión y protección de los
espermatozoides contra diversos shocks durante el procesamiento, almacenamiento y
transporte utilizados para la inseminación artificial. Según los autores citados, a saber, debe
englobar las siguientes propiedades: isotónico (280 – 310 mOsm/ kg), capacidad tampón
(pH regulado), protección contra el shock por frío, fuente de energía (metabolismo
espermático), control de la contaminación microbiana, protección durante la congelación y
descongelación, y capaz de preservar la fertilidad de los espermatozoides.
Los mismos autores, citados inmediatamente antes, indican que, dependiendo del
período de uso del semen post recolectado para la inseminación artificial, la conservación
del semen se realiza de dos formas, en forma líquida (3 – 5 días) y congelada (años). El
almacenamiento en refrigeración se hizo posible desde el descubrimiento de la yema de
huevo como aditivo beneficioso y el fosfato como buffer primario. Posteriormente, el
empleo de citrato como tampón mejoró el período de sobrevivencia de los espermatozoides
a 5ºC.
Además de la yema de huevo, la leche entera homogeneizada, la leche descremada
fresca o reconstituida y la leche de coco también se utilizan para preservar la fertilidad de
los espermatozoides. Entre varios tampones (Tris, TES, MES, HEPES, PIPES, MOPS y
BES), los diluyentes a base de Tris se utilizan ampliamente para el almacenamiento de
semen líquido/ congelado. Tris y citrato son los constituyentes más comunes en los
diluyentes utilizados para congelar semen bovino. Los bicarbonatos y el citrato de sodio
son otros tampones inestables a la temperatura que se utilizan y, en contraste con estos,
Tris, TES, MOPS y HEPES son más estables a altas temperaturas y otras condiciones
ambientales (Raheja et al., 2018).
Raseona (2014) evaluó la efectividad de tres diferentes diluyentes para preservar el
semen bovino almacenado bajo condiciones diferentes, como una alternativa a las pajuelas
de semen (congeladas – descongeladas) utilizadas para inseminación artificial. Se
colectaron las muestras de semen de dos toros Nguni utilizando un electro eyaculador y
transportadas al laboratorio a 37ºC para evaluación. Se utilizaron tres diluyentes (Triladyl,
Ham’sF10 y M199). Triladyl tuvo la más alta tasa de viabilidad espermática y la tasa de
motilidad total a las 72 horas (P<0.01). Si embargo, Ham’sF10 tuvo la más alta tasa de
motilidad progresiva en comparación a los otros diluyentes. No hubo diferencia
significativa en la tasa de viabilidad entre Ham’sF10 y M199. Así mismo, no se observó
diferencia significativa en el total de anormalidades espermáticas (colas ausentes,
enrolladas, dobladas), excepto para acrosomas reaccionados (P<0.05) entre los dos toros
Nguni. Temperaturas inferiores a 24ºC influyeron en la motilidad y viabilidad espermática
en Ham’sF10. La autora concluyó que Triladyl probó ser el mejor diluyente disponible
mostrando más altas tasas de viabilidad y motilidad total en comparación con Ham’sF10 y
M199.
Memon et al. (2022) utilizaron alrededor de 40 (n=10) eyaculados de cuatro toros
Tharparkar, con una edad de 4 a 5 años. Después de la recolección se examinaron los
eyaculados para una evaluación inicial (volumen, color, pH, motilidad, movimiento de
onda, viabilidad, morfología, integridad de membrana y concentración de
espermatozoides). El eyaculado con más de 70% de motilidad, morfología, integridad de la
membrana y viabilidad, se procesó y extendió en un diluyente basado en Tris (control) y
diluyente de soja con una concentración de 3, 6, 9, 12 y 15 ml de leche de soja. Las
muestras congeladas y descongeladas se evaluaron en cuanto a motilidad, morfología,
viabilidad e integridad de la membrana. Las muestras diluidas en Tris dieron como
resultado una motilidad de 48.50±1.2, una morfología de 65.00±1.5, una viabilidad de
67.25±3.4 y una integridad de la membrana de 63.75±2.9. Sin embargo, en el diluyente a
base de soja, en la cantidad de 9 ml, los parámetros de calidad de muestras congeladas
mejoraron (57.75±1.1 en motilidad, 73.00±3.4 en morfología, 72.25±0.3 en viabilidad y
70.25±1.3 en integridad de la membrana). Después de la evaluación en el laboratorio, se
inseminaron muestras diluidas con Tris y una concentración optimizada de 9 ml de
diluyente a base de soja en 20 vacas (n= 10/ grupo). La preñez se siguió después del día 60
del servicio. El semen diluido con el diluyente a base de soja produjo una tasa de
concepción mejorada. Los autores concluyeron que el diluyente a base de soja mejoró la
calidad del semen descongelado enfriado y congelado de los toros Tarrparkar.
2.1.4.2. Bases Teóricas
- Espermatogénesis
Según Staub y Johnson (2018), la espermatogénesis es un proceso finamente regulado de
multiplicación y diferenciación de células germinales que conduce a la producción de
gametos masculinos, los espermatozoides liberados en el polo apical de las células de
Sertoli, el componente somático de los túbulos seminíferos. La espermatogénesis se puede
dividir en tres partes: espermatocitogénesis, meiosis y espermiogénesis.
Durante la espermatocitogénesis, las células germinales madre participan en el
proceso espermatogenético realizando una primera división mitótica que genera
espermatogonias. Estos últimos proliferan a su vez realizando varias divisiones mitóticas
sucesivas que dan como resultado la producción de espermatocitos de preleptoteno. Los
espermatocitos preleptoteno cruzan la barrera hematotesticular y participan en la profase
meiótica. Durante la profase de la primera división de la meiosis, las células germinales se
diferencian sucesivamente en diferentes estadios (leptoteno, cigoteno, paquiteno, diploteno)
antes de sufrir las dos divisiones meióticas. La primera división meiótica es la división
reduccional (reducción del número de cromosomas, separación de los cromosomas
homólogos), mientras que la segunda división meiótica es la división ecuacional
(separación de las cromátidas hijas). Por lo tanto, la meiosis permite la producción de
espermátidas haploides redondas. La espermiogénesis consiste en la diferenciación de
espermátidas redondas en espermátidas con diversos grados de elongación y finalmente en
espermatozoides. Los espermatozoides se liberan en la luz de los túbulos seminíferos
durante una etapa final llamada espermiación.
- Colección de semen
Para Schenk (2018), las pautas de recolección de semen de toros establecidas por
investigadores y personal de la industria para maximizar la cosecha de esperma de los toros
han evolucionado durante más de 60 años. Hoy en día, una industria de inseminación
artificial madura emplea esas estrategias para satisfacer las demandas. Estos esquemas de
manejo eficientes explotan el potencial reproductivo de cada toro mientras minimizan el
riesgo asociado de lesiones a los toros y reducen los costos de producción asociados. El
personal empleado por una instalación productora de semen debe estar autorizado para
tomar decisiones eficaces y racionales basadas en los principios del comportamiento sexual
y la fisiología reproductiva del toro. Además, las instalaciones de recolección deben estar
bien planificadas para permitir la presentación segura de situaciones sexuales novedosas al
mismo tiempo que brindan la máxima seguridad para los empleados y una base adecuada
para los toros. Los toros normales producen y eyaculan una gran cantidad de esperma. La
mayoría de los toros tienen una libido suficiente para la actividad sexual de rutina, pero se
sacian ante situaciones de estímulo predecibles. Los cambios frecuentes a la novedad
deberían permitir la cosecha semanal de cuatro a seis eyaculados por semana para la
mayoría de los toros. Es necesario utilizar las características fisiológicas asociadas con cada
eyaculación para establecer la frecuencia de recolección de cada toro, y capacitar a un
personal integrado de recolección y laboratorio para monitorear y hacer ajustes a la
frecuencia de la eyaculación para maximizar la recolección de esperma. Los toros jóvenes
pueden eyacular de 10 a 20 mil millones de espermatozoides por semana, y los toros
maduros deben eyacular de 40 a 60 mil millones de espermatozoides por semana. Los
procedimientos de manejo de recolección de semen deben revisarse cuando los toros no
cumplen con las metas de producción.
- Diluyentes del semen
El amplio uso de la IA en la industria láctea se puede atribuir en parte al desarrollo de
diluyentes adecuados para semen líquido y congelado.
Murphy et al. (2017) indican que, en Irlanda, como en otros países, el semen líquido
normalmente se almacena a temperatura ambiente en recipientes termoaislantes para
reducir los efectos de las fluctuaciones naturales de temperatura del día a la noche. Aunque
la temperatura de almacenamiento fluctuante entre 5 y 32 °C no tiene efecto sobre la
viabilidad, la motilidad progresiva total es mayor para el semen líquido almacenado a 15 °C
en comparación con otras temperaturas. Además de la dilución del semen, los diluyentes
proporcionan compuestos protectores como albúmina sérica bovina (BSA), antioxidantes y
antibióticos para mantener la función espermática. A pesar de esto, el semen líquido tiene
una vida útil limitada y el semen almacenado en Caprogen (el estándar de oro para la
dilución de semen líquido) se usa principalmente durante solo 2,5 a 3 días después de la
recolección, ya que se ha informado una reducción en las tasas de preñez a partir de
entonces. Se han realizado varios estudios sobre diluyentes líquidos de semen de toro con el
objetivo de combatir la reducción de la fertilidad asociada con una mayor duración del
almacenamiento. Muchos de estos estudios se han centrado en reducir la actividad
metabólica de los espermatozoides, ya que se ha demostrado que la supervivencia de los
espermatozoides durante largos períodos de tiempo está inversamente relacionada con su
actividad metabólica. Los enfoques adoptados han incluido el almacenamiento de semen a
5 °C, la reducción de la concentración de espermatozoides, la alteración del pH, así como la
gasificación de N2 y la modificación la composición del diluyente. La capacidad de
prolongar la vida útil del semen líquido es importante ya que (1) la distribución del semen
líquido se simplificaría si pudiera usarse durante más días y (2) la carga de trabajo
involucrada en la recolección y el procesamiento del semen se reduciría considerablemente.
ya que los toros utilizados para semen líquido tendrían un horario de recolección reducido.
 Aparte de Caprogen, se han desarrollado varios otros diluyentes para el
almacenamiento de semen para una variedad de especies domésticas. BioXcell es un medio
libre de proteínas animales (extensor a base de lecitina de soja), que se ha utilizado
habitualmente para la criopreservación y conservación a temperaturas frías de semen de
búfalo, carnero y toro. Aunque varios autores han informado sobre los beneficios del uso de
diluyentes a base de lecitina en la criopreservación de semen de toro, muchos de estos
estudios se han centrado únicamente en el análisis in vitro. INRA96 es un diluyente a base
de leche que se desarrolló principalmente para mantener la fertilidad del semen equino
durante el almacenamiento refrigerado a 4 o 15 °C durante un máximo de 72 h, pero
también se ha utilizado para la crioconservación de semen equino. En los últimos años,
INRA96 también se ha utilizado como medio de almacenamiento para el esperma de otras
especies, como conejo, perro, cabra y oveja, y ha producido una fertilidad aceptable in vivo
en ovejas después de la IA cervical después de 24 h de almacenamiento. Otros diluyentes
disponibles comercialmente incluyen OptiXcell, un medio similar a la yema de huevo libre
de proteínas para semen de toro líquido y congelado; NutriXcell, un diluyente a largo plazo
utilizado principalmente para la conservación de semen porcino hasta 6 días; AndroMed,
un medio a base de lecitina de soya sin yema de huevo para congelar semen de toro,
carnero, búfalo y cabra; y BullXcell, un diluyente Tris de yema de huevo utilizado para la
criopreservación de semen de toro (Rehman et al., 2013; Van den Berg et al., 2014;
Murphy et al., 2017).
- Evaluación del semen
Es muy necesario determinar los niveles de umbral de anomalías en los espermatozoides
basándose en investigaciones publicadas sobre los efectos de cada anomalía en la fertilidad
del toro. Estos umbrales consideran si la anormalidad impide que los espermatozoides
afectados fertilicen el óvulo, es decir, la anormalidad no permite el transporte a los óvulos o
la unión a los óvulos. Tales anomalías incluyen aquellas con motilidad anormal o nula, que
se filtran en el tracto femenino, y forma anormal de la cabeza, que reduce la capacidad de
penetrar en la zona pelúcida. El umbral para tales anormalidades se establece en 30%. Sin
embargo, el aumento del número de espermatozoides en el eyaculado no puede compensar
las anomalías que inician la fertilización y/o el desarrollo del embrión, pero este desarrollo
no se mantiene. El umbral para estas anomalías es, por lo tanto, inferior al 20 % (Felton-
Taylor et al., 2020).
La determinación del porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales es
altamente repetible y está fuertemente correlacionada con los días hasta la concepción y la
producción de terneros tanto en hatos lecheros como de carne. Sin embargo, un obstáculo
importante en la aceptación de las pruebas de morfología por parte de la industria ganadera
es la variación observada en los resultados debido a los efectos ambientales. Está
establecido que cualquier estrés ambiental suficiente para causar una elevación del cortisol
circulante es suficiente para afectar la morfología de los espermatozoides. Las altas
temperaturas ambientales y, a menudo, la alta humedad asociada que se produce durante el
período de finales de primavera-verano-principios de otoño en el norte de Australia, pueden
afectar transitoriamente la morfología al igual que la nutrición, y ambos posibles factores
estresantes están influenciados por la estación. La edad del toro, particularmente alrededor
de la pubertad, también afecta la producción de esperma y la morfología, mientras que el
efecto informado de la raza sobre la morfología parece inconsistente (Felton-Taylor et al.,
2020).
2.1.4.3. Definición de Variables
Variable independiente
Diluyentes comerciales
Variable dependiente
- Motilidad individual progresiva
- Integridad de la membrana citoplasmática
- Viabilidad de los espermatozoides
2.1.5. Marco Metodológico
2.1.5.1. Tipo y Diseño de Investigación
Investigación de enfoque cuantitativo, debido a que tiene las siguientes peculiaridades: la
recolección de datos es numérica, estandarizada y cuantificable, y el análisis de la
información y la interpretación de resultados permiten fundamentar la comprobación de
una hipótesis mediante procedimientos estadísticos, los cuales ofrecen la posibilidad de
generalizar los resultados. Así mismo, de carácter experimental, en las investigaciones
experimentales el objetivo es reproducir un fenómeno dentro de un ambiente específico de
pruebas e ir modificando diferentes elementos para observar que sucede con el fenómeno.
(Muñoz, 2011). Y es una investigación de corte transversal debido a que los grupos de
tratamientos se implementarán en forma simultánea.
2.1.5.2. Lugar y Duración del Estudio
El Presente trabajo se realizará en las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología
Animal de la Estación Agraria El Porvenir, ubicado en el Distrito de Juan Guerra, provincia
y departamento de San Martín a una altitud de 200 msnm, donde se realizará la colección
procesamiento y congelación de semen. La Fase experimental tendrá una duración de 3
meses.
2.1.5.3. Materiales y Equipos
Materiales
- Tubos falco graduado de 15ml
- Pajillas de 0.5ml
- Jeringas de 20ml
- Tijeras
- Matraces
- Probetas graduada
- Tubos Eppendorf
- Laminas porta y cubre objetos
- Thermo
- Platina térmica
- Pipetas de 10 y 10e0 ul.
- Platina para tubos ppendorf
- Tips
- Dilutor
- Agua bidestilada
- Detergente enzimático
- Alcohol
Equipos
- Electro eyaculador
- Refrigeradora
- Baño maría
- Estufa de desecación
- Microscopio de contraste de fases
- Tanque criogénico de almacenamiento de pajillas
- Congelador semiautomático de pajillas
- Cabina de flujo laminar

2.1.5.4. Técnicas Experimentales

- Recolección de muestra de semen
La recolección de semen se realizará a través del método de electro eyaculación, para el que
se requiere el uso de un dispositivo el cual se introduce vial rectal; previo a la utilización
del electro eyaculador se procede a la preparación del animal, que consiste en recortar los
pelos del orificio prepucial y limpiarlo, se lava y seca cuidadosamente el área. un ayudante
procede a extraer las heces del recto y a estimular mediante masaje transrectal las glándulas
accesorias (glándulas vesiculares y ampollas de los conductos deferentes).
Para la introducción del electro eyaculador se debe asegurar que se encuentre limpio
y se le coloca gel lubricante, luego se alza la cola y se introduce haciendo leves
movimientos rotatorios, una vez introducido se ubica la cola en medio del mango del
electrodo.
El equipo con el que cuenta la Estación dispone de un programa automático para
uso.
- Preparación de los diluyentes
ANDROMED R 200 ml, Marca Minitube.
Se realizará de acuerdo a la receta del producto, en baño maría a 35°C.
Con una dilución uno en cinco (200 ml del producto + 800ml de agua bidestilada).
TRILADYL R 250 g, Marca Minutube.
Se realizará de acuerdo a la receta del producto, en baño maría a 35°C.
Una parte de agua bidestilada, tres partes del producto y una parte yema de huevo (250g del
producto + 750 agua bidestilada + 250g de yema de huevo).
OPTIXCELL 250 ml, Marca IMV
Se realizará de acuerdo a la receta del producto, en baño maría a 35°C.
Dilución uno en tres (250 ml del producto + 500 de agua bidestilada).
- Evaluación del semen
Una vez realizada la colección del semen se rotulará y se trasladará al Laboratorio de
Biotecnología Animal de la Estación Agraria “El Porvenir”; el eyaculado será dividido en
tres partes iguales para diluir con los tres diluyentes comerciales para, posteriormente,
hacer las evaluaciones correspondientes.
Se realizará dos tipos de evaluación: Macroscópica (que es la que se realiza
comúnmente con todas las muestras de eyaculado) y Microscópica (en la que se encuentran
las variables que se proponen en este proyecto).
 Evaluación macroscópica del semen
Color
En general el semen es de color blanco cremoso, que más o menos tiende al tono marfil, en
relación con la cantidad de espermatozoides contenidos. Puede ser blanco grisáceo o
también puede tener una coloración blanquecina o ligeramente amarillenta y su opacidad se
halla en función de la concentración espermática. El color amarillo es un carácter normal
del semen de muchos toros, que no altera la funcionabilidad de las células espermáticas y
que carece de influencia en la fertilidad. Se piensa que es un lipocromo derivado del
epitelio de la ampolla, pero no está influido por el tipo de alimentos ingeridos. Los toros
pueden producir semen de color amarillo debido a la presencia de riboflavina por las
glándulas vesiculares y ampollas del conducto deferente” (Toro, 2009).
Volumen
Se tiene un amplio rango que va de 2-6 ml. Se debe tener en cuenta que para toros mayores
de 2 años el mínimo esperable son 4 ml, en los animales jóvenes y en los de menor talla
dentro de una especie son los que producen menor volumen de semen, a esto se le llama
aspermia que es la ausencia de eyaculado, hipospermia cuando se trata de un volumen
reducido e hiperespermia al volumen aumentado” (Curbelo, 2013). “La capacidad de
producción de semen por gramo de tejido testicular y la producción diaria de
espermatozoides (PDE) están directamente correlacionadas con la circunferencia escrotal
en toros jóvenes. En los toros que están sometidos a un régimen periódico de colección de
semen, el volumen y la concentración espermática son indicadores de la capacidad para
producir espermatozoides” (Baracaldo et al., 2007).
Evaluación microscópica del semen
Concentración
La evaluación de la concentración espermática se realizará usando un fotómetro de la
marca Minitube el cual dispone el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Estación
Agraria “El Porvenir”-San Martín.
Motilidad espermática individual progresiva
La evaluación de motilidad individual progresiva normalmente se evaluará de forma
subjetiva, mediante la observación visual de la muestra en un microscopio de contraste de
fases en una platina térmica a 37°C.Según Ávalos et al. (2018), los espermatozoides deben
normalmente moverse de modo rápido y recto a través del campo. La movilidad puede
clasificarse como:
- Muy buena: cuando el 80 – 100 % de espermatozoides presentan movilidad
progresiva.
- Buena: cuando el 60 - 79 % de espermatozoides presentan movilidad progresiva.
- Regular: cuando el 40 - 59 % de espermatozoides presentan movilidad progresiva.
- Mala: cuando menos del 40% de espermatozoides presentan movilidad
progresiva.

Viabilidad Espermática
Esta evaluación se realizará mediante el método de tinción eosina-nigrosina, el que consiste
en la penetración de la eosina en el citoplasma de las células incapaces de evitar su ingreso
(vivas) o muertas aquellas que se tiñen; la nigrosina es la que ayudará a mejorar el contraste
para las células vivas.
El procedimiento será el siguiente:
Sobre una platina térmica a 37° C de depositará 5 ul de muestra sobre una placa
porta objetos, se agregará 5 ul de eosina al 5% y se homogeniza, luego de 1 minuto y con el
borde de otra placa portaobjetos se realizará un frotis.
Las soluciones de eosina y nigrosina se mantendrán sobre la platina térmica. Una
vez seco el frotis, se llevará a visualizar en el microscopio de contraste de fases con
objetivo de 40X.
Se observarán campos aleatorios para cuantificar los espermatozoides totales en
cada campo; los espermatozoides que tengan el citoplasma de color rosa-ceniza indican que
están muertos y los espermatozoides vivos no presentarán coloración alguna; se
cuantificarán no menos de 200 células espermáticas.
Fórmula empleada:
%VE = (n/N) x 100
Integridad de la membrana citoplasmática
Para esta evaluación se realizará mediante la prueba hipo osmótica (HOST), la que consiste
en evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática de los espermatozoides, mediante la
incorporación de agua extracelular para lograr el equilibrio osmótico al ser expuesto a
medios con osmolaridad menor a la normal.
Los espermatozoides serán sometidos a una solución hipo osmótica de 50mOsm/l,
preparada con 0.1225 g de D-fructosa, 0.225g de sodio y 50 ml de agua bidestilada, se
incubará 100 ul de solución hipo osmótica en baño maría a 37°C y se incorporará 25 ul de
muestra luego de 5 minutos se agregará 31 ul de solución hipo osmótica formolada para
detener la reacción. Dicha solución se preparará mezclando 1ml de solución hipo osmótica
inicial y 3 ul de formaldehido. Posteriormente se depositarán 5ul de la alícuota sobre
portaobjetos y cubierto con cubreobjetos, para realizar la evaluación correspondiente en el
microscopio de contraste de fases con objetivo de 40X. Los espermatozoides con adecuada
reacción de membrana (HOST+) exhibirán enrollamiento de la cola en diferente grado, y
los espermatozoides con ineficiente respuesta al estrés hipo osmótico o muertos, no
presentarán enrollamiento sino colas rectas (HOST-) (Jeyendran et al.,1984)
se contabilizarán 200 espermatozoides como mínimo.
Fórmula empleada:
%FMC = (n/ N) x 100
2.1.5.5. Variables a Evaluar
- Motilidad individual progresiva del semen en toros de la raza Gyr.
- Integridad de la membrana citoplasmática del semen en toros de la raza Gyr.
- Viabilidad espermática del semen de toros de la raza Gyr.
2.1.5.6. Análisis Estadístico
Las hipótesis estadísticas son:
H0: μ1 = μ2 = … = μn
H1: AL MENOS UNA MEDIA DIFIERE DEL RESTO
Las que serán contrastadas mediante un diseño completamente al azar con arreglo factorial
3 x 2, en el que los diferentes niveles del factor A corresponden a los tres diluyentes y los
diferentes niveles del factor B corresponden a los momentos Antes y Después de la
descongelación. El modelo aditivo lineal (Ostle, 1979) es:
Yijk = μ + Ai + Bj + (AB)ij + ξ ijk; i: 1, 2, 3; j: 1, 2; k: 1, 2, …, 10
Donde: Yijk, cualquiera de las variables a evaluar; μ, verdadero efecto medio; Ai, verdero
efecto del i-ésimo diluyente; Bj, verdero efecto del j-ésimo momento; (AB)ij, verdadero
efecto de la interacción diluyentes x momentos; ξ ijk, verdadero efecto de k-ésima repetición
sujeta a los efectos del j-ésimo momento dentro del i-ésimo diluyente (error experimental).
Habrá disposición de tolerar una máxima probabilidad de 5% de cometer error de
tipo I (α ). Dado que la información se expresa en porcentajes, antes de aplicar el análisis de
la varianza se procederá a su adecuación aplicando la conversión raíz cuadrada seno del
arco (Scheffler, 1981).
Aplicado el análisis de la varianza, sólo cuando el valor de F sea significativo se
aplicará la prueba de rango múltiple de Duncan para comparar los tratamientos.

III. ACTIVIDADES Y RECURSOS

3.1. Cronograma de Actividades
Actividad Meses, 2023
Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto
Presentación del Proyecto de Investigación X
Adecuación de material, equipo y otros X
Fase de campo (colectas, laboratorio, datos) X X
Redacción y presentación de informe X
Sustentación de la tesis X

3.2. Presupuesto y Financiación

Descripción del gasto Monto, s/. Financiamiento
Vacuno 12000.00 Estación Agraria
Alimento para ganado 500.00 Estación Agraria
Equipo de colecta 800.00 Estación Agraria
Equipo criogénico 3000.00 Estación Agraria
Análisis de laboratorio 1000.00 Responsable
Procesador electrónico (Laptop) 3500.00 Responsable
Material de escritorio 150.00 Responsable
Impresión y publicación 300.00 Responsable
Movilidad 500.00 Responsable
Viáticos 600.00 Responsable
Total 22350.00

3.3. Producto de la Investigación: Artículo científico.

3.4. Bibliografía
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