Por consiguiente, tenemos los resultados

Comparación de la precisión de los diferentes ensayos de endotoxinas

Aquí se encuentra la recuperación de la endotoxina estándar de control:

La recuperación de CSE del pico de WFI y agua purificada

 en el ensayo K-QCL: fue del 108% ± 41%

 en el ensayo Endosafe-MCS: 46% ± 7%
 en el ensayo ENDOZYME II GO: 51% ± 4%

Todos los resultados de los ensayos fueron significativamente diferentes

La recuperación de CSE de muestras de validación de limpieza con ambos ensayos basados

en LAL fue inferior que la de las muestras de WFI y de agua purificada, pero fue similar
para los tres tipos de agua con el ensayo ENDOZER II GO.

Tabla: promedio de resultados para la cuantificación de endotoxina estándar de control CSE

de muestras enriquecidas 0,5 UI/ML y desviacione estándar por tipo de agua para los tres
ensayos.

Recuperación de la endotoxina estándar de referencia RSE

La recuperación del pico duro de RSE (0.5 IU/mL) de 10 muestras fue cercana al 100%
para los tres ensayos
 Las recuperaciones no fueron significativamente diferentes entre K-QCL y Endosafe-MCS
o ENDOZYME II GO (prueba t de Student, p = 0,92 y p = 0,07, respectivamente), pero sí
entre Endosafe-MCS y ENDOZYME II GO (prueba t de Student, p = 0,04).

Tabla: distribución general de la recuperación de los resultados de pico (0,5 ui/ml de

endotoxina estándar de referencia dura de 10 muestras.

Precisión: Repetibilidad y precisión intermedia

Repetibilidad

Los CV más bajos se observaron con el ensayo ENDOZYME II GO y los más altos con el
ensayo Endosafe-MCS.  Sin embargo, las diferencias no fueron estadísticamente
significativas: Prueba F, (intervalo de confianza del 95%): K-QCL 3,0%, (-2,8%; +3,0%);
Endosafe-MCS 8,6%, (-8,0%; +9,1%); ENDOZYME II GO 4,1%, (-3,8%; +4,3%).

Tabla: Distribucción general de los coeficientes de variación de repetibilidad para la

muestra de cada ensayo.
Precisión intermedia

La evaluación de la precisión intermedia mostró que los resultados con el ensayo ENDOZYME II GO
fueron los más reproducibles con un CV < 15%

para los ensayos K-QCL 40% y Endosafe-MCS > 30%

Tabla:Coeficiente de variación porcentual (% CV) en WFI, agua purificada y muestras de validación

de limpieza para concentraciones determinadas en 10 corridas para los 3 ensayos con un pico duro
CSE.

Interferencia en la recuperación del control positivo del producto (CPP)

Los resultados del ensayo Endosafe-MCS mostraron una mayor variabilidad para la recuperación
de PPC que los de los ensayos K-QCL y ENDOZYME II GO.

 La recuperación de PPC para el ensayo ENDOZYME II GO se situó en torno al 100% para todos los
tipos de agua, incluidas las muestras de validación de limpieza. Para los ensayos K-QCL y Endosafe-
MCS, las recuperaciones de PPC de WFI y agua purificada fueron de alrededor del 100% pero de
las muestras de validación de limpieza, la recuperación de PPC fue inferior al 50%. Esto fue similar
a la inhibición observada para la recuperación de picos de CSE dura, donde un factor de 1,4 y 2 en
comparación con WFI, para los ensayos K-QCL y Endosafe-MCS, respectivamente

Parámetros de la curva estándar

Correlación de la curva estándar

El criterio de la farmacopea para la correlación absoluta de la curva estándar para los

ensayos K-QCL y Endosafe-MCS es que |r| debe ser debe ser igual o superior a 0,980.
También utilizamos este criterio para el ensayo ENDOZYME II GO, que no estaba en la
farmacopea como prueba compendio en el momento de este estudio. Para todos los
métodos, este criterio
se alcanzó. La correlación absoluta varió de 0,995 a 0,999 para el ensayo 0,999 para el
ensayo K-QCL y fue de 1,0 para el ensayo ENDOZYME II GO en 11 repeticiones
independientes. La correlación absoluta para la curva estándar archivada internamente en el
ensayo Endosafe-MCS fue de 0,997-0,998, según los datos proporcionados por el
fabricante. La mayor variabilidad se observó en el ensayo K-QCL, que requería una
preparación diaria de la curva estándar. Durante el estudio se utilizaron cuatro lotes
diferentes de cartuchos Endosafe-MCS durante el estudio, lo que explica la mayor
variabilidad de la correlación absoluta en este ensayo.

Forma de la curva estándar

La menor variabilidad se observó en las curvas estándar de los ensayos Endosafe-MCS y

ENDOZYME II GO, según la pendiente y la intersección Y (Fig. 6). Aunque utilizamos
diferentes lotes de cartuchos Endosafe-MCS en este estudio, la curva estándar se archivó en
los cartuchos y no se realizó cada vez, y para el ensayo ENDOZYME II GO se preparó
previamente en las microplacas de ensayo. La curva estándar para el ensayo K-QCL, que
tuvo que prepararse para cada ejecución, presentó la mayor variabilidad. Sin embargo,
ninguno de los resultados de las curvas estándar en ninguno de los ensayos.

Resultados no válidos

Los criterios de validez se resumen en la Tabla 1. Los resultados se consideraron no

válidos cuando las recuperaciones de PPC fueron inferiores al 50% o superiores al 200%, o
si el CV  de la recuperación de la muestra o del PPC era superior al 10% para el ensayo K-
QCL o superior al 10% para el ensayo K-QCL o superior al 25% para los ensayos
Endosafe-MCS y ENDOZYME II GO.
Los porcentajes medios globales de resultados no válidos fueron del 8,0%, 13,1% y 1,4%
para el ensayo K-QCL, Endosafe-MCS y ENDOZYME II GO, respectivamente (Fig. 7).
Los resultados no válidos para el ensayo K-QCL se debieron principalmente a la baja
recuperación (< 50%) del pico de PPC de las muestras de muestras de validación. Para el
ensayo Endosafe-MCS, la recuperación de PPC a partir de las muestras de validación de
limpieza fue a menudo superior al 200% y a veces inferior al 50%, con una gran
variabilidad.
Tiempo hasta el resultado y rendimiento
Los tiempos medios totales de ensayo (es decir, tiempo hasta el resultado) fueron de 1 h 32
min, 1 h 38 min y 57 min para los ensayos Endosafe-MCS, K-QCL y ENDOZYME II GO,
respectivamente (Fig. 8). Los tiempos medios de aplicación fueron de 1 h 17 min, 25 min y
22 min, respectivamente. Los datos brutos del ensayo ENDOZYME II GO demostraron que
el tiempo de lectura puede reducirse a 20 min (para una sensibilidad λ 0,05 UI/mL), lo que
reduciría el tiempo total de obtención de resultados a 47 min.

El tiempo hasta el resultado y los tiempos prácticos se midieron para 20 muestras en cada
ensayo. El tiempo medio hasta el resultado por muestra fue de 5 min tanto para el ensayo
Endosafe-MCS y K-QCL y de 3 minutos para el ensayo ENDOZYME II GO ensayo. El
tiempo medio de aplicación por muestra fue de 4 minutos para el ensayo EndosafeMCS y
de 1 minuto para los ensayos K-QCL y ENDOZYME II GO. 

Discusiones

Discusiones 
El estudio comparativo de los tres ensayos de endotoxinas para el agua demostró que el
ensayo K-QCL presentaba los mejores CV generales, pero la mayor variabilidad entre
ejecuciones y la mayor variabilidad para el porcentaje de recuperación de PPC. Esto se
debe potencialmente a la preparación diaria de la curva estándar. Como era de esperar, la
recuperación de CSE fue mejor con el ensayo K-QCL ya que este estándar se obtuvo de
Lonza y se utilizó para preparar la curva estándar del ensayo. Sin embargo, los resultados
de la recuperación del estándar internacional de RSE fueron satisfactorios para los tres
ensayos.
los tres ensayos y cada fabricante utiliza este estándar para determinar la potencia de su
propia CSE. 

El ensayo Endosafe-MCS tuvo los CV más bajos entre los ensayos duplicados, pero los
porcentajes de recuperación fueron altos y variables, PPC de muestras de agua purificada,
especialmente en el caso de las muestras enriquecidas. Además de resultados no válidos,
debido principalmente a que la recuperación de PPC a menudo fuera de los límites
definidos a partir de muestras de validación de limpieza. Este ensayo tuvo el mayor tiempo
de obtención de resultados cuando se analizaron 20 muestras, pero la automatización de
este ensayo con el sistema Nexus podría significativamente [17]. El ensayo ENDOZYME
II GO tuvo los CV de las muestras, mostró una variabilidad muy baja entre ensayos
duplicados, la
recuperación más reproducible de los picos duros de CSE/RSE, el mayor rendimiento para
20 muestras, presentó la mejor correlación para las curvas estándar, y tuvo la tasa más baja
de resultados inválidos. Los porcentajes de recuperación de los picos PPC y CSE/RSE
duros fueron los más homogéneos independientemente del tipo de agua analizada, y no se
observaron en las muestras de validación de limpieza.

Los porcentajes medios globales de resultados no válidos fueron 8,0%, 13,1% y 1,4% para
los ensayos K-QCL, Endosafe-MCS y ENDOZYME II GO respectivamente. Los
resultados no válidos para el ensayo K-QCL se debieron a la baja recuperación (< 50%) del
pico de PPC de las muestras de validación de limpieza enriquecidas. Para el ensayo
Endosafe-MCS, que fue el método menos robusto de los tres probados, la recuperación de
PPC de las muestras de validación de limpieza fue a menudo superior al 200% y a veces
inferior al 50%, con una gran variabilidad. Se podrían haber obtenido resultados más
fiables con los ensayos K-QCL y Endosafe-MCS si las muestras de validación de limpieza
se hubieran diluido dos veces.

Un resumen de la comparación de las características de los tres y nuestras recomendaciones

de uso, teniendo en cuenta los parámetros críticos evaluados en este estudio se presentan
en 
las Tablas 3 y 4.

El tiempo de utilización del ensayo ENDOZYME II GO fue de 22 minutos, pero podría

haberse reducido si se hubiera utilizado un robot de pipeteado, como Integra que ahora ha
sido personalizado por bioMérieux para preparar el GOPLATE®. Asimismo, el tiempo de
realización del ensayo K-QCL, que fue de 25 minutos, podría haberse reducido si se
hubiera
PyroTek. El tiempo de realización de la prueba Endosafe-MCS de 1 h 17 min podría
haberse reducido si se hubieran utilizado varios módulos MCS o si se hubiera utilizado el
automatismo Nexus. 

Además, dado que el ensayo ENDOZYME II GO es un ensayo de punto final, a diferencia

de los ensayos K-QCL y Endosafe-MCS que son ensayos cromogénicos cinéticos, es
posible preparar hasta cuatro microplacas simultáneamente, aumentando así la tasa de
producción de muestras.
Los resultados de este estudio demostraron que el rendimiento del método basado en rFC
era al menos similar al de los métodos basados en LAL para la detección de endotoxinas en
muestras de agua en nuestro entorno.

El método basado en rFC ofrece ventajas adicionales sobre los métodos basados en LAL,
como la mejora de la consistencia entre lotes, el aumento de la especificidad de la
endotoxina debido a menos interferencias, una recuperación estadísticamente más robusta
de los picos (menor tasa de resultados no válidos), y tiene un rango de sensibilidad
apropiado. Por lo tanto, concluimos que el ensayo ENDOZYME II GO parece ser adecuado
para la detección de endotoxinas en aguas farmacéuticas en un entorno de alto rendimiento
y que el método rFC es un buen sustituto de los ensayos LAL convencionales.