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PRACTICA # 01
FRACCIONAMIENTO
SUBCELULAR

I. Generalidades:

Diferentes estructuras subcelulares se separan por centrifugación de

homogeneneizados. Los homogeneizados se preparan rompiendo las células de los
órganos o tejidos, en medios apropiados que preservan los organelos, para lo cual se
emplean soluciones de sacarosa u otros azúcares que permitan conservar la integridad
de los organelos y evitar la tendencia de estos a volverse agrupar después de sacarlos
de la célula.

El fraccionamiento subcelular tiene tres componentes comunes

independientemente del tipo de tejido o célula. El primero de ellos corresponde a las
características químicas del medio líquido en donde se realizará el fraccionamiento, ya
que los iones que lo componen influyen en la estructura de los orgánulos que se deseen
obtener. La segunda es denominada disgregación o ruptura de la membrana y/o pared
celular, mientras que a la tercera se le conoce como separación de cada de las
fracciones celulares con base a procesos físicos como es la centrifugación o la
separación por columnas de exclusión.

El método más empleado para separar los organelos celulares es la centrifugación

diferencial, que consiste en someter al homogeneizado a deferentes velocidades en la
centrifuga para lograr las separaciones, basadas sobre diferencia de densidad y tamaño
de los organelos.

II. Reactivos:
- Sol. de sacarosa
- Sol .de NaCl 0,85 %

III. Procedimiento:

a) Una porción adecuada de homogeneizado se centrifuga a baja velocidad (1000

gravedad) durante 10 minutos y se obtiene :
1. El sedimento, formado por núcleos y células que no se rompieron durante
la homogeneización y fragmentos de membranas plasmáticas.
2. El sobrenadante que se encuentran partículas menos densas no
sedimentadas
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b) El sobrenadante anterior (a) se centrifuga a mayor velocidad ( 10,000

gravedad) durante 20 minutos y se obtiene:
1. El sedimento, formado por mitocondrias y lisosomas.
2. El sobrenadante que se encuentran partículas menos densas no
sedimentadas

c) El sobrenadante de (b) se centrifuga a 100,000 gravedad durante una a dos

horas y se obtiene :
1. El sedimento, formado por microsomas, fragmentos de retículos
endoplasmático y membrana plasmática.
2. El sobrenadante último que queda se denomina fracción soluble o citosol
y contiene algunas enzimas que no forman parte de las estructuras
intracelulares.
EXTRACCIÓN DE UNA MOLÉCULA
A) Para sagre: Obtener el suero sanguíneo. Con este fin la muestra será colocada
en un tubo sin aticoagulante. Se dejará en reposo 5-10 minutos. Con una varilla
de vidrio se desprenderá el coagulo que se esta formando si hubiera quedado
adherido al borde superior del tubo. Contrapesar con otro tubo empleando una
balanza y centrifugar a 3500 rpm. Por 8 a 10 minutos. Con una pipeta pasteur
separa el suero a otro tubo o frasco. Guardar a 4°C para su análisis.
B) Para higado: Prefundir el higado con KCL 0,154M lavar con el mimo reactivo
helado. Pesar 2 a 4 gr. De la muestra. Triturar con tijeras y homogenizar
agregando 2 a 4 ml de KCL 0,154M o Buffer Fosfato 0,02M pH 7,0. si es
necesario emplear mas mustra con solvente manteniendo la misma proporción.
La homgenización se hará por tres periodos de dos minutos cada uno con un
intervalo de un minuto. Finalmente, pasar los homogenizados a tubos de
centrífuga, contrapesar y centrifugar a 3500 rpm. Por 8 a 10 minutos. Separar
los sobrenadantes y guardarlos a 4°C para su análisis posterior. Anotar las
características.

IV. RESULTADOS
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Fraccionamiento celular
https://www.youtube.com/watch?v=OmQdFl8twA0
https://www.youtube.com/watch?v=Zv8SzbFFeBg

Seguridad en el laboratorio
https://www.youtube.com/watch?v=nT3Vk9Azpns

Referencia bibliográfica
http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm

Bahirova S, Hughes B, Hendzel M y Schulz R Fraccionamiento secuencial y

aislamiento de proteínas subcelulares de tejido o células cultivadas. ELSEVIER
[Internet] Noviembre 2015 Disponible
en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4678309/