UNIVERSIDAD NACIONAL

JORGA BASADRE GROHMANN

Facultad de Ciencias Agropecuarias
E.A.P. MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
CURSO: MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN PARCIAL DE MICROORGANISMOS
DEL AIRE Y SUELO

PRESENTADO POR:
MGR. JAIME DANIEL MACHACA MENA
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

OBJETIVO

• Reconocer algunos procedimientos para el aislamiento e identificación parcial de microorganismos del

aire y suelo
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

PROCEDIMIENTO
1) Microorganismos del Aire:
• Se elige un ambiente interno como una oficina.
• Se elije un ambiente externo como la vía pública
• En ambos casos se toma una Placa Petri con Agar nutritivo y ora con
Agar Sabouraud, se abre la tapa superior y se expone al aire libre por
15 minutos.
• Luego se lleva a la incubadora.
− Agar Nutritivo a 35 – 37ºC x 24 hr bacterias
− Agar Sabouraud a 25ºC x 2 a 5 días hongos (esporas)
Observación de los microorganismos
Después de 7 días, al evaluarse el crecimiento de microorganismos y
observar sus características macroscópicas.
• Para el caso de bacterias se realiza una coloración Gram para
identificar que tipo de coloración toman ya sea gran positiva o
negativas.
• Para el caso de hongos se realiza montaje con colorante Azul de
Lactofenol y para una mejor identificación se realiza un microcultivo.
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

Hongos Bacterias

hifas

conidiao esporas
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

Preparación en fresco para observación directa

MICROCULTIVO
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

conidias o esporas

hifas
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

ocular micrometrica
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

Colonias en tubos con agar Sabouraud

inclinado de:

a) Aspergillus flavus,
b) Aspergillus ochraceus,
c) Aspergillus niger,
d) Aspergillus fumigatus,
e) Aspergillus terreus,
f) Aspergillus carbonarius,

aisladas del aire de la ciudad de Piura.

 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

Microorganismos de Suelo

 Toma de muestra de suelo

Para la obtención de las muestras, se utiliza una pala de acero

inoxidable que permite extraer parte del suelo rizosférico sin la
planta de una profundidad de 15 cm aproximadamente. La
cantidad de suelo extraída por punto de muestreo, 1kg, es
colocada en bolsa de polietileno, las cuales se etiqueta, rotula
y lleva al laboratorio para su procesamiento.
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

a) Aislamiento de Microorganismo: Trichoderma sp.

• Las muestras de suelo se procesan con el empleo de las diluciones decimales seriadas.

• Se pesó 1 g de suelo y se diluyó en 10 ml de agua destilada estéril para preparar una solución madre, agitando
durante varios minutos.

• A partir de esta se realizaron cuatro diluciones decimales seriadas sucesivas hasta el valor 10-4

• De cada dilución (entre 10-1 y 10-4) se toma 0,1 ml para realizar la siembra en placas Petri con medio Papa Dextrosa
Agar (PDA) y se siembra por extensión superficial.

• Las placas se incubaron a 25 ± 1oC por siete días para realizar observaciones diarias.

• Las colonias se pasan a tubos de ensayos que contenían PDA para su conservación.

• La identificación de las especies de Trichoderma se preparan microcultivos y se realizan observaciones

microscópicas con lente objetivo 40X, y así apreciar con calidad las características morfológicas de micelio, fiálides,
conidióforos, conidios y clamidosporas.
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
 MICROCULTIVO

colocar la cuadricula

hacer inuculo tapar

humedeser cubrir
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

b) Aislamiento de Microorganismo: Azotobacter sp.

• Se pesa 10 gramos de muestra de suelo y se diluye en 90 mL de solución salina fisiológica (S.S.F) estéril, de la cual
se harán diluciones hasta 10-4 en tubos de ensayo con 9 mL de S.S.F.

• Se cultiva 1 mL de cada dilución, en tubos de ensayo con 10 mL de Medio de cultivo ASHBY con azul de bromotimol
como indicador de pH.

• Los tubos se incuban a 28°C durante 7 días en aerobiosis.

• Posteriormente se realiza la lectura considerando como tubos positivos de crecimiento presuntivo de Azotobacter sp,
los que presentaron turbidez, velo superficial y viraje del medio de azul a amarillo (Zapater, 1975).

 Se tomó una alícuota a partir de los tubos positivos y se siembra por agotamiento en placas Petri con Agar ASHBY.

 Estas placas se incuban a 25 - 28 °C durante 3 días, tiempo en el cual se observan colonias cremosas posterior al
cabo de 6 a 7 días un color marrón oscuro presuntivo para Azotobacter sp.
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

Azotobacter es una bacteria Gram-

negativa.

forma bacilos
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

c) Aislamiento de Microorganismo simbiótico: Rhizobium sp.

• El aislamiento de rizobios se realiza a partir de plantas leguminosas (Ejm. Raíz de habas “Vicia faba”).
• Ya en laboratorio con el uso de tijeras, cuchillas y/o similares se extrae los nódulos en una placa Petri limpia.
• La esterilización superficial de los nódulos se lleva a cabo sumergiendo los nódulos primero en agua corriente para
eliminar todos los restos de suelo. A continuación se pasan a etanol al 96% durante 30 segundos, se realiza un
lavado rápido con agua destilada estéril y se sumergen en HgCl2 al 0,1% (p/v) durante 45 segundos seguido de
varios lavados con agua destilada estéril. De esta forma se consigue eliminar toda la flora microbiana superficial.
• Una vez los nódulos están estériles, se procede de dos formas para asegurar el crecimiento bacteriano.
− En el primer caso se realiza un corte con bisturí para acceder a la zona central del nódulo y con el asa de
siembra se transfieren las bacterias a una placa con YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) (Vincent 1970).
− En el segundo caso se homogeneizan en un mortero estéril y se transfiere una alícuota a una placa con el
mismo medio YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) y se extiende con espátula drigalsky.
• Las placas se incuban a 28°C hasta la aparición de colonias aproximadamente de 3 a 5 días
• Las colonias aisladas se obtienen por agotamiento de asa de siembra. Para estudiar la morfología de las bacterias
se hacen frotis sobre portas y se examinan al microscopio óptico, previa tinción de Gram.
PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

placa
petri
 PRÁCTICA Nº10: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE Y SUELO

Yeast Mannitol Agar w/ Congo Red

El extracto de levadura sirve como una buena fuente de

aminoácidos fácilmente disponibles, complejo de
vitamina B y factores de crecimiento accesorios para
rizobios. También equilibra el potencial de oxidación-
reducción del medio en el rango favorable para Rhizobia
y sirve como hidrógeno donante en proceso respiratorio.

El manitol es la fuente de alcohol de azúcar

fermentable. El magnesio proporciona cationes
esenciales para el crecimiento de Rhizobia. El rojo
congo inhibe las cepas sensibles a la penicilina. Las
colonias de Rhizobia se destacan como blancas,
translúcidas, reluciente y elevado, con márgenes
enteros.

Coloración de Gram: las colonias seleccionadas debían

estar formadas por bacterias Gram negativas y de tipo
bacilar.
Uso de los microorganismos nativos aislados del suelo
Uso de los microorganismos nativos aislados del suelo