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Artículo

Efectos neurotóxicos de Linalool yβ-Pineno en

Tribolium castaneumHierbas
Nerlis Pajaro-Castro1,2 ,Karina Caballero Gallardo1y Jesús Olivero-Verbel1,*
IDENTIFICACIÓN
IDENTIFICACIÓN

1 Grupo de Química Ambiental y Computacional, Campus Zaragocilla, Facultad de Ciencias Farmacéuticas,

Universidad de Cartagena, Cartagena 130016, Bolívar, Colombia;
np ajaroc@unicartagena.edu.co (NP-C.); kcaballerog@unicartagena.edu.co (KC-G.)
2 Grupo de Ciencias Médicas y Farmacéuticas, Facultad de Ciencias de la Salud, Departamento de Medicina,
Universidad de Sucre, Sincelejo 700003, Sucre, Colombia
* Correspondencia: joliverov@unicartagena.edu.co ; Teléfono: +57-5-6698-179

Recibido: 9 de septiembre de 2017; Aceptado: 21 de noviembre de 2017; Publicado: 24 noviembre 2017

Abstracto:El control de plagas efectivo y ético requiere el uso de productos químicos que sean altamente
específicos, seguros y ecológicos. El linalol y el β-pineno se encuentran naturalmente como componentes principales
de los aceites esenciales de muchas especies de plantas distribuidas en todo el mundo y, por lo tanto, cumplen con
estos requisitos. Estos monoterpenos fueron probados como repelentes contraTribolium castaneum, usando el
método de preferencia de área, después de cuatro horas de exposición y el efecto transcripcional de genes
asociados con la neurotransmisión. Cambios en la expresión génica de acetilcolinesterasa (Ace1), variante de
empalme del canal de aniones activado por GABA 3a6a (Rdl), canal iónico activado por GABA (Grd), canal de cloruro
activado por glutamato (Glucl) y canal de cloruro activado por histamina 2 (Hiscl2) fueron evaluados y también se
estudió la interacción con proteínas importantes para el insecto usando métodos in silico. Para linalol y β-pineno, la
concentración de repelente 50 (RC50) los valores fueron 0.11µL/cm2y 0.03µL/cm2, respectivamente. Ambos
compuestos indujeron la sobreexpresión del gen Hiscl2 en insectos adultos, y el β-pineno también promovió la
sobreexpresión de Grd y el gen Ace1. Sin embargo, el β-pineno y el linalool tenían poco potencial para acoplarse a
modelos generados por computadora para el canal iónico activado por GABA LCCH3, las subunidades alfa1 y alfa2
del receptor nicotínico de acetilcolina y las proteínas putativas del receptor de octopamina/tiramina de
T. castaneumya que sus respectivas afinidades de unión eran marginales y, por lo tanto, la acción repelente probablemente
involucraba mecanismos distintos a la interacción directa con estos objetivos. Los resultados indicaron que el β-pineno fue
más potente que el linalool en la inducción de repelencia de insectos, y también tuvo una mayor capacidad para generar
cambios en la expresión de genes implicados en la transmisión neuronal.

Palabras clave:la expresion genica; insectos; monoterpenos; repelentes

1. Introducción

Los bioplaguicidas están ganando cada vez más atención e interés entre aquellos preocupados por los enfoques de
manejo de cultivos integrados, seguros y respetuosos con el medio ambiente.1,2] y, en consecuencia, la naturaleza nos ha
proporcionado una variedad de agentes quimioterapéuticos [3]. Entre ellos, los aceites esenciales (AE) y sus constituyentes
afectan los procesos bioquímicos, alterando específicamente el equilibrio endocrinológico de los insectos. De hecho, algunas
plantas biosintetizan los aceites esenciales para protegerse de los insectos y pueden interrumpir el proceso de morfogénesis
a través de la neurotoxicidad o actuando como reguladores del crecimiento.1] e interfiriendo con el metabolismo básico y la
fisiología de los insectos [4].
Los terpenos son una clase de metabolitos secundarios de plantas que tienen una estructura y función distintas,
y se consideran agentes importantes en los usos medicinales de las plantas aromáticas.3]. Los monoterpenos, un
grupo estructuralmente diverso de compuestos fitoquímicos, son el componente principal de los aceites esenciales.
En los últimos años ha aumentado el interés por comprender las acciones farmacológicas de estas moléculas. Los
estudios han demostrado que estas moléculas naturales pueden modular las propiedades funcionales

Moléculas2017,22, 2052; doi:10.3390/moléculas22122052 www.mdpi.com/journal/molecules

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de varios tipos de canales iónicos activados por ligandos y voltaje, y por lo tanto pueden usarse como alternativas a los
insecticidas sintéticos contra plagas en productos almacenados [5].
El linalool y el β-pineno son dos monoterpenos volátiles de alcoholes e hidrocarburos.6] reportados como
componentes principales de los aceites esenciales en varias especies aromáticas [7] (Cifra1). Linalool es producido por
plantas y se usa en productos cosméticos, perfumes y saborizantes. Además, se ha demostrado que tiene actividad
antimicrobiana y propiedades repelentes de insectos que actúan sobre el sistema nervioso central (SNC) [6]. Linalool
es ligeramente volátil con un agradable aroma asociado con fragancias de lavanda y laurel [3,8]. El objetivo de este
estudio fue evaluar los efectos del linalool y el β-pineno en la expresión de genes relacionados con la
neurotransmisión enT. castaneum, y evalúa la interacción con proteínas importantes para el insecto utilizando
métodos in silico.

Figura 1.Estructuras químicas 2D de linalol (A) y β-pineno (B).

2. Resultados

2.1. Actividad repelente

Los resultados del porcentaje de repelencia de los productos químicos probados se presentan en la Figura2. A la
concentración más baja, se encontró actividad atractiva para ambos compuestos. Sin embargo, a concentraciones
más altas, estos compuestos mostraron una fuerte actividad repelente, con una concentración de repelente de 50 (RC
50) valores de 0.11 y 0.03µL/cm2para linalol y β-pineno, respectivamente. el RC50del control positivo fue 0.02µL/cm2.
Los resultados del ANOVA de dos vías mostraron que hubo interacción entre las diferentes concentraciones
evaluadas, por lo tanto, el efecto repelente fue dependiente de la concentración.

Figura 2.Porcentaje de repelencia del linalol (A) y β-pineno (B) contraT. castaneum. * Estadísticamente
significativo en comparación con el control (pag<0,05). (A) valor t = 1,050; valor F = 4,411; (B) valor t = 2,646; Valor F
= 4,133.

2.2. La expresion genica

En este estudio, los cambios en la expresión génica deT. castaneumlos adultos se presentan en la figura3.
Ambos constituyentes se comportaron de manera diferente y mostraron diferencias estadísticamente significativas
en la expresión de genes como Grd, Ace1 e Hiscl2. Aunque los insectos expuestos al linalool no mostraron una
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diferencias en la expresión del gen Ace1, se observó una tendencia al aumento en ambos genes
housekeeping. El ANOVA de dos vías mostró que no hubo interacción entre los genes, por lo tanto, la
expresión génica fue independiente para cada gen.

Figura 3.Expresión relativa de ARNm de genes seleccionados en adultos deT. castaneumdespués de 4 h de

exposición a diferentes concentraciones de linalol y β-pineno. Dentro de cada gen, la expresión relativa se
normalizó frente al control (Valor = 1). * Efectos significativos en comparación con el control. Rdl: valor t =
1,636; valor F = 0,542; Hr39: valor t = 1,718; valor F = 0,903; GluCl: valor t = 0,450; valor F = 0,579; Grd: valor
t = 0,042; valor F = 0,065; As1: valor t = 2,559; valor F = 0,924; HisCl2: valor t = 3,157; Valor F = 0,715.

2.3. Modelado y Validación de Homologías

Las mejores proteínas obtenidas en el proceso de modelado por homología se cargaron en Protein Model Data Base
(PMDB). Los resultados de validación obtenidos utilizando los diferentes servidores demostraron la calidad de los modelos.
ProQ calificó los modelos obtenidos como regular, muy y extremadamente buenos (Tabla1).
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Tabla 1.Resultados de la validación de proteínas modeladas por homología deT. castaneumutilizando Pro Q.

Proteínas LGscore MaxSub

hidrolasa de éster carboxílico 5.448 0.154
Hidrolasa de éster carboxílico 2 (actividad de acetilcolinesterasa) 6.207 0.459
Variante 3a6a de empalme del canal de aniones activado por ácido gamma-aminobutírico (GABA-RDL) 1.520 0.087
Canal de iones activado por ligando de ácido gamma-aminobutírico (GABA-GRD) Canal de 2.658 0.120
cloruro activado por ligando de ácido gamma-aminobutírico 3) (GABA-LCCH3) 2.611 0.129
Canal de cloruro activado por glutamato Canal de 2.010 0.150
cloruro activado por histamina 1 Canal de cloruro 2.487 0.166
activado por histamina 2 Receptor hormonal en la 2.435 0.143
proteína similar a 39 Subunidad alfa 1 del receptor 0.947 0.432
nicotínico de acetilcolina Subunidad alfa 2 del receptor 1.580 0.090
nicotínico de acetilcolina 1.707 0.118
Canal de cloruro sensible al pH 1.740 0.139
Receptor putativo de octopamina/tiramina 2.150 0.100

Los resultados del proceso de validación obtenidos por RAMPAGE mostraron que las proteínas estudiadas tenían un
número de residuos en regiones favorecidas y permitidas superior al 90 % (Figuras S1–S13). Las figuras S14–S26 representan
los resultados obtenidos con QMean, que eran una medida del grado de naturalidad de una estructura para una proteína en
particular. Estos resultados mostraron valores con signo negativo, indicando puntajes inferiores a los obtenidos para las
estructuras experimentales promedio.

2.4. acoplamiento molecular

Se llevó a cabo un enfoque computacional para identificar posibles objetivos para el linalol y el β-pineno, con un
enfoque particular en elT. castaneumProteínas implicadas en respuestas neurológicas. Los resultados se presentan en
la Tabla2. El β-pineno produjo mejores interacciones que el linalool, con valores de afinidad que oscilaron entre−7.7 a−
5,0 kcal/mol. Sin embargo, estos valores de afinidad fueron bajos en comparación con los obtenidos a partir de
inhibidores conocidos.

Tabla 2.Afinidades calculadas por AutoDock vina (Kcal/mol) obtenidas para acoplar linalol y β-pineno en algunas
proteínas.

Proteínas Código Uniprot Linalol β-pineno inhibidores

hidrolasa de éster carboxílico E7DN61 − 5.3±0.1 − 5.8±0.0

Hidrolasa de éster carboxílico 2 (actividad de acetilcolinesterasa) Variante de E7DN62 − 5.5±0.2 − 6.1±0.1
empalme de canal de aniones activado por ácido gamma-aminobutírico 3a6a A8DMU1 − 4.9±0.1 − 6.1±0.0 − 9.8±0.0 *
Canal de iones activado por ligando de ácido gamma-aminobutírico A8DMU2 − 5.1±0.1 − 6.0±0.0 − 9.4±0.0 *
Canal 3 de cloruro activado por ligando de ácido gamma-aminobutírico A8DMU3 − 6.7±0.2 − 7.2±0.0 − 9.0±0.0 *
Canal de cloruro activado por glutamato Canal de A8DMU5 − 4.9±0.2 − 6.6±0.3
cloruro activado por histamina 1 Canal de cloruro A8DMU7 − 5.3±0.2 − 5.6±0.0
activado por histamina 2 Receptor hormonal en la A8DMU8 − 5.0±0.2 − 5.7±0.0
proteína similar a 39 Subunidad alfa 1 del receptor D2A6H1 − 5.2±0.2 − 6.0±0.0
nicotínico de acetilcolina Subunidad alfa 2 del receptor A8DIP3 − 7.1±0.2 − 7.4±0.1 − 8.8±0.0+
nicotínico de acetilcolina A8DIQ7 − 6.8±0.3 − 7.6±0.0 − 8.5±0.0+
Canal de cloruro sensible al pH A8DMU9 − 5.4±0.2 − 5.0±0.0
Receptor putativo de octopamina/tiramina D6WB14 − 7.2±0.2 − 7.7±0.0 − 8.2±0.0‡
* Ivermectina [9];+imidacloprid [10];‡prometazina [11].

La estructura 3D de las proteínas y los aminoácidos involucrados en la interacción proteína-ligando se

muestra en la Figura S27. El linalool y el β-pineno se unen al mismo sitio y, por lo tanto, interactúan con el
mismo tipo de aminoácidos en todos los complejos estudiados, excepto aquellos formados con la hidrolasa de
éster carboxílico y las proteínas del canal de cloruro activado por glutamato donde los químicos se acoplaron
en diferentes sitios. de la proteína Los principales aminoácidos identificados en las interacciones proteína-
ligando fueron ILE, LEU, THR, SER y VAL, con una frecuencia de aparición superior al 40 %. Las principales
interacciones proteína-ligando identificadas fueron hidrofóbicas y de enlaces de hidrógeno.
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3. Discusión

Los productos repelentes de insectos naturales se han convertido en una alternativa viable a los repelentes sintéticos [
12,13] ya que presentan menos riesgos para el medio ambiente y la salud humana [7]. En este artículo, se estudiaron dos
compuestos principales de EO para evaluar la actividad repelente, la expresión génica y el acoplamiento molecular. El β-
pineno mostró mayor actividad repelente que el linalool (Figura2), y ambos tenían RC más pequeño50valores que IR3535,
aunque estos fueron comparables con el control positivo.
El β-pineno fue más potente contraT. castaneumque el linalol. Este compuesto es un monoterpeno oxigenado
que está abundantemente presente en el medio ambiente y se encuentra ampliamente en las plantas como
componente de los aceites esenciales.14]. Ha sido reportado con toxicidad aguda para insectos deT. castaneum
después de tres días de exposición [15]. Por su parte, el linalool es un monoterpeno de 10 átomos de carbono y un
grupo alcohol [dieciséis] que ha sido reportado como un mosquito (Aedes aegypti) [17] y repelente de escarabajos (T.
castaneum yDominica Rhyzopertha) [18], lo que coincide con los efectos observados en este estudio.
Linalool y β-pineno son repelentes de insectos; sin embargo, los mecanismos por los cuales funcionan estos
compuestos no se comprenden completamente. Solo se sabe que los monoterpenos pueden actuar sobre varios
receptores de insectos y mamíferos, especialmente a nivel del sistema nervioso, y específicamente sobre los canales
de cloruro activados por el ácido gammaaminobutírico (GABA); receptores de octopamina, tiramina y acetilcolina
nicotínica (nAChR); acetilcolina esterasa; canales de sodio; y otros objetivos. Se ha informado que varios
monoterpenoides diferentes se unen a los receptores ionotrópicos GABA en humanos, roedores e insectos en
investigaciones previas [1,5,19]. Los sistemas de defensa aleloquímicos de los insectos permiten la rápida eliminación
de las sustancias tóxicas ingeridas y/o los cuerpos grasos, lo que facilita la desintoxicación de los contaminantes que
penetran en las estructuras cuticulares o traqueales a través de enzimas, como P450, glutatión-S-transferasas y
esterasas, que se concentran típicamente en el intestino medio del insecto [1]. Sin embargo, algunos de los objetivos
más importantes de los agentes insecticidas son los receptores de neurotransmisores inhibidores, como los canales
de cloruro activados por ácido gamma-aminobutírico (GABA) de invertebrados (GABACl) y los canales de cloruro
activados por glutamato (GluCl), que están relacionados con cambios en el comportamiento.20].
La actividad repelente está relacionada con cambios en el comportamiento de los insectos, que son causados
por efectos sobre el SNC. El canal iónico activado por histamina es un miembro de la superfamilia de canales iónicos
activados por ligando cys-loop (cys-loop LGIC) [21], y tiene dos subunidades, HisCl1 y HisCl2, que controlan la
fototransducción de los invertebrados [22]. Fuera de la fototransducción, la histamina también parece ser el
neurotransmisor que se encuentra en algunas neuronas mecanosensoriales endrosófilaasí como en las neuronas
estomatogástricas, cardíacas y olfatorias de la langosta.23,24]. Los insectos adultos expuestos a linalol y β-pineno
sobreexpresaron el gen Hiscl2 (Figura3), sugiriendo muy probablemente que la función de este gen podría ser uno de
los mecanismos implicados en la acción repelente de estos monoterpenos. Sin embargo, estos compuestos tienen
poca capacidad in silico para unirse a esta proteína, con valores de afinidad de−5.0±0.2 y
− 5.7±0,0 Kcal/mol para linalool y β-pineno, respectivamente (Tabla2), dejando espacio para la participación de
mecanismos moduladores no relacionados con la unión directa.
Los monoterpenos son capaces de penetrar rápidamente en las células de los insectos al ser compuestos
volátiles y lipofílicos que interfieren en las funciones fisiológicas por lo que sus modos de acción o mecanismos de
resistencia son especialmente complejos.1,5]. Por ejemplo, interactúan con el funcionamiento de las sinapsis GABA [
25], o cambiar la actividad de los canales iónicos activados por ligandos y/o activados por voltaje en el SNC, lo que
perjudica la actividad de las enzimas neuronales como Ace [26].
En comparación con el β-pineno, el linalool exhibió menos actividad en términos de expresión génica, a pesar de
cierto potencial para interactuar con las proteínas involucradas en la sinapsis (Figura S27b). Por otro lado, el β-pineno
induce la sobreexpresión de Grd y Ace1 enT. castaneumadultos (Figura3). Los receptores ionotrópicos deT. castaneum
funcionan como canales de cloruro activados por GABA (GABACls-Grd), miembros receptores de la familia de canales
iónicos activados por ligando Cys-loop, que median la transmisión sináptica inhibidora rápida.22,27]. Por otro lado, la
función biológica canónica de Ace es terminar la transmisión de impulsos en las sinapsis colinérgicas hidrolizando
rápidamente el neurotransmisor acetilcolina en animales; por lo tanto, es el objetivo de los insecticidas
anticolinesterásicos [28]. Aunque es claro que los monoterpenoides evaluados tenían poca capacidad para interactuar
directamente in silico con varias proteínas relacionadas con la neurotransmisión
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(Mesa2, Figura S27), la activación de la expresión génica indicó que otros mecanismos alternativos estaban
modulando indirectamente sus actividades repelentes.
El uso de herramientas moleculares junto con enfoques in silico ayuda a comprender mejor los
mecanismos de toxicidad.29–31]. En esta investigación, además de evaluar la expresión génica, también se
estudiaron las interacciones de dos monoterpenos con proteínas importantes en la neurotransmisión. Se
empleó el modelado de homología para construir la estructura tridimensional de las proteínas antes del
acoplamiento molecular. La calidad de los modelos se evaluó con QMean, ProQ y RAMPAGE (Tabla1, Figuras
S1–S26), y los valores de LGscore y MaxSub implicaron que los modelos obtenidos eran buenos [32]. La media
QZ-score utiliza estructuras que se resuelven mediante cristalografía de rayos X como referencia para estimar
la calidad absoluta de un modelo [33]. Para los modelos de este estudio, el QMeanZ-la puntuación estuvo en el
rango de−10.99 a−4.70, mostrando que estos modelos variaban en calidad; a la inversa, sin embargo, los
resultados obtenidos con RAMPAGE y ProQ sugirieron que los modelos tenían la calidad adecuada [34–36].
La aplicación de enfoques computacionales se usa a menudo para el estudio de los perfiles toxicológicos de
nuevos agentes insecticidas candidatos.37]. Los resultados del acoplamiento revelaron que el linalool y el β-pineno
tenían poca capacidad para interactuar con elT. castaneumproteínas involucradas en el proceso de neurotransmisión
(Tabla2) ya que la afinidad de unión estaba entre−5,0 y 6,0 Kcal/mol, valores muy alejados de los obtenidos para los
inhibidores conocidos, que rondan−9,0 Kcal/mol (Tabla2) [9–11]. Curiosamente, las interacciones proteína-ligando
para el β-pineno y el linalool también compartieron algunos residuos con la ivermectina.38]; sugiriendo un sitio de
unión común. Aunque las proteínas evaluadas se relacionaron con la acción de varios compuestos químicos sobre los
insectos, en este estudio in silico, el linalol y el β-pineno mostraron valores de afinidad muy bajos sobre las proteínas,
lo que indica que la acción repelente probablemente involucre mecanismos alternativos.

4. Materiales y Métodos

4.1. cría de insectos

La cepa de tipo salvaje deTribolium castaneumHerbst fue tomado de una colonia de stock mantenida en nuestro
laboratorio. La identificación deT. castaneumse realizó de acuerdo a las características morfológicas reportadas por
Dönitz et al. [39]. Los insectos se criaron con una dieta de copos y avena molida (70:30) a 26±2◦C, con una humedad
relativa del 70% al 85% y un fotoperiodo luz:oscuridad de 10:14 h [2,6,7]. Luego, se eligieron aleatoriamente adultos
sanos de dos a cuatro semanas de edad para los bioensayos.

4.2. Materiales

Linalool (> 99 %) y β-pineno (> 95 %) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Reactivo

de acetona (≥99,5%) también se adquirió de Sigma-Aldrich.

4.3. Actividad repelente

Los experimentos se llevaron a cabo en adultos deT. castaneumen condiciones de laboratorio. La actividad repelente de
linalool y β-pineno se evaluó mediante el método de preferencia de área [20,40]. Las áreas de prueba consistieron en papel de
filtro Albet DP 597125 de 9 cm cortado por la mitad (31,8 cm2). Como recipientes experimentales se utilizaron cajas de Petri (9
cm de diámetro) para albergar 20T. castaneum. Linalool y β-pineno se disolvieron en serie en acetona (0,0002, 0,002, 0,02, 0,2
y 0,3µL/cm2). QuinientosµL de la solución se aplicaron uniformemente a un disco de papel de medio filtro a cinco
concentraciones de prueba diferentes. La otra mitad del papel de filtro restante se trató con 500µL de acetona y se utiliza
como vehículo de control. Luego, los medios discos se secaron al aire durante aproximadamente 10 minutos para permitir la
evaporación del solvente. Durante cada prueba, 20T. castaneumlos adultos sin distinción de género se liberaron en el centro
del disco, luego se cubrieron rápidamente con una cubierta para platos y se colocaron en la oscuridad. Los conteos de los
insectos presentes en cada lado del papel de filtro se realizaron después de 4 h de exposición. Como control positivo, una
formulación al 15% de
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IR3535 etilo 3-(norte-acetilo-norte-butilamino)propionato [2] se utilizó. A continuación, se calculó el porcentaje de

repelencia (PR) de cada compuesto/repelente comercial usando la fórmula Ecuación (1).

RP = [(Nc−Nt)/(Nc + Nt)]×100 (1)

donde Nc y Nt son el número de insectos en las áreas no tratadas (control) y tratadas, respectivamente. Se
usaron tres réplicas para cada concentración probada del compuesto principal y cada ensayo se repitió dos
veces.
Después de que se realizó el experimento, la concentración mediana de repelente (RC50) para cada
compuesto se obtuvo mediante análisis Probit (RC50= 0,11µL/cm2para linalol y RC50= 0,03µL/cm2
para β-pineno) y se usó para ensayos de expresión génica.

4.4. Ensayos de expresión génica

El control de adultos y los organismos expuestos se congelaron directamente con nitrógeno líquido y se
conservaron en RNAlater. El ARN total se aisló usando un RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) de
acuerdo con los protocolos del fabricante. Las concentraciones de ARN se midieron con un espectrofotómetro
NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) y la calidad se verificó mediante la relación de
absorbancia 260/280 nm. cDNA se obtuvo a través de la QuantiTect®Reverse Transcription Kit (Qiagen Inc.,
Valencia, CA, EE. UU.) según los protocolos del fabricante. Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real (RT-PCR) en un aparato del sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EE. UU.). Se analizaron seis genes (Tabla3) [41–43]. La expresión génica se normalizó a proteína
ribosomal 18 (Rps18) y proteína ribosomal 49 (Rps49) [44]. Las secuencias de cebadores se presentan en la
Tabla3. La RT-PCR se realizó con Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA,
EE. UU.). El∆∆CT se utilizó para calcular la expresión génica relativa. Todos los experimentos se realizaron por
duplicado [45–47].

4.5. Modelado y Validación de Homologías

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas deT. castaneumse obtuvieron de Uniprot [48] en formato
FASTA con los siguientes números de acceso E7DN61, E7DN62, A8DMU1, A8DMU2, A8DMU3, A8DMU5,
A8DMU7, A8DMU8, D2A6H1, A8DIP3, A8DIQ7, A8DMU9 y D6WB14. Estructuras tridimensionales de hidrolasa
de éster carboxílico, hidrolasa de éster carboxílico 2, ácido gamma-aminobutírico (GABA)-RDL, GABA-GRD, canal
iónico activado por GABA LCCH3, canal de cloruro activado por glutamato, canal de cloruro activado por
histamina 1, canal de cloruro activado por histamina canal de cloruro 2, receptor de hormonas en 39-like,
subunidad alfa 1 del receptor nicotínico de acetilcolina, subunidad alfa 2 del receptor nicotínico de acetilcolina,
canal de cloruro sensible al pH y proteínas receptoras putativas de octopamina/tiramina se construyeron
mediante modelos de homología utilizando (PS) 2-v2: Proteína Servidor de predicción de estructura [49,50],
Phyre2 [51], y I-Tasser [52]. Se seleccionó el mejor modelo generado por cada servidor de predicción para
validar la calidad del modelo [33]. La calidad de los modelos se evaluó mediante el RAMPAGE [53], ProQ
(Predictor de la calidad de la proteína) y QMEAN [31,54]. La mejor estructura de cada proteína obtenida
después del procedimiento de validación se sometió a análisis estructural utilizando el sistema de gráficos
moleculares PyMOL [33] y guardado en la base de datos de modelos de proteínas (PMDB) [32]. PM0081096,
PM0081123, PM0081100, PM0081098, PM0081126, PM0081097, PM0081124, PM0081099, PM0081101,
PM0081125, PM0081129, PM0081127, and PM0081128 were assigned as the identifiers for the structures
carboxylic ester hydrolase, carboxylic ester hydrolase2, GABA-RDL, GABA-GRD, Canal iónico activado por GABA
LCCH3, canal de cloruro activado por glutamato, canal de cloruro activado por histamina 1, canal de cloruro
activado por histamina 2, receptor hormonal similar a 39, subunidad alfa 1 del receptor nicotínico de
acetilcolina, subunidad alfa 2 del receptor nicotínico de acetilcolina, canal de cloruro sensible al pH , y receptor
putativo de octopamina/tiramina, respectivamente.
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Tabla 3.Secuencias de cebadores de los genes utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).

Nombre del gen Símbolo genético Identificación del gen Entrez Adelante (5′-3′) Inversa (5′-3′) Tamaño del amplicón

Genes evaluados

acetilcolinesterasa as1 HQ260968.1 CCGTTCGTCCCAGTCATTG AGTAGTAGCCTTCTTCTGTGTTAG 121

Variante de empalme de canal de aniones activado por GABA 3a6a RDL NM_001114292.1 ACTTGGGCGACGTCAACATA ACGTGAAATCCATCTGGACC 159
canal iónico activado por GABA Grad. NM_001114300.1 GGTCTCCTTCTGGCTGAACC TGGACCACAGCGAACTGAAT 198
Canal de cloruro activado por glutamato glucl NM_001114304.1 TGAATGGCACAGATGGTCCC CCAGACTCGACTGGCTTCAG 194
Canal de cloruro activado por histamina 2 Hiscl2 NM_001109951.1 TGGATGTCCAGTTGTTCGGT TGTGGCTGAATAGGCAAGTCAT 176
Receptor hormonal en proteína similar a 39 Hr39 XR_043083.1 CGACCGTCGACTGTCAAAAA AGTCGACATGGAACGGAAAC 145
Gen de limpieza
Proteína ribosómica 49 $49 XM_964471.2 TGGCAAACTCAAACGCAACT AGCGCCTACGAACCCTGTT 62
Proteína ribosómica 18 $18 XM_968539.2 CGAAGAGGTCGAGAAAATCG CGTGGTCTTGGTGTGTTGAC 235
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4.6. acoplamiento molecular

Antes del acoplamiento molecular, las estructuras 3D de la hidrolasa de éster carboxílico, la hidrolasa de éster
carboxílico 2, GABA-RDL, GABA-GRD, canal iónico activado por GABA LCCH3, canal de cloruro activado por glutamato,
canal de cloruro activado por histamina 1, cloruro activado por histamina canal 2, receptor hormonal en 39-like,
subunidad alfa1 del receptor nicotínico de acetilcolina, subunidad alfa2 del receptor nicotínico de acetilcolina, canal de
cloruro sensible al pH y proteínas putativas del receptor de octopamina/tiramina deT. castaneum posteriormente
fueron optimizadas y minimizadas utilizando cargas parciales atómicas con el método de Kollman utilizando el
paquete SYBYL 8.1.1 (Tripos, San Luis, MO, EE. UU.). Se utilizó el software MGLTools 1.5.0 (Molecular Graphics
Laboratory, La Jolla, CA, EE. UU.) para convertir estructuras de formato PDB a PDBQT, agregando hidrógenos polares y
asignando cargas parciales de Kollman. La estructura 3D del linalool y el β-pineno se obtuvieron de Pubchem [55] y
optimizado utilizando Gaussian 03 mediante cálculos químicos cuánticos basados en la teoría funcional de la
densidad (DFT) en el nivel 6-311G [56]. Los estudios de acoplamiento se llevaron a cabo utilizando AutoDock Vina [57].
El acoplamiento se realizó estableciendo un cubo de tamaño suficiente para cubrir la proteína completa con un
espaciado de punto de rejilla de 1 Å. La afinidad de unión promedio para las mejores poses se aceptó como el valor de
afinidad de unión para un complejo particular [56]. Las interacciones ligando-residuo existentes en la proteína se
evaluaron con LigandScout 3.0 (Inte:Ligand, Maria Enzersdorf, Austria, Europa) [58]. La validación del proceso de
acoplamiento se realizó acoplando los receptores GABA, octopamina/tiramina y nicotínico, y sus inhibidores se
reportan en la literatura (Tabla2) [9,10].

4.7. Análisis estadístico

el emparejadotSe utilizó una prueba para comparar el número medio de insectos en las áreas tratadas y no
tratadas del papel de filtro. Se estableció repelencia o atracción si ocurrían diferencias significativas para porcentaje
positivo o negativo de repelencia, respectivamente. Se empleó el análisis probit para calcular RC50. La distribución
normal y la igualdad entre varianzas se verificaron mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Bartlett,
respectivamente. Se utilizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba posterior de Bonferroni para
comparar todos los grupos (tratados y de control) en diferentes intervalos de tiempo. Los datos se presentan como
medios±SE y las diferencias entre medias se consideran significativas alpag≤0.05. Se utilizó GraphPad InStat 3.05
(GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) para el análisis de datos. Los parámetros evaluados en el análisis estadístico
se encuentran en las Tablas S1 y S2.

5. Conclusiones

En resumen, los monoterpenos linalol y β-pineno mostraron actividad repelente contraT. castaneum, que afecta
la expresión de genes relacionados con la neurotransmisión, como la acetilcolinesterasa, el canal iónico activado por
GABA y el canal 2 de cloruro activado por histamina. Sin embargo, cada compuesto químico indujo un perfil de
expresión génica diferente. Estos productos químicos tenían poca capacidad para acoplarse a las proteínas asociadas
con el proceso de neurotransmisión en el escarabajo rojo de la harina.

Materiales complementarios:Los materiales complementarios están disponibles en línea.

Expresiones de gratitud:Los autores agradecen al Programa de Apoyo a Grupos de Investigación (2012-2014), y la

Beca 02295/2013, auspiciada por la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Cartagena, así como la Beca
RC-0572-2012 (Patrimonio Autonomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la TecnologiAy la Innovacion,
Francisco Josémide Caldas), y el Programa Nacional de Formación Doctoral (Colciencias, 567-2012).

Contribuciones de autor:Nerlis Pajaro-Castro, Karina Caballero-Gallardo y Jesús Olivero-Verbel concibieron y diseñaron los
experimentos, realizaron los experimentos, analizaron los datos, contribuyeron con reactivos/materiales/herramientas de análisis y
escribieron el artículo.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Disponibilidad de muestras:Las muestras de los compuestos linalool y β-pineno están disponibles de los autores.

© 2017 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de
acceso abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons
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