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mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200 DOI 10.1002/mnfr.200600177 1191

La intervención con jugos de frutas ricos en polifenoles

resulta en una elevación del glutatiónS-Expresión de la
proteína transferasa P1 (hGSTP1) en leucocitos humanos de
voluntarios sanos

Tomas Hofmann1, Ute Liegibel1, Peter Winterhalter2, Achim Bub3,

Gerhard Rechkemmer4y Beatrice Louise Pool-Zobel1

1 Departamento de Toxicología Nutricional, Instituto de Nutrición, Universidad Friedrich Schiller de Jena, Jena,
Alemania
2 Instituto de Química Alimentaria, Universidad Técnica de Braunschweig, Braunschweig, Alemania
3 Instituto de Fisiología Nutricional, Centro Federal de Investigación de Nutrición y Alimentos, Karlsruhe, Alemania
4Cátedra de Biofuncionalidad de los Alimentos, Departamento de Alimentación y Nutrición, Life and Food Science Center
Weihenstephan, Universidad Técnica de Munich, Freising-Weihenstephan, Alemania

Los polifenoles son probablemente antigenotóxicos debido a sus actividades antioxidantes y podrían alterar las enzimas
de fase I y II de una manera que resulte en quimioprotección. Investigamos la hipótesis de que los polifenoles mejoran la
expresión de glutatión.S-transferasas (GST), que aumenta la desintoxicación de carcinógenos y, por lo tanto, brinda
protección contra el estrés oxidativo. La expresión de la proteína HGSTP1 y los polimorfismos de GST se determinaron en
leucocitos obtenidos durante un estudio de intervención con sujetos sanos que consumieron dos jugos de frutas en un
ensayo de 8 semanas (fase de ejecución libre de polifenoles, fase de intervención del jugo, fase de lavado, segunda fase
de intervención del jugo, cada régimen de tratamiento duró 2 semanas). El estudio había demostrado originalmente que
la intervención del jugo redujo significativamente el daño oxidativo del ADN en los leucocitos en la semana 8 (Bub, A.,
Watzl, B., Blockhaus, M., Briviba, K.y col., J. Nutr. Bioquímica2003,14,90 – 98). Volvimos a analizar los niveles de daño en el
ADN en función de los genotipos de GST. También tratamos leucocitosin vitrocon mezclas de polifenoles y se determinó la
citotoxicidad y expresión de 96 genes relacionados con el metabolismo de fármacos. Los resultados clave con los
leucocitos del estudio de intervención fueron que el contenido inicial de la proteína hGSTP1 se suprimió por primera vez
en las semanas 4 y 6. Sin embargo, en la semana 8, la expresión de la proteína hGSTP1 aumentó significativamente. Los
niveles de proteína HGSTP1 y el daño en el ADN se correlacionaron inversamente (p =0.005), pero no hubo diferencia para
las células obtenidas de sujetos conhGSTM1*1yhGSTM1*0genotipos, ni hubo ninguna diferencia entre las células de los
sujetos que consumieron los dos jugos diferentes. El tratamiento de leucocitos con mezclas de polifenoles.in vitrono
resultó en la expresión del gen GST modulado o la actividad total de GST, sino en una regulación positiva de otras
enzimas de biotransformación.p.ej,miembros del citocromo P450 y la familia de las sulfotransferasas). En conclusión,in
vitroel tratamiento de leucocitos condujo a una expresión modulada de ARNm de genes seleccionados, no directamente
relacionados con los sistemas de defensa oxidativos.En vivo,sin embargo, observamos un aumento tardío de hGSTP1, que
podría estar asociado con una represión inicial del daño oxidativo del ADN en leucocitos de sujetos humanos que
consumían jugos con altos niveles de polifenoles.

Palabras clave:Biomarcador / Desintoxicación / Flavonoides / Enzimas Fase II / Polifenoles/ Recibido: 3 de

abril de 2006; revisado: 14 de septiembre de 2006; aceptado: 17 de septiembre de 2006

1. Introducción propiedades [2]. Una variedad de estudios ha demostrado que los

polifenoles, como los flavonoides, tienen actividades antioxidantesin vitro [
Los polifenoles son los principales fitoquímicos en frutas y 3, 4]. En los sistemas celulares, se ha informado que tienen abundantes
verduras [1] y pueden ejercer sus efectosa través deantioxidante actividades biológicas relacionadas con la quimioprotección.

Correspondencia:Profesor Dr. Beatrice L. Pool-Zobel, Director del Instituto Abreviaturas: Cy-3-O-gramo,cianidina-3-O-glucósido;EGCG, ( – )-

de Nutrición, Departamento de Toxicología Nutricional, Universidad galato de epigalocatequina;GST,glutatiónS-transferasa;UGT,UDP-
Friedrich Schiller de Jena, 07743 Jena, Alemania glucuronosiltransferasa
Correo electrónico:b8pobe@uni-
jena.de Fax: +49-3641-949672

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1192 T Hofmannet al.
potenciales tivos. En particular, los estudios basados en células han
demostrado que los compuestos polifenólicos seleccionados afectan las
vías de transducción de señales, lo que conduce a la inhibición del
crecimiento y la transformación celular, mejora la apoptosis, reduce el
comportamiento invasivo y ralentiza la angiogénesis. Se especula que
mecanismos de este tipo pueden ser responsables de las actividades
anticancerígenas que, por ejemplo, se han demostrado para polifenoles
como la curcumina, la genisteína y la quercetina, según lo revisado por
Lambert.et al. [5]. Mientras que estos efectos celulares antes mencionados
probablemente contribuyan a la prevención secundaria del cáncer al
retrasar la progresión de la tumorigénesis, los mecanismos adicionales
son importantes para la prevención primaria del cáncer [6]. Estos incluyen
actividades de bloqueo que evitan directa o indirectamente que los
carcinógenos químicos induzcan mutaciones y, por lo tanto, el inicio o la
progresión del cáncer [7]. También se ha demostrado que los polifenoles,
como la quercetina y la miricetina, son activos en este contexto, lo que
produce efectos antigenotóxicos en los sistemas celulares [8, 9]. Desde
entonces, se han detectado efectos similares en humanos.en vivodespués
de una intervención dietética con jugos de frutas ricos en polifenoles [10].
Una explicación sencilla de las propiedades antigenotóxicas
observadas podría ser que los polifenoles eliminan las especies
reactivas de oxígeno que causan daño en el ADN y se cree que
tienen un papel fundamental en la causa del cáncer [11]. Sin
embargo, los polifenoles también podrían prevenir
indirectamente el daño del ADN al alterar las enzimas de fase I y
II de una manera que resulte en quimioprevención [12]. Por
ejemplo, varios polifenoles, conocidos por tener actividades
anticancerígenas en sistemas experimentales, pudieron modular
la actividad de las enzimas gastrointestinales UDP-
glucuronosiltransferasa (UGT, EC 2.4.1.17). Los autores
concluyeron que una inducción de la actividad de la UGTenzima
gastrointestinal puede contribuir a una mejor desintoxicación de
compuestos potencialmente cancerígenos y, posteriormente, a
la prevención del cáncer gastrointestinal [13].
Junto a las UGT también el glutatiónS-Las transferasas (GST,
EC 2.5.1.18) son importantes enzimas de fase II con
potencial desintoxicante [14]. En ratas, se ha demostrado
que los polifenoles de la dieta (ácido elágico, flavona,
cumarina y alfa-angelicalactona) mejoran selectivamente los
miembros del sistema de desintoxicación de GST en el
esófago, el estómago y el páncreas [15]. En humanos, las
isoformas de GST también se localizan en diferentes tejidos
con patrones de expresión específicos de órganos [16].
Constituyen una familia de supergenes compleja que
metaboliza colectivamente fármacos quimioterapéuticos,
carcinógenos y contaminantes ambientales, y desempeñan
un papel protector fundamental contra los xenobióticos,
como se ha revisado en el pasado [17, 18]. Sus niveles de
expresión pueden tener efectos profundos en la
susceptibilidad a las agresiones químicas; la sobreexpresión
genera resistencia y la infraexpresión aumenta la
susceptibilidad [19, 20].
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que son proteínas asociadas a la membrana en el metabolismo del
glutatión de eicosanoides (MAPEG) [17, 21]. Los genotipos nulos para
hGSTM1 y hGSTT1 ocurren en frecuencias de aproximadamente 50 y
20–50 % de la población, respectivamente. Son genotipos
importantes con potencial alto impacto en la capacidad metabólica
de los respectivos sujetos, ya que resultan en ausencia de las
respectivas enzimas. La hipótesis principal ha sido que las personas
con genotipos GST nulos tienen un mayor riesgo de cáncer debido a
una capacidad reducida para eliminar los carcinógenos activados [22,
23]. Dos polimorfismos ligados fueron descritos en el hGSTP1gen,
uno en el codón 105 y otro en el codón 114, de los cuales la variante
polimorfa del codón 105 modifica la actividad específica de la enzima
[24]. HGSTP1 es también una de las principales GST extrahepáticas y
se expresa notablemente en leucocitos periféricos, donde puede
servir como biomarcador para la inducción de enzimas de fase II
mediante intervención dietética [25].
En el siguiente estudio, nos interesaba comprender si los polifenoles actúan mediante los
mecanismos de alteración del metabolismo de fase II y si esta podría ser una razón por la cual
los polifenoles reducen el daño del ADN en los leucocitos humanos, como se observó
anteriormente [10]. El estudio de intervención se había realizado en sujetos masculinos sanos
que consumían dos jugos de frutas, uno rico en antocianidinas y el otro en catequinas de té
verde. El estudio nos mostró que la intervención del jugo no tuvo efecto en las roturas de una
sola cadena de ADN, pero redujo significativamente el daño oxidativo del ADN en los leucocitos.
Esto se asoció con un estado antioxidante mejorado y funciones de células inmunitarias
estimuladas, aunque la intervención durante 2 semanas no resultó en polifenoles plasmáticos
elevados en sujetos después del ayuno nocturno. Utilizando las muestras biológicas restantes
(leucocitos periféricos criopreservados) de este estudio anterior, el presente estudio determinó la
expresión de hGSTP1 y el polimorfismo de GST para evaluar los efectos de estos parámetros
sobre el daño oxidativo. También pretendíamos investigar más de cerca la expresión de genes
relacionados con la biotransformación en leucocitos periféricos tratados con los polifenoles de
los jugos de frutas. Se prepararon e investigaron dos mezclas individuales de los componentes
compuestos de acuerdo con los dos jugos originales [10] para diferentes actividades biológicas
en los leucocitos. También pretendíamos investigar más de cerca la expresión de genes
relacionados con la biotransformación en leucocitos periféricos tratados con los polifenoles de
los jugos de frutas. Se prepararon e investigaron dos mezclas individuales de los componentes
compuestos de acuerdo con los dos jugos originales [10] para diferentes actividades biológicas
en los leucocitos. También pretendíamos investigar más de cerca la expresión de genes
relacionados con la biotransformación en leucocitos periféricos tratados con los polifenoles de
los jugos de frutas. Se prepararon e investigaron dos mezclas individuales de los componentes
compuestos de acuerdo con los dos jugos originales [10] para diferentes actividades biológicas
en los leucocitos.in vitro.En particular, evaluamos los efectos de las mezclas de polifenoles en la
expresión de genes relacionados con el metabolismo de fármacos.in vitro.
2. Materiales y métodos
2.1Ex-vivodeterminaciones
2.1.1 Diseño del estudio y dieta
El estudio cruzado aleatorizado se ha descrito en detalle antes
[10]. Se dividió en cinco períodos, cada uno con una duración de
2 semanas: semanas 1 y 2, período inicial, semanas 3 y 4,
consumo de jugo A o B (330 ml/día), semanas 5 y 6 de lavado por
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yodo, semanas 7-8 consumo de jugo B o A (330 ml/día) y
semanas 9-10 período de lavado. Los jugos contenían una
mezcla de jugo de manzana, mango y naranja. Además, el jugo A
(76 % p/p de agua) era rico en aronia, arándanos y moras,
mientras que el jugo B (78 % p/p de agua) contenía té verde rico
en flavonoides, albaricoque y lima. Durante el período de
estudio de 10 semanas, se instruyó a los sujetos para que
excluyeran de su dieta los alimentos ricos en polifenoles. Cada
sujeto era su propio control, ya que los jugos de frutas placebo
bien diseñados (que no contenían polifenoles [26]) no estaban
disponibles en el momento en que se realizó el estudio. El
estudio inscribió a un total de 27 hombres no fumadores (edad
media 35 años) con peso corporal normal (IMC medio 24 kg/m2).
Fue aprobado por el Comité de Ética Médica de Landes-
rztekammer Baden-W-rttemberg. Todos los participantes dieron
su consentimiento por escrito.
2.1.2 Aislamiento de leucocitos de sangre periférica Las
muestras utilizadas para las determinaciones descritas en este
trabajo se obtuvieron de los sujetos inmediatamente después de
la primera fase de ejecución (semana 2), después de la primera
fase de intervención (semana 4), después de la primera fase de
lavado (semana 6) y después de la segunda intervención. fase
(semana 8). Los puntos de tiempo indicados fueron
seleccionados para cubrir todo el rango del estudio de
intervención. Las determinaciones de proteína HGSTP1 no se
pudieron realizar para otros puntos de tiempo, debido a las
cantidades limitantes del material biológico. Los leucocitos se
aislaron y congelaron como se describe anteriormente [27]. Solo
24 de los 27 sujetos entregaron cantidades suficientes de
leucocitos para realizar las determinaciones aquí descritas. El
daño del ADN se determinó en leucocitos frescos
inmediatamente después de que estuvieran disponibles. Las
proteínas HGSTP1 se determinaron en lotes,
2.1.3 Genotipado de GST
Leucocitos criopreservados (66106células) se utilizaron para
aislar el ADN con el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Hilden,
Alemania) como se describe en el manual del fabricante. Se
utilizó un método de PCR multiplex para detectar la presencia o
ausencia de lahGSTM1yhGSTT1genes [22, 28] utilizando
cebadores de MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania) con las
secuencias y procedimientos descritos en detalle anteriormente
[25]. Un fragmento de lab-El gen de la globina se coamplificó
como control positivo interno en la reacción de PCR.
2.1.4 Daño en el ADN
El daño del ADN (roturas de una sola hebra y bases de ADN
oxidadas) se determinó en leucocitos frescos inmediatamente
después del aislamiento y se siguió el procedimiento descrito en
el estudio original [10, 29].
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Modulación de enzimas humanas de fase II por polifenoles 1193
2.1.5 GlutatiónS-proteína transferasa P1
(hGSTP1) y proteína total
Se utilizó un kit ELISA para determinar hGSTP1 en placas de
microtitulación (HEPKIT-Pi, Biotrin, Sinsheim-Reihen, Alemania),
utilizando una dilución 1:4 del citosol (correspondiente a 2-36105
células). El procedimiento de prueba se basa en la adición
secuencial de muestra, conjugado de anticuerpo-enzima y
sustrato a pocillos de microensayo recubiertos con IgG anti-
hGSTP1. La intensidad del color resultante es proporcional a la
cantidad de hGSTP1. El rango de ensayo es 3.12–100yog/L. La
detección fotométrica del producto coloreado se realizó a 450
nm utilizando como referencia 630 nm (Microplate Reader Tmax,
MWG-Biotech; Software: Softmax Version 2.34). El contenido de
proteína total se midió utilizando el método de Bradford con BSA
como proteína estándar [30].
2.2in vitrodeterminaciones
2.2.1 Sustancias problema
(+)-catequina, (-)-epicatequina, (-)-epigalocatequina, (-)-galato
de epigalocatequina (EGCG), quercetina, rutina, quercitrina,
miricetrina, kampferol, hesperidina, naringenina, ácido
gálico, ácido protocatequínico, ácido gentísico , el ácido
clorogénico, el ácido cafeico y la floridzina fueron purificados
por HPLC (~90–99 %) por el proveedor y todos se obtuvieron
de Sigma-Aldrich Chemie (Munich, Alemania). La
isoquercitrina era de Fluka (Taufkirchen, Alemania), el
eriodictiol era de Roth (Karlsruhe, Alemania) y el ácido
ferúlico era de ICN (Eschwege, Alemania).
Cianidina-3-O-glucósido (Cy-3-O-g) se aisló del pálido de las
grosellas negras. En un primer paso, los antocianos se
extrajeron con metanol/ácido acético (19:1) y se
concentraron con una columna Amberlite XAD-7. Luego
Cy-3- O-g fue aislado del extracto con cromatografía en
contracorriente de alta velocidad (HSCCC) [31]. La mezcla de
procianidina constaba de 69,1 % de procianidina B2, 20,0 %
de procianidina B3 y 10,9 % de procianidinas oligoméricas) y
se aisló mediante la técnica de separación suave de
cromatografía en contracorriente (CCC).
2.2.2 Preparación de mezclas de polifenoles que
simulan los jugos de frutas
Las mezclas de polifenoles se prepararon utilizando concentraciones que
simulaban los contenidos de los jugos de frutas complejos de laen vivo
estudio de intervención (Tabla 1) [10]. Para ello, los 22 ingredientes (polvo
sólido) se mezclaron en la proporción predeterminada y se almacenaron a
-208C. Las mezclas secas se disolvieron en soluciones madre de DMSO (40
mM en DMSO), que contenían las concentraciones molares de los
principales polifenoles identificados como se identificó previamente en los
jugos de frutas naturales [10]. Para evaluar las actividades biológicas en
los leucocitos, las soluciones madre se diluyeron apropiadamente y se
agregaron al medio de cultivo celular para obtener concentraciones
basadas en la
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1194 T Hofmannet al. mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200

Tabla 1.Composición química de las mezclas de polifenoles (enyoM) imitando jugos de frutas (en mg/L) de laen vivoestudio de intervención [10]

Químico Concentración de la mezcla A Concentración de la mezcla B

Jugo A yoMETRO yom a los 40yoMETRO Jugo B yoMETRO yom a los 40yoMETRO

miligramos por litro Cy-3-O-gramo miligramos por litro EGCG

(+)-catequina 10 34.5 3.2 15 51.7 6.1

( – )-Epicatequina 22 75.8 7 33 113.7 13.4
( – )-Epigalo-catequina 0 0 0 5 16.3 1.9
EGCG 0 0 0 155 338.2 40
procianidinas 35 60.5 5.6 27 46.7 5.5
Cy-3-O-gramo 210 433.2 40 0 0 0
quercetina 5 16.5 1.5 1 3.3 0.4
Rutina 9 14.7 1.4 4 6.6 0.8
isoquercitrina 37 79.7 7.4 0 0 0
quercitrina 15 33.5 3.1 3 6.7 0.8
miricetrina 7 22 2 0 0 0
Kampferol 4 14 1.3 0 0 0
hesperidina 13 21.3 2 47 77 9.1
eriodictiol 28 97.1 9 40 138.8 16.4
Naringenina 26 95.5 8.8 dieciséis 58.8 7
ácido gálico 14 82.3 7.6 10 58.8 7
ácido protocatequiico 44 285.5 26.4 0 0 0
ácido gentísico 41 266 24.6 270 1751.8 207.2
Ácido clorogénico 157 443.1 40,9 30 84.7 10
ácido cafeico 23 127.7 11.8 6 44.3 5.2
Ácido ferúlico 10 51.5 4.8 1 5.2 0.6
floridzina 4 9.2 0.8 2 4.6 0.5
Importes totales 714 2263.6 209 665 2807.2 332

La mezcla A se preparó de acuerdo con un jugo rico en antocianidinas, la mezcla B contenía ingredientes que simulaban un jugo rico en té verde/
isoflavonoides.

concentración molar de Cy-3-O-g (mezcla A) y EGCG (mezcla 2.3 Parámetros de toxicidad

B). La concentración más alta de DMSO en los cultivos
celulares fueF0,1%.
2.2.3in vitrocultivo de leucocitos de sangre
periferica
Los leucocitos de sangre periférica se aislaron de una preparación de
células enriquecidas (capas leucocitarias obtenidas de sangre entera
de un donante de sangre), se criopreservaron y se genotiparon para
hGSTT1yhGSTM1polimorfismos como se ha descrito anteriormente.
Para realizar lain vitroexperimentos, las células se descongelaron
rápidamente para evitar los impactos tóxicos del medio de
congelación y se lavaron una vez con PBS antes de usarlas en cultivo
celular. Usamos y refinamos nuestros métodos descritos
anteriormente para el largo plazoin vitrocultivo de leucocitos
humanos periféricos [27]. losin vitroSe realizaron investigaciones
para evaluar los mecanismos putativos, utilizando establecidos y
caracterizadosin vitrotécnicas de cultivo celular. Dado que la duración
máxima de exposición es evidentemente más corta queen vivo
incluimos concentraciones más altas para tener dosis comparables
(que son una función tanto de los tiempos de exposición como de las
concentraciones). También incluimos concentraciones como las
encontradas en el plasma de sujetos que consumían polifenoles.
La integridad celular de los leucocitos tratados se evaluó con
CellTiter-BlueTMensayo (Promega, Mannheim, Alemania), un método
que se puede utilizar para suspensiones de células no adherentes,
tales como leucocitos, para estimar el número de células viables. El
CellTiter-AzulTMensayo se utilizó para estudiar los efectos de las
mezclas de polifenoles en la viabilidad celular. Este ensayo utiliza el
colorante resazurina que solo las células viables reducen a la
resorufina altamente fluorescente. El ensayo se llevó a cabo en
placas de microtitulación de 96 pocillos con mediciones de
fluorescencia (Tecan, Spectra Fluor Plus, Austria, Em/Ex 520/ 595 nm)
en diferentes momentos, es decir, después de 0–72 h.
Se investigaron otros tipos de efectos citotóxicos de las mezclas de
polifenoles mediante el ensayo de exclusión con azul de tripano, que
mide los efectos sobre la integridad de la membrana. Para el in vitro
análisis, los leucocitos se incubaron en placas de 96 pocillos con las
dos mezclas de polifenoles durante 0-72 h. Las células se tiñeron con
azul de tripano, se contaron y comprobaron la tinción con azul de
tripano (células muertas) o exclusión (células viables) en un
hemocitómetro.
,
Se realizó el Ensayo Cometa, que revela daños en el ADN a nivel de
una sola célula, de acuerdo con nuestro procedimiento descrito.

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mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200
dura [27]. Leucocitos (concentración final 26106células/mL)
se incubaron con diferentes concentraciones de polifenoles.
Un grupo de células fue tratado con H2O2(75yoM, 5 min),
como control positivo.
2.3.1 Expresión génica con matriz c-DNA Los leucocitos se
precultivaron en matraces de cultivo de células T25 durante 24 h
antes del tratamiento. Las células se recogieron, se centrifugaron y
se añadió medio fresco con las mezclas de polifenoles a las células (2
6106células/mL). Después de 24 h, las células se recolectaron
nuevamente, se centrifugaron y los sedimentos celulares resultantes
se lavaron dos veces con volúmenes iguales de PBS. El ARN celular
total se aisló utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen). Antes dein vitro
Pasos de transcripción inversa La integridad del ARN total aislado se
comprobó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de
formaldehído de agarosa. Se usaron dos matrices cada una para ARN
aislado de leucocitos de dos experimentos reproducidos de forma
independiente, cada uno de los cuales constaba de un control medio,
un control DMSO y cuatro grupos de tratamiento. La hibridación se
realizó en 112 sitios (3 espacios en blanco, 3 puntos de referencia
negativos, 10 genes domésticos y 96 genes humanos relacionados
con el metabolismo de fármacos) en macromatrices de genes de
ADNc (GEArray Q Series Human Drug Metabolism Gene Array HS11,
SuperArraymetroBioscience Corporation, Frederick, MD, EE. UU.),
como hemos descrito antes [32] según el protocolo del fabricante.
Una lista detallada de genes está disponible en el sitio web de la
compañía (http://www.superarray.com/). Los datos sin procesar se
normalizaron entre 0 y 100 % de expresión, donde las señales de las
medias de los controles negativos (áreas sin secuencias de genes
manchadas o con genes no expresados en células humanas)
igualaron el 0 % y las medias de las señales de todos los genes
domésticos manchados se fijaron en 100%.
2.3.2 Mediciones de actividad total de GST
Las células se trataron con las mezclas de polifenoles en diferentes
concentraciones durante 6 y 24 hy se obtuvo el citosol como se
describió anteriormente [19]. La actividad de GST total en el citosol se
determinó espectrofotométricamente a 340 nm usando 1-cloro-2,4-
dinitrobenceno 1 mM y glutatión 1 mM como sustratos a una
temperatura de 30ºC.8C [33].
2.3.3 Análisis estadístico
La evaluación de todos los datos se basó en valores individuales o
medios con células de 24 individuos humanos o para elin vitro
experimentos de al menos tres experimentos reproducidos de forma
independiente (una excepción fueron las matrices de c-DNA connorte
=2). Se utilizó el software Prism versión 4.01 (Graph Pad, San Diego,
EE. UU.) para establecer niveles de significancia de dos colas usando
pares o no pares.t-pruebas, con y sin correcciones de Welch para
varianzas desiguales e iguales, respectivamente. Se utilizaron ANOVA
bidireccional y unidireccional con postest de Bonferroni, según
correspondiera, y como se indica en las secciones de resultados. Los
efectos relacionados con el tratamiento se consideraron
estadísticamente significativos enpag <0.05.
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Modulación de enzimas humanas de fase II por polifenoles 1195
3 resultados
3.1Ex-vivodeterminaciones
Los leucocitos estaban disponibles de 24 del total de 27 sujetos
que habían participado originalmente en el estudio de
intervención [10]. De estos, 12 consumieron jugo A y 12
consumieron jugo B en la primera fase de intervención y luego
cambiaron a jugo B/A en la segunda fase de intervención. Había
17 sujetos conhGSTM1*1,7 sujetos conhGSTM1*0genotipos y el
17% eranhGSTT1*0portadores En total, el número de sujetos en
estos subgrupos de polimorfismos fue demasiado pequeño para
evaluar posibles diferencias en la susceptibilidad. Es por eso que
solo buscamos discriminar algunos efectos biológicos
seleccionados en bebedores de jugos A y B, o de subconjuntos
con lahGSTM1*1yhGSTM1*0 genotipos.
La Tabla 2 muestra los grados de daño en el ADN y los niveles de
expresión de la proteína hGSTP1 en los 24 sujetos o en los
subgrupos, muestra estas dos respuestas dependiendo del tipo
de jugo de fruta consumido o del genotipo. Dado que los
polifenoles pueden inducir proteínas adicionales además de
hGSTP1, optamos por presentar los datos comoyog proteína
,
hGSTP1por 106células 'ya que previamente hemos encontrado
,
que esto es una demostración más válida de inducibilidad queyo
g hGSTP1por proteína total' [34]. Era evidente que hay una
reducción significativa del daño del ADN en los leucocitos de los
24 donantes después de la segunda fase de intervención con el
jugo de frutas, como también se informó anteriormente [10]. No
hubo diferencias entre los sujetos que solo consumían jugo A o
B. Tampoco hubo diferencias entre los sujetos con hGSTM1*1y
hGSTM1*0genotipos. La única razón de la falta de significación
de los resultados en la semana 8 en el hGSTM1*0genotipos
(después de la segunda fase de la intervención con jugo de
frutas) fue probablemente el número limitado de sujetos en este
grupo (hGSTM1*0, n =7;hGSTM1*1, n =17).
La expresión de la proteína HGSTP1 fue relativamente mayor antes
de la intervención con jugo de frutas que después de las primeras 2
semanas de tratamiento y después del período de lavado de 2
semanas (Tabla 2). Parecía como si ambas intervenciones dieran
como resultado una inhibición de hGSTP1 en los leucocitos de sangre
periférica para todos los sujetos tomados en conjunto. No hubo
diferencias de respuesta entre las dos intervenciones de jugo.
Tampoco hubo diferencias aparentes al comparar los subgrupos con
los diferentes genotipos, pero nuevamente el número limitado de
muestras de sujetos conhGSTM1*0El genotipo puede ser el motivo
de la falta de importancia del aumento de hGSTP1 en la semana 8. En
conjunto, los resultados apuntan a una inducción de hGSTP1 en los
leucocitos periféricos de los sujetos tratados con los dos zumos de
frutas. Esta inducción pareció reflejar una recuperación mejorada de
la proteína hGSTP1 posterior a su inhibición inicial después de la
semana 4 (después de las primeras 2 semanas de intervención con
jugo de frutas) y la semana 6 (después del primer período de lavado).
Para ver si existe alguna conexión entre el daño del ADN y la proteína
hGSTP1, correlacionamos hGSTP1
www.mnf-journal.com
1196 T Hofmannet al. mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200

,
Tabla 2.Daño en el ADN, expresado como % de fluorescencia en la cola'

Tiempo Paraca- Jugo A Jugo B Todos hGSTM1*1 hGSTM1*0

punto metro
(semana) Significar SEM Significar SEM Significar SEM Significar SEM Significar SEM

2 ADN 48 6 43 7.3 45 4.7 48 5.7 39 7.9

4 daño 41 6.7 ns 32 3.4 ns 37 3.8 ns 38 5.1 ns 32 4,6 ns
6 36 3.8 ns 34 4.4 ns 35 2.8 ns 35 3.8 ns 35 3,4 ns
8 26 2.8 p =0.0039 27 3.4 p =0.0074 27 2.1 p =0.0011 26 2.7 p =0.0025 29 3,4 ns

2 hGSTP1 23 2.5 24 2.1 23 1.6 21 1.6 28 3.3

4 ng/106celdas 14 2 p =0.0110 15 1.5 p =0.0002 15 1.2 pag <0.0001 15 1.5 p =0.0063 13 2.2 p =0.0030
6 14 2.2 p =0.0105 15 2.1 p =0.0006 15 1.5 p =0.0002 12 1.4 p =0.0002 19 3,5 ns
8 34 2.9 p =0.0106 34 3.9 p =0.0341 34 2.4 p =0.0009 35 2.5 pag <0.0001 30 5,6 ns
pag <0.0001 p =0.0004 pag <0.0001 pag <0.0001 ns

Se muestran los valores medios de los sitios sensibles a la endonucleasa (que consisten en roturas de cadenas de ADN, pirimidinas oxidadas y otras lesiones)
determinados mediante el ensayo Comet con endonucleasa III [54]). Los niveles de proteína total fueron 8 € 1,2 y 7 € 0,8yog/106células para los voluntarios
que consumen los jugos A y B, respectivamente. Hubo un aumento significativo de la proteína total (10 € 1,2) en las células dehGSTM1*1genotipos, que no se
consideró de importancia biológica. Las diferencias significativas se evaluaron con pruebas no apareadast-prueba con la corrección de Welch para varianzas
desiguales. El número de voluntarios fuenorte =12 para los jugos A y B,norte =17 parahGSTM1*1ynorte =7 parahGSTM1*0.

cias entre los subgrupos para elin vitro

determinaciones.

La integridad celular de los leucocitos, tratados con diferentes

Figura 1.Roturas de hebras individuales y bases de pirimidina oxidadas
versushGSTP1 para todos los sujetos (norte =24) y puntos de tiempo, que
son significativamente diferentes de la semana 2, a saber, las semanas 4, 6
y 8 (norte =72). La correlación (Spearman) es significativa con p =0.005.
niveles contra el daño del ADN utilizando datos de todos los puntos de tiempo
que fueron significativamente diferentes de la semana 2, a saber, las semanas 4,
6 y 8 (norte =72). La Figura 1 muestra que los niveles de hGSTP1 y el daño en el
ADN se correlacionaron inversamente con unapags-valor de 0.005.
3.2in vitrodeterminaciones
in vitroSe llevaron a cabo determinaciones con leucocitos aislados de
sangre periférica humana y con mezclas de polifenoles, imitando la
composición de los jugos de frutas, para mejorar nuestra
comprensión de los efectos de los polifenoles en este tipo de células
diana. Para esto, sin embargo, primero necesitábamos determinar
los rangos de concentración no citotóxicos. Para todas las
investigaciones elhGSTT1yhGSTM1se determinaron polimorfismos
(13%hGSTT1*0y 61%hGSTM1*0), pero debido al pequeño tamaño de
la muestra no pudimos ver ninguna diferencia.
concentraciones de polifenoles, se evaluó con el CellTiter-BlueTM
ensayo. Las soluciones se prepararon y agregaron en cantidades que
entregaron concentraciones de 0.1 a 40yoM Cy-3-O-go 0.1–40yoM
,
EGCG a la solución final (Cy-3-O-g equivalentes' o, EGCG
equivalentes'), respectivamente, para las mezclas A y B. La
concentración total de polifenoles disponible en,p.ej,40yoM
,
equivalentes' se muestra en la Tabla 1. La Tabla 3 muestra que las
viabilidades celulares disminuyeron significativamente en la
concentración más alta empleada de la mezcla de polifenoles B (40yo
M EGCG-equivalentes) y después de los períodos de incubación más
largos (48 y 72 h). En comparación con la mezcla B, la mezcla A tuvo
un menor impacto sobre la viabilidad celular.
Los efectos citotóxicos de las mezclas de polifenoles también se
investigaron directamente mediante el ensayo de exclusión con azul
de tripano, que mide los efectos sobre la integridad de la membrana.
Para elin vitroanálisis, los leucocitos se incubaron con las dos mezclas
de polifenoles y se midió la viabilidad celular como se describe en la
Sección 2. Después de 2 h de incubación, las células del control
medio tenían una viabilidad de 95 € 2% y las células del control
DMSO tenían una viabilidad de 92 € 3%. Estos valores se mantuvieron
hasta por 72 h devitroincubación, después de lo cual se obtuvo una
viabilidad de 92 € 3% en el control medio y 89 € 3% en el control
DMSO. Ninguno de los polifenoles tuvo efecto sobre la viabilidad, ya
que incluso en las concentraciones más altas (40yoM equivalentes) y
duraciones más largas de tratamiento (72 h) con las mezclas A y B,
las células seguían siendo viables a 91 € 4 y 87 € 2%,
respectivamente.
El daño del ADN se determinó como un marcador sensible de los
efectos tóxicos que refleja la pérdida de la integridad del ADN.
Los leucocitos se incubaron durante 1 o 24 ha 378C con
diferente concentración de polifenoles, produciendo 0.1–40yoM
equivalentes de Cy-3-O-g (mezcla A) y EGCG (mezcla B). Había

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mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200 Modulación de enzimas humanas de fase II por polifenoles 1197

Tabla 3.Integridad celular, medida con CellTiter-BlueTMensayo, de leucocitos humanos después de la incubación con dos mezclas de polifenoles (n
=3)

yoMETRO Duración dein vitrotratamiento

equivalentes 1 hora 2 horas 12 horas 24 horas 48 horas 72 horas

de referencia Significar Dakota del Sur Significar Dakota del Sur SD media Significar Dakota del Sur Significar Dakota del Sur Significar Dakota del Sur

compuesto % del control medio

Medio 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0

DMSO 121 25 98 4 102 11 107 7 112 22 97 0
Mezcla Aa) 0.1 110 12 100 5 102 8 112 17 112 13 99 9
1 103 8 100 6 104 9 113 6 106 4 109 6
5 103 7 102 3 101 3 110 9 102 4 103 3
10 108 12 107 13 101 10 110 11 101 1 105 3
20 106 8 94 5 102 13 103 8 102 3 102 7
40 104 12 98 3 98 8 97 5 90 4 79 25
Mezcla Bb) 0.1 85 5 97 6 101 5 106 8 98 2 99 2
1 96 8 102 5 102 8 109 9 98 2 98 2
5 108 10 105 dieciséis 101 13 106 10 100 3 99 3
10 102 6 103 4 97 7 104 7 94 8 92 7
20 106 6 102 7 103 7 100 12 81 14 80 29
40 114 22 98 7 96 dieciséis 79 20 44 42 34 44

Las concentraciones se calcularon para equivalentes de Cy-3-O-g (mezcla A) y EGCG (mezcla B) enyoM. a) El
compuesto de referencia era de Cy-3-O-gramo.
b) El compuesto de referencia fue EGCG. Los resultados no fueron significativamente diferentes entre sí (ANOVA unidireccional con post-test de comparación
múltiple de Dunnett) con la excepción de la mezcla B 40yoM durante 48 h y 72 h (pag <0,01).

ningún aumento del daño en el ADN relacionado con el compuesto o el tiempo tor de 2, en comparación con el control de DMSO, se
(datos no mostrados). consideraron regulados [32]. Después de la incubación con la
mezcla B (1yoM EGCG equivalentes) siete genes (ABCC2, CYP2F1,
Sobre la base de las mediciones de citotoxicidad, pudimos elegir CYP3A4, CYP3A5, NNMT, SULT1C2 y SULT2A1)cumple este
concentraciones no tóxicas pero fisiológicamente relevantes criterio (Tabla 4). Las hGST y las UGT detectadas en la membrana
para el análisis de la expresión génica, que es un requisito dieron suficientes señales para indicar que estaban bien
importante antes de evaluar los efectos funcionales.in vitro expresadas (ver Material complementario), pero los polifenoles
[35]. solo tendían a regular al alza estos genes.

3.2.1 Expresión génica con matriz c-DNA 3.2.2 Mediciones de actividad enzimática
Para estudiar los efectos funcionales, los leucocitos periféricos
Para estas determinaciones se utilizaron leucocitos recién
se incubaron durante 24 h con 0,1 y 1yoM equivalentes de Cy-3-
aislados, ya que nuestros estudios previos habían demostrado
O-g (mezcla A) y EGCG (mezcla B), lo que equivale a 0,52 y 0,83yo
que había una pérdida de la proteína hGSTP1 y de la actividad
M o 5.2 y 8.3yoM polifenoles totales para las mezclas A y B,
GST en las células criopreservadas [27]. La Tabla 5 muestra las
respectivamente (ver Tabla 1). Estas condiciones y
actividades enzimáticas en leucocitos periféricos incubados
concentraciones de incubación no fueron citotóxicas, como se
durante 6 y 24 h con 0,1, 1, 10 y 40yoM equivalentes de Cy-3-O-g
demostró anteriormente, y están dentro de las concentraciones
(mezcla A) y EGCG (mezcla B). Ninguna de las mezclas de
plasmáticas máximas alcanzadas después de una comida rica en
polifenoles influyó en la actividad de GST. Tampoco hubo efecto
polifenoles (0,1–10yoM) [36]. Los leucocitos expresaron una serie
de las dos mezclas sobre el contenido de proteína total.
de genes relacionados con el metabolismo de fármacos. De los
96 genes detectados en la membrana, 58 se expresaron de
acuerdo con nuestras pautas (consulte la Sección 2). Estos
incluyeron 11 de los 12 miembros de la familia GST (hGSTA2, 4. Discusión
hGSTA3, hGSTA4, hGSTM2, hGSTM3, hGSTM5, hGSTP1, hGSTT1,
hGSTT2, hMGST2 yhMGST3)y tres de las cinco UGT vistas Los polifenoles inhiben el daño del ADNen vivo [10], aunque existen
(UGT1A1, UGT1A4yUGT2B10),pero solo 9 de los 24 CYP (CYP2C9, algunos estudios con vegetales y frutas que no muestran esta
CYP2C19, CYP2F1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F3, CYP20A1y asociación [37]. Como se ha discutido en detalle, las discrepancias
CYPOR).Sobre la base de los resultados de nuestra matriz de podrían deberse al tipo de polifenoles utilizados durante la
genes,hGSTP1es, con diferencia, la principal isoenzima de todas intervención, la matriz alimentaria y la biodisponibilidad, la dosis y el
las investigadashGST.Doblar los cambios sobre la cara momento del análisis [38]. El presente estudio cómo-

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1198 T Hofmannet al. mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200

Tabla 4.Modulación de la expresión génica de genes relacionados con el metabolismo de fármacos en leucocitos humanos tras incubación (24 h) con
diferentes mezclas de polifenoles

Símbolo banco de genes Descripción Medio DMSO Mezcla A 0.1yoMETROa Mezcla A 1yoMETROa Mezcla B 0.1yoMETROb Mezcla B 1yoMETROb
SD media SD media SD media Doblar Pliegue SD medio Pliegue SD medio Pliegue SD medio
cambio cambio cambio cambio

ABCC2 NM_000392 Casete de unión a ATP, 48,7 50,2 51,6 57,3 38,7 64,0 0,8 72,3 88,2 1,4 66,4 68,5 1,3 119,2 127,32.3
subfamilia C, miembro 2
CYP2F1 NM_000774 Citocromo P450, 32,4 16,7 24,6 17,6 13,4 12,2 0,5 22,6 1,7 0,9 36,2 30,5 1,5 51,8 17,72.1
familia 2, subfamilia F,
polipéptido 1
CYP3A4 NM_017460 Citocromo P450, 7.9 1.8 7.8 3.0 4.4 2,8 0,6 9.9 6.4 1.3 13,6 3,3 1,7 17,8 9,4 2.3
familia 3, subfamilia A,
polipéptido 4
CYP3A5 NM_000777 Citocromo P450, 5.8 2,5 5,8 6.5 5.3 4.0 0.9 7.7 5.4 1.3 8.4 4.2 1.5 14,8 11,72.5
familia 3, subfamilia A,
polipéptido 5
MGST3 NM_004528 GST microsomal 3 14,5 0,6 22,6 15,4 19,7 18,2 0,9 8.3 4.5 0.4 11,6 19,4 0,5 16,1 26,1 0,7
NNMT NM_006169 Nicotinamida 45,3 22,2 36,5 5,6 27,7 3,5 0,8 47,0 3,5 1,3 45,8 6,6 1,3 73,8 3,0 2.0
NORTE-metiltransferasa
SULT1C2 NM_006588 sulfotransferasa 5,7 3,6 4,1 0,3 4.2 1.0 1.0 5.5 0.1 1.3 5.1 0.7 1.2 10,0 0,5 2.4
familia, citosólica, 1C,
miembro 2
SULT2A1 NM_003167 sulfotransferasa 5.6 2.6 4.1 0.9 5.7 2.2 1.4 6.4 2.4 1.5 5.5 0.1 1.3 9.9 3.7 2.4
familia, citosólica, 2A,
miembro 1

a) El compuesto de referencia era Cy-3-O-gramo.

b) El compuesto de referencia fue EGCG. Los datos son valores medios € DE; se calcularon los cambios de pliegue para el control de DMSO; los cambios de pliegue por debajo de 0,5 y por
encima de 2 están marcados en negrita;norte =2.

Tabla 5.Actividad total de la enzima GST (nM/min/106106células) ni consumir una dieta baja en polifenoles. Esto puede indicar que el
detectadas en leucocitos de sangre periférica incubados con mezclas consumo de jugo estaba relacionado con la reducción del daño en el
de polifenoles durante 6 y 24 h
ADN. Sin embargo, los mecanismos no están claros ya que ambos
jugos con composiciones totalmente diferentes (antocianinacontra té
yoMETRO Duración dein vitrotratamiento
equivalentes 6 horas 24 horas verde (catequinas)) muestran resultados idénticos. Esto podría
de referencia Media Dakota del Sur Significar Dakota del Sur significar que no era la acción de los polifenoles lo que causaba los
compuesto nmol/min/106106células efectos, sino el consumo de jugo de frutas en sí. Aunque los efectos
no se pueden atribuir a compuestos específicos de los jugos, los
Medio 1.6 0.6 2.3 0.9
DMSO 3.1 0.6 2.5 1.2 hallazgos están en línea con nuestros estudios previos sobre las
Mezcla Aa) 0.1 2.4 0.9 2.5 0.6 actividades protectoras de los jugos de vegetales usando un conjunto
1 2.3 1 2.4 1 similar de biomarcadores [29]. En otro estudio de intervención
10 3 0 2.6 0.6 humana con sujetos diabéticos, la ingesta de alimentos ricos en
40 3.1 1.8
polifenoles (110 mg/día) durante 14 días también redujo
Mezcla Bb) 0.1 3 0.7 2.4 0.5
1 2.6 0.4 3 1.1 significativamente el daño del ADN en los leucocitos [39], y otros
10 3.1 0.2 3 1.2 estudios,p.ej,un estudio de intervención humana realizado con jugo
40 2.3 0.6 de bayas rojas mixtas también mostró este tipo de asociaciones [26].
Aquí estábamos interesados en determinar si un estado modulado
a) El compuesto de referencia era Cy-3-O-gramo.
b) El compuesto de referencia fue EGCG. Los datos son valores medios €
de quimioprotección reflejado por una mejora de los sistemas de
DE;norte =3 durante 6 horas ynorte =3–6 durante 24 h de duración del defensa toxicológicos, como las GST, contribuye a estos efectos de
tratamiento. Los resultados no fueron significativamente diferentes reducción del daño en el ADN.
entre sí (ANOVA unidireccional con post-test de comparación múltiple
de Dunnett).
Hemos determinado previamente que la reducción del daño genético
en el ADN de los leucocitos puede deberse a la mejora de la hGSTP1
se basó en un ensayo de intervención específico. El resultado del citosólica por los jugos de tomate y zanahoria [25]. En el presente
estudio fue que el consumo de dos jugos de frutas que estudio, ahora encontramos que hGSTP1 se suprime primero en los
proporcionaban 236 y 226 mg/día de polifenoles mejoró el leucocitos obtenidos después de la intervención inicial de 2 semanas
estado antioxidante, redujo el nivel de daño oxidativo del ADN y con los jugos de frutas. La supresión sigue siendo evidente después
mejoró las funciones inmunológicas sin diferencias entre los dos del primer período de lavado. Sin embargo, después de otro período
jugos [10]. La medición posterior a la intervención de las bases de intervención de 2 semanas con el otro jugo de fruta, hGSTP1 se
de ADN oxidadas reveló un nivel similar de bases de ADN induce significativamente. Esto confirma las observaciones anteriores
oxidadas en comparación con la línea de base, cuando los sobre el tiempo de retraso entre la ingesta de polifenoles y otros
sujetos no recibían suplementos de jugo de frutas cambios medibles y beneficiosos de

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mol. Nutrición Alimentos Res. 2006,50,1191 – 1200 Modulación de enzimas humanas de fase II por polifenoles 1199

funciones fisiológicas [10]. El punto temporal, en el que la inducción no eran diferentes enhGSTM1*1yhGSTM1*0asignaturas. Esto es
de hGSTP1 es significativa, es el mismo que el punto temporal de diferente de otro estudio realizado por nuestro grupo en el que
inhibición significativa del daño oxidativo del ADN. Esto podría observamos más daño en el ADN de los leucocitos enhGSTM1*0 que
sugerir una relación causal, al menos para la semana 8 cuando se enhGSTM1*1asignaturas (12,3 € 4,6contra9,4 € 2,9,pags <0,05) tras
realizaron las mediciones. Antes de eso, no hay efectos significativos intervención con pan rico en prebióticos € antioxidantes [53]. En el
sobre el daño del ADN, pero los niveles de hGSTP1 se reducen presente estudio, los niveles totales de sitios de endonucleasa III
notablemente. También hubo una correlación significativa (p =0,005) fueron más altos, probablemente como reflejo de una mayor
entre los niveles de proteína hGSTP1 y el daño oxidativo del ADN, lo actividad del lote de endonucleasa III utilizado en estos estudios, que
que concuerda bien con otros estudios que muestran que el procedía de una fuente diferente.
aumento de los valores de hGSTP1 se acompañó de una reducción
del daño del ADN en los leucocitos humanos [40]. La disminución
También hemos demostrado recientemente que la presencia
inmediata de la expresión de la proteína hGSTP1 probablemente no
continua de EGCG puede reducir el daño del ADN inducido por
se deba a la toxicidad directa de los polifenoles del jugo de frutas, ya
radicales en los leucocitos primarios [27]. Sobre la base del protocolo
que nuestrain vitrolos estudios no indican una vulnerabilidad
experimental pudimos concluir que esto posiblemente se deba a una
particular de los leucocitos periféricos después de la incubación con
combinación de diferentes mecanismos. Por un lado, se planteó la
polifenoles. Sin embargo, también un tratamiento de las células de
hipótesis de que EGCG puede modular favorablemente la expresión
leucemia K562 con el compuesto natural curcumina conduce también
de los sistemas antioxidantes como podría ocurrir durante el
a una inhibición de la proteína hGSTP1.a través deAP-1 y NFjFactores
pretratamiento de 18 h y, en segundo lugar, se concluyó que EGCG
de transcripción B [41]. Es posible que esta reducción sea específica
podría eliminar los radicales libres. Ácido elágico, ácido ferúlico, coles
para las células sanguíneas humanas como los leucocitos, ya que
de Bruselas, quercetina,a-angelicalactona, ácido tánico, cumarina,
también Perssonet al. [42] informó una reducción de hGSTP1 en el
ácido fumárico, curcumina y flavona, por separado, y combinaciones
ARNm y el nivel de proteína después de 250 g de vegetales mixtos
dea-La angelicalactona y la flavona administradas a ratas en la dieta
adicionalespordía.
aumentaron las actividades de las enzimas UGT hepáticas o
intestinales (intestino delgado proximal, medio y distal y colon), o
Como se recomendó anteriormente para realizarin vitroestudios con
ambas [13]. En el presente estudio, abordamos la cuestión de si las
polifenoles, nuestros estudios funcionales se llevaron a cabo en
UGT también podrían inducirse en los leucocitos periféricos mediante
concentraciones dentro del rango de las concentraciones máximas
mezclas de polifenoles compuestas para imitar los jugos de frutas del
que se han detectado en el plasma de voluntarios humanos que
en vivo estudiar. El objetivo original era dilucidar si los polifenoles
consumen una comida rica en polifenoles. Se informa que estos
específicos del jugo de frutas podrían contribuir a mecanismos
niveles están en el rango de 0.1–10yoM [35]. Por ejemplo, los niveles
similares a las actividades quimiopreventivas. Sin embargo, dado que
de EGCG en plasma fueron 0,17yoM [43] o 0,72yoM en humanos que
no se encontraron efectos, en el futuro será necesario investigar
consumen sólidos de té verde (disueltos en agua) [44]. Hemos
también el jugo completo (hasta los límites de toxicidad) e identificar
demostrado previamente que la expresión de la proteína GST, a
componentes adicionales con actividades biológicas similares en los
saber, hGSTT1, es inhibida por butirato [45]. Esta observación en
leucocitos, así como en los hepatocitos y en las células
células de adenoma de colon humano se atribuyó a una mayor
gastrointestinales. .
degradación dehGSTT1ARNm reduciendo así la expresión de
proteínas. Si esto podría ser o no un mecanismo por el cual los jugos
de frutas primero redujeron la expresión de hGSTP1en vivono se
conoce, y los resultados de nuestroin vitro Las investigaciones En conclusión, aquí hemos presentado nuevosen vivoevidencia que
realizadas aquí no respaldan el mecanismo. muestra un contenido modulado de proteína hGSTP1 en leucocitos
periféricos de sujetos humanos que habían estado consumiendo
jugos de frutas con altos niveles de polifenoles. Curiosamente, las
Se ha demostrado que las GST hepáticas son inducidas por
mezclas de polifenoles que creamos para imitar las concentraciones
xenobióticos cancerígenos, lo que, sin embargo, no implica
de polifenoles en los jugos no modularon las GST en el ARNm ni en el
necesariamente un beneficio quimiopreventivo [46].
nivel de actividad enzimática.in vitro.No inhibieron ni potenciaron la
Alternativamente, los antioxidantes u otros xenobióticos
expresión de genes relacionados con este grupo de enzimas. Esto
anticancerígenos pueden inducir GST, lo que permite que los
podría deberse a lain vitrosituación, que no es capaz de imitar la
animales de experimentación toleren mejor la exposición a
respuesta tardía observadain vivo (por ejemplo,24 horas de
carcinógenos [47, 48]. Análisis reciente deGSTpolimorfismos
exposicióncontra8 semanas), o a la mezcla de polifenoles, que
revelaron asociaciones heterogéneas que indican que elGSTgenotipo
pueden no contener los ingredientes clave (aún no identificados)
podría estar asociado con aumentos en los riesgos de cáncer o que
responsables de los efectos sobre hGSTP1 por el complejo jugo de
no hubo asociaciones, según el tejido, las situaciones de exposición y
fruta enteraen vivo.
el acoplamiento de polimorfismos para otros genes [49-52].

Los nuevos hallazgos presentados aquí mostraron que el daño oxidativo El estudio in vivo fue apoyado por una subvención de Unilever-
del ADN en respuesta a los jugos de frutas ricos en polifenoles Bestfoods, Heilbronn, Alemania. Los estudios in vitro sobre

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1200 T Hofmannet al.
Los efectos de los polifenoles fueron respaldados por la Deutsche
Forschungsgemeinschaft (subvención n.º Po 284 9-1/9-2).
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