Universidad Popular del Cesar

Facultad de ciencias de la salud

Departamento de microbiología
2009
 NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE
SUELOS.
ANTES DE INICIAR EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS…

 El uso de bata de manga larga, gorro, tapabocas y guantes es obligatorio durante la

permanencia en el laboratorio, igualmente no olvide usar zapatos cerrados de material
resistente para evitar cualquier riesgo de accidente y/o infección.

 Organícese; coloque las maletas y demás útiles no relacionados con la practica de

laboratorio en el lugar indicado por el docente, luego desinfecte su mesón de trabajo
con hipoclorito de sodio; posteriormente ubique los reactivos, equipos y muestras
necesarios para realizar su trabajo, de manera que facilite la consecución de los
procedimientos, llevándolos a cabo, de la manera más sencilla.

 Verifique que el material necesario para el desarrollo de la práctica este completo y

estéril.

 Cada estudiante debe contar con asas curva y redonda, láminas y laminillas,
marcadores de tinta indeleble, cinta amarilla para pared, vinipel, toallas de papel
desechables e hipoclorito.

 Tenga muy en cuenta las señales de seguridad, nunca las cambie de lugar o dañe
alguna.

DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA…

 Tenga cuidado con el uso del mechero, antes de prenderlo reconozca la posición de
cerrado o abierto (palanca en cruz o en paralelo al tubo de gas). Verifique igualmente
que la manguera que conduce el gas hacia mechero este en buenas condiciones, de lo
contrario evite usar ese mechero.

 Para evitar contaminaciones con otros microorganismos al hacer repiques, debe

asegurarse de esterilizar el asa calentando el alambre de ferro níquel con el mechero

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 en toda su extensión hasta que ésta se ponga roja, este proceso debe realizarse antes
y después del uso.

 Abra la caja de Petri, tubos u otros que contengan medios o cultivos el menor tiempo
posible y cerca al mechero para evitar contaminaciones.

 Es conveniente mantener un poco de hipoclorito concentrado en un vaso en donde se

descarten las asas utilizadas; cuando se manipulan hongos se prefiere la desinfección
del asa sumergiéndola en hipoclorito por 5 minutos, ya que, el proceso de incineración
puede generar aerosoles que contienen esporas dispersantes.

 Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapón en la

mano derecha sostenido entre el dedo meñique y la palma de la mano, cerca de a la
llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo índice y el
pulgar. Del correcto manejo de los tubos depende el éxito de los cultivos y por
consiguiente también los resultados microbiológicos.

 Flamear la boca de los tubos después de quitarles el tapón y antes de volverlos a tapar
para evitar la formación de aerosoles o la contaminación del contenido del tubo con
bacterias del medio ambiente.

 Destapar las cajas de Petri manteniendo la base y la tapa simultáneamente en la mano

izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. Para tener
esta posibilidad la caja debe estar sobre la mesa con el medio hacia arriba, esta se
debe coger con la mano izquierda y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la
misma mano.

 Las láminas deben estar limpias y desengrasadas.

 El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora.

Las cajas de petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las
superficies de los cultivos.

 No olvide descartar los medios de cultivo en un tiempo no superior a 8 días, según lo

indicado por el docente, ya que los hongos y actinomicetes tienen un período de
crecimiento mayor.

 Es recomendable no incubar tubos con medios de cultivo sólidos o líquidos en gradillas

de madera, ya que, además de ocupar gran espacio en la incubadora, la madera es un
material no recomendado para el trabajo con microorganismos.

 Recuerde mantener su sitio de trabajo aseado y organizado, aún durante el desarrollo

de las prácticas, evite caminar o recorrer el laboratorio continuamente con muestras
biológicas, microorganismos, o reactivos peligrosos como ácidos o bases fuertes.

 Si va a preparar y servir medios de cultivo, tenga en cuenta que este procedimiento

debe hacerse en un sitio destinado para este fin, cuyo mesón debe haber sido
desinfectado previamente con hipoclorito de sodio. La temperatura adecuada para
servir el medio de cultivo es aquella un poco superior a la corporal, si el medio esta
demasiado caliente puede generar vapores de agua que posteriormente, al disminuir
la temperatura generaran agua líquida que a su vez facilita la contaminación del medio;
si por el contrario, el medio se deja enfriar demasiado antes de servir, se tienden a
generar grumos de agar solidificado y la probabilidad de contaminación por
microorganismos presentes en el ambiente aumenta.

 El microscopio debe manejarse de manera técnica. Encenderlo una sóla vez. Una vez
logrado el enfoque de la muestra para retirar la lámina, pase al objetivo de menor
aumento (10X), no gire el tornillo macrométrico, pues desenfocara la distancia frontal.
 Está prohibido hacer manipulación boca-mano. Comer, fumar, cortar cinta pegante con
la boca, morder lápices dentro del laboratorio.

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  En caso de derrame o ruptura de un recipiente con cultivo, cubrir con papel toalla y
aplicar un germicida. Informar al profesor, en caso eventual de accidente, cortadura,
quemadura para tomar acción pronta y apropiada

AL FINALIZAR LA PRÁCTICA….

DESECHOS ESTADO FISICO ENVASE COLOR

Comunes Sólidos Bolsas plásticas Negro/Gris
Infecciosos Sólidos Bolsas plásticas

(Aguas o suelo Líquidos Recipientes Rojo

contaminadas) herméticos en
bolsas plásticas
Punzocortantes Solido Recipientes rigidos Rojo
Solido Doble bolsa
plásticas cuando las
Quimicos Liquido características lo Rojo
permitan

Envases originales
Biologico (plantas, Solido Bolsas gruesas Verde
suelo, troncos)
Especiales Solido Bolsas plasticas en Amarillo
recipientes
hermeticos

 Elimine los residuos de muestras en las bolsas destinadas para su desecho, recuerde
que los medios de cultivo con microorganismos deben someterse a esterilización en
autoclave, antes de ser desechados.

 Lave el material de vidrio que no requiera ser esterilizado y dispóngalo de manera

organizada sobre el mesón indicado.

 Limpie los lentes del microscopio con papel de arroz y guarde estos equipos en el lugar
correspondiente.

 Verifique que su puesto de trabajo haya quedado limpio y desinfectado con hipoclorito
de sodio.

 Recuerde guardar su bata de laboratorio dentro de una bolsa y lavarla por separado,
previa desinfección con un líquido blanqueador.

 Todo el equipo reusable (por ej. puntas de micro pipetas, jeringas, cánulas, agujas,
tubos para recolección de especímenes, etc.) deberá ser ubicado en un recipiente
metálico o de plástico resistente a punciones o cortaduras. Se recomienda el uso de
bidones y botellas de plástico o cualquier recipiente similar acondicionado para tal fin.
El recipiente contendrá líquido decontaminante y deberá estar ubicado en el mismo
lugar de trabajo.

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 ACTIVIDAD GRUPAL.

1. Observa el comportamiento del personal de laboratorio (estudiantes, auxiliares, docentes)

toma fotos o realiza un video si es posible y analiza:

 ¿Se practican las normas de bioseguridad?

 ¿Qué riesgos potenciales corre el personal de laboratorio?
 ¿Qué prácticas inadecuadas (no acordes con las normas de bioseguridad)
observaste?
 Como microbiólogo, ¿qué recomendaciones generales harías para mejorar la
bioseguridad en tu universidad?

Todos los grupos de trabajo presentan los videos realizados o exponen las fotos y con base en
lo observado deben elaborar un plegable o folleto, que contenga las normas necesarias para
prevenir contaminaciones y accidentes, durante el desarrollo de las prácticas de microbiología
de suelos. El mejor folleto o plegable será expuesto en el laboratorio.

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 PRACTICA 1

TÉCNICAS PARA EL ENRIQUECIMIENTO Y OBSERVACIÓN IN

SITU DE MICROORGANISMOS DEL SUELO

OBJETIVOS

 Aplicar técnicas sencillas para el enriquecimiento y la observación de microorganismos

del suelo in situ.
 Observar la diversidad y los patrones de colonización de microorganismos del suelo sobre
superficies sólidas.
 Practicar la observación de microorganismos del suelo in vivo

MATERIALES

Laminas portaobjetos limpias

Capilares
Cinta adhesiva
Pala
Asas Agujas rectas y curvas.
Coloraciones (Gram, Azul de lactofenol, safranina)
Microscopio
Parafina (una vela)
Una Papa
Sacabocados
Frascos de vidrio
Muestras de suelo
Alcohol
Mecheros

PROCEDIMIENTO

I. Observación De Microorganismos Del Suelo Por La Técnica De Portaobjeto Enterrado

 Tome un par de portaobjetos limpios y desengrasados, únalos por sus superficies.

Posteriormente envuélvalos con cinta adhesiva transparente en sus extremos.

 Seleccione un suelo protegido de la actividad humana, animales etc. Con la ayuda de una
pala entierre varios pares de laminas unidas a profundidades de 5, 15 y 30 cm. Puede
también enterrar laminas en diferentes tipos de suelo según si interés (ejm: diferente grado
de humedad, diferente grado de fertilidad, diferente vegetación).
 Marque el sitio y deje enteradas las laminas por 2 , 4 y 6 semanas.

 Retire del suelo las láminas enterradas en cada sitio, a las 2, 4 y 6 semanas.

 Separe el par de laminas, lave cuidadosamente la superficie expuesta y retire las

partículas gruesas de suelo, debe quedar una película fina sobre la lamina, la cual no debe
ser dañada. Lave bien la parte opuesta de la lamina y y séquela con cuidado para
colocarla sobre la platina del microscopio

 Observe primero en montaje húmedo, (con agua y laminilla), y luego con colorantes a 10,
40 y 100X.

 Trate de identificar estructuras microbianas, patrones de crecimiento, diversidad de formas

etc.

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 Dibuje y describa las observaciones, tabule los resultados de acuerdo a las diferentes
profundidades y suelos que quiere comparar.

II. Observación De Microorganismos Del Suelo Por La Técnica De Capilares

 Tome una lamina portaobjetos y y coloque sobre ella entre 5 y 10 tubos capilares,
Péguelos con cinta adhesiva en sus extremos sin obstruir los orificios.

 Entierre las laminas en el suelo a diferentes profundidades (igual que en el

procedimiento anterior, sin embargo es recomendable esta técnica para observar
microorganismos en suelos bastante húmedos), si se quiere se puede introducir
algunos sustratos en el interior de los capilares.

 Después de transcurridas 2,4 y 8 semanas, desentierre las láminas, realice

observaciones macro y microscópicas tomando las muestras del interior los capilares
con ayuda de una aguja ( en caso de ser necesario parta los capilares y prepare
montajes húmedos y coloreados).

 Compare lo observado entre diferentes muestras y con la técnica anterior.

III. Enriquecimiento Y Observación De Clostridium Sp Amiloliticos

Este ensayo es un método clásico de enriquecimiento para la obtención de bacterias

anaeróbicas, aisladas a partir de agregados de suelo en un medio natural rico en almidón
como es la papa.

 Se toma una papa y con un sacabocados de aproximadamente 1 centímetro de diámetro

(previamente impregnado con alcohol y flameado) se orada hasta la mitad. Se retira el
cilindro de papa y se corta unos 3mm en la base, e deja sobre papel absorbente, caja de
Petri o una lamina limpia junto al mechero para que no se contamine.

 Se introduce en el orificio una pequeña cantidad de agregados de suelo (cerca de 0,5 g) y

se coloca nuevamente el cilindro de papa.

 Se sella con parafina liquida (vela derretida), y se coloca dentro de un frasco de boca
ancha, al que se le agrega agua hasta cubrir la papa inoculada y se tapa con papel de
aluminio o una tapa metálica.

 Se deja incubar al medio ambiente por 2 -3 días.

 Se retira la papa del frasco, se retira el cilindro de papa y del interior del orificio se toman
muestras con ayuda del asa para hacer extendidos, se dejan secar al aire. Se fijan al calor
y se colorea con Gram.

 Realice otro montaje para ser coloreado con la coloración para endosporas de Shaeffer
Fulton (Consultar procedimiento).

CUESTIONARIO

1. Consulte que es una técnica de cultivo por enriquecimiento y para que se usa en
microbiología del suelo.

2. Consulte las diferentes morfologías de bacterias endosporadas y los tipos de sustratos

utilizados, tanto anaerobias como aerobias.

3. Que son los microorganismos oligotróficos y un método de enriquecimiento para la

selección de este tipo de microorganismos presentes en el suelo o el agua, consulte dos
géneros de este tipo de microorganismos y describa sus características morfológicas y de
crecimiento.

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 PRACTICA 2
DETERMINACION DEL EFECTO RIZOSFERICO
OBJETIVOS

 Evidenciar el efecto de la rizosfera sobre el número de microorganismos del suelo

adyacente a la raíz.
 Determinar el efecto rizosférico en plántulas de interés, mediante la obtención del índice
rizosférico.

MATERIALES

Cajas de Petri con Agar Nutritivo (AN) o Agar Plate count (PCA)
Tubos de ensayo para preparar series de diluciones
Pipetas de 1 -5 mL
Micropipetas 1-100 microlotros y 100-1000 microlitros
Asas de vidrio en L (Asas de Drigalsky)
Muestras de suelo rizosférico de diferentes especies vegetales
Muestras de suelo no rizosférico
Vortex
Solución salina o agua peptonada.

Cada grupo debe traer un 2 asas de hokey (asa de vidrio en forma de L) estériles.

PROCEDIMIENTO

I Toma De Muestras

 En un suelo con cobertura boscosa, un suelo cultivado o un jardín, seleccione una plántula
saludable (según su interés) y desentiérrela con cuidado, extrayendo todo el sistema
radical sin romper las raíces.
 Sacuda suavemente las raíces de tal manera que se desprenda el volumen de suelo que
no esta adherido directamente a la superficie radical, tome 100 gramos de raíces finas con
las partículas de suelo que están adheridas directamente a la superficie rodeando las
raíces (Suelo rizosférico)
 En el mismo terreno seleccione el área mas cercan al lugar donde se encontraba la
planta, pero que no tenga influencia del sistema radical y tome unos 100 gramos de suelo
(suelo no rizosférico).
 Coloque por separado en bolsas plásticas el suelo rizosférico y el suelo no rizosférico,
rotúlelo y transpórtelo al laboratorio en el menor tiempo posible.

II Procesamiento de las muestras

 Tome las raíces de la plántula y agítelas vigorosamente sobre una superficie limpia y
desinfectada, hasta que se desprenda la mayor cantidad posible de suelo rizosférico, tome
10 gramos de dicho suelo y disuélvalo en 90 mL de agua agitando vigorosamente en el
vortex hasta que no se distingan gránulos de suelo en el fondo del recipiente. A partir de
allí, prepare una serie de diluciones hasta
 10 -6 en los tubos de ensayo con solución salina o agua peptonada.

 Tome diez gramos del suelo no rizosférico y proceda de la misma manera a realizar una
serie de diluciones.

 De cada dilución (10-1 a 10-6) de suelo rizosférico, tome 0,1 mL y proceda a realizar una
siembra en superficie en una caja de Petri con Agar Nutritivo o Agar Plate Count, con
ayuda del asa de vidrio

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 Repita el procedimiento anterior a partir de la serie de diluciones del suelo no rizosférico.

 Rotule las cajas e Incúbelas a una temperatura entre 25 a 30 oC por 3 a 5 días o hasta
evidenciar el crecimiento de colonias microbianas en toda la superficie de la caja.

 Retire las cajas de la incubadora y proceda a realizar el recuento del número de colonias
en cada cajas y determine el numero de UFC por gramo de suelo rizosférico (R) y el
numero de UFC por gramo de suelo no rizosférico ( S).

 Determine la relación R/S

 Interprete el resultado de acuerdo al valor:

 R/S > 1, R/S = 1 o R/S <1

 De acuerdo al resultado, explique el efecto rizosférico de la planta sobre la microbiota del

suelo.

NOTA: Se puede determinar el efecto rizosférico para diferentes grupos de microorganismos

inoculando la muestra de las diluciones en medios de cultivo selectivos para hongos, bacterias,
actinomicetes, etc, o incluso géneros y especies de especial interés.

CUESTIONARIO

4. ¿Que es la competencia rizosférica de un microorganismo?

5. ¿Que importancia practica tiene la determinación del efecto rizosférico?.
6. ¿Qué factores relacionados con la interacción planta microorganismo pueden influir en el
resultado del índice R/S)?

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 PRACTICA 3
OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS FIJADORES DE
NITROGENO DE VIDA LIBRE
OBJETIVOS

 Obtener microorganismos fijadores asimbióticos de nitrógeno de los generos Azospirillun y

Azotobacter
 Comprobar La técnica de aislamiento en cultivos selectivos para la obtención de bacterias
fijadoreas de nitrógeno activas
 Observar las características fisiológicas y morfológicas de bacterias fijadoras de nitrógeno
de vida libre, en respuesta a condiciones ambientales propicias para su actividad.

PROCEDIMIENTO

PREPARE LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA AISLAMIENTO

Medio Ashby para aislamiento de Azotobacter sp

Componente Cantidad (gr / L)

K2HPO4 0,2
MgSO4 7H2O 0,2
NaCl 0,2
CaCO3 5
K2SO4 0,1
Manitol 15
Agar 15
PH Ajustar a 7
*Se puede agregar 5ml de extracto de suelo o 0.1 gramo de extracto de levadura.
Esterilización: 20 minutos a 121 oC

Medio NFB Ácido málico Semisólido para aislamiento de Azospirillum sp

Componente Cantidad (gr / L)

K2HPO4 0,5
Na2MoO4 2 mg
MnSO4 0.3mg
MgSO4 7H2O 0,2
NaCl 0,02
CaCl2 5
FeSO4 0,0017
Acido Malico 5
KOH 4
Agar 2
*zul de bromotimol (Solución) 3 ml
PH Ajustar a 6,5 - 7
*Azul de bromotimol Solución al 0.5% con KOH 0.2 N.
Esterilizar a 121°C, 20 minutos en autoclave
El medio semisólido se sirve en tubos de ensayo o frascos ocupando un tercio del volumen.
Con la misma preparación se agregan 15 gramos de agar para preparar medio sólido y se
suplementa con 0,5 gramos de extracto de levadura
Para evidenciar el crecimiento de algunas especies de Azospirillum se puede preparar el medio
sólido sin azul de bromotimol y a cambio se agrega 15ml de solución de rojo congo(1 g
disuelto en 400 mL)

OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS NFB EN LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS

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PURIFICACIÓN DE CEPAS

Azotobacter:

Tome muestras de suelo de buena calidad, pase la muestra por tamices de diferente tamaño
de poro hasta obtener partículas de suelo uniformes, del menor tamaño posible conservando
su estructura y agregación. Transfiera los gránulos seleccionados a una caja de petri seca y
estéril, con unas pinzas estériles, tome los gránulos de suelo y dispongamos de a 5, 7 o 9
sobre las cajas con medio de cultivo Ashby (Figura1). Incube a 30 oC y observe
periódicamente hasta evidenciar colonias en crecimiento alrededor de los gránulos. Consulte
la literatura para reconocer las características del genero en este medio de cultivo. Tome las
colonias típicas de Azotobacter, realice coloración de Gram para reconocer sus características
microscópicas y purifíquelas sobre nuevas cajas de medio de cultivo selectivo.

Figura 1: Disposición de gránulos de suelo sobre medio de cultivo Ashby

Fijadores microaerofilicos tipo Azospirillum

Tome muestras de raicillas finas (con el suelo adherido sobre su superficie) de plantas
gramíneas (maíz, caña, arroz, pastos). Coloque 1 gramo junto en un tubo con 9 ml de solución
salina al 0,8% . Agite vigorosamente en vortex durante 5 minutos, posteriormente prepare
diluciones seriadas y de cada una de las diluciones inocule 0,1ml en cada frasco del medio
selectivo semisólido, incube a 30 oC hasta observar la formación de una película fina de color
blanco o amarillo a 2-5 ml de la superficie del medio. Con un asa tome una parte de la película
formada y transfiérala al medio selectivo sólido realizando estriado por agotamiento, con el fin
de obtener colonias aisladas. Realice coloraciones de Gram para reconocer sus características
microscópicas.

PROCEDIMIENTO COMPLEMENTARIO OPCIONAL

OBTENCIÓN DE UN BIOPREPARADO A BASE DE LOS MICROORGANISMOS

SELECCIONADOS.

A partir de cada aislamiento microbiano de los diferentes grupos funcionales se lleva a cabo
una propagación masiva para la obtención de un inóculo en caldo nutritivo enriquecido con
extracto de levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el crecimiento rápido y
abundante de los diferentes microorganismos.

INOCULACIÓN DE PLANTAS DE CRECIMIENTO CORTO CON BIOPREPARADOS A BASE

DE MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL

4.1 Se colocan 500 gramos de suelo en recipientes plásticos.

4.2. Se sembraron 10 semillas de la planta seleccionada (planta indicadora de crecimiento
rápido) en cada uno de los recipientes.

4.3. Seguidamente se aplican10ml del biopreparado con el microorganismo a probar sobre toda
la superficie del suelo y se riega inmediatamente sin inundación. Se coloca un tratamiento sin
inoculo como control y se adiciona el medio de cultivo sin microorganismo.

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4.4. Realice conteos diarios del porcentaje de semillas germinadas en cada tratamiento

DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA INOCULACIÓN POR MEDIO DE PARAMENTROS

DE CRECIMIENTO VEGETAL
Después de varios días de crecimiento días se desentierran cuidadosamente todas las plantas
y se realizan las siguientes determinaciones:
 Longitud Promedio de la raíz.
 Longitud Promedio de las hojas.
 Biomasa del follaje y de raíces.

CUESTIONARIO

 Consulte las características morfológicas propias del genero Azotobacter y Azospirillum

que permiten su reconocimiento en el laboratorio.
 ¿Qué diferencia hay en el proceso de fijación de nitrógeno entre bacterias de vida libre
como las estudiadas en esta práctica y bacterias simbióticas como Frankia sp y
Rhizobium sp?
 Que importancia ha tenido el uso de inoculantes microbianos a base de Azotobacter y
Azospirillum para la agricultura.

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 PRACTICA 4

BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO

SIMBIÓTICAS.
OBJETIVOS
 Obtener cultivos de bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium a partir de
nódulos de plantas leguminosas.
 Comparar la morfología de bacterias del género Rhizobium en simbiosis vs en cultivo.

MATERIALES

Cajas de Petri con agar selectivo YMA o agar ELMARC

Tubos de ensayo para preparar series de diluciones
Pipetas de 1 -5 mL
Micropipetas 1-100 microlotros y 100-1000 microlitros
Asas de vidrio en L (Asas de Drigalsky)
Plantulas de palntas leguminosas noduladas
Muestras de suelo adyacente a plantas leguminosas
Vortex
Solución salina o agua peptonada.
Bisturí
Asas rectas y redondas.

PROCEDIMIENTO

En un suelo de buena calidad identifique la presencia de plantas saludables y vigorosas de

especies leguminosas ( Trébol, Arveja, Frilol, Leucaena, etc), desentierre algunas plantas con
cuidado para extraer el sistema radical completo sin dañar la raíz principal y raíces
secundarias.
Lave cuidadosamente la raíz e identifique los nódulos radicales formados por la infección de
bacterias simbióticas del genero Rhizobium, estas estructuras son tumores de color rojo,
marrón o café, de forma lobulada o acorazonada como se observa en la siguiente figura.

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Seleccione nódulos grandes, brillantes y de color intenso, lávelos con abundante agua y
transfiéralos a una caja de petri limpia y seca.
Desinfecte la superficie de los nódulos, sumergiéndolos en una solución de hipoclorito de sodio
al 5% durante 1 minuto, lave nuevamente los nódulos varias veces con agua estéril para retirar
el exceso de hipoclorito de la superficie (entre 5 y 8 lavados de a un minuto), tenga la
precaución de realizar los lavados cerca al mechero o en cámara de esterilidad para evitar
contaminación de los nódulos con bacterias y hongos ambientales.
Coloque los nodulos lavados y desinfectados sobre una caja de petri limpia y estéril, con ayuda
de un bisturí o una cuchilla desinfectada corte un nódulo por el centro y verifique la presencia
de leghemoglobina, una sustancia de color rojizo presente en nódulos activos (fijadores de
nitrógeno) y con buen contenido de bacteroides de Rhizobium.

Tome diferentes porciones de nódulos y colóquelos con una pinza estéril sobre la superficie de
agar YMA o agar ELMARC e inocule las cajas de petri a temperaturaentre 25 a 30 oC .
También puede tomar los nódulos cortados y preparar diluciones en solución salina o agua
peptonada para inocular a partir de las diluciones y realizar siembra masiva con ayuda de un
asa de Hokey.

Tome secciones de nódulos sobrantes, con un asa tome una muestra del interior, realice un
frotis y realice una tinción de Gram. Identifique las células de Rhizobium y observe
cuidadosamente la morfología y tamaño de los bacteroides.

Al cabo de 5 a 7 días retire los cultivos de la incubadora y observe el crecimiento de colonias

alrededor de los nódulos, o masivamente en toda la superficie a en las cajas inoculadas a
partir de las diluciones.
Tome muestras de las colonias mas representativas y realice coloraciones de Gram, compare
la forma y el tamaño de las células, con lo observado a partir de las muestras directas de los
nódulos, establezca las diferencias. Y discuta los resultados.

PROCEDIMIENTO COMPLEMETARIO OPCIONAL

Tome colonias puras y prepare una suspensión bacteriana, determine el numero de UFC por
medio de conteos en cámara de Neubauer o por espectrofotometría.
Tome plantas o semillas de la misma especie leguminosa de donde fueron obtenidas las
colonias de Rhizobium, desinfecte las superficies y lávelas con abundante agua.
Coloque en contacto las plántulas o las semillas con la suspensión bacteriana, por un tiempo
entre 15 y 30 minutos, luego retírelas y proceda a sembrarlas en recipientes con suelo
esterilizado o pasterizado.

Al cabo de 2 o 3 semanas de crecimiento desentierre las plantas y compruebe la formación de

nódulos radicales formados por la infección con las células de Rhizobium inoculadas.

CUESTIONARIO

¿Qué la leghemoglobina y que papel desempeña en el interior de los nodulos formados por
Rhizobium en raíces de plantas leguminosas?
¿Qué son los bacteroides y que diferencias morfológicas y funcionales presentan con celulas
de Rhizobium de vida libre ?.
¿Qué importancia tiene la colonización y fijación de nitrógeno por parte de de Rhizobium para
la producción de cultivos de plantas leguminosas ?

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 PRACTICA 5

OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS Y

SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS

OBJETIVOS

 Obtener diferentes microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de muestras de

suelo y raíces de plantas.
 Obtener microorganismos celulolíticos a partir de muestras de material vegetal en
descomposición natural.
 Observar la expresión de la actividad de organismos solubilizadores de fosfatos y
degradadores de celulosa en los medios de cultivo selectivos.
 Determinar cualitativamente la actividad solubilizadora de fosfatos mediante la medición
del índice de solubilización relativa.

PROCEDIMIENTO

PREPARE LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE LOS

ORGANISMOS DE INTERES

Medio SRS para el aislamiento de Solubilizadores de fosfatos

Componente Cantidad (gr / L)
(NH4)2 SO4 0,5
KCL 0,2
MgSO4 0,3
MnsO4 0,004
FeSO4 0,002
NaCl 0,2
Glucosa 10
Extracto de levadura 0,5
Purpura de bromocresol 0,1
*Ca3 (PO4)2 5
Agar 15
Esteriliza a 121oC 30 minutos.
PH:7
El fosfato se esteriliza en forma independiente y se adiciona a los otros componentes antes de
servir.

Medio para Degradadores de celulosa. Agar Celulosa –Rojo Congo

Componente Cantidad (gr / L)

K2HPO4 0,5
MgSO4 0,25
Celulosa en polvo 1,88
Rojo congo 0,2
Agar 5
Gelatina 2
Extracto de suelo 100ml
PH 7 con NaOH0,1N
Esteriliza a 121oC 30 minutos.

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OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS

Tome muestras de suelo de buena calidad o compost maduro, pase la muestra por tamices de
diferente tamaño de poro hasta obtener partículas de suelo uniformes, del menor tamaño
posible conservando su estructura y agregación. Transfiera los gránulos seleccionados a una
caja de Petri seca y estéril, con unas pinzas estériles, tome los gránulos de suelo y
dispóngalos de a 5, 7 o 9 sobre las cajas con medio de cultivo SRS. También puede tomar
segmentos de raicillas de plantas exigentes en fósforo tales como maíz, trigo o caña de azúcar,
Incube a 30 oC y observe periódicamente hasta evidenciar colonias de hongos o bacterias en
crecimiento alrededor de los gránulos o de las raicillas. La actividad solubilizadora se evidencia
por la aparición de un halo transparente alrededor de la colonia en el medio SRS, acompañado
de cambio de pH del medio que se evidencia por una coloración amarilla en el medio que
originalmente es de color púrpura. Seleccione las colonias con mayor expresión de la actividad
solubilizadora y purifíquelas sobre nuevas cajas de medio de cultivo selectivo SRS.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD SOLUBILIZADORA DE FOSFATOS

La valoración de la eficiencia relativa de solubilización de los aislamientos, se puede realizar

empleando el método propuesto por Sundara Rao y Sinha (1963) sobre el medio original de
aislamiento (SRS), el cual está basado en la medición del diámetro de halos de transparencia
alrededor de colonias bacterianas que crecen en un medio de cultivo sin formas solubles de
PO4 3- pero con fosfato de calcio o hierro, el cual puede ser solubilizado por las colonias
microbianas que presenten esta capacidad. La eficiencia relativa de solubilización de fosfatos
se expresa haciendo una relación del diámetro del halo de solubilización con respecto al
diámetro de la colonia. Sin embargo esta técnica se puede considerar únicamente cualitativa.

Para la determinación relativa de solubilización se toman cajas de Petri con medio SRS con
fosfato de calcio, de cada aislamiento bacteriano, se siembra en el centro de la caja una
colonia de bacteria tomada con la punta de una aguja a partir de colonias de 48 horas de
crecimiento. Se hacen de 3 a 5 replicas para cada aislamiento y se incuban a 31ºC por 5 días,
luego de los cuales se registró el diámetro de las colonias y el diámetro de los halos de
solubilización (transparencia en el medio de cultivo)

Para valorar la actividad solubilizadora se emplea la relación:

Diámetro de solubilización
Actividad = __________________________________
Diámetro de la colonia bacteriana

Donde el valor mínimo del índice de solubilización es de 1. Esto corresponde a una colonia que
no presenta halo de solubilización evidente y se asume que este es igual al diámetro de la
colonia.

Aspecto inicial del medio de cultivo SRS, con
partículas de fosfato de calcio tribásico, poco
solubles.
El indicador de pH (púrpura de bromocresol)
torna el medio de color morado a pH neutro.
Manual de prácticas de Microbiología del Suelo
Crecimiento de colonias bacterianas
solubilizadoras de fosfato en medio SRS: A,
diámetro de la colonia.
B, diámetro del halo de solubilización de
fosfatos. C, acidificación del medio de
cultivo (el indicador de pH vira a amarillo).
Nelson Osvaldo Valero
OBTENCION DE MICRORGANISMOS CELULOLITICOS

Tome muestras de suelo rico en residuos de vegetales, compost elaborado a partir de

materiales celulósicos, trozos de madera en descomposición, humus u hojarasca, pase la
muestra por tamices de diferente tamaño de poro hasta obtener partículas de suelo uniformes,
del menor tamaño posible. Transfiera los gránulos seleccionados a una caja de Petri seca y
estéril, con unas pinzas estériles, tome los segmentos de material en descomposición y
dispóngalos sobre las cajas con medio de cultivo Agar Celulosa –Rojo Congo.
Incube a 30 oC y observe periódicamente hasta evidenciar colonias de microorganismos en
crecimiento alrededor de las partículas. Consulte la literatura para reconocer las características
de colonias que degradan celulosa. Purifique las colonias con mayor expresión de la actividad
celulolitica sobre nuevas cajas de medio de cultivo selectivo.

CUESTIONARIO

 Consulte y elabore una síntesis de los mecanismos bioquímicos que presentan hongos y
bacterias para llevar a cabo la solubilización de fosfatos.
 Consulte las fuentes de fosfato inorgánico y orgánico sobre las cuales actúan los
microorganismos solubilizadores para liberar el ión ortofosfato.
 Explique el mecanismo de acción de organismos celulolíticos, para la descomposición de
la celulosa.
 Consulte algunos géneros de hongos y bacterias conocidos por su actividad degradadota
de celulosa.
 Consulte un método para evaluar la actividad de microorganismos celuloliticos.

Manual de prácticas de Microbiología del Suelo Nelson Osvaldo Valero

 PRACTICA 6

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL

CRECIMIENTO VEGETAL L SOBRE ESPECIES VEGETALES DE
CRECIMIENTO RÁPIDO

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos del suelo, especialmente los que habitan la rizósfera, desarrollan
procesos de gran interés para el crecimiento y nutrición de las plantas; entre tales acciones
se encuentra la degradación de la materia orgánica, la fijación de nitrógeno, producción y
liberación de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, solubilización de elementos
minerales nutrientes de las plantas, protección frente a fitopatógenos, etc. Es así como en
la actualidad existe un creciente interés en aplicaciones agroecológicas mediante la
utilización de microorganismos rizosféricos como fertilizantes biológicos, para lo cual los
estudios básicos hacen importantes aportes para llegar a tecnologías que permitan la
utilización masiva de biopreparados microbianos (biofertilizantes y / o fitoestimuladores) en
modelos alternativos de agricultura enmarcados dentro el concepto de sostenibildad.

Los microorganismos que incrementan el suministro y la disponibilidad de nutrientes,

mejorando el nivel de fertilidad del suelo y contribuyendo al crecimiento de la planta se
denominan biofertilizadores. Similarmente, a los microorganismos que producen
sustancias con actividad biológica análoga a la de fitohormonas y aumentan la
productividad en los cultivos, se denominan fitoestimuladores ( Barea & Olivares, 1998).

OBJETIVO GENERAL

Observar la acción promotora del crecimiento vegetal de microorganismos rizosféricos

obtenidos en el laboratorio de microbiología del suelo, sobre plantas de crecimiento rápido.

OBJETIVOS ESPECIFOCOS

 Obtener microorganismos biofertilizadores y fitoestimuladores y preparar un inoculo

microbiano a base de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal.
 Llevar a cabo la inoculación del biopreparado sobre plantas indicadoras.
 Determinar la respuesta de las plantas indicadoras, mediante la medición de variables
agronómicas, tras la inoculación con biopreparados microbianos.

MATERIALES

 Semillas de arroz, tomate, algodón, cebada, maíz, lechuga etc.

 Recipientes o bolsas plásticas con capacidad para un Kg de suelo
 Pipetas o jeringas de 5 -10 cc
 3 Kg Suelo
 Cepas de diferentes microorganismos obtenidos en las prácticas anteriores del laboratorio
de microbiología del suelo (Azotobacter sp, Azospirillum sp, Pseudomonas, etc)
 Matraces con medio de cultivo líquido (Caldo nutritivo)

PROCEDIMIENTO

Obtención de biopreparados

Se toman las diferentes cepas microbianas seleccionadas y se lleva a cabo una propagación
masiva de cada microorganismo, para la obtención de un inóculo en caldo nutritivo
enriquecido con extracto de levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el
crecimiento rápido y abundante de los diferentes microorganismos. Para ello se toma suficiente

Manual de prácticas de Microbiología del Suelo Nelson Osvaldo Valero

inoculo a partir de una colonia fresca y pura, y se inocula en condiciones de esterilidad en un
erlenmeyer con 200 ml de medio de cultivo líquido y se incuban por dos o tres días (si es
posible con agitación permanente). Cuando observe crecimiento abundante, detenga el
crecimiento, determine la cantidad de UFC/ ml mediante recuentos en cámara de Neubauer o
por nefelometría.

Montaje del bioensayo de promoción del crecimiento

 Cada grupo de laboratorio selecciona una planta según su interés y consigue semillas que
no hayan sido tratadas con antifungicos o bactericidas.
 Proceder a lavar cuidadosamente 50 semillas
 Se toman 5 recipientes plásticos y se colocan 500 gramos de suelo en cada uno.
 Se distribuyen 10 semillas de la planta seleccionada uniformemente en la superficie del
suelo en cada recipiente.

 Seleccionar 3 de los biopreparados elaborados y con la ayuda de una pipeta o con una
jeringa limpia, se toman 10 ml del biopreparado y se aplican uniformemente sobre las
semillas. Utilice un biopreparado diferente para cada recipiente, en el cuarto recipiente
inocule una mezcla de los tres microorganismos seleccionados y en el quinto recipiente
aplique 10ml del medio de cultivo estéril para utilizarlo como control sin inoculo microbiano.

En resumen:

Recipiente 1: Suelo + Bacteria 1 + 10semillas

Recipiente 2: Suelo + Bacteria 2 + 10semillas
Recipiente 3: Suelo + Bacteria 3 + 10semillas
Recipiente 4: Suelo + Bacterias 1 2 y 3 + 10semillas
Recipiente 5: Suelo + medio de cultivo sin bacterias + 10semillas

 Después de la inoculación cubra las semillas con una capa delgada de suelo y riegue
inmediatamente con suficiente agua pero sin inundación.

Seguimiento del bioensayo

Figura 1: Ejemplo de un bioensayo con organismos biofertilizantes.

Realizar conteos diarios del porcentaje de semillas germinadas en cada recipiente. Después de
pasados 3 días sin variación en el numero de semillas germinadas, realice tablas y graficas
para comparar la velocidad de germinación en cada uno de los recipientes con semillas
inoculadas.

Después de determinar el porcentaje de germinación, observar el crecimiento de las plantas

durante 7 a 10 días más, manteniendo la humedad en el suelo.

Manual de prácticas de Microbiología del Suelo Nelson Osvaldo Valero

Después de varios días de crecimiento se desentierran cuidadosamente todas las plantas y se
realizan las siguientes determinaciones:

 Longitud Promedio de la raíz.

 Longitud Promedio de las hojas.
 Biomasa del follaje y de raíces.

Figura2: Ejemplo del registro de las variables respuesta.

Elabore tablas de datos y / o graficas para presentar y explicar los resultados y elabore un
informe analizando y concluyendo en concordancia a lo planteado en los objetivos.

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 PRACTICA 7
COMPOSTAJE
El compost es un producto derivado de un proceso natural constantemente cambiante en el
que participan varios grupos de microorganismos, cada uno apropiado a diferentes condiciones
y durante un tiempo determinado. Los sustratos proporcionados provienen de desechos
vegetales conservando según su composición una relación de carbono y nitrógeno apropiada
para no limitar el proceso y obtener un producto de color y olor similar al suelo. Otros producto
adicionado es el estiércol, el cual, se constituye en la principal fuente de microorganismos. En
general los materiales usados son considerados elementos sobrantes de distintas actividades
productivas, por lo que el compostaje es considerada una excelente estrategia para el manejo
de residuos orgánicos, al generarse un producto que enriquece el suelo pero sobre todo, que
mejora las condiciones físicas y químicas del mismo.

En una pila de material en compostaje, si bien se dan procesos de fermentación en

determinadas etapas y bajo ciertas condiciones, lo deseable es que prevalezcan los
metabolismos respiratorios de tipo aerobio, tratando de minimizar los procesos fermentativos y
las respiraciones anaerobias, ya que los productos finales de este tipo de metabolismo no son
adecuados para su aplicación agronómica y conducen a la pérdida de nutrientes.

MATERIALES.

 Residuos vegetales escogidos y picados:

 papa, cáscaras de alverja, zanahoria, cáscaras de frutas, cebolla, perejil y especies, papel
(diferente de periódico), desechos de rosa.

 1 bulto de cada uno de los siguientes materiales:

 Estiércol de vaca y/o gallina y/o equino.
 Pasto seco y/o heno y /o cascarilla de arroz.
 1 kilo de cal.
 1 kilo de urea granulada.
 1 kilo de Melaza.

 Pala y rastrillo de jardinería.

 vasija plástica.
 Agua
 6 tubos de PVC de 25 cm de alto y de ½ pulgada de diámetro.
 1 tubo de PVC de 60 cm de largo y de ½ pulgada de diámetro.
 Guantes
 pH metro.
 Termómetro.

PROCEDIMIENTO.

 Antes de realizar la pila ubique un sitio amplio y protegido del sol excesivo y la lluvia; y
genere la estructura para organizar la pila de compostaje.
 Distribuya los materiales en la pila de abajo hacia arriba en el siguiente orden: pasto seco,
residuos vegetales y pasto picado, boñiga de bovino o equino (esta ultima es la más
recomendada), cal.
 Coloque los materiales en capas siguiendo el orden que se presenta a continuación:
 2 cm de cascarilla de arroz seca.
 6 cm de residuos vegetales en mezcla con el pasto seco.
 3 cm de boñiga.
 Disperse una delgada capa de cal por toda la pila.
 Adicione melaza diluida en agua.
 Puede enriquecer el compostaje adicionando urea y o roca fosfórica como fuentes de N y P
adicionales.

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 Repita el proceso aumentando la altura de la pila hasta agotar los residuos vegetales.
 Para controlar la desecación o humedad excesiva, procure cubrir la pila o realizarla bajo
techo.
 Realice volteos semanales con el propósito de airear la pila.
 De igual manera controle la humedad periódicamente, la cual debe ser un poco superior a
la capacidad de campo (al tomar un puñado deben escurrir algunas gotas al hacer presión
de la muestra).
 Evalué cada 5 días el pH y la temperatura antes de realizar el volteo.

Para determinar el pH tome muestras a partir de varios puntos genere una muestra
compuesta y realice a partir de solución con 2.5 partes de agua (de la misma manera que
se efectúa para suelos).

La temperatura debe determinarla, considerando el promedio tomado en 3 puntos de la pila

a una profundidad media.

 El compost estará listo cuando la mezcla presente color café-negruzco y la temperatura se

haya estabilizado.

Complete la siguiente tabla según las observaciones semanales del proceso.

SEMANA COLO OLOR TAMAÑO TEMPERATURA PH PRESENCIA

S R DE /AUSENCIA
PARTÍCU DE HONGOS
LA Y ACTINOS.
1

 Grafique la relación de la temperatura y el pH en el tiempo.

 Investigue las etapas del proceso de compostaje y determine la duración de cada etapa en
este caso.

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 PRACTICA 8

AISLAMIENTO DE NEMATODOS

Los nematodos son animales invertebrados, pertenecientes al Phylum Artropoda, clase

Nematoda, la estructura que los limita se llama cutícula, esta posee 6 o 7 capas y su función es
la permeabilidad, igualmente poseen cabeza, en ella labios, papilas y una estructura
puntiaguda llamada estilete o diente órgano encargado de la alimentación primordialmente,
esófago, cavidad de segmentación y cola (Volcy C, 1977). Generalmente poseen seis estados
en sus ciclo de vida: huevo, cuatro estados larvarios y adulto, donde el primer estado larvar
ocurre dentro del huevo y cuando eclosiona, se jalla en segundo estado, y cada uno de los
cambios larvarios implica el cambio de cutícula, estilete y otros organos este proceso es
conocido como muda. Los nematodos pueden vivir en diferentes ambientes, muy fríos como
tundras, desiertos, etc. En el suelo es posible encontrar diferentes grupos de nematodos como
fitopatogenos, saprofitos, predadores, micofagos y entomopatogenos entre ellas los géneros
Meloidogyne, Panagrolaimus, Seinura, Aphelechoides y Rhabditis, respectivamente. La
importancia de estos radica en la asociación que presentan con los cultivos ya que en el caso
de Meloisogyne, causa agallas en mas de 2000 especies de plantas, asi mismo, pueden
encontrarse en el suelo siendo fauna benéfica como los que atacan a hongos e insectos. Esta
practica busca familiarizar al estudiante con la obtención de nematodos apartir de suelo y luego
brindar herramientas para el aprendizaje de la producción de estos in situ.

Para la toma de muestra puede usar diferentes es importante tomar muestras de suelo
homogeneo, con textura, humedad y temperatura similar, en el caso de un cultivo trate de
escoger lotes pequeños y uniformes en cuanto a edad, pendiente del terreno, historia, etc. Asi,
tomando muestras del mismo tamaño puede seguir cualquiera de los esquemas para el
muestreo aleatorio o estratificado (Ver Figura 8.1), en el caso de los cultivos trate de eliminar el
efecto de los bordes.

Figura 8.1. Procedimientos para toma de muestras de suelos para nematodos

Existen diferentes procedimientos para separar los nematodos del suelo como el tamizado, el
metodo de gravedad de Cobb, el metodo de la bandeja, decantación y tamizado de Christie y
Perry, y Centrifugacion-flotacion

PROCEDIMIENTO

Obtención de nematodos

Embudo de Bareman

 Realice el montaje como se muestra en la figura 8.2, tenga en cuenta que la distancia de la
lampara sea suficiente para calentar pero no para inhabilitar a los enmatodos, agregue
agua tibia al embudo hasta la mitad, acondicione una malla dentro del embudo y sobre
esta, un papel filtro, deposite 100 gramos del suelo a analizar

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 Figura 8.2 Técnica Embudo de Baermann.

 Ubique un beaker debajo de la manguera, trate de sostener la manguera con una pinza
evitando la salida del agua y encienda la lámpara, así, estimulara la migración de los
nematodos hacia el beaker.
 Luego de 24 horas, los nematodos se encontraran en el beaker.
 Realice montajes al estereoscopio agua del beaker y observe los diferentes nematodos.

Embudo de Baermann modificado

 Antes de hacer el montaje anterior mezcle 200g suelos con 3 litros de agua en un
recipiente amplio, agite la suspensión y filtrele por tamices N 60, 230, 325, (apertura 250,
63, 44µ respectivamente)
 Los residuos obtenidos en los últimos dos tamices se depositan en una toalla y se colocan
sobre el embudo.

Gravedad de Cobb

 Coloque 1kg de suelo en un balde con 8 litros de agua, remueva la suspensión y tamice
por el tamiz N 20, recogieno el agua en otro balde y realizando el ciclo por los tamices 60,
100, 230 y 325.
 Los residuos retenidos en estos tamices mezclelos y llevelos a un embudo o a una bandeja
de plástico para obtener nematodos limpios y sin partículas de suelo

Identificacion de nematodos entomopatogenos

 Adicione 1ml del agua de los nematodos aislados a papel filtro, recortado en forma de
circulo dentro de cajas de petri pequeña
 Ubique una larva de Galeria mellonella o Spodoptera frujiperda, rotule y selle muy bien,
evitando el contacto con otros insectos durante la manipulación, luego de 48 horas realice
disección de cada una de las larvas y observe los diferentes nematodos.
 Realice la identificación de los nematodos y clasifique fitopatogenos y entomopatogenos,
realizando la observación de labios y estilete, según la figura.

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Grafique todos los nematodos observados en el aislamiento y analice según las características
de suelos.

El grupo comentara la experiencia del montaje y el aislamiento.

Mediante diferentes métodos divulgue a los demás grupos, los nematodos encontrados
parasitando al insecto.

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 PRACTICA 9
MICORRIZAS.

El término micorriza describe la simbiosis de ciertos hongos con raíces de casi la totalidad de
plantas verdes; estas asociaciones representan múltiples beneficios para la planta,
principalmente derivados del aumento del área que las raíces pueden explorar para tomar los
nutrientes, otro beneficio resulta de la liberación de compuestos orgánicos por las micorrizas
vesículo-arbusculares que solubilizan los fosfatos y los hacen en consecuencia, más
disponibles.

Las micorrizas fueron descubiertas por el botánico alemán Frank apellido en 1885, en las
raíces de algunos árboles forestales; posteriomente en 1900 el francés Bernard apellido puso
de manifiesto su importancia en relación con las orquídeas, hasta ese momento las micorrizas
eran consideradas excepciones, pero ahora se sabe que esta simbiosis no se establece con
ciertas plantas en contadas excepciones.

Aproximadamente unas 5.000 especies de hongos con carpóforos (principalmente

Basidiomycetes) están asociados a árboles forestales en regiones boreales y templadas,
estableciendo un tipo de micorriza. Los dos tipos más comunes, extendidas y conocidas son
las ectomicorrizas y las endomicorrizas. Cada tipo se distingue sobre la base de la relación de
las hifas del hongo con las células radicales del hospedador. En las ectomicorrizas el micelio
invade la raíz sin entrar en el interior de las células, de aquí el nombre de ectomicorrizas. En
las endomicorrizas el micelio invade la raíz, inicialmente de manera intercelular, pero luego
penetra en el interior de las células radicales, desde la rizodermis hasta las células corticales
(enumerarVer figura).

En esta guía se presentan las metodologías básicas para el aislamiento de esporas y

determinación del porcentaje de infección de las micorriza en la raíz, las metodologías pueden
variar de acuerdo al tipo de raíz, debido a que las raíces de especies forestales requieren ser
sometidas durante un tiempo más prolongado a clarificación con KOH.

MATERIALES:
completar materiales.
 Alcohol de
 Alcohol de
 Bisturí / Asa de siembra
 Cámara de incubación

PROCEDIMIENTO:

Por grupos cada uno puede trabajar diferentes especies de plantas, detrminar el numeri de
esporas y porcentaje de infeccion, posteriormente se hacen comparaciones de los valores
obtenidos.

Para el ensayo de cuantificación de esporas debe tomar suelo rizosferico de un cultivo de

interés en la zona a una profundidad entre 10 a 20 cm.

Para la cuantifición del porcentaje de infección, debe 50 gramos de raíces aproximadamente.

Determine el pH de la muestra de suelo.

CUANTIFICACIÓN DEL PORCENTAJE DE INFECCION (Phillips  Hayman, 1970; Konke

Gemma, 1983).

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 1) Separar raíces de 2do y 3er orden
2) Cortar raices en fracciones de 2 cm
3) Sumergir raíces en tubo de ensayo con KOH al 10%
4) Llevar a Baño Maria por 15 minutos a 1 hora (dependiendo del grosor) a 90 ºC
5) Revisar periódicamente hasta observar la raíz transparente sin dañar la corteza
6) Llevar al colador con chorro suave de agua
7) Sumergir las raíces pigmentadas en peroxido al 20% (H 2O2) de 5 a 15 minutos
8) Lavar al chorro suave
9) Acidificar la raíz sumergiéndola en HCl 10% por 5-15 minutos (NO LAVAR)
10) Colorear con azul de tripan 0.05%
11) Incubar a baño maria por 5 - 15 minutos
12) Extender aproximadamente 10 raices en una lamina
13) Observar al microscopio (usar glicerol y cubrir con laminillas)
14) Determinar porcentaje de colonización.
Para el caso de endomicorrizas se determina la infección teniendo en cuenta la presencia de
hifas (H), vesículas (V), arbúsculos (A) y esporas (E) del hongo M.V.A. en la raíz. Y con los
datos obtenidos se calcula el porcentaje de infección total (IT%), según la siguiente formula:

N. de campos observados con estructuras MVA

% Infección Total = __________________________________________ x100
N. de campos observados

Para determinar el porcentaje de infección de cada una de las estructuras del hongo (MVA), se
aplica la siguiente formula:

N. de campos observados con c/u de las

estructuras de MVA
% Infección Total de (M.V.A) = ___________________________________________ x 100
N. total de campos observados

AISLAMIENTO DE ESPORAS: METODO DEL TAMIZADO HUMEDO Y CENTIFUGACION EN

GRADIENTE DE SACAROSA (Gerolema  Nicholson, 1963)

1) Pesar 20 gramos de suelo (Suelo húmedo)

2) Vaciar en beaker
3) Agregar 200 ml de agua desionizada para disgregar
4) Agregar mas agua hasta completar el volumen de 800 ml, agitar vigorosamente, sin
chispee
5) Dejar reposar por 20 segundos
6) Verter sobrenadante en tamices de 400 y 38 micrómetros
7) Repetir los pasos anteriores tres veces
8) Recolectar tamizado de 38 micrómetros en tubo de ensayo
9) Llevar a centrifugar por 3 minutos a 2700 RPM
10) Recolectar precipitado
11) Agregar sacarosa al 50%
12) Centrifugar por 5 minutos a 2700 RPM
13) Verter sobrenadante en tamiz de 38 micrómetros
14) Lavar tamizado y verterlo en una caja de petri .
15) Observar las esporas en el esteroscopio
16) Recolectar esporas y conservarlas en Meizner

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Algunas esporas encontradas en suelos del Cesar (GARCES E, et al 2006

Gigaspora ssp. (Aumento10x) Entrophospora ssp.

Sclerocystis ssp.
Glomus ssp

Hifas Intramatricales Hifas Extramatricales

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  Complete la siguiente tabla de resultados.

% INFECCION EN RAIZ POR ESTRUCTURA DEL NUMERO Y DIVERSIDAD

HONGO DE ESPORAS EN EL
PLANTA SUELO RIZOSFERICO

h.Intra, h. Extra Vesiculas Arbusc Esporas # Esporas/ Diversidad

100gr Esporas/
20gr

 Dibuje e identifique las estructuras observadas en el microscópio.

 Discuta sobre los resultados resumidos en el cuadro.
 Establezca posibles asociaciones entre las especies vegetales, las condiciones del
suelo (pH) y los datos consignados en la tabla de resultados.

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