Molecular Microbiology - 2021 - Iwadate - PaeA YtfL Protects From Cadaverine and Putrescine Stress in Salmonella - En.es

Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.
com
13652958, 2021, 6, Descargado de https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mmi.14686 por Cochrane Colombia, Wiley Online Library el [22/03/2023]. Consulte los Términos y condiciones (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) en Wiley Online Library para conocer las reglas de uso; Los artículos de OA se rigen por la Licencia Creative Commons aplicable
Recibido: 11 noviembre 2020 |Revisado: 18 enero 2021|Aceptado: 19 enero 2021
DOI: 10.1111/mmi.14686
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
PaeA (YtfL) protege del estrés de cadaverina y putrescina en

SalmonelaTyphimurium yE. coli
Yumi Iwadate|Rouhallah Ramezanifard|Yekaterina A. Golubeva|Lucas A. Fenlon|

James M. Slauch
Departamento de Microbiología, Universidad de

Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, IL, EE. UU. Abstracto
SalmonelayE. colisintetizar, importar y exportar cadaverina, putrescina y espermidina para
Correspondencia mantener los niveles fisiológicos y proporcionar homeostasis del pH. Tanto los niveles
James M. Slauch, Departamento de intracelulares bajos como los altos de poliaminas confieren fenotipos pleiotrópicos o letalidad.
Microbiología, Universidad de Illinois en
Urbana-Champaign, 601 S. Goodwin Ave, Aquí, demostramos que la proteína de membrana interna PaeA (YtfL) previamente no
Urbana, IL, 61801, EE. UU. caracterizada es necesaria para reducir las concentraciones citoplasmáticas de cadaverina y
Correo electrónico: slauch@illinois.edu
putrescina. Nosotros identificamospaeacomo un gen implicado en la supervivencia de la fase
La dirección actual estacionaria cuando las células se cultivaron inicialmente en medio ácido, en el que producen
Luke A. Fenlon, Departamento de Medicina
Interna, Facultad de Medicina de la Universidad cadaverina. Elpaea el mutante también es sensible a la putrescina, pero no a la espermidina ni a
de Utah, Salt Lake City, UT, EE. UU. la espermina. La sensibilidad a la cadaverina externa en fase estacionaria solo se observa a pH >
Información de financiación
8, lo que sugiere que las poliaminas deben desprotonarse para difundirse pasivamente en el
Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades citoplasma celular. En ausencia de PaeA, los niveles de poliamina intracelular aumentan y las
Infecciosas, Número de concesión/premio: AI123381
células pierden viabilidad. La degradación o modificación de las poliaminas no es relevante. La
expresión ectópica del conocido exportador de cadaverina, CadB, en fase estacionaria suprime
parcialmente lapaeafenotipo, y la sobreexpresión de PaeA en fase exponencial complementa
parcialmente uncadBmutante cultivado en medio ácido. Estos datos apoyan la hipótesis de que
PaeA es un exportador de cadaverina/putrescina, reduciendo niveles potencialmente tóxicos
bajo ciertas condiciones de estrés.
PALABRAS CLAVE
cadaverina, poliaminas, putrescina,Salmonela, fase estacionaria
1|INTRODUCCIÓN que posteriormente se acidifican y maduran en fagolisosomas tras la

entrega o producción de varios efectores antimicrobianos, incluidos el
Salmonella entericaes un importante patógeno transmitido por los alimentos superóxido y el óxido nítrico (Slauch, 2011). No tenemos una comprensión
que causa aproximadamente 1,2 millones de infecciones cada año en los completa de los sistemas adicionales de tolerancia al estrés necesarios
Estados Unidos (Scallan et al., 2011). ingeridoSalmonelacolonizan el epitelio del paraSalmonelasobrevivir y replicarse dentro de los macrófagos.
intestino delgado e inducen diarrea inflamatoria e invasión bacteriana, lo que Las poliaminas se encuentran en los tres dominios de la vida. Interactúan
lleva a la diseminación sistémica (Darwin & Miller, 1999; Tsolis et al., 1999; Wallis con moléculas cargadas negativamente, como ácidos nucleicos y fosfolípidos.
& Galyov, 2000; Zhou & Galan, 2001). El mas serio SalmonelaLa enfermedad De hecho, se estima que más de la mitad de las poliaminas en la célula existen
resulta de esta infección extraintestinal (Feasey et al., 2012; Pegues & Miller, en complejos de poliamina-ARN (Miyamoto et al., 1993). Fisiológicamente, las
2010), cuyo sello distintivo es la capacidad deSalmonelapara sobrevivir en poliaminas se han implicado en numerosos procesos celulares en bacterias,
macrófagos (Burton et al., 2014; Fenlon & Slauch, 2014). Los macrófagos como el crecimiento en condiciones anaeróbicas, la síntesis de sideróforos, la
engullen bacterias en fagosomas, síntesis de peptidoglicanos, la formación de biopelículas,
Microbiología Molecular.2021;115:1379–1394. wileyonlinelibrary.com/journal/mmi |

© 2021 John Wiley & Sons Ltd 1379
|
1380 IWADATEET Al.
motilidad de enjambre, resistencia al estrés oxidativo y resistencia al estrés Salmonelano puede sintetizar espermina (Tabor & Tabor, 1985). La
ácido (Chattopadhyay et al., 2003, 2009; Kurihara et al., 2009a; Michael, 2018; cadaverina y la putrescina se pueden degradar a succinato a través de la
Park et al., 1996). Las poliaminas también afectan el ensamblaje de los vía de degradación de la lisina (Knorr et al., 2018; Schneider & Reitzer,
ribosomas, el inicio de la traducción y la fidelidad de la traducción (Igarashi & 2012). En contraste conmi.coli,Salmonella entericano tiene la segunda
Kashiwagi, 2015, 2018). De hecho, se ha propuesto que las alteraciones en los ruta de degradación de putrescina mediada por PuuABCD (Schneider &
niveles de poliamina afectan la traducción de un subconjunto de proteínas Reitzer, 2012). La espermidina se convierte en N-acetilespermidina
críticas para la fisiología celular general y la respuesta al estrés (Igarashi & mediante SpeG (Fukuchi et al., 1995), pero no se conoce ningún otro
Kashiwagi, 2015, 2018; Sakamoto et al., 2020). mecanismo de degradación.
La espermidina y la putrescina se encuentran ampliamente en las La cadaverina es exportada por el antiportador lisina:cadaverina CadB
bacterias (Michael, 2018).Salmonella entericayE. colise encuentran entre (Soksawatmaekhin et al., 2004), la putrescina es excretada por el antiportador
las bacterias que también producen cadaverina (Chattopadhyay et al., ornitina:putrescina PotE (Kashiwagi et al., 1997), y la espermidina es excretada
2009; Gale & Epps, 1944; Park et al., 1996).Salmonelatiene sistemas para la por MdtJI (Higashi et al., 2008). Más recientemente, Hassan et al. AceI
captación, exportación, síntesis y degradación de poliaminas (Figura 1). identificado enAcinetobacter baumanniicomo exportador de cadaverina/
Salmonelasintetiza cadaverina a partir de L-lisina mediante la lisina putrescina (Hassan et al., 2019). El homólogo putativo enSalmonela(
descarboxilasa LdcC expresada constitutivamente (Yamamoto et al., STM14_3648) no se ha caracterizado. El transportador ABC PotABCD importa
1997), o la CadA inducible por ácido (Gale & Epps, 1944; Park et al., 1996) preferentemente espermidina y también puede transportar putrescina
(ver más abajo). La putrescina se sintetiza a partir de larginina por SpeA y (Igarashi et al., 2001), mientras que el transportador ABC PotFGHI
SpeB oa partir de L-ornitina por SpeC o el inducible SpeF (Michael, 2016; aparentemente es específico para la putrescina (Igarashi et al., 2001). PlaP es un
Tabor & Tabor, 1985). La espermidina se sintetiza a partir de S-adenosil-L- simportador de putrescina:protón (Kurihara et al., 2011).Salmonelano codifica el
metionina descarboxilada y putrescina por SpeE (Bowman et al., 1973; importador de putrescina PuuP identificado enE. coli(Kurihara et al., 2009b).
Tabor & Tabor, 1987).
periplasma
Maceta GRAMOHIF aPAG

por favor PAG
opestaña CD SOY
Citoplasma
L-arginina
Habla
L-lisina L-ornitina agmatina
ldc CadA SpeF Especificaciones SpeB
SpeE
cadaverina putrescina espermidina
PatA
PatD SpeE SpeG
PatA
GabT
PatD
GabD Aminopropilo GabT N-acetilo
CsiID cadaverina GabD espermidina
LhgO
- cetoglutarato succinato
+ succinato
Citoplasma
dB
California PaéA S T M14_3 648? PAG
ote dtJI
METRO SOY
periplasma
FIGURA 1Vías conocidas del metabolismo de las poliaminas enSalmonella enterica. Las líneas azules representan vías sintéticas, las líneas verdes
representan vías de degradación o modificación y las líneas naranjas representan vías de transporte.
|1381
IWADATEET Al.
En condiciones ácidas in vitro, el sistema de resistencia al estrés ácido un Δ en el marcomsracepa en medio LB de pH 5 no tamponado con nitrito
dependiente de lisina CadAB se induce transcripcionalmente. CadA (LB5N) o sin nitrito (LB5) y se midió su crecimiento y supervivencia. Como se
descarboxila la lisina para producir cadaverina, que es secretada por CadB muestra en la Figura 2b, c, todas las cepas mostraron un mayor retraso cuando
(Park et al., 1996). Durante este proceso, se consume un protón y se se cultivaron LB5N, pero no hubo una diferencia general en el crecimiento
produce un dióxido de carbono, y se secreta la diamina protonada, que hasta la fase estacionaria entre las cepas. Después de la entrada en fase
ayuda a neutralizar el pH citoplasmático (Park et al., 1996). Dentro del estacionaria, el Δpaeael mutante perdió viabilidad durante 24 horas cuando se
fagosoma del macrófago,Salmonelaestá expuesto a estrés ácido, pH 5 a cultivó en medio LB5. El efecto fue mayor cuando las células crecieron en LB5N.
5.5. sin embargo, elcadBAlos genes permanecen reprimidos y el No hubo efecto sobre la viabilidad en fase estacionaria cuando el paeael
citoplasma se vuelve ácido (Chakraborty et al., 2015). Mantener el mutante se cultivó en medio LB de pH 7 (LB7), con o sin nitrito (Figura 2d, e).
citoplasma ácido es importante para mejorar la regulación al alza Introducción de un plásmido de baja copia que codifica PaeA (pWKS30-paea) en
prolongada de lassrABsistema de dos componentes, que regula el sistema elpaeamutante complementó el defecto de supervivencia en LB5N (Figura 2f).
de secreción SPI2 tipo III y sus genes efectores (Chakraborty et al., 2015), Estas observaciones revelaron que paea,que codifica una supuesta proteína de
necesarios para la supervivencia en el fagosoma (Jennings et al., 2017). No membrana interna no caracterizada, es importante para la supervivencia en la
está claro si existen otras razones paraSalmonelapara reprimir los genes fase estacionaria cuando las células se cultivan en medio LB de pH 5,
responsables de la producción de poliaminas en el fagosoma, y si esto especialmente en presencia de nitrito.
afecta aún másSalmonelavirulencia. Aunque la pérdida de viabilidad en fase estacionaria en elpaeamutante
Estamos interesados en las rutas metabólicas importantes para la depende del crecimiento inicial a pH 5, este fenotipo se ve reforzado por el
supervivencia deSalmonelaen el fagosoma. Nos enfocamos en la región nitrito, lo que sugiere que el óxido nítrico podría estar involucrado en la
genómica que codificaytfL. Estudios previos enmi.colidemostró queytfK ySra. A, sensibilidad. Para probar esta hipótesis, determinamos si los secuestrantes de
codificado a ambos lados deytfLson importantes para la tolerancia al estrés óxido nítrico o las metionina sulfóxido reductasas, importantes para la
relacionado con nitratos y nitritos, respectivamente (Iwadate & Kato, 2017; St tolerancia al estrés por óxido nítrico (St John et al., 2001; Vine & Cole, 2011),
John et al., 2001). Se sabe que la adición de nitrito aumenta el estrés ácido tenían algún efecto sobre el fenotipo. Como se muestra en la Figura S1a,b,
(Muhlig et al., 2014). Eliminamos estos genes e investigamos la supervivencia de ninguno de los mutantes de deleción simple o quíntuple de los genes
mutantes en medio ácido con nitrito. Aunque ninguno de los mutantes mostró secuestradores de óxido nítrico,hmpA, norW, hcp, nrfA, ynirBD, ni los mutantes
defectos en el crecimiento, encontramos queytfL es responsable de la de deleción simple o cuádruple de los genes de metionina sulfóxido reductasa,
supervivencia de la fase estacionaria cuando las células se cultivan en medio msrA, msrB, msrC,ymsrpq, mostró pérdida de viabilidad en fase estacionaria en
ácido con nitrito. Análisis posteriores mostraron que, en el ytfLmutante, las estas condiciones, ni las mutaciones afectaron al fenotipo causado por la
poliaminas cadaverina o putrescina pueden acumularse en altas deleción depaeaen estos fondos. Las cepas que carecían de la óxido nítrico
concentraciones en el citoplasma, provocando la pérdida de viabilidad en la dioxigenasa HmpA, el eliminador primario de óxido nítrico en presencia de
fase estacionaria. La explicación más sencilla es que YtfL actúa como oxígeno (Gardner & Gardner, 2002), crecieron hasta una CFU más baja a las 12
exportador de poliaminas, aunque no podemos descartar algún efecto h después de la incubación en medio LB5N y, por lo tanto, la proporción de CFU
indirecto sobre las concentraciones de cadaverina/putrescina. Hemos (CFU en 36 horas después de la incubación/CFU a las 12 horas después de la
renombrado elytfL genepaea, paraPAG olya míomi exportar incubación) fue más alto que el de tipo salvaje, pero elpaeaderivado aún perdió
viabilidad en fase estacionaria. Estos resultados sugirieron que los
secuestrantes de óxido nítrico y las metionina sulfóxido reductasas no son

2| RESULTADOS responsables de la supervivencia en la fase estacionaria cuando las cepas se
cultivan en LB5N. Por lo tanto, aunque la adición de nitrito al medio mejora la

2.1| AΔpaeamutante pierde viabilidad en estacionario paeafenotipo en fase estacionaria (Figura 2b,c), parece ser un efecto indirecto y
cuando se cultiva en medio LB de pH 5 con nitrito no dependiente del óxido nítrico per se.
El óxido nítrico es producido por los macrófagos (MacMicking et al., 1997)

y se sabe que es importante para controlarSalmonelainfección
(Chakravortty et al., 2002; Vázquez-Torres et al., 2000). AmbosytfK ymsra 2.2|ElΔpaeael mutante es sensible al sobrenadante de
se han implicado en la resistencia a las especies nitrogenadas reactivas cultivos en fase estacionaria cultivados en medio LB
(Iwadate & Kato, 2017; St John et al., 2001). Elpaea(ytfL) el gen se pH5 con nitrito
encuentra entreytfKymsra(Figura 2a). Los datos transcriptómicos sugieren
quepaease transcribe tanto de su propio promotor como a través de la Luego abordamos la pregunta de por qué la pérdida de viabilidad en la fase
lectura delmsrapromotor, con un aumento en la transcripción cuando estacionaria en el Δpaeala tensión se observa sólo cuando las células se cultivan
Salmonelase está replicando en los macrófagos (Kroger et al., 2013; en LB5 pero no en LB7. Primero, preguntamos si la diferencia inicial en el pH de
Srikumar et al., 2015). En condiciones ácidas, el nitrito se convierte en los medios altera el pH en la fase estacionaria y, por lo tanto, la supervivencia
óxido nítrico in vitro (St John et al., 2001). Para ver el efecto de las del Δpaeacepa. Como se muestra en la Figura S2a–d, todos los cultivos de LB sin
eliminaciones depaeaoseñoraAsobre la sensibilidad al nitrito en tampón alcanzaron un pH de ~8,8 independientemente de la cepa, el pH inicial
condiciones ácidas, cultivamos de tipo salvaje, un Δpaea::Cm tensión, o o la presencia de nitrito. Esto es como se esperaba en LB,
|
1382 IWADATEET Al.
(a) ytfK paea (ytfL) msra
(b) 0 (C) 0
1 1.E +10
1 1.E +10
Tipo salvaje Tipo salvaje

10
1.E +099 ∆msra 100 9
1.E + 9
∆msra
∆paea
UFC 10
1.E +088
***
*** 100 8
1.E + 8 ***
UFC
10
1.E +077
100 7
1.E + 7
∆paea
10
1.E +066
100 6
1.E + 6
***
100+55
***
10+055
1.E 1.E
LB5 LB5N
10
1.E +044
100 4
1.E + 4
0 12 24 36 48 0 12 24 36 48
Tiempo (h) Tiempo (h)
(d) (mi)
1010 Tipo salvaje 10 1.E +10
Tipo salvaje
∆paea ∆paea
109 100+99
1.E
∆msra ∆msra
108 100 8
1.E + 8
UFC
UFC
107 100 7
1.E + 7
106 100 6
1.E + 6
105 100 5
1.E + 5
LB7 LB7N
104 0+044
1.E
0 12 24 36 48 0 12 24 36 48
Tiempo (h) Tiempo (h)
NS
(F) **
1.E1+10
0 10
1.E+09
1.E1+088
12h
LB5N
UFC
1.E+07
36h
1.E1+066
1.E+05
1.E1+044
peso ∆paea ∆paea
pWKS30 pWKS30 pagpaea
FIGURA 2El Δpaeamutante pierde viabilidad en fase estacionaria cuando crece en medio pH 5 LB. (a) Elpaealugar geométrico (a escala). (be) Las células se
cultivaron en pH 7 LB (LB7), pH 5 LB (LB5), o cada medio con nitrito 2 mM (LB7N, LB5N). Después de 12, 24, 36 y 48 horas, las diluciones apropiadas se sembraron
en placas de glucosa LB para determinar las CFU. Símbolos: cuadrados, tipo salvaje; círculos, Δpaea; triángulos, Δmsra. (f) Supervivencia en fase estacionaria de las
cepas indicadas que contienen el vector o pWKS30-paeaplásmido cultivado en LB5N. Los valores se informan como media±desviación estándar, dondenorte=3. Sin
emparejartlas pruebas comparan la cepa de tipo salvaje con Δpaeacepa o como se indica en el panel F. (NS No significativo, *pag< .05, **pag< .005, ***pag< .
0005). Cepas utilizadas: 14028, JS2430, JS2431, JS2452, JS2453 y JS2454
dado el hecho de que los péptidos son la principal fuente de carbono, lo que indicó que el ΔpaeaLa cepa es sensible a algún compuesto en el medio de
resulta en la liberación de amoníaco (Sezonov et al., 2007). Así, el efecto del pH cultivo producido cuando las células se cultivan en LB5N.
inicial del medio sobre la supervivencia de los Δpaeatensión en la fase Para comprender mejor la toxicidad del sobrenadante de cultivos LB5N en
estacionaria no se debe a ninguna diferencia en el pH del medio de la fase fase estacionaria, examinamos el efecto del pH del sobrenadante durante la
estacionaria. incubación en fase estacionaria. de tipo salvaje o ΔpaeaLas células en fase
En segundo lugar, preguntamos si era el crecimiento de Δpaeacepa en estacionaria cultivadas en LB7 se suspendieron en las soluciones
LB5N o el medio resultante que confirió pérdida de viabilidad en fase sobrenadantes de LB5N con pH ajustado y se incubaron durante 24 horas a 37
estacionaria. Para hacerlo, cambiamos las células y los medios de cultivos que °C. Como se muestra en la Figura 3c, el efecto tóxico del sobrenadante en el Δ
crecieron en LB7 o LB5N (Figura 3a). Como se muestra en la Figura 3b, el Δpaea paeaLa cepa se observó sólo cuando el pH estaba entre 8,5 y 9,5. También
las células perdieron viabilidad cuando se suspendieron en medio comprobamos si la toxicidad del sobrenadante es dosis-dependiente. Como se
acondicionado a partir de células cultivadas en LB5N, independientemente de si muestra en la Figura 3d, el efecto tóxico del sobrenadante LB5N se observó con
el Δpaealas células se cultivaron inicialmente en LB5N o LB7. Estos resultados poca pérdida de actividad cuando se diluyó al 20 %.
|1383
IWADATEET Al.
FIGURA 3El Δpaeael mutante es sensible al (a) Sobrenadantes

sobrenadante de cultivos en fase estacionaria
desarrollados en medio LB de pH 5 con nitrito. (a) Crecimiento Crecimiento
El tipo salvaje y Δpaea las cepas se cultivaron Medio Medio

durante 12 h en LB7 o LB5N. Las células se LB7 LB5N
eliminaron por centrifugación y el sobrenadante
de los cultivos de tipo salvaje se filtró. Las células
peso peso
se lavaron y suspendieron en el sobrenadante
Células Células
indicado (tiempo 0) y se incubaron a 37 °C
durante 24 horas. Las UFC se determinaron a las
0 y 24 horas con los resultados que se muestran
en el panel B. (b) Las células son de tipo salvaje o
Δpaeacepa cultivada 12 h en LB7. El ∆paea ∆paea
sobrenadante proviene de un cultivo LB5N de Células Células
tipo salvaje que se mezcló 1:1 con solución salina

que contenía tampón MES 100 mM (pH 5,5 o 6,0),
12 horas 12 horas
tampón MOPS (pH 7,0, 8,0 u 8,5) o tampón CAPS Culturas
Células Flotante Células
Culturas
(pH 9,0 o 9,5) . Las UFC se determinaron a las 0 y 24 horas a 37°C
24 h. (c) El Δpaealas células se suspendieron en
solución salina tamponada con CAPS de pH 9,0 (b)1010
que contenía el porcentaje indicado de
Relación de UFC (24h / 0h)
sobrenadante LB5N de tipo salvaje. Símbolos: 100.1-1

cuadrados, tipo salvaje; círculos, Δpaea. Los
valores se informan como media±desviación 01.01-2
estándar, dondenorte=3. Sin emparejartlas ***
pruebas comparan la cepa de tipo salvaje con la 0.0101-3 ***

Δpaeacepa. Para panel D, emparejadotlas
0.00101-4
pruebas comparan cada condición con 0% de
LB7 LB5N LB7 LB5N Sobrenadante WT
sobrenadante (*pag< .05, **pag< .005,
+-+-+-+- paeaGenotipo de células

*** pag< .0005). Cepas utilizadas: 14028 y
JS2430 LB7 LB5N Condiciones de crecimiento celular
(C) (d)
1.E1
+ 0000 100
1.E-01 Tipo salvaje
1.E1-02-2 10-1
**
1.E-03
1.E1-04-4
** **
10-2
1.E-05
1.E1-06-6
∆paea 10-3
1.E-07 ** **
***
∆paea
1.E1-08-8 * ** *
1.E-09 10-4
5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 80
pH % (v/v) de sobrenadante en tampón
en solución salina tamponada de pH 9. La actividad se redujo significativamente con el 10 % Tampón pH 9, en fase estacionaria Δpaeacélulas. Como se muestra en la
de sobrenadante y se perdió por completo con el 5 % de sobrenadante. Figura S3, la adición de lisina al cultivo inicial aumentó significativamente
la toxicidad del sobrenadante resultante. Ninguno de los otros 19
aminoácidos tuvo ningún efecto. Cuando se agregó lisina al medio
2.3|La toxicidad del sobrenadante depende de la acondicionado, en lugar del cultivo inicial, no se observó el aumento de la
producción de cadaverina inducible por ácido toxicidad del sobrenadante (Figura S3). Estos resultados implicaban que
un compuesto elaborado a partir de o con lisina es responsable de la
En un intento por determinar qué compuesto en el sobrenadante era toxicidad del sobrenadante.
responsable de la toxicidad, preguntamos si la suplementación con algún EnSalmonela, la lisina juega un papel importante en la tolerancia al
aminoácido en particular en el cultivo original afectaría la producción del estrés ácido; La descarboxilación de lisina en cadaverina mediada por
compuesto tóxico. Cultivamos células de tipo salvaje hasta la fase estacionaria CadA neutraliza el pH citoplasmático (Park et al., 1996). Presumimos que
en LB5N en la que agregamos uno de los 20 aminoácidos al 0,4%. Luego la adición de lisina en LB5N mejora la producción de cadaverina y este
probamos el efecto de los sobrenadantes resultantes, diluidos 1:20 en proceso es necesario o responsable de la acumulación de la
|
1384 IWADATEET Al.
la cepa de tipo salvaje; la supervivencia de Δpaeacepa en presencia de

1010
cadaverina 0,75 mM igualó a la cepa de tipo salvaje en presencia de
cadaverina 7,5 mM. Estos resultados indicaron que la eliminación depaea
100. 1-1
aumenta drásticamente la sensibilidad a la cadaverina en fase
estacionaria. Estos resultados también apoyan la suposición de que se
0.1001-2
trata de cadaverina producida por tipo salvaje opaeacepas cultivadas en
*** ***
LB5N que es la sustancia tóxica en el sobrenadante del cultivo.
0.01001-3
peso ∆paea∆cadBA∆cadBA peso ∆paea∆cadBA∆cadBA Salmonelasintetiza putrescina y espermidina, así como cadaverina (Tabor &
∆paea ∆paea
Tabor, 1985). NiSalmonelanimi.colisintetizar espermina (Tabor & Tabor, 1985),
Sobrenadante de tipo salvaje ∆cadBAFlotante
pero pueden encontrar espermina en el medio ambiente. Determinamos si un Δ
paeaLa cepa es sensible específicamente a la cadaverina o, más ampliamente, a

FIGURA 4 ElcadBASe requieren genes para la toxicidad de
las poliaminas. Como se muestra en la Figura 5c, cuando la fase estacionaria de
flotante. Los sobrenadantes son de tipo salvaje o ΔcadBA cepa cultivada en
LB5N. Las cepas indicadas se cultivaron en LB7, luego, las células se tipo salvaje y Δpaeacepas fueron tratadas con putrescina a pH 9, el ΔpaeaLa
suspendieron en un total de 5 ml de tampón CAPS (pH 9,0) que contenía el cepa mostró una pérdida dramática de viabilidad en relación con el tipo salvaje
sobrenadante indicado (4 ml) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Los valores de una manera dependiente de la concentración. De manera análoga a lo que
se informan como media±desviación estándar, donde norte=3. Sin emparejart
se observó con cadaverina, la cepa de tipo salvaje también fue sensible a la
las pruebas comparan las cepas de tipo salvaje e indicadas en la misma
putrescina, pero solo a concentraciones más altas. Estos resultados indican que
condición (*pag< .05, **pag< .005, ***pag< .0005). Cepas utilizadas: 14028,
lapaeael mutante muestra una mayor sensibilidad tanto a la cadaverina como a
JS2430, JS24304 y JS2456
la putrescina en concentraciones similares y en grados similares.
compuesto tóxico en el sobrenadante. Por lo tanto, hicimos un ΔcadBA cepa y
comprobaron la toxicidad del sobrenadante tras el crecimiento de esta cepa en En contraste con lo observado anteriormente, el tipo salvaje y Δpaealas
LB5N. Como se muestra en la Figura 4, el sobrenadante de la ΔcadBAel cultivo cepas fueron igualmente sensibles a la espermidina y la espermina de una
no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia del Δpaeatensión en fase manera dependiente de la concentración, siendo la sensibilidad
estacionaria. Tenga en cuenta que el ΔcadBAΔpaeacepa permaneció sensible al aproximadamente igual en grado a la observada con la cepa de tipo salvaje
sobrenadante del cultivo de tipo salvaje. Por lo tanto, el sistema CadAB se tratada con cadaverina (Figura 5d,e). Estas observaciones se correlacionan con
requiere para la producción del compuesto tóxico, pero no está involucrado en las similitudes y diferencias estructurales en estos cuatro compuestos (Figura
la sensibilidad de un Δpaeamutante per se. 5f), y sugieren que elpaeamutante no es simplemente sensible a las poliaminas,
Los resultados anteriores sugieren que la cadaverina, producida y sino más específicamente a la cadaverina y la putrescina.
exportada por CadAB, es tóxica para el Δpaeamutante en fase estacionaria. Por El efecto tóxico del sobrenadante en Δpaeadependía del pH
lo tanto, medimos los niveles de poliamina en los cultivos mediante LC/MS (Figura 3b). Probamos si la toxicidad de la cadaverina también
(Figura S4a). Las células produjeron muy poca espermidina, depende del pH. Como se muestra en la Figura 5g, el ΔpaeaLa cepa
independientemente de las condiciones de cultivo o del tiempo de incubación. es sensible a la cadaverina solo cuando el pH de la solución osciló
La producción de putrescina osciló entre 0,3 y 0,6 mM, de nuevo en gran entre 8,5 y 9,5. La sensibilidad muy reducida de la cepa de tipo
medida independiente del pH del medio. Por el contrario, la cadaverina fue salvaje también dependía del pH, solo se observó a pH 9,5. En
inferior a 0,5 mM en LB7, pero aumentó a >2 mM en LB5 con un aumento ausencia de cadaverina, las tasas de supervivencia del Δpaeay las
adicional cuando las células se cultivaron en LB5N durante 24 horas. Este cepas de tipo salvaje en soluciones de pH creciente eran
aumento de la producción dependía de CadAB. indistinguibles. Así, como se vio para los sobrenadantes tóxicos, la
sensibilidad a la cadaverina depende del pH.
También medimos las sensibilidades de tipo salvajeE. colicepa
2.4|ElΔpaeala cepa es sensible a la cadaverina y la MG1655 y un Δpaeacepa a cadaverina y putrescina. Como se muestra en
putrescina, pero no a la espermina ni a la espermidina a pH 9 la Figura complementaria S5, la eliminación depaeaenE. coliresultó en una
mayor sensibilidad a la cadaverina y la putrescina, pero no a la
Para probar directamente la hipótesis de que Δpaeason sensibles a la espermidina y la espermina. Estos resultados sugieren que se conserva la
cadaverina en fase estacionaria, agregamos cadaverina en varias función de PaeA en la tolerancia a las poliaminas.
concentraciones al tampón de pH 9 y monitoreamos la viabilidad del tipo Proponemos que la dependencia del pH está relacionada con el pKa
salvaje y Δpaeacepa. Como se muestra en la Figura 5a, el Δpaea la cepa fue de los grupos amino de cadaverina (pKa = 10,25 y 9,13). Bajo estas
sensible a cadaverina 0,5 mM. La sensibilidad aumentó de manera dependiente condiciones básicas, una fracción de los grupos amino de la cadaverina se
de la concentración, alcanzando un máximo en concentraciones de cadaverina desprotona, lo que la deja sin carga y permeable a la membrana.
de 2,5 mM o superiores con una pérdida logarítmica de 8 en la viabilidad. Este Teóricamente, a pH 9, se desprotona el 2,7% de la cadaverina. A medida
fenotipo se complementó cuando PaeA se expresó a partir de un plásmido que la cadaverina ingresa al citoplasma bacteriano, se protonaría y
(Figura 5b). La cepa de tipo salvaje también mostró sensibilidad a la cadaverina cargaría. Si es cierto, esto implica que (1) la toxicidad es causada por
en fase estacionaria, pero solo a concentraciones más altas. De hecho, el Δpaea cadaverina en el citoplasma y (2) el transporte al citoplasma es pasivo. La
cepa es ~ 10 veces más sensible en comparación con putrescina se comportaría de manera similar.
|1385
IWADATEET Al.
(a) (b)
100 100 ∆paeapagpaea
1.E-01 cadaverina
1.E-1002-2 1.E-1001-1 pWKS30 de tipo salvaje

1.E-03
***
*
Relación UFC (24h/0h)

1.E-1002-2
1.E-1004-4
Relación de UFC (24h/0h)

1.E-05 ** Tipo salvaje 1.E-1003-3 *
1.E-1006-6 **
1.E-07 ** 10-4
*** 1.E-04 ** ∆paeapWKS30
1.E-1008-8
***
** * ∆paea
10-5 cadaverina
1.E-09 1.E-05
0 2.5 57.5 10 0 0.25 0.5 0.75 1
Cadaverina (mM) Cadaverina (mM)
(C) (d
1.E+10000 1.)E+1000 0
1.E-01 * putrescina 1.E-01 espermidina

*
1.E-1002-2 1.E1
- 002-2

1.E-03 1.E-03
10-4
1.E-04
***
Tipo salvaje 1.E1 *

- 004-4
1.E-05 *** 1.E-05 * Tipo salvaje

1.E-1006-6 1.E1
*** ***
- 006-6
∆paea
1.E-07 ** ∆paea 1.E-07
1.E-1008-8 1.E1
- 008-8
1.E-09 1.E-09
0 2.5 5 7.5 10 0 2.5 5 7.5 10
(mi) Putrescina (mM) Espermidina (mM)
1.E+10000
(F)
H2norte NUEVA HAMPSHIRE2
1.E-01 espermina cadaverina
1.E-1002-2
1.E-03 hn
NUEVA HAMPSHIRE
2
1.E-1004-4 putrescina
2
1.E-05 Tipo salvaje H

1.E-1006-6 ∆paea norte
NUEVA HAMPSHIRE2
H2norte
1.E-07 espermidina
1.E-1008-8 H
1.E-09 norte
NUEVA HAMPSHIRE2
0 2.5 5 7.5 10 hn2 norte
Espermina (mM) Hespermina

(gramo) (h)
1.E+10000 1.E+10000
1.E-01 1.E-01
1.E-1002-2 Tipo salvaje 1.E-1002-2

**
1.E-03 1.E-03
1.E-1004-4 *** 1.E-1004-4
1.E-05 1.E-05
1.E-1006-6 1.E-1006-6
1.E-07 1.E-07 Tipo salvaje
1.E-1008-8
cadaverina ∆paea 1.E-1008-8
Sin poliaminas ∆paea
1.E-09 *** 1.E-09
5 6 7 8 9 10 5 6 7 8 9 10
pH pH
FIGURA 5El Δpaeamutante es sensible a cadaverina y putrescina, pero no a espermidina y espermina. Las cepas indicadas se cultivaron durante 12 h en
LB7, luego se suspendieron en 5 ml de tampón CAPS (pH 9,0) que contenía la cantidad indicada de (a y b) cadaverina, (c) putrescina, (d) espermidina o (e)
espermina y se incubó a 37°C durante 24 horas. (f) Estructura de cadaverina, putrescina, espermidina y espermina. ( g ) El efecto del pH en la
supervivencia del tipo salvaje y Δpaeacepas mutantes en presencia de cadaverina 0,625 mM y (h) en ausencia de cadaverina. Símbolos: cuadrados
abiertos, tipo salvaje; círculos abiertos, Δpaea; cuadrados cerrados, vector pWKS30 que alberga de tipo salvaje; círculos cerrados, Δpaeaque alberga el
vector pWKS30; triángulos cerrados, ΔpaeaalbergandopaeapWKS30-placZ-paea. Los valores se informan como media±desviación estándar, dondenorte=
3. Sin emparejartlas pruebas comparan el tipo salvaje y Δpaeapresiones (*pag< .05, **pag< .005, ***pag< .0005). Cepas utilizadas: 14028, JS2430, JS2452,
JS2453 y JS2454
2.5|Evidencia de cadaverina o putrescina citoplásmica introducción de un pWKS30-cadBplásmido en un ΔpaeaLa cepa suprimió

alta como base para la toxicidad parcialmente su sensibilidad a la cadaverina en comparación con la Δpaea
cepa que alberga el vector pWKS30. La supresión de la cadBAgenes en el Δ
Para distinguir aún más si PaeA protege a la célula de la cadaverina paeamutante resultó en una mayor sensibilidad a la cadaverina (Figura
citoplasmática o de la cadaverina extracitoplasmática, verificamos si S6b). Introducción del pWKS30-cadB plásmido suprimió esta sensibilidad
la expresión exógena de la bomba de salida de cadaverina CadB adicional en el Δpaeacepa (Figura S6b). Estos resultados apoyan la
suprime la sensibilidad. Como se muestra en la Figura S6a, el conclusión de que la célula es
|
1386 IWADATEET Al.
sensible a la cadaverina intracelular. La pérdida del exportador de cadaverina CadB PaeA podría desempeñar algún papel en la degradación de
aumenta la sensibilidad, mientras que la expresión ectópica de CadB suprime cadaverina. El Salmonelael genoma codifica ortólogos paraE. coliproteínas
parcialmente la sensibilidad. PatA, PatD, GabT, GabD, CsiD y LhgO, que se sabe que están involucradas
PaeA protege el citoplasma de cadaverina y putrescina. Presumimos varios en la degradación de cadaverina a succinato (Knorr et al., 2018) (Figura 1).
mecanismos para la tolerancia a la cadaverina. PaeA podría (1) prevenir el flujo Construimos un ΔpatAΔPatDΔcsiD-csiRcepa (Δdeg) que carece de todos los
de entrada, (2) promover el flujo de salida, (3) promover la degradación o genes involucrados en la degradación de cadaverina y monitoreó la
modificación, (4) o afectar la toxicidad per se. Nos propusimos probar estas sensibilidad a cadaverina en esta cepa y en un isogénicopaeamutante
diversas hipótesis. Como se muestra en la Figura S8, la cepa Δdeg fue resistente a cadaverina
La dependencia del pH de la sensibilidad tanto a la cadaverina como a 1 mM. Esto muestra que no es simplemente la degradación de cadaverina
la putrescina implica que se requiere la desprotonación del compuesto. La lo que protege a las células de tipo salvaje. Eliminación depaeaen el fondo
interpretación más sencilla es que se requiere la desprotonación de las de degradación defectuosa confirió sensibilidad. Cabe señalar que Δdeg Δ
poliaminas para su entrada pasiva en la célula a través de la membrana paea cepa exhibió una mayor sensibilidad a cadaverina que Δpaeacepa
citoplasmática. Aunque teóricamente es posible que PaeA bloquee de (Figura S8). Presumiblemente, esto se debe a que la concentración de
alguna manera esta entrada pasiva, es difícil imaginar un mecanismo cadaverina es mayor en ausencia de degradación.
molecular para tal acción. A continuación, examinamos si la modificación de cadaverina o
Una vez dentro de la célula, las poliaminas se protonarían. Luego podrían putrescina está involucrada en la tolerancia dependiente de PaeA. Se sabe
ser bombeados fuera del citoplasma. Una consecuencia potencial es un que la putrescina se convierte en espermidina por la propilamina
aumento del pH citoplasmático, que podría ser tóxico. De hecho, el aumento transferasa SpeE (Bowman et al., 1973); SpeE también puede convertir
del pH citoplasmático es la razón por la cual la cadaverina normalmente se cadaverina en aminopropilcadaverina (Bowman et al., 1973). El donante
produce y bombea en condiciones ácidas (Park et al., 1996). Un argumento en de propilamina, S-adenosilmetionina descarboxilada, lo fabrica SpeD
contra de este mecanismo de toxicidad es el hecho de que la sobreproducción (Markham et al., 1982; Tabor & Tabor, 1987). SpeG puede modificar aún
del exportador cadaverino CadB suprime la sensibilidad en elpaeamutante más la espermidina a N-acetilespermidina (Fukuchi et al., 1994; Matsui et
(Figura S6). Si la pérdida de protones del citoplasma fuera tóxica, el CadB al., 1982). Construimos un ΔvelocidadΔspeGcepa que carece de esta vía de
debería exacerbar la sensibilidad. Para probar más directamente los efectos de modificación de poliaminas y determinó el efecto de la eliminación de la
la cadaverina, monitoreamos el pH intracelular de tipo salvaje y Δpaeacepas paeagen en este fondo sobre la sensibilidad a la cadaverina. Como se
durante el tratamiento con cadaverina. Utilizamos una proteína fluorescente muestra en la Figura S8, la eliminación depaeaen el dvelocidadΔspeGLa
verde (GFP) que responde al cambio de pH (Arce-Rodriguez et al., 2019). cepa aún aumentó la sensibilidad a la cadaverina, lo que sugirió que no se
Confirmamos la respuesta al pH incubando las células en soluciones salinas requiere la vía de modificación de la cadaverina y la putrescina. En
tamponadas a varios pH en presencia de ácidos y bases permeables a las conjunto, estos resultados muestran que PaeA actúa independientemente
células, equilibrando así el pH intracelular y extracelular. Como se muestra en la de las vías conocidas de degradación o modificación, y sugieren que la
Figura S7a, la GFP sensible al pH expresada en tipo salvaje y Δpaealas cepas cadaverina (o putrescina) per se es tóxica.
cambian uniformemente la fluorescencia en respuesta al pH. Como se muestra
en la Figura S7b, la incubación de tipo salvaje o Δpaealas cepas en tampón de
pH 9 durante 24 h aumentaron el pH intracelular de ~7,4 a 7,6. Las células 2.6|PaeA está involucrada en el eflujo de
permanecieron viables durante este período de tiempo. La adición de cadaverina y putrescina
cadaverina 0,2 mM no afectó la viabilidad ni el grado de alcalinización del
citoplasma durante este tiempo (Figura S7b,c). Cuando de tipo salvaje y Δpaea El locus STM14_3648 codifica una supuesta proteína de membrana interna
Las cepas se incubaron en presencia de cadaverina 0,5 mM durante 12 horas, la no caracterizada homóloga a la familia PACE de bombas de salida de
ΔpaeaLa cepa mostró una pérdida de viabilidad del ~75 %, mientras que el pH múltiples fármacos. Hasan et al. informó recientemente que las
intracelular fue de ~7,7, en comparación con un pH de ~7,6 observado en el tipo poliaminas eran el sustrato fisiológico para laAcinetobacterhomólogo AceI
salvaje en las mismas condiciones. El pH intracelular del Δpaeala tensión (Hassan et al., 2019). Aunque demostraron que laSalmonelaproteína no
finalmente alcanzó ~7,8 después de 24 horas. Tenga en cuenta que es difícil redujo los niveles de cadaverina cuando se expresó enE. coli, eliminamos
determinar la contribución de las células muertas a este cambio general en la STM14_3648 y probamos el efecto en nuestro ensayo. Como se muestra
fluorescencia. Sin embargo, dado que el pH intracelular en la mayoría de los en la Figura S9, la eliminación de STM14_3648 no tiene efecto sobre la
cultivos estaba finalmente por encima de 7,6 sin ninguna pérdida significativa tolerancia a la cadaverina ni en elpaea+o Δpaeaantecedentes.
de viabilidad, parece poco probable que el pequeño aumento del pH Para probar si PaeA está involucrada en la salida de poliaminas, medimos el
intracelular observado en el Δpaea cepa podría explicar la toxicidad de la nivel intracelular de cadaverina o putrescina después de un corto período de
cadaverina. Además, en el cultivo de tipo salvaje en el que las células tratamiento. Para evitar la complicación de la degradación, utilizamos la tensión
permanecieron viables, la adición de cadaverina no afectó significativamente el Δdeg. Cuando el Δdeg y Δdeg Δpaeacepas se trataron con cadaverina o
pH intracelular en comparación con el tampón solo. Teniendo en cuenta todos putrescina 5 mM, lapaeamutante comenzó a perder viabilidad después de 3 h.
nuestros resultados, concluimos que la sensibilidad a la cadaverina no se debe Sin embargo, hubo poca pérdida de viabilidad después de 1 h (Figura 6a). Por lo
a ningún efecto de la poliamina sobre el pH intracelular. tanto, recolectamos células 1 hora después del tratamiento. Las células tratadas
se lavaron y totalizaron cadaverina intracelular y

|1387
IWADATEET Al.
(a) (b)
1.E1
+010
10 60
1.E+09
∆grados de control
**
** ∆grados∆ de controlpaea 50 cadaverina
18
1.E+08
** ***
Contenido de poliamina en las células a 1h

1.E+07 ****** cadaverina ∆grados
40 putrescina
n mol / mg peso seco

1.E1
+ 06
6 putrescina ∆grado
30 *
UFC
***
1.E+05
1.E1 4
+ 04
20
1.E+03
* putrescina
1.E1 2
+ 02 ∆grados∆paea
10
Cadaverina ∆grados∆paea
1.E+01 Tratamiento 24h
1.E1
+ 000 0
0 6 12
Tiempo (h)
18 24 +-+-+-+- paea
Antes Control cadaverina putrescina
tratamiento Agregado Agregado
(d) (mi)
Washingtons h
(C) ∆grados de control
1010
1.E+10 35 35
∆grados∆ de controlpaea
1.E+09 * 30 30
1.E+1088 ** ** cadaverina ∆grados
en cultivo completo (µM)

* * ** *
en cultivo completo (µM)

putrescina
Contenido de cadaverina
∆grado
1.E+07 25 25
Contenido de putrescina
1.E+1066 *** 20 20
UFC
1.E+05
1 4
1.E+04
* putrescina ∆grados∆paea
15 15
1.E+03 Cadaverina ∆grados∆paea 10 10
***
1.E+1022 5 5
1.E+01 1h Tratamiento
0 0
1.E+1000
0 6 12 18 24
Tiempo (h)
paea+ paea+
FIGURA 6Las concentraciones intracelulares de cadaverina y putrescina aumentan en el Δpaeamutante después de un tratamiento breve con cadaverina
o putrescina. Elpaea+o Δpaeacepas que carecen de todos los genes conocidos para la degradación de cadaverina y putrescina
(Δgrado = ΔpatAΔPatDΔcsiD-R) se cultivaron durante 12 h en LB7, luego se suspendieron en 5 ml de tampón CAPS (pH 9,0) con o sin 5 mM de cadaverina o
putrescina y se incubaron a 37 °C. (a) Las UFC se determinaron en los puntos de tiempo indicados. (b) El contenido intracelular de cadaverina y putrescina se
determinó en el punto de tiempo de 1 hora. La espermidina fue < 0,15 nmoles mg–1y la espermina fue < 0,25 nmoles mg–1en todas las celdas. Estos datos se
vuelven a trazar en la Figura S10. (c) Una hora después del tratamiento inicial, las células se lavaron y se resuspendieron en 5 ml de tampón CAPS (pH 9,0) y se
determinaron las CFU en los puntos de tiempo indicados. (d) Contenido de cadaverina en cultivos completos de tipo salvaje (medio y células) inmediatamente
después de retirar cadaverina o (e) putrescina, y después de 24 horas de incubación. Símbolos: Cuadrados, Δdeg; círculos, Δgrado Δpaea; marcadores rellenos de
negro con líneas negras, control; marcadores abiertos con líneas discontinuas, tratamiento cadaverino; rotuladores rellenos grises con líneas grises, tratamiento de
putrescina. Los valores se informan como media±desviación estándar, dondenorte=3. Sin emparejartlas pruebas comparan las cepas indicadas con la cepa original
en el mismo tratamiento (*pag< .05, **pag< .005, ***pag< .0005). Cepas utilizadas: JS2464 y JS2465
putrescina fueron medidos por LC/MS. También continuamos monitoreando la y de acuerdo con la Figura 6, el tratamiento con cadaverina 5 mM resultó en un
viabilidad en estas células después de eliminar la poliamina extracelular. Como aumento de 16 veces en cadaverina asociada a células en el Δpaeaversuspaea+
se muestra en la Figura 6b, elpaeacepa tenía un nivel 24 veces mayor de células. Incluso cuando tratamos elpaea+células con cadaverina 50 mM, los
cadaverina en comparación con la isogénicapaea+cepa. En las células tratadas niveles estaban por debajo de los observados a 5 mM en el Δpaeacepa. Niveles
con putrescina, el Δpaeacepa mostró un nivel de putrescina 16 veces mayor en en el ΔpaeaLas cepas mostraron una caída inicial en las concentraciones de
comparación con la isogénicapaea+cepa (Figura 6b). La figura S4b muestra que cadaverina celular inmediatamente después de lavar las células. Sin embargo, a
el ΔpaeaLa cepa también tenía niveles más altos de cadaverina intracelular las 3 h, los niveles intracelulares se mantuvieron constantes y
después del crecimiento en LB5 o LB5N. Como se muestra en la Figura 6d,e, significativamente más altos que los delpaea+células tratadas con cadaverina 5
tanto elpaea+y ΔpaeaLas cepas mostraron niveles generales similares de mM. Incluso a 50 mM de cadaverina, los niveles en elpaea+
cadaverina y putrescina en los cultivos totales después de lavar y suspender las las células cayeron a un nivel de referencia aparente. Proponemos que la caída del
células en tampón de pH 9. Estos resultados sugieren que PaeA no está contenido de cadaverina intracelular inmediatamente después del lavado se deba a
involucrada en la degradación o modificación de cadaverina y putrescina, sino una pérdida inespecífica. El hecho de que las concentraciones intracelulares
que aumenta la salida de cadaverina y putrescina del citoplasma. permanezcan altas en elpaeamutante es consistente con un papel de PaeA en el flujo
La Figura 6c muestra que las células tratadas continuaron perdiendo de salida de cadaverina. El hecho de que elpaea+las células tratadas con cadaverina 50
viabilidad después de eliminar cadaverina o putrescina extracelular. O el daño mM continuaron perdiendo viabilidad al mismo ritmo que el Δpaea las células tratadas
letal se había producido en 1 h o la concentración intracelular permaneció alta. con 5 mM sugieren que las altas concentraciones iniciales pueden causar daños que
Supervisamos la cadaverina intracelular a lo largo del tiempo después del finalmente son letales.
tratamientopaea+o Δpaeacepas con varias concentraciones de cadaverina y Luego preguntamos si la expresión ectópica de PaeA suprime el defecto de
lavando las células después de 1 h. Como se muestra en la Figura S11c crecimiento conferido por cadaverina producida endógenamente.
|
1388 IWADATEET Al.
(a) LB7 (b) LB5 (C) LB5N

101 101 101
pWKS30 de tipo salvaje
****
pW de tipo salvaje KS30 pW de tipo salvaje KS30

∆cadBApag WKS30
sobredosis600
sobredosis600
sobredosis600
10
10 ∆cadBApW KS30 1010 ∆cadBApWK S30 1010
∆cadBpWK S30 ∆cadBpWKS 30
*** ∆cadBpW KS30
∆cadB∆paea ∆cadB∆paea
∆cadB∆Pensilvania eApWKS30
***
pWKS30 pWKS30 ***
******
010.1
-1 01.01-1 01.01-1 ***
0 12 24 36 0 12 24 36 0 12 24 36
Tiempo (h) Tiempo (h) Tiempo (h)
(d) LB5N (mi) (F)

100 ***
11001 300
∆cadB∆paé ApagcadB ∆cadB∆paea ∆cadB∆paea
Cadaverina en sobrenadante (µM)

∆cadB LB5N LB5N
80 250
(n mol / mg peso seco)

***
pagcadB ***
***
∆cadB cadaverina en celda 60 200
** pagpaea *
sobredosis600
***
101 0 ∆cadB∆paea 150
***** 40 ***
pagpaea
*** 100
* ∆cadBpWKS30 20 **
∆cadB∆paea 50
**
pWKS30 0 ***
10. 01-1 0
0 12 24 36
Tiempo (h)
3 horas 24h 3 horas 24h
FIGURA 7expresión ectópica depaeasuprime parcialmente el defecto de crecimiento de un ΔcadBmutante en medio ácido. El tipo salvaje, ΔcadBA, ΔcadB
, y ΔcadBΔpaeaLas cepas que albergan el vector pWKS30 se cultivaron en (a) LB7, (b) LB5 o (c) LB5N (NaNO 1,5 mM2). (d) El ΔcadBy ΔcadBΔpaeacepas que
albergan pWKS30, pWKS30 PlacZ-cadB, o pWKS30 PlacZ-paeaplásmido se cultivaron en LB5N (NaNO 1,5 mM2). Símbolos: rombos cerrados, tipo salvaje
pWKS30; asteriscos cerrados, ΔcadBApWKS30; círculos cerrados, ΔcadBpWKS30; círculos abiertos, ΔcadBΔpaeapWKS30; triángulos cerrados, ΔcadB
pWKS30PlacZ-cadB; triángulos abiertos, ΔcadBΔpaeapWKS30PlacZ-cadB; cuadrados rellenos, ΔcadBpWKS30PlacZ-paea; cuadrados abiertos, ΔcadBΔpaea
pWKS30PlacZ-paea. (e) contenido de cadaverina en el sedimento celular o (f) sobrenadante del ΔcadBΔpaeacepa que contiene los plásmidos indicados
cultivados durante 3 horas o 24 horas en LB5N (NaNO 1,5 mM2). Los valores se informan como media±desviación estándar, dondenorte=3. Sin
emparejartlas pruebas comparan las cepas indicadas con la cepa pWKS30 de tipo salvaje (ac) o una cepa isogénica correspondiente con pWKS30 (de) (*
pag< .05, **pag< .005, ***pag< .0005). Cepas utilizadas: JS2452, JS2457, JS2458, JS2459, JS2460, JS2461, JS2462 y JS2463
Como se muestra en la Figura 7, las cepas eliminadas paracad AB,cadB, ocadb producido endógenamente por CadA en el ambiente ácido, de acuerdo con
paea creció esencialmente como el control de tipo salvaje en LB7 y LB5, sin PaeA que actúa en el eflujo de cadaverina. De hecho, como se muestra en la
pérdida significativa de viabilidad en la fase estacionaria. Sin embargo, cuando Figura 7e,f, la cantidad de cadaverina intracelular en la cepa que expresapaea
las células se cultivaron en LB5N, lacad ABmutante mostró un defecto de ectópicamente es 7 o 9 veces menor que en la cepa que alberga el vector
crecimiento significativo, aunque la cepa finalmente alcanzó la misma OD final después de 3 y 24 h de crecimiento en LB5N, respectivamente, con un aumento
600. Estos resultados sugieren que el nitrito exacerba el estrés ácido concomitante de cadaverina encontrada en el sobrenadante. Estos resultados
normalmente contrarrestado por CadAB, como se señaló anteriormente sugieren que PaeA está involucrada en el eflujo de cadaverina en condiciones
(Muhlig et al., 2014). Por el contrario, ni el ΔcadBni el ΔcadBΔpaea fueron fisiológicas. Nótese que la concentración total de cadaverina producida en el
capaces de crecer en LB5N. El hecho de que elcadBmutante mostró un defecto cadB+cepas complementadas es mayor, probablemente debido al hecho de que
de crecimiento más grave en LB5N que el ΔcadBAmutante sugiere que el CadB es un antiportador de lisina:cadaverina, lo que aumenta la cantidad de
defecto no es solo la falta de tolerancia adecuada al estrés ácido, sino también sustrato para la producción de cadaverina.
el resultado de la producción de cadaverina mediada por CadA intracelular, que
aumenta cuando las células se cultivan en LB5N versus LB5 (Figura S4b).
3|DISCUSIÓN
Como se muestra en la Figura 7d, la introducción de pWKS30 PlacZ-cadB en
ΔcadBy ΔcadB ΔpaeAcepas restauraron su crecimiento en LB5N. La introducción En el estudio actual, identificamospaea(ytfL) como gen implicado en la
de pWKS30 PlacZ-paeArestauró parcialmente el crecimiento de ambos ΔcadBy Δ tolerancia a cadaverina y putrescina en fase estacionaria. La explicación
cadB ΔpaeApresiones. Estos resultados sugirieron que PaeA reduce el estrés más simple para nuestros datos es que se requiere PaeA para el eflujo de
causado por la acumulación de cadaverina que es cadaverina y putrescina bajo ciertas condiciones que de otro modo
|1389
IWADATEET Al.
conducir a una acumulación tóxica. Nuestros resultados confirman que susceptible a poliaminas que OmpC (Dela Vega & Delcour, 1996). Entre las
Salmonela, cultivada en medio LB de pH bajo, produce concentraciones cuatro poliaminas, la espermina es la más potente, seguida de la espermidina y
significativas de cadaverina a través de la vía CadAB y la excreta en el medio. la cadaverina, siendo la putrescina la menos efectiva (Dela Vega & Delcour,
Esta producción es independiente de PaeA y se exacerba al agregar nitrito al 1996). Sin embargo, la pérdida de la función de las porinas no es letal (Hall &
medio de crecimiento, por razones que no se comprenden. Un mutante que Silhavy, 1981). El exceso de poliaminas, como los niveles bajos, afecta los
carece de PaeA se vuelve sensible a cadaverina en fase estacionaria. El mutante procesos mediados por ARN, particularmente el inicio de la traducción de
también es sensible a la putrescina, pero no a la espermidina ni a la espermina. ciertos ARNm, lo que define el "módulo de poliamina" (Sakamoto et al., 2020).
La sensibilidad depende del pH y solo se observa a pH > 8. Esto se debe Ya sea como resultado de cambios en la expresión de genes específicos o de
presumiblemente a que la poliamina externa debe desprotonarse para que defectos más generales en la traducción, esto ciertamente podría ser letal. En
pueda difundirse pasivamente en el citoplasma celular. Es la cadaverina concentraciones subletales, el exceso de poliaminas confiere fenotipos
citoplasmática la que confiere sensibilidad. Esto está respaldado por varias particulares, que incluyen sensibilidad al peróxido de hidrógeno, alta
líneas de evidencia. Primero, podemos medir directamente el aumento temperatura y concentraciones normalmente subinhibitorias de kanamicina, en
significativo de cadaverina o putrescina intracelular en elpaeamutante En cepas que no pueden degradar putrescina o cadaverina (Schneider et al., 2013),
segundo lugar, uncadBmutante es sensible al crecimiento en pH 5 LB con y detención del crecimiento y lisis celular a baja temperatura en cepas con
nitrito. BorrandocadAsuprime este fenotipo, al igual que la expresión ectópica exceso de espermidina (Limsuwun & Jones, 2000). Tenga en cuenta que la
de PaeA. Por lo tanto, CadA está produciendo cadaverina intracelular que no se sensibilidad a las poliaminas depende de la fisiología general de la célula. Por
puede excretar, lo que le confiere sensibilidad. En tercer lugar, la expresión ejemplo, en nuestros experimentos, las concentraciones de putrescina
ectópica del exportador de cadaverina, CadB, en fase estacionaria suprime intracelular fueron relativamente altas en la fase exponencial; sin embargo, las
parcialmente lapaeafenotipo. Es la cadaverina o la putrescina per se las que son células crecieron normalmente, mientras que concentraciones similares de
tóxicas, en que la degradación o modificación no son relevantes. Tenga en cadaverina en la fase estacionaria fueron letales (Figura S4).
cuenta que, aunque descubrimos la función de PaeA en condiciones específicas, Nuestros datos sugieren que PaeA facilita la salida de cadaverina
parece probable que tenga un papel más amplio en la homeostasis celular. Las y putrescina, pero el mecanismo molecular no está claro. La proteína
poliaminas, producidas en respuesta a cualquier cantidad de condiciones de PaeA de 447 aminoácidos contiene tres dominios conservados que a
estrés u otra necesidad fisiológica, podrían acumularse hasta niveles menudo se encuentran juntos. Los 197 aminoácidos N-terminales
potencialmente letales cuando se satisface la necesidad o cambian las comprenden un dominio transmembrana de cuatro en la familia
condiciones. Este exceso de poliaminas debe eliminarse del citoplasma. DUF21 (PF01595), asociado con proteínas de transporte (Chen et al.,
2020). Se prevé que los dominios N-terminal y C-terminal estén en el
A diferencia de las células de mamíferos (Mandal et al., 2013), enSalmonela yE. citoplasma. El dominio transmembrana es seguido por dos dominios
coli, la síntesis de poliaminas no es esencial para el crecimiento y la supervivencia de repetición CBS en tándem (PF00571), que se sabe que se unen a
celular (Chattopadhyay et al., 2009). Sin embargo, bajo ciertas condiciones, como el ligandos con un grupo adenosilo, incluido ATP (Hirata et al., 2014).
crecimiento en un ambiente anaeróbico o en un 95% de oxígeno, los mutantes Los 100 aminoácidos C-terminales constituyen un dominio CorC_HlyC
incapaces de sintetizar poliaminas no pueden crecer o incluso perder viabilidad (PF03471). Esta estructura general es ciertamente consistente con
(Chattopadhyay et al., 2003, 2009). Como se muestra en la Figura 1, Salmonelatiene que PaeA sea un transportador. Sin embargo,2+/Co2+transporte,
múltiples vías redundantes para la síntesis, importación y exportación de poliaminas, como MpfA deBacillus subtilis(Pi et al., 2020), y MpfA de estafilococo
lo que sugiere queSalmonelacontrola los niveles de poliamina en respuesta a los aureus(Armitano et al., 2016). magnesio2+y las poliaminas tienen
cambios en el entorno externo y/o las condiciones dentro de la célula. A pesar de la funciones importantes como cationes que se unen a los ácidos
existencia de los sistemas de importación/exportación conocidos, nuestros datos nucleicos, aunque no son completamente intercambiables (Lightfoot
sugieren que la importación de cadaverina y putrescina en nuestros experimentos fue & Hall, 2014; Tabor & Tabor, 1985). Por lo tanto, no podemos
el resultado de la difusión pasiva de las especies sin carga en la célula, lo que explica la descartar que PaeA sea un transportador de iones que afecte
dependencia del pH, y que la exportación dependía en gran medida de PaeA . Estos indirectamente el eflujo de poliaminas. Sin embargo, es interesante
resultados pueden explicarse por el hecho de que ninguno de los sistemas conocidos que PaeA parece ser específico para cadaverina y putrescina, sin
de importación o exportación de poliaminas se expresa en fase estacionaria tardía en tener efecto sobre la espermina o la toxicidad de la espermidina, y
Salmonela (Kroger et al., 2013). que puede complementar parcialmente la pérdida de CadB en fase
exponencial. Se requerirán más análisis bioquímicos de PaeA para
Las poliaminas tienen efectos pleiotrópicos sobre las células. Muchos demostrar que es un exportador, definir el sustrato e identificar la
estudios han abordado la necesidad de poliaminas utilizandoE. colimutantes fuente de energía putativa. También necesitamos comprender mejor
defectuosos para la síntesis de poliaminas (Chattopadhyay et al., 2009, 2013, el papel fisiológico de PaeA. Los datos transcriptómicos sugieren que
2015; Chattopadhyay & Tabor, 2013; Igarashi & Kashiwagi, 2018; Keller et al., paease expresa en la mayoría de las condiciones, pero es más
2019). Los efectos del exceso de poliaminas sobre la fisiología celular son altamente inducida cuandoSalmonelase está replicando en los
menos conocidos. Enmi.coli, las poliaminas inhiben la función de los poros en macrófagos (Kroger et al., 2013; Srikumar et al., 2015). Análisis más
las porinas de la membrana externa OmpF y OmpC al unirse dentro de los detallado depaease requiere regulación.
poros desde el lado periplásmico (Dela Vega & Delcour, 1996; Iyer & Delcour, Las poliaminas también están implicadas en la patogénesis. El PaeA/YtfL de
1997). Aunque homólogo, OmpF es dos veces más Neumonía por Klebsiella, que es 91% idéntico a PaeA deS. enterica, es
|
1390 IWADATEET Al.
se informó que es responsable de producir un medio gastado que induce el introducido en un fragmento pWKS30 amplificado con YI_pWKS30-3 y
desmontaje de los microtúbulos del huésped en las células epiteliales del YI_pWKS30-10 por ensamblaje Gibson (NEBuilder® HiFi DNA
pulmón. Expresando el Klebsiellaproteína en unE. colicepa confirió el mismo Assembly). El producto resultante se transformó en DH5α. El
fenómeno (Chua et al., 2019). Aunque no identificaron el compuesto activo, las plásmido fue confirmado por secuenciación de ADN.
poliaminas están involucradas en el ensamblaje de los microtúbulos (Savarin et
al., 2010). Curiosamente, la mayoría de los estafilococos no sintetizan ni
metabolizan poliaminas (Anzaldi & Skaar, 2011; Joshi et al., 2011). De hecho, 4.2|Ensayo de supervivencia en fase estacionaria
estos organismos son muy sensibles a la espermina y la espermidina, pero no a
la cadaverina ni a la putrescina, y mostraron una mayor sensibilidad a pH Las células de cultivos en medio LB durante la noche se recogieron por
alcalinos (Joshi et al., 2011). La epidemiaS. aureusLa cepa MRSA USA300 posee centrifugación y se suspendieron en el mismo volumen de NaCl al 0,85%. Las
un "elemento móvil catabólico de arginina" que codifica una espermina/ suspensiones se diluyeron 1:25 en 5 ml de medio LB pH 5 sin tamponar con
espermidina acetil transferasa SpeG que puede desintoxicar las poliaminas que NaNO 2 mM2(LB5N) o sin NaNO2(LB5) o medio LB de pH 7 (LB7) e incubado
se encuentran en la piel y los tejidos inflamados, lo que se cree que contribuye durante 48 h a 37 °C en un tambor giratorio. Para las cepas que albergaban un
a su mayor patogenicidad (Anzaldi & Skaar, 2011; Joshi et al., 2011). plásmido pWKS30, se añadieron al medio 50 µg/ml de ampicilina. En los
Necesitamos determinar si PaeA juega algún papel enSalmonelaPatogénesis. tiempos indicados, los cultivos se diluyeron y se sembraron en agar LB
En conclusión, encontramos que PaeA está involucrada en la supervivencia complementado con glucosa al 0,1 % y se incubaron durante la noche a 37 °C
de la fase estacionaria cuandoSalmonelaestá expuesto a cadaverina o para determinar las CFU. El pH del medio gastado se determinó usando un
putrescina, pero no a espermidina y espermina. Además, demostramos que medidor de pH. Para curvas de crecimiento, OD600del cultivo se midió en un
PaeA reduce el nivel intracelular de cadaverina y putrescina durante el lector de absorbancia BioTek ELx808 en los puntos de tiempo indicados.
tratamiento. Estos resultados sugieren que PaeA está involucrada en la salida Cuando fue necesario, los cultivos se diluyeron en el medio de cultivo original.
selectiva de cadaverina y putrescina y esto es importante para la supervivencia
en condiciones de estrés específicas.

4.3|Ensayo de tolerancia medio gastado
4| PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Para preparar el medio gastado, se recogieron por centrifugación células de tipo
salvaje de cultivos de LB durante la noche y se suspendieron en el mismo volumen de
4.1| Cepas bacterianas y plásmidos NaCl al 0,85 %. A continuación, las suspensiones se diluyeron 1:25 en 5 ml de LB5N o
LB7 y se incubaron durante 12 horas a 37°C en un tambor giratorio. A continuación,
Las cepas y los plásmidos se describen en la Tabla S1. TodoSalmonelaLas las células se eliminaron por centrifugación (7.000gramo) y el sobrenadante se filtró a
cepas utilizadas son derivados deSalmonella entericaserovar través de un filtro de jeringa Millex-GP de 0,22 μm (Millipore). Para la preparación de
Typhimurium cepa 14028. Se construyeron deleciones con inserción células en fase estacionaria, se centrifugaron cultivos de medio LB durante la noche y
simultánea de casetes de resistencia a antibióticos usando recombinación las células se suspendieron en el mismo volumen de NaCl al 0,85%. Las suspensiones
mediada por λ Red como se describió previamente (Datsenko & Wanner, se diluyeron 1:25 en 5 ml de LB5N o LB7. Después de 12 h de incubación a 37 °C en un
2000; Ellermeier et al., 2002), con los criterios de valoración indicados. Las tambor giratorio, las células se recogieron por centrifugación (7000gramo) y se lavó
deleciones se verificaron mediante análisis PCR y luego se transdujeron a dos veces con NaCl al 0,85%. Las células de la fase estacionaria se suspendieron en el
fondos no mutagenizados utilizando el fago P22 HT105/1 int-201 (Maloy et volumen original del medio gastado preparado con o sin tampón MES 100 mM (pH 5,5
al., 1996). Todos los plásmidos se pasaron a través de una modificación de o 6,0), tampón MOPS (pH 7,0, 8,0 u 8,5) o tampón CAPS (pH 9,0 o 9.5). Cuando fue
restricción menos Pi +Salmonelacepa (JS198) (Ellermeier et al., 2002) antes necesario, los medios agotados preparados se diluyeron con NaCl al 0,85 %. Los
de la transformación en derivados de la cepa 14028. cultivos de 5 ml resultantes se incubaron durante 24 horas a 37°C en un tambor
E. coliLas cepas K12 utilizadas son derivados de la cepa MG1655. Las giratorio. Después de la dilución en serie, los cultivos, antes y después de la
mutaciones de deleción se construyeron usando recombinación mediada incubación, se sembraron en placas de agar LB complementadas con glucosa al 0,1 %
por λ Red (Datsenko & Wanner, 2000) y las mutaciones se transfirieron a y se incubaron durante la noche a 37 °C para determinar las CFU. La tolerancia al
fondos limpios mediante transducción P1 (Silhavy et al., 1984). medio gastado se calculó dividiendo las CFU después de 24 horas de incubación por
El pWKS30-PlacZpaeaEl plásmido se construyó amplificando el gen las CFU antes de la incubación.
paeA utilizando los cebadores ytfLF e ytfLR (Tabla S3). Tanto el

producto de PCR como el plásmido pWKS30 se digirieron con
enzimas de restricción EcoRI y XbaI (New England Biolabs) según el
protocolo del fabricante. Los fragmentos resultantes se ligaron con 4.4|Ensayo de tolerancia a la poliamina
ADN ligasa T4 (New England Biolabs) de acuerdo con el protocolo del
fabricante y se transformaron enE. colicepa DH5α. El plásmido fue Las células de la fase estacionaria, preparadas como antes, se suspendieron en
confirmado por secuencia de ADN. el volumen original de NaCl al 0,85 % con tampón CAPS (pH 9,0) con la cantidad
Plásmido pWKS30-PlacZcadBse construyó utilizando los cebadores indicada de cadaverina, putrescina, espermidina o espermina. Las reservas de
YIS_275-17 y YIS_275-18 para amplificar lacadBgen, que fue poliamina se prepararon primero a 20 mM en NaCl al 0,85 %.
|1391
IWADATEET Al.
con tampón CAPS (pH 9,0). Para realizar el ensayo a pH variado, las células se la GFP sensible al pH, y a Cari Vanderpool y Jim Imlay por sus valiosos
suspendieron en el volumen original de NaCl al 0,85 % con tampón MES 100 debates. Este estudio fue apoyado por NIH subvención R01 AI123381
mM (pH 5,5 o 6,0), tampón MOPS (pH 7,0, 8,0 u 8,5) o tampón CAPS (pH 9,5). ). a JMSYI es apoyado por una JSPS Postdoctoral Fellowship for
Los cultivos se incubaron durante 24 horas a 37°C en un tambor giratorio. Research Abroad.
Después de la dilución en serie, los cultivos, antes y después de la incubación,
se sembraron en placas de agar LB complementadas con glucosa al 0,1 % y se CONFLICTOS DE INTERÉS

incubaron durante la noche a 37 °C para determinar las CFU. La tolerancia a la Los autores declaran que no existen conflictos de interés.
poliamina se calculó dividiendo las CFU después de 24 horas de incubación por
las CFU antes de la incubación. CONTRIBUCIONES DE AUTOR

YI realizó la investigación; YI, RR, YAG y JMS diseñaron la
investigación; LF realizó la caracterización inicial depaea (ytfL); YI y
4.5|Medición del pH intracelular JMS escribieron el artículo. Todos los autores aprobaron la versión
final del manuscrito.
Para obtener una curva de calibración, pH 7 LB fase estacionaria cultivada
en medio de tipo salvaje o Δpaealas células que albergaban pS2513-PHP DECLARACIÓN DE HABILIDAD DE DISPONIBILIDAD DE DATOS
se suspendieron a OD600= 0,4 a 0,5 en solución salina que contiene 50 mM Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están
de tampón MES (pH 6,0 o 6,5) o tampón MOPS (pH 7,0, 7,5, 8,0 u 8,5), cada disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.
uno con 50 mM de benzoato de sodio y 50 mM de metilamina HCl e
incubados a 30 °C durante 10 min. La emisión de fluorescencia de PHP (λ ID ORCO
emisión= 515 nm) se registró en λexcitaciónde 405 nm o 485 nm con un lector James M. Slauch https://orcid.org/0000-0003-4634-9702
multimodo híbrido BioTek Synergy H1. La excitación relativa (R 405/485)
se representó frente al pH del tampón. Para medir el pH citoplásmico REFERENCIAS
durante el tratamiento con cadaverina, se suspendieron células en fase Anzaldi, LL & Skaar, EP (2011) La evolución de una superbacteria: Cómo
estacionaria que albergaban pS2513-PHP en 5 ml de tampón CAPS (pH estafilococo aureussupera su susceptibilidad única a las poliaminas.
Microbiología Molecular,82, 1–3. Disponible en: https://doi. org/
9,0) con o sin 0,2 o 0,5 mM de cadaverina. En el momento indicado, la
10.1111/j.1365-2958.2011.07808.x
emisión de fluorescencia de PHP (λemisión= 515 nm) se registró en λexcitación Arce-Rodríguez, A., Volke, DC, Bense, S., Haussler, S. y Nikel, PI
de 405 nm o 485 nm y el pH citoplasmático se calculó usando la curva de (2019) Determinación ratiométrica no invasiva del pH intracelular en
calibración. Las CFU se determinaron sembrando diluciones apropiadas Pseudomonasespecies utilizando un nuevo indicador codificado
genéticamente. Biotecnología microbiana,12, 799–813. Disponible en:
en placas de glucosa LB que contenían 50 µg/ml de kanamicina.
https://doi. org/10.1111/1751-7915.13439
Armitano, J., Redder, P., Guimaraes, VA & Linder, P. (2016) Un imprescindible
factor para alto Mg(2+) tolerancia deestafilococo aureus.Fronteras en
Microbiología,7, 1888. Disponible en: https://doi.org/10.3389/
fmicb.2016.01888
4.6|Medición del contenido de poliaminas en células,
Bowman, WH, Tabor, CW & Tabor, H. (1973) Biosíntesis de espermidina
cultivo y medio gastado hermana Purificación y propiedades de la propilamina transferasa de
Escherichia coli.Revista de Química Biológica,248, 2480–2486.
Para medir los niveles de poliamina intracelular, las células se recogieron por Disponible en: https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)44133-1 Burton,
N., Schürmann, N., Casse, O., Steeb, A., Claudi, B., Zankl, J .,
centrifugación (7.000gramo) en los puntos de tiempo indicados y se lavaron con
et al. (2014) El impacto desigual de las defensas oxidativas del huésped determina
tampón CAPS 100 mM de NaCl al 0,85 % (pH 9,0) dos veces. Después de eliminar
el destino deSalmoneladurante la infección sistémica en ratones.Huésped celular
cuidadosa y completamente el sobrenadante, el sedimento celular se congeló a y microbio,15, 72–83. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j. chom.2013.12.006
− 80°C. Las células se suspendieron en 1 ml de metanol y se rompieron
mediante sonicación. Las muestras se aclararon por centrifugación y la Chakraborty, S., Mizusaki, H. & Kenney, LJ (2015) Un ADN basado en FRET
biosensor rastrea la acidificación dependiente de OmpR deSalmonela
concentración de poliaminas en el solvente se determinó por LC-MS en el
durante la infección por macrófagos.PLoS Biología,13, e1002116.
Centro de Metabolómica, Centro de Biotecnología Roy J. Carver, Universidad de Disponible en: https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002116
Illinois en Urbana-Champaign. La concentración se reporta por 1 mg de peso Chakravortty, D., Hansen-Wester, I. y Hensel, M. (2002)Salmonelapato-
seco. Cuando se indique, la concentración de poliaminas en el sobrenadante se genicidad isla 2 media la protección de intracelularSalmonelade
intermedios reactivos de nitrógeno.Revista de Medicina Experimental,195,
determinó después de la eliminación de las células por centrifugación. Para la
1155–1166. Disponible en: https://doi.org/10.1084/jem.20011547
determinación de las concentraciones de poliamina en cultivos completos, las Chattopadhyay, MK, Chen, W. & Tabor, H. (2013)Escherichia colipegamento
células se rompieron mediante sonicación y el sobrenadante se aclaró mediante tationilespermidina sintetasa/amidasa: filogenia y efecto sobre la
centrifugación. regulación de la expresión génica.Cartas de Microbiología FEMS,338,
132– 140. Disponible en: https://doi.org/10.1111/1574-6968.12035
Chattopadhyay, MK, Keembiyehetty, CN, Chen, W. y Tabor, H. (2015)
EXPRESIONES DE GRATITUD Las poliaminas estimulan el nivel de la subunidad sigma38 (RpoS) de Escherichia
Agradecemos a Thomas E. Kehl-Fie, Jacqueline Morey y Katie Frye por coliARN polimerasa, lo que da como resultado la inducción del sistema de
su ayuda con las mediciones del pH intracelular utilizando respuesta ácida dependiente de glutamato descarboxilasa a través de gadE
|
1392 IWADATEET Al.
regulón.Revista de Química Biológica,290, 17809–17821. Disponible Hall, MN & Silhavy, TJ (1981) Análisis genético de laompBlugar en
en: https://doi.org/10.1074/jbc.M115.655688 Escherichia coliK-12.Revista de Biología Molecular,151, 1–15. Hassan,
Chattopadhyay, MK, Tabor, CW & Tabor, H. (2003) Las poliaminas protegen KA, Naidu, V., Edgerton, JR, Mettrick, KA, Liu, QI, Fahmy,
Escherichia colicélulas del efecto tóxico del oxígeno.Actas de la L., et al. (2019) Las diaminas de cadena corta son los sustratos fisiológicos
Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América,100, de las bombas de eflujo de la familia PACE.Actas de la Academia Nacional
2261–2265. Disponible en: https://doi.org/10.1073/pnas.26279 90100 de Ciencias de los Estados Unidos de América,116, 18015–18020. Disponible
en: https://doi.org/10.1073/pnas.1901591116
Chattopadhyay, MK, Tabor, CW y Tabor, H. (2009) Las poliaminas son Higashi, K., Ishigure, H., Demizu, R., Uemura, T., Nishino, K., Yamaguchi,
no se requiere para el crecimiento aeróbico deEscherichia coli: Preparación A., et al. (2008) Identificación de un complejo de proteínas de excreción de
de una cepa con deleciones en todos los genes para la biosíntesis de espermidina (MdtJI) enEscherichia coli.Revista de Bacteriología,190, 872–
poliaminas. Revista de Bacteriología,191, 5549–5552. Disponible en: https:// 878. Disponible en: https://doi.org/10.1128/JB.01505-07
doi. org/10.1128/JB.00381-09 Hirata, Y., Funato, Y., Takano, Y. y Miki, H. (2014) Mg2+-dependiente en-
Chattopadhyay, MK & Tabor, H. (2013) Las poliaminas son críticas para interacciones de ATP con los dominios de cistationina-beta-sintasa
la inducción del sistema de resistencia al ácido dependiente de (CBS) de un transportador de magnesio.Revista de Química Biológica,
glutamato descarboxilasa enEscherichia coli.Revista de Química 289, 14731–14739. Disponible en: https://doi.org/10.1074/jbc.
Biológica, 288, 33559–33570. Disponible en: https://doi.org/10.1074/ M114.551176
jbc. M113.510552 Igarashi, K., Ito, K. & Kashiwagi, K. (2001) Sistemas de absorción de poliaminas
Chen, YS, Kozlov, G., Fakih, R., Yang, M., Zhang, Z., Kovrigin, EL, et al. enEscherichia coli.Investigación en Microbiología,152, 271–278. Disponible
(2020) mg(2+)-Detección de ATP en CNNM, un supuesto transportador de en: https://doi.org/10.1016/s0923-2508(01)01198-6
magnesio.Estructura,28, 324–335 e324. Disponible en: https://doi. org/ Igarashi, K. & Kashiwagi, K. (2015) Modulación de la síntesis de proteínas por
10.1016/j.str.2019.11.016 poliaminas.Vida IUBMB,67, 160–169. Disponible en: https://doi. org/
Chua, MD, Liou, CH, Bogdan, AC, Law, HT, Yeh, KM, Lin, JC, et al. 10.1002/iub.1363
(2019)Klebsiella pneumoniaedesensambla los microtúbulos del huésped en las Igarashi, K. & Kashiwagi, K. (2018) Efectos de las poliaminas en la síntesis de proteínas
células epiteliales del pulmón.Microbiología Celular,21, e12977. Disponible en: tesis y crecimiento deEscherichia coli.Revista de Química Biológica,
https://doi.org/10.1111/cmi.12977 293, 18702–18709. Disponible en: https://doi.org/10.1074/jbc.
Darwin, KH & Miller, VL (1999) Base molecular de la interacción de TM118.003465
Salmonelacon la mucosa intestinal.Reseñas de microbiología clínica, Iwadate, Y. & Kato, JI (2017) Participación del gen ytfK de PhoB
12, 405–428. Disponible en: https://doi.org/10.1128/CMR.12.3.405 regulon en fase estacionaria H2O2 tolerancia al estrés enEscherichia
Datsenko, KA & Wanner, BL (2000) Inactivación en un solo paso de cromo- coli.Microbiología,163, 1912–1923. Disponible en: https://doi. org/
genes somales enEscherichia coliK-12 utilizando productos PCR.Actas de la 10.1099/mic.0.000534
Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, 97, 6640– Iyer, R. & Delcour, AH (1997) Inhibición compleja de OmpF y OmpC
6645. Disponible en: https://doi.org/10.1073/pnas.12016 3297 porinas bacterianas por poliaminas.Revista de Química Biológica, 272,
18595–18601. Disponible en: https://doi.org/10.1074/
Dela Vega, AL & Delcour, AH (1996) Disminución de poliaminasEscherichia jbc.272.30.18595
colipermeabilidad de la membrana externa.Revista de Bacteriología, Jennings, E., Thurston, TLM y Holden, DW (2017)SalmonelaSPI-2
178, 3715–3721. Disponible en: https://doi.org/10.1128/ Efectores del sistema de secreción tipo III: mecanismos moleculares y
jb.178.13.3715-3721.1996 consecuencias fisiológicas.Huésped celular y microbio,22, 217–231.
Ellermeier, CD, Janakiraman, A. & Slauch, JM (2002) Construcción de Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.chom.2017.07.009
copia única dirigidalacafusiones utilizando rojo lambda y recombinación John, GS, Brot, N., Ruan, J., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P.,
específica de sitio mediada por FLP en bacterias.Gene,290, 153–161. Weissbach, H., et al. (2001) Péptido metionina sulfóxido reductasa de
Disponible en: https://doi.org/10.1016/S0378-1119(02)00551-6 Escherichia coliyTuberculosis micobacterianaprotege a las bacterias
Feasey, NA, Dougan, G., Kingsley, RA, Heyderman, RS y Gordon, contra el daño oxidativo de los intermediarios de nitrógeno reactivo.
MA (2012) Invasiva no tifoideaSalmonelaenfermedad: una enfermedad Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de
tropical emergente y desatendida en África.Lanceta,379, 2489–2499. América,98, 9901–9906. Disponible en: https://doi.org/10.1073/
Disponible en: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(11)61752-2 Fenlon, LA & pnas.161295398
Slauch, JM (2014) Phagocyte roulette inSalmonela Joshi, GS, Spontak, JS, Klapper, DG y Richardson, AR (2011)
asesinato.Huésped celular y microbio,15, 7–8. Disponible en: https://doi. El elemento móvil catabólico de arginina codificado SpeG anula la
org/10.1016/j.chom.2014.01.001 hipersensibilidad única deestafilococo aureusa las poliaminas
Fukuchi, J., Kashiwagi, K., Takio, K. & Igarashi, K. (1994) Propiedades y exógenas.Microbiología Molecular,82, 9–20. Disponible en: https://doi.
estructura de la espermidina acetiltransferasa enEscherichia coli. org/10.1111/j.1365-2958.2011.07809.x
Revista de Química Biológica,269, 22581–22585. Disponible en: Kashiwagi, K., Shibuya, S., Tomitori, H., Kuraishi, A. e Igarashi, K. (1997)
https://doi.org/10.1016/S0021-9258(17)31685-X Excreción y captación de putrescina por la proteína PotE enEscherichia
Fukuchi, J., Kashiwagi, K., Yamagishi, M., Ishihama, A. e Igarashi, K. coli.Revista de Química Biológica,272, 6318–6323. Disponible en:
(1995) Disminución de la viabilidad celular debido a la acumulación de https://doi.org/10.1074/jbc.272.10.6318
espermidina en mutantes deficientes en espermidina acetiltransferasa de Keller, C., Chattopadhyay, M. & Tabor, H. (2019) Requisito absoluto para
Escherichia coli.Revista de Química Biológica,270, 18831–18835. Disponible poliaminas para el crecimiento deEscherichia colimutantes (mnmE/G)
en: https://doi.org/10.1074/jbc.270.32.18831 defectuosos en la modificación del anticodón oscilante del ARN de
Gale, EF & Epps, HM (1944) Estudios sobre descarboxilación de aminoácidos bacterianos. transferencia.Cartas de Microbiología FEMS,366. Disponible en: https://
ylases: 1. l(+)-lisina descarboxilasa.El diario bioquímico,38, 232– 242. doi.org/10.1093/femsle/fnz110
Disponible en: https://doi.org/10.1042/bj0380232 Knorr, S., Sinn, M., Galetskiy, D., Williams, RM, Wang, C., Müller, N.,
Gardner, AM & Gardner, PR (2002) Flavohemoglobina desintoxica nítrico et al. (2018) Degradación generalizada de lisina bacteriana a través de
óxido en aeróbicos, pero no anaeróbicos,Escherichia coli. Evidencia de una glutarato y L-2-hidroxiglutarato.Comunicaciones de la naturaleza,9,
nueva actividad de eliminación de óxido nítrico anaeróbico inducible. 5071. Disponible en: https://doi.org/10.1038/s41467-018-07563-6
Revista de Química Biológica,277, 8166–8171. Disponible en: https://doi. Kröger, C., Colgan, A., Srikumar, S., Händler, K., Sivasankaran, S.,
org/10.1074/jbc.M110470200 Hammarlöf, D., et al. (2013) Una transcriptómica relevante para la infección
|1393
IWADATEET Al.
compendio paraSalmonella entericaserovariedad typhimurium.Huésped Pegues, DA y Miller, SI (2010)Salmonelaespecies, incluyendoSalmonela

celular y microbio,14, 683–695. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j. Tifo. En: Mandell, GL, Bennett, JE y Dolin, R. (Eds.)Principios y práctica
chom.2013.11.010 de las enfermedades infecciosas de Mandell, Douglas y Bennett.
Kurihara, S., Suzuki, H., Oshida, M. & Benno, Y. (2011) A novel putres- Churchill Livingstone, págs. 2887–2903.
importador de cine necesario para la motilidad de la superficie impulsada Pi, H., Wendel, BM y Helmann, JD (2020) Desregulación del magnesio
por pili tipo 1 inducida por putrescina extracelular enEscherichia coliK-12. el transporte protegeBacillus subtiliscontra la intoxicación por manganeso
Revista de Química Biológica,286, 10185–10192. Disponible en: https://doi. y cobalto.Revista de Bacteriología,202, e00711-19. Disponible en: https://
org/10.1074/jbc.M110.176032 doi.org/10.1128/JB.00711-19
Kurihara, S., Suzuki, H., Tsuboi, Y. & Benno, Y. (2009a) Dependencia de Sakamoto, A., Sahara, J., Kawai, G., Yamamoto, K., Ishihama, A., Uemura,
pululando enEscherichia coliK-12 sobre espermidina y el importador de T, et al. (2020) El mecanismo citotóxico del exceso de poliaminas funciona a
espermidina.Cartas de Microbiología FEMS,294, 97–101. Disponible en: través de la represión traduccional de proteínas específicas codificadas por
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2009.01552.x el módulo de poliamina.Revista Internacional de Ciencias Moleculares,21,
Kurihara, S., Tsuboi, Y., Oda, S., Kim, HG, Kumagai, H. y Suzuki, H. 2406. Disponible en: https://doi.org/10.3390/ijms21072406 Savarin, P.,
(2009b) El importador de putrescina PuuP deEscherichia coliK-12. Barbet, A., Delga, S., Joshi, V., Hamon, L., Lefevre, J., et al.
Revista de Bacteriología,191, 2776–2782. Disponible en: https://doi. (2010) Un papel central para las poliaminas en el ensamblaje de microtúbulos en
org/10.1128/JB.01314-08 las células. El diario bioquímico,430, 151–159. Disponible en: https://doi. org/
Lightfoot, HL & Hall, J. (2014) Función de poliamina endógena: la 10.1042/BJ20091811
perspectiva del ARN.Investigación de ácidos nucleicos,42, 11275–11290. Scallan, E., Hoekstra, RM, Angulo, FJ, Tauxe, RV, Widdowson, M.-
Disponible en: https://doi.org/10.1093/nar/gku837 A., Roy, SL, et al. (2011) Enfermedades transmitidas por los alimentos adquiridas
Limsuwun, K. & Jones, PG (2000) La espermidina acetiltransferasa es en los Estados Unidos: principales patógenos.Enfermedades infecciosas
necesarios para prevenir la toxicidad de la espermidina a bajas emergentes,17, 7–15. Disponible en: https://doi.org/10.3201/eid1701.P11101
temperaturas en Escherichia coli.Revista de Bacteriología,182, 5373–5380. Schneider, BL, Hernandez, VJ & Reitzer, L. (2013) Putrescine catab-
Disponible en: https://doi.org/10.1128/jb.182.19.5373-5380.2000 El olismo es una respuesta metabólica a varios estreses enEscherichia coli.
MacMicking, J., Xie, QW & Nathan, C. (1997) Nitric oxide and macro- Microbiología Molecular,88, 537–550. Disponible en: https://doi. org/
función del fago.Revisión anual de inmunología,15, 323–350. 10.1111/mmi.12207
Disponible en: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.15.1.323 Schneider, BL & Reitzer, L. (2012) Vía y redundancia enzimática en
Maloy, SR, Stewart, VJ y Taylor, RK (1996)Análisis genético de catabolismo de putrescina enEscherichia coli.Revista de Bacteriología,
Bacterias patógenas: un manual de laboratorio. Prensa de laboratorio de 194, 4080–4088. Disponible en: https://doi.org/10.1128/JB.05063-11
Cold Spring Harbor. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D. & D'Ari, R. (2007)Escherichia colifisio-
Mandal, S., Mandal, A., Johansson, HE, Orjalo, AV y Park, MH ología en caldo Luria-Bertani.Revista de Bacteriología,189, 8746–8749.
(2013) El agotamiento de poliaminas celulares, espermidina y espermina, Disponible en: https://doi.org/10.1128/JB.01368-07
provoca una detención total en la traducción y el crecimiento en células de Silhavy, TJ, Berman, ML y Enquist, LW (1984)Experimentos con Gene
mamífero. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos Fusiones. Laboratorio de Cold Spring Harbor.
de América,110, 2169–2174. Disponible en: https://doi.org/10.1073/ Slauch, JM (2011) ¿Cómo mata el estallido oxidativo de los macrófagos?
pnas.1219002110 ¿bacterias? Sigue siendo una pregunta abierta.Microbiología Molecular,80,
Markham, GD, Tabor, CW y Tabor, H. (1982) S-adenosilmetionina 580–583. Disponible en: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2011.07612.x
descarboxilasa deEscherichia coli. Estudios sobre el piruvato unido Soksawatmaekhin, W., Kuraishi, A., Sakata, K., Kashiwagi, K. & Igarashi, K.
covalentemente necesario para la actividad.Revista de Química Biológica, (2004) Excreción y captación de cadaverina por CadB y sus funciones
257, 12063–12068. Disponible en: https://doi.org/10.1016/S0021 fisiológicas enEscherichia coli.Microbiología Molecular,51, 1401–1412.
- 9258(18)33678-0 Disponible en: https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2003.03913.x
Matsui, I., Kamei, M., Otani, S., Morisawa, S. y Pegg, AE (1982) Srikumar, S., Kröger, C., Hébrard, M., Colgan, A., Owen, SV,
Ocurrencia e inducción de espermidina-N1-acetiltransferasa en Sivasankaran, SK, et al. (2015) RNA-seq aporta nuevos conocimientos
Escherichia coli.Comunicaciones de investigación bioquímica y sobre el transcriptoma intramacrófago deSalmonella typhimurium.
biofísica, 106, 1155–1160. Disponible en: https://doi.org/ Patógenos PLoS,11, e1005262. Disponible en: https://doi.org/10.1371/
10.1016/0006-291x(82)91233-5 journal.ppat.1005262
Michael, AJ (2016) Biosíntesis de poliaminas y poliamina- Tabor, CW & Tabor, H. (1985) Poliaminas en microorganismos.
moléculas que contienen.El diario bioquímico,473, 2315–2329. Revisiones microbiológicas,49, 81–99. Disponible en: https://doi. org/
Disponible en: https://doi.org/10.1042/BCJ20160185 10.1128/MR.49.1.81-99.1985
Michael, AJ (2018) Función de poliamina en arqueas y bacterias.Diario Tabor, CW & Tabor, H. (1987) Elvelocidadoperón deEscherichia
de Química Biológica,293, 18693–18701. Disponible en: https:// coli. Formación y procesamiento de una forma de proenzima de
doi.org/10.1074/jbc.TM118.005670 sadenosilmetionina descarboxilasa.Revista de Química Biológica, 262,
Miyamoto, S., Kashiwagi, K., Ito, K., Watanabe, S. e Igarashi, K. (1993) 16037–16040. Disponible en: https://doi.org/10.1016/S0021
Estimación de la distribución de poliaminas y estimulación de - 9258(18)47692-2
poliaminas de la síntesis de proteínas enEscherichia coli.Archivos de Tsolis, RM, Adams, LG, Ficht, TA y Baumler, AJ (1999) Contribución
Bioquímica y Biofísica,300, 63–68. Disponible en: https://doi.org/ deSalmonella typhimuriumfactores de virulencia a la enfermedad diarreica
10.1006/abbi.1993.1009 en terneros.Infección e inmunidad,67, 4879–4885. Disponible en: https://
Muhlig, A., Behr, J., Scherer, S. & Muller-Herbst, S. (2014) Stress re- doi.org/10.1128/IAI.67.9.4879-4885.1999
respuesta deSalmonella entericaserovar Typhimurium a nitrito Vázquez-Torres, A., Jones-Carson, J., Mastroeni, P., Ischiropoulos, H. &
acidificado.Microbiología Aplicada y Ambiental,80, 6373–6382. Fang, FC (2000) Acciones antimicrobianas de la oxidasa del fagocito NADPH
Disponible en: https://doi.org/10.1128/AEM.01696-14 y la sintasa de óxido nítrico inducible en la salmonelosis experimental. I.
Park, YK, Bearson, B., Bang, SH, Bang, IS y Foster, JW (1996) Interno Efectos sobre la muerte microbiana por macrófagos peritoneales activados
Crisis de pH, lisina descarboxilasa y la respuesta de tolerancia ácida de in vitro.Revista de Medicina Experimental,192, 227–236. Disponible en:
Salmonella typhimurium.Microbiología Molecular,20, 605–611. https://doi.org/10.1084/jem.192.2.227
Disponible en: https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1996.54410 70.x Vine, CE & Cole, JA (2011) Fuentes, sumideros y rutas sin resolver
vías para la recuperación de bacterias entéricas del estrés nitrosativo.
|
1394 IWADATEET Al.
Cartas de Microbiología FEMS,325, 99–107. Disponible en: https://doi. INFORMACIÓN DE SOPORTE

org/10.1111/j.1574-6968.2011.02425.x
Se puede encontrar información de apoyo adicional en línea en la
Wallis, TS & Galyov, EE (2000) Base molecular deSalmonela-inducido
sección Información de apoyo.
enteritis.Microbiología Molecular,36, 997–1005. Disponible en: https://
doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01892.x
Yamamoto, Y., Miwa, Y., Miyoshi, K., Furuyama, J. y Ohmori, H. (1997)
ElEscherichia coli ldcCEl gen codifica otra lisina descarboxilasa, Cómo citar este artículo:Iwadate Y, Ramezanifard R, Golubeva
probablemente una enzima constitutiva.Genes y Sistemas Genéticos,72, YA, Fenlon LA, Slauch JM. PaeA (YtfL) protege de
167– 172. Disponible en: https://doi.org/10.1266/ggs.72.167
Estrés de cadaverina y putrescina enSalmonelaTyphimurium
Zhou, DG & Galán, J. (2001)Salmonelaentrada en las células huésped: el trabajo en
concierto de proteínas efectoras secretadas tipo III.Microbios e yE. coli.Mol Microbiol. 2021;115:1379–1394.https://doi.
infección, 3, 1293–1298. Disponible en: https://doi.org/10.1016/S1286 org/10.1111/mmi.14686
- 4579(01)01489-7

Molecular Microbiology - 2021 - Iwadate - PaeA YtfL Protects From Cadaverine and Putrescine Stress in Salmonella - En.es

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Molecular Microbiology - 2021 - Iwadate - PaeA YtfL Protects From Cadaverine and Putrescine Stress in Salmonella - En.es

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

PaeA (YtfL) protege del estrés de cadaverina y putrescina en

Yumi Iwadate|Rouhallah Ramezanifard|Yekaterina A. Golubeva|Lucas A. Fenlon|

Departamento de Microbiología, Universidad de

SalmonelayE. colisintetizar, importar y exportar cadaverina, putrescina y espermidina para

parcialmente lapaeafenotipo, y la sobreexpresión de PaeA en fase exponencial complementa

PaeA es un exportador de cadaverina/putrescina, reduciendo niveles potencialmente tóxicos

bajo ciertas condiciones de estrés.

cadaverina, poliaminas, putrescina,Salmonela, fase estacionaria

1|INTRODUCCIÓN que posteriormente se acidifican y maduran en fagolisosomas tras la

engullen bacterias en fagosomas, síntesis de peptidoglicanos, la formación de biopelículas,

Microbiología Molecular.2021;115:1379–1394. wileyonlinelibrary.com/journal/mmi |

Tabor & Tabor, 1987).

Maceta GRAMOHIF aPAG

L-lisina L-ornitina agmatina

ldc CadA SpeF Especificaciones SpeB

responsables de la producción de poliaminas en el fagosoma, y si esto especialmente en presencia de nitrito.

afecta aún másSalmonelavirulencia. Aunque la pérdida de viabilidad en fase estacionaria en elpaeamutante

viabilidad en fase estacionaria. Estos resultados sugirieron que los

secuestrantes de óxido nítrico y las metionina sulfóxido reductasas no son

cultivan en LB5N. Por lo tanto, aunque la adición de nitrito al medio mejora la

El óxido nítrico es producido por los macrófagos (MacMicking et al., 1997)

(a) ytfK paea (ytfL) msra

Tipo salvaje Tipo salvaje

estacionaria. incubación en fase estacionaria. de tipo salvaje o ΔpaeaLas células en fase

FIGURA 3El Δpaeael mutante es sensible al (a) Sobrenadantes

El tipo salvaje y Δpaea las cepas se cultivaron Medio Medio

tipo salvaje que se mezcló 1:1 con solución salina

sobrenadante LB5N de tipo salvaje. Símbolos: 100.1-1

estándar, dondenorte=3. Sin emparejartlas ***

pruebas comparan la cepa de tipo salvaje con la 0.0101-3 ***

+-+-+-+- paeaGenotipo de células

la cepa de tipo salvaje; la supervivencia de Δpaeacepa en presencia de

paeaLa cepa es sensible específicamente a la cadaverina o, más ampliamente, a

Relación de UFC (24h / 0h)

Relación UFC (24h/0h)

Relación de UFC (24h/0h)

1.E-01 * putrescina 1.E-01 espermidina

Relación de UFC (24h / 0h)

Relación UFC (24h/0h)

1.E-05 *** 1.E-05 * Tipo salvaje

1.E-05 Tipo salvaje H

0 2.5 5 7.5 10 hn2 norte

Espermina (mM) Hespermina

Relación de UFC (24h / 0h)

1.E-1002-2 Tipo salvaje 1.E-1002-2

2.5|Evidencia de cadaverina o putrescina citoplásmica introducción de un pWKS30-cadBplásmido en un ΔpaeaLa cepa suprimió

en la Figura S7b, la incubación de tipo salvaje o Δpaealas cepas en tampón de

se lavaron y totalizaron cadaverina intracelular y

Contenido de poliamina en las células a 1h

n mol / mg peso seco

en cultivo completo (µM)

en cultivo completo (µM)

(a) LB7 (b) LB5 (C) LB5N

pW de tipo salvaje KS30 pW de tipo salvaje KS30

(d) LB5N (mi) (F)

Cadaverina en sobrenadante (µM)

(n mol / mg peso seco)

3 horas 24h 3 horas 24h

el resultado de la producción de cadaverina mediada por CadA intracelular, que

al., 2010). Curiosamente, la mayoría de los estafilococos no sintetizan ni

estos organismos son muy sensibles a la espermina y la espermidina, pero no a

selectiva de cadaverina y putrescina y esto es importante para la supervivencia