Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84

Listas de contenidos disponibles enCienciaDirecta

Informes de Bioquímica y Biofísica

revista Página de inicio:www.elsevier.com/locate/bbrep

Nueva fosfolipasa A2 ácida de Porthidium hyoprora

causa inflamación con infiltrado rico en mastocitos
Petrus Pires Marquésa,norte, Alessandra Estevesb, Marcelo Lancellottia,
Luis Alberto Ponce Sotoa, Sergio Marangonia
aDepartamento de Bioquímica y Biología de Tejidos, Instituto de Biología (IB), Universidad Estatal de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
bDepartamento de Anatomía, Instituto de Ciencias Biomédicas (ICB), Universidad Federal de Alfenas (UNIFAL), Alfenas, MG, Brasil

información del artículo resumen

Historial del artículo: Las Fosfolipasas A2 (PLA2) son un grupo de enzimas que hidrolizan los fosfolípidos en la posición sn-2 , estan
Recibido el 27 de febrero de 2015 presente en toda la naturaleza. En los animales venenosos, estas proteínas asumen un papel especial, pudiendo
Recibido en forma revisada el 8 de
ejercer diversos efectos farmacológicos. En este trabajo, los autores identificaron una nueva isoforma de PLA2 en el
marzo de 2015
veneno de Porthidium hyoprora,que se aisló a través de pasos cromatográficos secuenciales y se denominó PhTX-III.
Aceptado el 9 de marzo de 2015 Disponible en
La enzima se caracterizó bioquímica y estructuralmente. Los estudios estructurales que utilizan espectrometría de
línea el 24 de marzo de 2015
masas confirmaron una PLA2 secretora ácida, familia IIA, con masa molecular de 13 620,9 Da e identificación del
Palabras clave:
86% de su secuencia primaria. La PhTX-III no mostró efectos miotóxicos, anticoagulantes o antibacterianos, a
PhTX-III
menudo presentes en esta clase de enzimas. Aunque fue capaz de iniciar una respuesta inflamatoria, con edema
Actividad formadora de edema
local y liberación de citocinas IL-1α, IL-6 y TNF-α, probablemente debido a la desgranulación de los mastocitos.
Actividad inflamatoria
Citoquinas proinflamatorias
&2015 Los Autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo CC BY-NC-ND
licencia (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

1. Introducción Diferentes isoformas de PLA2 puede exhibir uno o más efectos

Las Fosfolipasas A2 (EC 3.1.1.4), también llamado PLA2, son un grupo
de enzimas ampliamente estudiadas que hidrolizan los fosfolípidos en el
sn-2 posición, liberando lisofosfolípidos y ácidos grasos. En los venenos de
serpiente (así como en otros animales venenosos), estas proteínas
presentan un importante lugar no solo en el proceso de digestión, sino
que pueden exhibir varios efectos farmacológicos que conducirán o
ayudarán en la captura de presas.[20].
La PLA2 se dividen en 5 familias (citosólicas, secretoras, Ca+ +-
independientes, acetilhidrolasas PAF, y lisosómicas) y 16 grupos
principales. Las PLA2 del veneno de serpiente forman parte de la
familia de las fosfolipasa A2 secretora (PLA2s), caracterizado por el
tamaño pequeño (13–18 kDa), estructura terciaria con 5–8 puentes
disulfuro, presencia de
histidina en el sitio activo y requerimiento de Ca++ para catálisis[30,8].
La PLA2 secretado de las Viperidae del nuevo mundo se clasifican en el
grupo IIA, con una masa molecular que varía entre 13 y 15 kDa, siete
puentes disulfuro conservados y una cola C-terminal de siete
residuos[14,33].
norteCorrespondencia a: Rua Geraldo Cardoso, 54, Residencial São Lucas, Alfenas, MG,
Brasil. Teléfono:þ55 35 32991302.
Correos electrónicos:petruspm@gmail.com (PP Marqués), aesteves@unifal-
mg.edu.br (A.Esteves),lancellottim@gmail.com (M. Lancellotti), poncesoto@yahoo.com.ar
(LA Ponce-Soto),marango@unicamp.br (S.Marangoni).
farmacológicos diferentes (que pueden ocurrir por acción directa o por
el producto de su catálisis) como miotoxicidad, cardiotoxicidad,
necrosis, anticoagulación, neurotoxicidad, citotoxicidad y otros[19,7].
Una misma especie puede contener diferentes isoformas de estas
moléculas, que pueden ser, en algunos casos, ácidas. A pesar de su
actividad, la PLA2 ácida generalmente muestra neurotoxicidad débil,
miotoxicidad y potencia letal in vivo, pero induce otros efectos
farmacológicos significativos como la inhibición de la agregación
plaquetaria, hipotensión, efectos inflamatorios y citotoxicidad.
Las diferentes isoformas que se encuentran en el veneno de una
serpiente cumplen diferentes funciones, como la inmovilización de presas o
la digestión. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos y las
consiguientes diferencias estructurales responderán a tales divergencias en
actividades y propiedades bioquímicas.
Porthidium hyoprora es una especie endémica de la región
noroeste de América del Sur, dentro de la selva amazónica[5]. Tal
aislamiento geográfico puede dar lugar a diferencias significativas en la
composición bioquímica del veneno de serpiente o de proteínas
específicas. El proceso de evolución a lo largo del aislamiento
geográfico podría originar diferentes variantes de una proteína,
creando una diversidad de efectos farmacológicos, y eso incluiría
PLA2s con diferentes características[11].
La relación estructura-función en las enzimas de PLA2 no está completamente
claro para todos los efectos ya informados. Sigue siendo una

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbep.2015.03.001
2405-5808/& 2015 Los autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
 PP Marqués et al. / Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84
pregunta sin resolver por qué algunas isoformas pueden desempeñar roles
específicos mientras que otras, aunque muy similares, no pueden. La falta de
algunas propiedades por parte de algunas fosfolipasas A2 y las ligeras diferencias
en sus estructuras son pistas para entender cómo actúan tales toxinas[6].
En el presente trabajo se aisló una nueva PLA2 ácida, denominada
PhTX-III, a partir del veneno de Porthidium hyoprora y caracterizado
en su estructura, bioquímica y propiedades farmacológicas, en un
esfuerzo por comprender más sobre esta clase de enzimas.
2. Material y métodos
2.1. Obtención de PhTX-III
El veneno crudo de Porthidium hyoprora (Sigma-Aldrich Chemical
Co.; St. Louis, MO, EE. UU.) se purificó a través de dos pasos
cromatográficos. Primero, se disolvieron 50 mg de veneno crudo en 1
ml de buffer de bicarbonato de amonio (AMBIC) 1 M, pH 8.0 y luego
se centrifugó a 9000g(*) durante 5 min. El sobrenadante se sometió a
cromatografía de filtración en gel utilizando columna Sephadex G75
(1,5 cm-100 cm), previamente equilibrada con AMBIC 50 mM, bajo un
caudal de 12 ml/h. Se seleccionó el conjunto activo PLA2, se liofilizó y se
disolvieron 5 mg del mismo en 120 μl de ácido trifluoroacético al 0,1 %
(v/v) (disolvente A) y 80 μl de AMBIC. La solución se centrifugó
nuevamente a 9000g durante 5 min y el sobrenadante se sometió
a una cromatografía de fase inversa en una columna C5 Supelco
(0,78x30 cm) previamente equilibrada con Disolvente A. Las muestras
se eluyeron con un gradiente lineal (0-100 %, v/v) de acetonitrilo 66 %
(disolvente B) a un caudal constante de 1,0 ml/min durante 70 min. El
perfil de elución se controló a 280 nm y las fracciones recogidas se
liofilizaron y conservaron a -20°C (Figura 1A). Todos los productos
químicos y reactivos eran de grado analítico o de secuenciación.
(*)fuerza centrifuga relativa o fuerza g.
2.2. Actividad de la PLA2
La actividad de PLA2 se midió utilizando el ensayo descrito por Cho
y Kezdy[4] y Holzer y Mackessy[15]. La mezcla de ensayo estándar
contenía 200 μL de buffer (10 mM Tris-HCl , 10 mM CaCl2 y 100 mM
NaCl , pH 8,0), 20 μL de sustrato 4-nitro-3-(octanoiloxi) ácido benzoico
(3 mM), 20 μL de agua y 20 μL de la muestra de prueba en un volumen
final de 260 μL. La mezcla se incubó hasta 40 min a 37°C, y la
absorbancia se controló cada 10 min. La actividad enzimática,
expresada como la velocidad inicial de la reacción (V0), se calculó en
base al aumento de absorbancia después de 20 min.
Figura 1. (A) Perfil de elución de una cromatografía de fase reversa del pool seleccionado de filtración en gel (pool II), utilizando columna Supelco C5. En gris, la fracción seleccionada, PhTX-III. (B)
Espectro de masas Maldi-TOF desconvolucionado de PhTX-III utilizado para determinar la masa proteica exacta y certificar la homogeneidad de la muestra.
79
2.3. Parámetros cinéticos de PhTX-III
Para la evaluación de diferentes condiciones en la actividad de la
PLA2 , el ensayo descrito anteriormente se realizó con solo cambios
puntuales en el parámetro deseado. Para la evaluación de la
temperatura, el ensayo se realizó variando la temperatura de 25°C a
45°C. La influencia del pH sobre la actividad se evaluó utilizando
diferentes buffers: tampón de citrato de sodio (pHs 4,0–5,0); tampón
Tris-HCl (6,0-8,0); tampón de glicina (9,0–10,0). La influencia de los iones
divalentes en la reacción se realizó sustituyendo el Ca2+ por Ba2+, zinc2+,
Mn2+o Mg2+, o añadiendo estos iones y reduciendo la cantidad de calcio
de 10 mM a 1 mM. La influencia de la concentración de sustrato se
midió variando la concentración de ácido 4-nitro-3-(octanoiloxi)
benzoico de 0,05 a 10mM.
2.4. Determinación de la masa molecular por espectrometría de masas
Se inyectó una alícuota (45 μL) de PhTX-III en una columna C18 (100
μmx100 μm) en un RP-UPLC (nanoAcquity UPLC, Waters). La UPLC se
combinó con espectrometría de masas en tándem de nanoelectrospray en
un espectrómetro de masas QT of Ultima API (MicroMass/Waters) a un
caudal de 600 nl/min. El gradiente fue de 0 a 50 % de acetonitrilo en ácido
fórmico al 0,1 % durante 45 min. El instrumento se operó en modo MS
continuo y la adquisición de datos fue de m/z 100 a 3000 a una velocidad de
escaneo de 1 s y un retraso entre escaneos de 0,1 s. Los espectros se
acumularon en unos 300 escaneos y los datos cargados múltiples
producidos por el espectrómetro de masas en el m/z escala se convirtieron a
la escala de masa (peso molecular) utilizando el software basado en entropía
máxima suministrado con el paquete de software Masslynx 4.1. Los
parámetros de procesamiento fueron: rango de masa de salida 6000-20 000
Da a una "resolución" de 0,1 Da/canal; el modelo de patrón de isótopos
simulado se usó con el parámetro de ancho de desenfoque de espectro
establecido en 0,2 Da y las relaciones de intensidad mínima entre picos
sucesivos fueron del 20% (izquierda y derecha). A continuación, se suavizó el
espectro desconvolucionado (2x3 canales, Savitzky Golay smooth) y se
obtuvieron los valores del centroide de masa utilizando el 80 % de la parte
superior del pico y un ancho de pico mínimo a la mitad de la altura de cuatro
canales.
2.5. Análisis y digestión tríptica
La proteína se redujo con DTT (en una concentración final de 5 mM)
durante 25 min a 56°C y se alquiló con yodoacetamida (en una concentración
final de 14 mM) durante 30 min antes de la adición de tripsina (grado de
secuenciación de Promega modificado). Después de la adición de tripsina (20
ng/μL en tampón de bicarbonato de amonio 0,05 M),
80 PP Marqués et al. / Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84
la muestra se incubó durante 16 h a 37°C. Para detener la reacción se
añadió ácido fórmico al 0,4% y la muestra se centrifugó a 2500 rpm durante
10 min. Se descartó el sedimento y se secó el sobrenadante en un speed vac.
Los péptidos resultantes se separaron por C18 (100umx100 mm) RP- UPLC
(nanoAcquity UPLC, Waters) junto con espectrometría de masas en tándem
de nanoelectrospray en un espectrómetro de masas QTof Ultima
API (MicroMass/Waters) a un caudal de 600 nl/min. Antes de realizar un
espectro de masas en tándem, se adquirió un espectro de masas ESI/MS
(modo TOF MS) para cada fracción de HPLC en el rango de masas de 100–
2000m/z, para seleccionar el ion de interés; posteriormente, estos iones se
fragmentaron en la celda de colisión (modo TOF MS/MS). Los archivos de
datos sin procesar de las ejecuciones de LC–MS/MS se procesaron con el
paquete de software Masslynx 4.1 (Waters) y se analizaron con el motor de
búsqueda MASCOT versión 2.3 (Matrix Science Ltd.) contra la base de datos
de serpientes, utilizando los siguientes parámetros: tolerancia de masa
peptídica de ±0,1 Da, tolerancia de masa de fragmentos de ±0,1 Da, y
oxidación como modificaciones variables en metionina y tripsina como
enzima.
2.6. Evaluación de miotoxicidad
Ratones machos suizos (18–20 g; n=5) recibió una inyección
intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.) de 20ug de PhTX-III en solución
salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 0,12 M, fosfato de sodio 0,04
M, pH 7,2) en un volumen total de 50ul. El grupo i.m. recibió la
inyección en el músculo gastrocnemio y el grupo i.v. en la vena de la
cola. Los grupos de control recibieron solo PBS. Se recogió sangre de la
cola en tubos capilares heparinizados después de dos horas y se
determinó la actividad de la creatina quinasa plasmática (CK; EC 2.7.3.2)
mediante un ensayo cinético Ck-Nac, (creatina quinasa, Beacon
Diagnostics, Alemania). Los resultados se expresaron en U/L según el
fabricante.
2.7. Actividad antibacterial
La capacidad antibacteriana de PhTX-III se probó mediante la prueba de
difusión en agar, según Bauer (1966). Se utilizaron seis cepas de bacterias:
Escherichia coli (E.coliATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa
ATCC 27853; P. aeruginosa 31NM) y Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC
25923; S. aureus BEC9393; S. aureus Rib1). Los antibióticos disponibles
comercialmente Ofloxacin e Imipinen se usaron como controles positivos. La
PLA2 aislado fue probado en dosis crecientes hasta 200ug/ml.
2.8. Actividad anticoagulante
Se usó sangre de ratones machos suizos en las dos pruebas anticoagulantes
diferentes. Pruebas de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) y tiempo
de protrombina (PT). La sangre se recogió por punción cardíaca en tubos que
contenían citrato al 3,8% en una relación de volumen de 9:1. La sangre se
centrifugó y sólo se usó plasma en las pruebas. El volumen de plasma utilizado en
los experimentos fue de 45ul con 5ul de solución de toxina. Pruebas de control
utilizadas 50ul de plasma. Ambas pruebas utilizaron kits disponibles en el mercado
y coagulómetro automático.
2.9. Inducción de edema de pata de rata
Ratones machos suizos (18–20 g; n=5) recibieron inyecciones
subplantares de 5 a 40 μg de PhTX-III en PBS; en un volumen total de 50 ul
Los grupos de control recibieron solo el PBS. La hinchazón de la pata se
midió con un Calibrador Electrónico Serie 1101 (INSIZE LTDA, SP, Brasil) a
las 0,5, 3, 6 y 24 h después de la administración. El edema se expresó
como el aumento porcentual del tamaño del grupo tratado en
comparación con el grupo de control en cada momento. La dosis
edematógena mínima se definió como la dosis necesaria para provocar un
aumento del 30% en el tamaño de la pata.
2.10. Cuantificación de citoquinas
Ratones machos suizos (18–20 g; n=5) se les inyectó una dosis 10ug de
PhTX-III en el músculo tibial. Posteriormente, se recogieron muestras de sangre
de los animales en diferentes momentos utilizando capilares heparinizados para
comprobar el perfil de citocinas plasmáticas a lo largo del tiempo. Las
concentraciones de interleucina 1α (IL-1α), interleucina 6 (IL-6) y factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-α) se determinaron utilizando kits ELISA disponibles
comercialmente (BD OptEIA, BD Biosciences) siguiendo las instrucciones
proporcionadas.
2.11. Análisis morfológico
Ratones machos suizos (18–20 g; n=5) En los músculos gastrocnemios se
inyectaron 10 μg de PhTX-III disueltos en PBS, en un volumen total de 50 μl
o solo tampón PBS (control). Después de una hora, los animales fueron
sacrificados por dislocación cervical y se les extirparon los músculos y se
fijaron con solución de formaldehído al 10% en tampón de Millonig (fosfato
de sodio 0,13 M, NaOH 0,1 M, pH 7,4) durante doce horas a 4ºC.
Posteriormente, los músculos inyectados se lavaron con agua, se
deshidrataron con etanol, se diafanizaron con xileno y se incluyeron en
parafina. Secciones longitudinales y transversales de 7um se tiñeron con
hematoxilina-eosina (HE) y tinción Dominici y se analizaron con un
microscopio óptico Carl Zeiss Axio Scope.A1. Las fotografías se obtuvieron
utilizando Carl Zeiss AxioCam ICc3.
Se realizó una tinción de Dominici modificada basada en Litt[22]. Las
secciones se tiñeron en una mezcla de fucsina ácida y Orange G durante 30
min. Después de un enjuague rápido en etanol al 60%, se tiñeron con azul
de toluidina al 0,75% durante 20 s. Las soluciones se prepararon según
Tolosa[35].
3. Resultados
3.1. Estudios de estructura enzimática
La espectrometría de masas atestiguó la homogeneidad de la toxina después
de la purificación y reveló su masa molecular exacta como 13 620.9 Da (Figura
1B).
Los péptidos obtenidos por digestión tríptica se sometieron a
análisis MS/MS y los datos sin procesar se procesaron utilizando el
software Mascot MS/MS Ion Search. Fue posible obtener el 86% de la
estructura primaria PhTX-III. La proteína tenía su estructura
parcialmente deducida por comparación con otras proteínas cuyos
datos ya estaban disponibles en bases de datos (NCBI y UniProt). A
través de tales comparaciones, fue posible alinear la estructura
primaria de PhTX-III con otra PLA2 similar revelando gran similitud con
otras toxinas de diferentes venenos de serpientes (Figura 2). El
alineamiento se realizó con Clustal Omega[13,32,25].
Algunos residuos notables están presentes en la secuencia: El bucle
de unión al calcio, comprendido entre los residuos 25 y 33, Y–G–C–Y–C–
G–X–G–G (siendo X una sustitución de serina en PhTX-III); el fragmento
C–C–F–V–H–D–C–C–Y–G–K, muy conservado en el PLA2, entre los
residuos 43 y 53, que contiene parte del sitio activo: H48, D49, Y52, D99.
Las técnicas aplicadas revelaron una proteína con alta identidad con
otras PLA2 ya caracterizadas (hasta un 75% de identidad), todos ellos
aislados de venenos de serpiente, ácidos y con 122 aminoácidos. Esa es
una fuerte indicación de que PhTX-III es un PLA2 ácido lo que luego fue
confirmado por la predicción del punto isoeléctrico, estimado en 5.04,
utilizando el software EMBOSS Pepstats [13,25,28,32].
 PP Marqués et al. / Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84
Figura 2. (A) Alineación y comparación de péptidos obtenidos con PhTX-III con otros PLA2 ácidos de los venenos de serpiente. Todas las moléculas comparadas son PLA2 ácido aislado de
serpientes: Bothrops diporo (UniProt I2DAL4; UniProt I2DAL5), Bothrops erythromelas (UniProt Q2HZ28), Trimeresurus gramineus (UniProt P81479; P81480), Ambosrops pictus
(UniProt Q9I8F8). El asterisco (*) significa consenso total para ese residuo, dos puntos (:) significa consenso parcial. Los residuos ácidos están marcados en rojo.
3.2. Actividades enzimáticas y biológicas
La PhTX-III presenta actividad fosfopolipolítica frente al sustrato
cromogénico ácido 4-nitro-3-(octanoiloxi) benzoico. La temperatura y el
pH óptimos son 37°C (Fig. 3A) y 8.0 (Fig. 3B), respectivamente. La
velocidad máxima obtenida por los estudios de concentración de
sustrato fue de 10,81 U, con una Km de 4,43 mM. La enzima depende
de los iones de calcio para funcionar correctamente y la incubación con
otros iones divalentes conduce a la pérdida de actividad catalítica. Entre
los iones probados, el medio que contenía magnesio retuvo alrededor
del 75 % de la actividad enzimática, y ese es el mejor resultado. El zinc
inhibe totalmente cualquier rastro de actividad enzimática (Fig. 3D).
La dosis máxima probada de 20ug de PhTX-III, no muestran
miotoxicidad ni actividad anticoagulante. Las inyecciones
intramusculares e intravenosas no conducen a aumentos en el
contenido plasmático de CK, lo que indicaría lesión muscular. La
proteína tampoco puede ejercer ninguna actividad antibacteriana
incluso en dosis muy altas, hasta 200ug/ml.
Como se ha dicho, la toxina estudiada no muestra efecto anticoagulante.
En la prueba PT, el tiempo de confección fue de 20,97 ± 1,33 en el grupo
control y 21,5 ± 2,69 en presencia de PhTX-III. Para la prueba de aPTT, los
tiempos de coagulación fueron 33,17 ± 3.03 y 37.1 ± 1,65 en el grupo control
y con toxina añadida, respectivamente. En ambos casos, no hubo diferencia
estadística.
PhTX-III exhibió un efecto inflamatorio intenso evaluado por análisis de
citocinas y formación moderada de edema posterior a la inyección en la
almohadilla plantar. El efecto edematógeno se controló en el transcurso de 24 h y
reveló una relación dependiente de la dosis en el tamaño y la persistencia del
edema. La dosis edematógena mínima encontrada fue de 5 μg, lo que provocó un
aumento del tamaño de la pata del 30% después de una hora. En este mismo
tiempo, las dosis de 20 y 40 μg provocaron un aumento de tamaño del 39% y 51%,
respectivamente (Figura 4). Las dosis más bajas no muestran signos de edema
después de 24 h, pero en la más alta, el edema persistió, con un tamaño de la pata
aumentado en un 27%.
Treinta minutos después de la inyección de la toxina, los niveles de citocinas
inflamatorias IL-1α, IL-6 y TNF-α comenzaron a mostrar un perfil diferente en
comparación con los ratones de control, inyectados con PBS. TNF-α alcanzó su
punto máximo una hora después de la inyección de toxina (alcanzando 2496,35 ±
210,54 U/ml), pero su concentración descendió rápidamente, situándose cerca
de los niveles basales a las 3 h. Los niveles de IL-6 comenzaron a
81
aumentar después de 0,5 h, alcanzando su pico de 108,65 ± 2,41 pg/ml a las 3 h.
Posteriormente, su concentración comenzó a disminuir alcanzando niveles basales
después de 12 h. La concentración de IL-1α aumentó una hora después de la
inyección de la toxina, y mantuvo su comportamiento hasta las 6 h, donde alcanzó
una concentración máxima que persistió hasta las 12 h (Figura 5). El aumento de la
concentración de citoquinas es otra evidencia de las propiedades inflamatorias de
PhTX-III.
Las secciones histológicas en los músculos inyectados con tampón PBS o
PhTX-III confirmaron que la toxina no causa daño muscular, lo que se
confirma mediante el análisis de CK. La integridad muscular fue clara en
ambos casos. La diferencia que se observa es la gran cantidad de infiltrado
inflamatorio presente en los músculos inyectados con la toxina, con gran
cantidad de leucocitos. La tinción de Dominici hizo posible la identificación
de estas células como mastocitos (Figura 6).
4. Discusión
En un esfuerzo constante por develar la relación entre estructura y
función del PLA2, nuestro grupo aisló una nueva isoforma ácida del
veneno de Porthidium hyoprora, con alta actividad catalítica pero
incapaz de ejercer actividades miotóxicas, anticoagulantes o
antibacterianas.
Después del aislamiento de PhTX-III, los estudios de estructura primaria
lo identificaron como un grupo IIA PLA2[30]. La comparación de la estructura
primaria parcial con otros PLA2 atestiguó hasta un 75% de identidad con
isoformas ácidas de esa enzima de venenos de diferentes especies de
serpientes (Figura 2). Si se observa correctamente enFigura 2, las secuencias
de residuos conservadas comienzan y terminan siempre un aminoácido
antes de lo habitual por estas enzimas. Esto sucede debido a una
eliminación de un residuo, temprano en la cadena, y ocurre con frecuencia
en el grupo ácido IIA PLA2, sin embargo se utiliza la numeración habitual
para describir las regiones conservadas[37,39,29]. Esta observación, junto
con la predicción del punto isoeléctrico, es otra indicación de que la enzima
es ácida.
La actividad fosfolipolítica de PhTX-III se evaluó utilizando el
sustrato sintético 4-nitro-3-(octanoiloxi)ácido benzoico y los valores de
temperatura y pH óptimos encontrados fueron 37°C y 8.0,
respectivamente, que son valores muy comunes y típicos para estas
enzimas[36,2,10,16,17,27]. Comparando la actividad de PhTX-III en un
82 PP Marqués et al. / Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84

Fig. 3.Actividades de PhTX-III en diferentes circunstancias. (A y B) Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática, respectivamente. (C) Efecto de la concentración de sustrato sobre PhTX-III
usando sustrato cromogénico ácido 4-nitro-3-(octanoiloxi)benzoico. (D) Efectos de diferentes iones divalentes sobre la actividad PhTX-III, con o sin adición de Ca+2

medio que contiene calcio, los diferentes iones divalentes no pueden soportar
adecuadamente la actividad enzimática. Otros iones divalentes parecen competir
por el sitio de unión del calcio, y aquellos con radios iónicos más similares, como
Zn2+ tienden a causar una inhibición más efectiva[40].
Es habitual encontrar PLA2 ácido de veneno de serpiente con una
presencia leve de efectos farmacológicos o totalmente ausentes [18,9,38].
PhTX-III carece de algunas propiedades farmacológicas probadas,
generalmente presentadas por sus contrapartes básicas. Incluso en dosis
altas, PhTX-III no puede ejercer actividades miotóxicas, anticoagulantes o
antimicrobianas.
La región predicha como responsable de los efectos miotóxicos del
PLA2, comprendida entre los residuos 79 y 87 contiene
aminoácidos cargados negativamente y una cantidad muy pequeña de
cargas positivas en PhTX-III. Kini y evans[20]afirmado en base a la
observación de varias fosfolipasas A2 miotóxicas que esta región
normalmente debe contener una gran cantidad de residuos cargados
positivamente para causar miotoxicidad. De igual forma, el sitio
enzimático considerado fundamental para la observación de los efectos
antibacterianos, debe ser rico en aminoácidos básicos. Esta zona, la
región C-terminal del PLA2, contiene varios residuos cargados
negativamente, lo que probablemente sea el responsable de su falta de
actividad antibacteriana.
Incluso con la ausencia de algunos efectos farmacológicos clásicos,
PhTX-III exhibe propiedades inflamatorias intensas, con formación
 PP Marqués et al. / Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84
de edema y aumento de la concentración plasmática de citocinas inflamatorias de
fase aguda (higos. 4 y 5). Los edemas son causados por el aumento de la
permeabilidad microvascular y aparecen después de 1 h de inyección de PhTX-III
en la pata de los ratones. Los edemas pueden ser inducidos
Figura 4.Actividad de formación de edema en ratones peón después de la inyección de PhTX-III. Los
resultados se muestran en porcentaje de aumento del peón trasero tras la aplicación de diferentes
concentraciones de toxina, desde 0,5 hasta 24 h. La dosis edematógena mínima determinada fue de
5 ug.
Figura 5.Concentración plasmática de citocinas IL-1α (pg/ml), IL-6 (pg/ml) y TNF-α (U/ml) a lo largo
de 12 h tras la inyección de la toxina. Los marcadores vacíos representan mediciones realizadas
en el grupo de control y los marcadores llenos, el grupo que recibió PhTX-III.
Figura 6.Secciones de los músculos gastrocnemios de ratones inyectados con PhTX-III o tampón de fosfato, donde: A, B, C: sección de músculo teñida con HE, inyectada con tampón de
fosfato (A) y PhTX-III (B y C). D, E, F: sección de músculo teñida con Dominici, inyectada con tampón de fosfato (D) y PhTX-III (E, F). Barra en A, B: 40 μm. Barra en C, D, E, F: 20 μm.
83
por ácido araquidónico, resultante de la catálisis de fosfolipasa A2, y
por la liberación de IL-1[1,31].
Huancahuire-Vega et al.[17]estudiando otra PLA2 del mismo veneno,
PhTX-I, comprobó su capacidad de elevar la concentración plasmática de
IL-6, con un pico de 95 pg/ml a las 3 h de la inyección. PhTX-III provoca un
pico de citocina al mismo tiempo después de la inyección, pero con una
liberación de IL-6 más pronunciada, de 147 pg/ml. Otros autores obtuvieron
resultados similares con diferentes PLA2 con capacidad inflamatoria de
diferentes fuentes. En ellos, las concentraciones séricas de citoquinas
alcanzaron su punto máximo alrededor de tres horas después de la
inyección de la toxina, al igual que en el presente artículo, pero con menor
intensidad. [23,2].
La investigación utilizando una PLA2 aislada de Bothrops
roedingeri reveló altas capacidades inflamatorias, con un
comportamiento similar [12]. Como afirma el investigador, es probable
que TNF-α sea inducido por acción de PLA2 , que induciría la
expresión de selectinas dando como resultado la liberación de otras
interleucinas, como IL-1 e IL-6.
Las observaciones histológicas en los tejidos inyectados con toxina no
revelan daño muscular, sino una gran cantidad de infiltrado inflamatorio,
con un gran número de células. La tinción de Dominici hizo posible la
identificación de estos como mastocitos, como se sospechaba por
observaciones previas en secciones teñidas con HE. Dado que PhTX-III no
causó daño tisular ni hemorragia, la fuente de citoquinas puede explicarse
por la desgranulación de los mastocitos.[12,34].
Algunas fosfolipasas A2 puede actuar sobre las células sanguíneas,
incluidos los neutrófilos[24], macrófagos[41]e inducción de la
desgranulación de mastocitos[3,21]. Como se mencionó en la Sección 1,
muchos efectos farmacológicos causados por PLA2 requiere actividad
catalítica o la presencia de cargas positivas en su superficie para interactuar
con el objetivo, y la desgranulación de mastocitos no es una excepción a
esta regla[26].
En base a los resultados expuestos, al menos una parte de las
manifestaciones inflamatorias pueden deberse a la desgranulación de los
mastocitos, provocada por la acción de PhTX-III. Aunque PhTX-III es una
enzima ácida, todavía contiene residuos cargados positivamente, en menor
proporción. Más estudios de actividades y comparación de estructura con
otras PLA2, básicos y ácidos, pueden conducir a futuras pistas sobre cuál es
el sitio específico de interacción entre PLA2 y mastocitos.
84 PP Marqués et al. / Informes de bioquímica y biofísica 1 (2015) 78–84
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a CAPES, Brasil, por el apoyo financiero
Apéndice A. Documento de transparencia
El documento de transparencia asociado con este artículo se puede
encontrar en la versión en línea enhttp://dx.doi.org/10.1016/j.bbrep.
2015.03.001.
Referencias
[1]AK Abbas, AH Lichtman, S. Pillai, Imunobiologia Celular e Molecular, Elsevier Editora,
2008.
[2]AK Calgarotto, DCS Damico, LA Ponce-Soto, PA Baldasso, SL Da Silva, GH
MF Souza, MN Eberlin, S. Marangoni, Caracterización biológica y bioquímica de la
nueva fosfolipasa básica A2 BmTX-I aislada deBothrops moojeni veneno de
serpiente, Toxicon 51 (8) (2008) 1509–1519.
[3]F. Chaves, G. León, VcH Alvarado, JMa Gutiérrez, Modulación farmacológica del
edema inducido por las fosfolipasas A2 miotóxicas Lys-49 y Asp-49 aisladas del
veneno de serpienteBothrops asper (terciopelo), Toxicón 36 (12) (1998) 1861–1869.
[4]W. Cho, FJ Kezdy, Sustratos cromogénicos y ensayo de fosfolipasas A2, Methods
Enzymol. 197 (1991) 75–79.
[5]DF Cisneros-Heredia, et al., Distribución e historia natural de las víboras cabeza de
sapo ecuatorianas del género Bothrocophias, Herpetozoa 19 (2006) 10.
[6]FF Davidson, EA Dennis, Relaciones evolutivas e implicaciones para la regulación de la
fosfolipasa A2 del veneno de serpiente a formas secretadas por humanos, J. Mol.
Evol. 31 (1990) 228–238.
[7]R. Doley, X. Zhou, RM Kini, Enzimas de fosfolipasa A2 de veneno de serpiente, en: S.
P. Mackessy (Ed.), Manual de Venenos y Toxinas de Reptiles, CRC Press, Boca Raton,
EE. UU., 2010.
[8]RE Duncan, E. Sarkadi-Nagy, K. Jaworski, M. Ahmadian, HS Sul, Identificación y
caracterización funcional de la fosfolipasa A2 específica de tejido adiposo (AdPLA),
J. Biol. química 283 (37) (2008) 25428–25436.
[9]J. Fernández, JM Gutiérrez, Y. Angulo, L. Sanz, P. Juárez, JJ Calvete,
B. Lomonte, Aislamiento de una fosfolipasa A2 ácida del veneno de la serpiente
asperde Costa Rica: caracterización bioquímica y toxicológica, Biochimie 92 (3)
(2010) 273–283.
[10]RS Floriano, VC Carregari, VA de Abreu, B. Kenzo-Kagawa, LA Ponce-Soto,
MA da Cruz-Höfling, S. Hyslop, S. Marangoni, L. Rodrigues-Simioni, Estudio
farmacológico de un nuevo Asp49 fosfolipasa A2 (Bbil-TX) aislado de Bothriopsis
bilineata esmargadina (veneno de víbora del bosque) en preparaciones
neuromusculares de vertebrados, Toxicon 69 (0) (2013) 191–199.
[11]JL Glenn, RC Straight, MC Wolfe, DL Hardy, variación geográfica en Crotalus
scutulatusscutulatus (serpiente de cascabel de Mojave) propiedades del veneno,
Toxicon 21 (1983) 119–130.
[12]MA Gomes Heleno, PA Baldasso, LA Ponce-Soto, S. Marangoni, Caracterización
bioquímica y propiedades farmacológicas de la nueva PLA2 básica BrTX-I aislada de
Bothrops roedingeri (Lancehead de Roedinger) Mertens, 1942, Snake Venom,
BioMed. Res. En t. 2013 (2013) 13.
[13]M. Goujon, H. McWilliam, W. Li, F. Valentin, S. Squizzato, J. Paern, R. Lopez, Un nuevo
marco de herramientas de análisis bioinformático en EMBL-EBI, Nucleic Acids Res.
38 (edición del servidor web) (2010) W695–699.
[14]RL Heinrikson, ET Krueger, PS Keim, Secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa A2-
alfa del veneno de Crotalus adamanteus. Una nueva clasificación de fosfolipasas A2
basada en determinantes estructurales, J. Biol. química 252 (14) (1977) 4913–4921.
[15]M. Holzer, SP Mackessy, Un ensayo de punto final acuoso de la fosfolipasa A2 del
veneno de serpiente, Toxicon 34 (10) (1996) 1149–1155.
[dieciséis]S. Huancahuire-Vega, LA Ponce-Soto, D. Martins-de-Souza, S. Marangoni,
Caracterización estructural y funcional de las brazilitoxinas II y III (BbTX-II y -III), dos
miotoxinas del veneno deBothrops brasilserpiente, Toxicon 54 (6) (2009) 818–827.
[17]S. Huancahuire-Vega, LA Ponce-Soto, D. Martins-de-Souza, S. Marangoni,
Caracterización bioquímica y farmacológica de PhTX-I, una nueva fosfolipasa A2
miotóxica aislada dePorthidium hyoproraveneno de serpiente, Comp. Bioquímica
Fisiol. Parte C: Toxicol. Farmacol. 154 (2) (2011) 108–119.
[18]DFJ Ketelhut, M. Homem de Mello, ELG Veronese, LE Esmeraldino, M.
T. Murakami, RK Arni, JR Giglio, ACO Cintra, SV Sampaio, Aislamiento,
caracterización y actividad biológica de isoformas ácidas de fosfolipasa A2 de
Bothrops jararacussuveneno de serpiente, Biochimie 85 (10) (2003) 983–991.
[19]RM Kini, Fosfolipasa A2: un complejo rompecabezas de proteínas multifuncionales, en: R.
M. Kini (Ed.), Venom Phospholipase A2 Enzymes: Structure, Function and
Mechanism, John Wiley & Sons, Chichester, Inglaterra, 1997, págs. 1–28.
[20]RM Kini, HJ Evans, Una región citolítica común en miotoxinas, hemolisinas,
cardiotoxinas y péptidos antibacterianos, Int. J. Péptido Proteína Res. 34 (4) (1989)
277–286.
[21]ECT Landucci, RC Castro, MF Pereira, ACO Cintra, JR Giglio, S. Marangoni,
B. Oliveira, G. Cirino, E. Antunes, G. De Nucci, Desgranulación de mastocitos
inducida por dos homólogos de fosfolipasa A2: disociación entre actividades
enzimáticas y biológicas, Eur. J. Pharmacol. 343 (2–3) (1998) 257–263.
[22]M. Litt, Estudios en eosinofilia experimental. V. Eosinófilos en ganglios linfáticos de
cobayos después de estimulación antigénica primaria, Am. J. Pathol. 42 (1963) 529.
[23]B. Lomonte, A. Tarkowski, L. Hanson, Respuesta del anfitrión aasperveneno de
serpiente, Inflamación 17 (2) (1993) 93–105.
[24]B. Lomonte, A. Tarkowski, L.Å. Hanson, Amplia especificidad citolítica de la miotoxina
II, una lisina-49 fosfolipasa A2 deasperveneno de serpiente, Toxicon 32
(11) (1994) 1359–1369.
[25]H. McWilliam, W. Li, M. Uludag, S. Squizzato, YM Park, N. Buso, AP Cowley,
R. López, Herramienta de análisis de servicios web del EMBL-EBI, Nucleic Acids Res. 41
(edición del servidor web) (2013) W597–600.
[26]M. Murakami, N. Hara, I. Kudo, K. Inoue, Activación de la desgranulación en
mastocitos por fosfolipasa A2 de tipo II exógena, J. Immunol. 151 (10) (1993) 5675–
5684.
[27]JA Pereanez, V. Nunez, S. Huancahuire-Vega, S. Marangoni, LA Ponce-Soto,
Caracterización bioquímica y biológica de un PLA(2) a partir del complejo de
crotoxina deCrotalus durissus cumanensis,Toxicón 53 (5) (2009) 534–542.
[28]P. Rice, I. Longden, A. Bleasby, EMBOSS: la suite europea de software abierto de
biología molecular, Trends Genet. 16 (6) (2000) 276–277.
[29]DR Rokyta, KP Wray, AR Lemmon, EM Lemmon, SB Caudle, Un transcriptoma de
glándula venenosa de alto rendimiento para la serpiente de cascabel de espalda de
diamante del este (Crotalus adamanteus)y evidencia de selección positiva
generalizada entre clases de toxinas, Toxicon 57 (5) (2011) 657–671.
[30]RH Schaloske, EA Dennis, La superfamilia de fosfolipasa A2 y su sistema de
numeración de grupos, Biochim. Biografía. Acta (BBA) – Mol. Biol celular. Lípidos
1761 (11) (2006) 1246–1259.
[31]F. Sebia-Amrane, F. Laraba-Djebari, Farmacomodulaciones del edema inducido y
cambios en la permeabilidad vascular porVipera lebetinaveneno: mecanismos
inflamatorios, Inflamación 36 (2) (2013) 434–443.
[32]F. Sievers, A. Wilm, D. Dineen, TJ Gibson, K. Karplus, W. Li, R. López,
H. McWilliam, M. Remmert, J. Soding, JD Thompson, DG Higgins, Generación rápida
y escalable de alineaciones de secuencias múltiples de proteínas de alta calidad
utilizando Clustal Omega, Mol. sist. Biol. 7 (2011) 539.
[33]DA Six, EA Dennis, La superfamilia en expansión de enzimas fosfolipasa A2:
clasificación y caracterización, Biochim. Biografía. Acta (BBA) – Mol. Biol celular.
Lípidos 1488 (1–2) (2000) 1–19.
[34]P. Starkl, T. Marichal, SJ Galli, PLA2G3 promueve la maduración y función de los
mastocitos, Nat. inmunol. 14 (6) (2013) 527–529.
[35]EMCd Tolosa, et al., Manual de técnicas para histologia normal e patológica, (2nd ed.),
Manole, Barueri (2003) 341.
[36]MH Toyama, DG de Oliveira, LOS Beriam, JC Novello, L. Rodrigues-Simioni,
S. Marangoni, Propiedades estructurales, enzimáticas y biológicas de la nueva
isoforma PLA2 deCrotalus durissus terrificusveneno, Toxicon 41 (8) (2003) 1033–
1038.
[37]IH Tsai, YM Wang, YH Chen, AT Tu, Variaciones geográficas, clonación y análisis
funcional de las fosfolipasas ácidas A2 del veneno deCrotalus viridis viridis,Arco.
Bioquímica Biografía. 411 (2) (2003) 289–296.
[38]M. Van der Laat, J. Fernández, J. Durban, E. Villalobos, E. Camacho, JJ Calvete,
B. Lomonte, Secuencia de aminoácidos y caracterización biológica de BlatPLA2, una
fosfolipasa A2 ácida no tóxica del veneno de la serpiente arbórea Bothriechis
lateralisde Costa Rica, Toxicón 73 (0) (2013) 71–80.
[39]YM Wang, J. Parmelee, YW Guo, IH Tsai, Ausencia de fosfolipasa A (2) en la mayoría de los
venenos de Crotalus horridus debido al bloqueo de la traducción: comparación con
Crotalus horridus atricaudatusveneno, Toxicon 56 (1) (2010) 93–100.
[40]BZ Yu, OG Berg, MK Jain, El catión divalente es obligatorio para la unión de ligandos al
sitio catalítico de la fosfolipasa A2 secretada, Bioquímica 32 (25) (1993) 6485–6492.
[41]JP Zuliani, JM Gutiérrez, LLC e. Silva, SC Sampaio, B. Lomonte, C. d. F.
P. Teixeira, Activación de funciones celulares en macrófagos por las fosfolipasas A2
secretoras de veneno Asp-49 y Lys-49, Toxicon 46 (5) (2005) 523–532.