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Wu,  J.,  Miller,  SA,  Hall,  HK  y  Mooney,  P.  2009.  Factores  que  afectan  la  eficiencia  de  la  
micropropagación  de  yemas  laterales  y  puntas  de  brotes  de  Rubus.
Tejido  de  células  vegetales  y  cu...

Artículo  en  Plant  Cell  Tissue  and  Organ  Culture  ∙  Enero  2009

CITAS LEE

5 697

4  autores:

Jin­Hu  Wu  ( )  El  Instituto   Harvey  Kenneth  Pasillo

de  Nueva  Zelanda  para  la  Investigación  de  Plantas  y  Alimentos  Ltd. Shekinah  Bayas  Ltd

10  PUBLICACIONES  35  CITAS 55  PUBLICACIONES  802  CITAS

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shirley  molinero paulina  mooney
a  nivel  de  planta Grupo  de  Trabajo  de  Innovación  Alimentaria

20  PUBLICACIONES  253  CITAS 23  PUBLICACIONES  549  CITAS

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Plant  Cell  Tiss  Organ  Cult  (2009)  99:  17–25  DOI  
10.1007 /  s11240­009­9571­5

PAPEL  ORIGINAL

Factores  que  afectan  la  eficiencia  de  la  micropropagación  de  yemas  
laterales  y  puntas  de  brotes  de  Rubus

Jin­Hu  Wu  y  Shirley  A.  Miller  y  Harvey  K.  Hall  y  Pauline  
A.  Mooney

Recibido:  23  de  enero  de  2009 /  Aceptado:  14  de  julio  de  2009 /  Publicado  en  línea:  5  de  agosto  de  2009
Springer  Science+Business  Media  BV  2009

Resumen  Se  investigaron  los  factores  que  afectan  la  eficiencia   medio  de  la  mitad  a  un  tercio,  con  adición  de  0,49  lM  de  ácido  
de  la  micropropagación  de  32  selecciones  de  Rubus,  incluidas   indol­3­butírico  y  0,05%  de  carbón  activado,  y  colocando  los  
las  etapas  de  pretratamiento  y  cultivo  de  iniciación.  El   cultivos  bajo  una  intensidad  de  luz  reducida  (17  lmol  m­2  s  
­1
enfriamiento  a  4°C  durante  6  semanas  como  pretratamiento   mejorar  la   ),  se  encontró  que  alivia  la  clorosis  y
promovió  significativamente  el  cultivo  de  iniciación  in  vitro;   micropropagación  con  plantas  de  Rubus  de  alta  calidad .  
hasta  el  65%  de  los  cultivos  de  iniciación  posteriores  al   Respuesta  al  cultivo  in  vitro  difirieron  mucho  y  en  consecuencia  
enfriamiento  fueron  exitosos.  La  citoquinina  6­benciladenina   se  requirieron  diferentes  métodos  de  micropropagación  por  
(BA)  fue  la  más  efectiva  de  las  tres  probadas  para  promover   diferentes  genotipos,  a  partir  de  estas  selecciones  se  
el  desarrollo  de  múltiples  brotes  en  cultivo,  con  un  promedio   observaron  tres  tipos  de  micropropagación  incluyendo  
de  tres  a  siete  brotes  o  plántulas  desarrollados  a  partir  de   microesquejes,  microbrotes  y  multibrotes,  y  se  caracterizó  su  
cada  nudo  individual.  La  alternancia  de  la  concentración  de   eficiencia.
BA  entre  4,44  y  13,31  lM  de  subcultivo  a  subcultivo  mejoró  la  
micropropagación  de  Rubus  recalcitrante  y  redujo  los   Palabras  clave  Propagación  in  vitro  Carbón  activado
problemas  asociados  con  el  cultivo  a  largo  plazo  en  presencia   Cultivo  alternativo  Microesquejes  Microbrotes
de  altas  concentraciones  de  BA.  Reducción  de  la  fuerza  de  los  macro  y  microelementos  
Multibrotes   Frambuesa   en  
Flrambuesa  
a  base negra  Hybridberry
Boysenberry  Thimbleberry

abreviaturas
BA  6­Benziladenina
J  H.  wu  (&) Ácido  indol­3­butírico  IBA
The  New  Zealand  Institute  for  Plant  and  Food  Research  Limited  (Plant  &   Carbón  activado  CA
Food  Research),  Mt  Albert  Research  Centre,  Private  Bag  92169,  Auckland  
1025,  Nueva  Zelanda  correo  electrónico:  
jinhu.wu@plantandfood.co.nz

SA  Miller  Plant  
&  Food  Research,  Ruakura  Research  Centre,  Private  Bag  
Introducción
3123,  Hamilton  3214,  Nueva  Zelanda
Rubus  es  uno  de  los  géneros  de  plantas  con  mayor  diversidad  
Dirección  actual:  HK  
Hall  Shekinah   morfológica  y  genética.  Contiene  un  amplio  espectro  de  
Berries  Ltd,  1  Clay  Street,  Motueka  7120,  Nueva  Zelanda especies  silvestres  además  de  las  cultivadas  domesticadas  
por  sus  frutos  comestibles  (Jennings  1988).  La  fruta  se  come  
tanto  fresca  como  procesada,  y  con  el  enfoque  reciente  en  los  
Dirección  actual:  PA  
factores  de  salud  y  bienestar  vinculados  con  su  alta  actividad  
Mooney  South  
Australian  Research  and  Development  Institute,  GPO  Box  397,   antioxidante  (Seeram  et  al.  2006),  el  consumo  y,  por  lo  tanto,  
Adelaide,  SA,  Australia la  demanda  han  aumentado  en  los  últimos  años.  Tecnologías  modernas

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18 Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25

Se  han  integrado  en  el  programa  de  mejoramiento  de  Rubus  de  Nueva   Materiales  y  métodos
Zelanda  (McGhie  et  al.  2002)  para  evaluar  nuevos  cultivares  de  Rubus  
con  alto  contenido  de  antocianina  y  alta  capacidad  antioxidante,  para   Recursos  vegetales,  pretratamiento  y  gestión
apoyar  el  impulso  de  la  industria  para  posicionar  y  promover  estas  frutas  
como  alimentos  funcionales. Todas  las  plantas  utilizadas  en  este  estudio  fueron  selecciones  avanzadas  
o  cultivares  desarrollados  a  partir  del  programa  de  cultivo  Rubus  de  Plant  
La  propagación  tradicional  por  esquejes,  acodos  o  retoños  todavía   &  Food  Research  (anteriormente  HortResearch).  Incluyeron  13  frambuesas  
se  usa  comercialmente  para  la  mayoría  de  los  genotipos,  pero  su   (Rubus  idaeus),  dos  frambuesas  negras  sin  espinas  (R.  occidentalis),  
propagación  exitosa  depende  en  gran  medida  del  crecimiento  adecuado   ocho  bayas  híbridas  (R.  spe  cies  híbridas:  con  o  sin  espinas),  seis  
de  las  plantas  y  de  condiciones  estacionales  favorables.   Boysenberries  (R.  especies  híbridas),  dos  Boysenberries  híbridas  sin  
Desafortunadamente,  muchos  genotipos  superiores  son  difíciles  o  lentos   espinas  (R.  especies  híbridas)  y  una  sola  baya  de  dedal  ornamental  (R.  
de  enraizar  con  los  métodos  tradicionales,  y  el  material  no  es  fácil  de   parviflorus).  El  material  vegetal  utilizado  para  el  cultivo  de  iniciación  fue  
propagar  in  vitro.  En  consecuencia,  los  métodos  tradicionales  de   traído  del  campo.  Los  propágulos  de  este  material  se  sembraron  en  
propagación  son  demasiado  lentos  o  demasiado  poco  confiables  para  la   macetas  como  madres  y  se  mantuvieron  en  un  invernadero  bajo  riego  
acumulación  rápida  de  nuevas  selecciones  para  la  evaluación  de   por  goteo.  Todos  estos  stocks  fueron  probados  para  la  ausencia  de  virus  
comunes  
características  genéticas  y  económicas,  o  para  cumplir  con  los  requisitos  de  plantación   antes  
de   de  su  uso  para  la  micropropagación.
la  industria.
Los  virus,  las  enfermedades  transmitidas  por  el  suelo  y  los  nematodos  
también  dificultan  seriamente  la  propagación  de  nuevas  selecciones  al  
transmitir  enfermedades  a  las  plantas  hijas  (Jennings  1988;  Wood  y  Hall   Durante  el  invierno  (junio  a  julio),  las  plantas  madre  se  colocaron  en  
2001). una  habitación  refrigerada  a  4  °C  en  la  oscuridad  durante  6  semanas  para  
El  cultivo  de  tejidos  proporciona  un  método  rápido  para  la  propagación   complementar  el  enfriamiento  natural.  Después  del  período  de  
in  vitro  de  cultivos  frutales  y  puede  producir  un  gran  número  de  plantas   enfriamiento,  las  plantas  se  trasladaron  nuevamente  al  invernadero.  Una  
de  Rubus  libres  de  virus  y  genéticamente  idénticas  en  un  tiempo   vez  que  brotaron  nuevos  brotes,  todas  las  cañas  viejas  se  eliminaron  
relativamente  corto  y  en  un  espacio  limitado,  sin  verse  afectado  por  la   totalmente  en  la  base.  Se  utilizaron  brotes  nuevos,  de  6  a  8  semanas  de  
variación  estacional  (Zimmerman  1991;  Sobczykiewicz  1992 ) . edad,  como  fuente  de  material  de  explante.  Se  usaron  cañas  de  plantas  
en  macetas  sin  pretratamiento  de  enfriamiento  como  controles.
La  primera  propagación  in  vitro  de  Rubus  fue  realizada  por  Broome  y  
Zimmerman  (1978)  en  zarzamora  sin  espinas  y  Harper  (1978)  en   Preparación  y  esterilización  de  explantes
frambuesa  negra.  Desde  entonces  se  han  publicado  varios  informes  que  
documentan  la  propagación  in  vitro  de  especies  de  Rubus  (McPheeters   Bajo  una  campana  de  flujo  laminar,  segmentos  de  tallo  de  3  a  5  cm  de  
et  al.  1988;  Pelto  y  Clark  2000).  Sin  embargo,  a  pesar  de  los  avances   largo,  con  una  yema  sana  pero  sin  hojas,  o  puntas  de  brotes  de  2  a  3  cm  
tecnológicos  y  de  propagación  a  lo  largo  de  los  años,  varios  cultivares   de  largo  se  sumergieron  en  etanol  al  70  %  durante  5  s  y  luego  se  
aún  son  recalcitrantes  en  el  cultivo  de  tejidos.  Entre  los  factores  que   transfirieron  a  una  solución  que  contenía  0,6  %  de  hipoclorito  de  sodio  
influyen  en  la  respuesta  in  vitro  se  encuentran  las  dificultades  encontradas   con  dos  gotas  de  Tween­20  durante  25  min.
en  la  desinfección  de  explantes  y  las  bajas  tasas  de  propagación   Luego  se  enjuagaron  cinco  veces  con  agua  estéril  y  se  mantuvieron  
(McPheeters  et  al.  1988;  Reed  1990;  Pelto  y  Clark  2000;  Tian  et  al.  2005),   sumergidas  en  agua  estéril,  antes  de  recortarlas  y  colocarlas  en  cultivo.
lo  que  genera  problemas  en  la  micropropagación  de  cultivares  nuevos  y  
existentes  (Donnelly  y  Daubeny  1986;  Bobrowski  et  al.  1996;  Gonzalez  et   Los  explantes  recortados  se  cortaron  en  segmentos  de  0,8  a  1,2  cm  
al.  2000;  Zawadzka  y  Or  likowska  2006). de  largo  y  luego  se  colocaron  verticalmente  en  una  placa  de  Petri,  de  8,5  
cm  de  diámetro  x  1,2  cm  de  alto  (Fig.  1a),  o  en  una  tina,  de  8  cm  de  
diámetro  de  base  x  6  cm  de  alto  (Fig.  1b),  para  la  cultura .  A  las  puntas  
El  objetivo  de  este  trabajo  fue  desarrollar  un  método  simple,  rápido  y   de  los  brotes  se  les  quitaron  todas  las  hojas  visibles  antes  de  colocarlas  
confiable  para  la  propagación  in  vitro  de  clones  libres  de  enfermedades  y   verticalmente  en  el  medio  de  cultivo.
fieles  al  tipo  de  32  genotipos  diferentes  de  Rubus,  incluidas  selecciones  
de  baya  híbrida,  baya  Boysen,  frambuesa  y  frambuesa  negra.  para   Cultura,  subcultura  y  gestión
facilitar  la  transferencia  rápida  de  nuevos  cultivares  y  selecciones  a  la  
industria  ya  la  producción  comercial  (Wu  et  al.  2003).  Se  estudiaron  las   El  medio  de  cultivo  de  iniciación  fue  medio  basal  MT  de  concentración  
influencias  de  la  edad  del  explante  y  el  pretratamiento  en  el  cultivo  de   media  (Murashige  y  Tucker  1969)  suplementado  con  4,44  lM  de  6­
iniciación  in  vitro  de  Rubus.  También  se  investigaron  los  efectos  de  los   benciladenina  (BA)  y  30  g  L­1  de  sacarosa.  Todos  los  medios  se  
genotipos  y  los  reguladores  del  crecimiento  de  las  plantas  en  el   solidificaron  con  7,5  g  L­1  de  agar  bacteriológico  Davis.  El  pH  del  medio  
establecimiento  in  vitro.  Se  describen  protocolos  para  la  micropropagación   se  ajustó  a  5,8  con  NaOH  0,1  M  o  HCl  0,1  M  antes  de  esterilizar  en  
de  Rubus  a  partir  de  diferentes  genotipos. autoclave  a  1,1  kg  cm­2  durante  15  min.

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Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25 19

Fig.  1  Diferentes  respuestas  de  los  explantes  durante  el  cultivo  de  iniciación  de  Rubus:  desarrollo  de  yemas  sin  botones  florales  después  de  7  días  de  cultivo  en  una  luz  (en  una  placa  de  Petri)  yb  oscuridad  (en  
una  tina);  c  botones  florales  en  desarrollo  pero  sin  hojas;  d  tanto  capullos  como  hojas.  La  barra  de  escala  representa  1  cm

Durante  el  período  de  cultivo  de  iniciación,  cada  recipiente  de  cultivo   aclimatación.  A  continuación,  las  plantas  se  trasladaron  a  un  invernadero  
tenía  de  6  a  10  explantes.  Los  cultivos  se  revisaron  diariamente  para   bajo  riego  por  goteo.  Se  registró  la  tasa  de  supervivencia  y  se  expresó  
detectar  cualquier  signo  de  contaminación.  Una  vez  que  se  encontró   como  porcentaje.
cualquier  signo  de  contaminación,  los  explantes  no  infectados  se  
transfirieron  a  un  nuevo  recipiente.  Solo  se  mantuvieron  y  usaron  para  la   Recogida  y  análisis  de  datos
micropropagación  cañas  vegetativas  limpias.  Todos  los  cultivos  se  
subcultivaron  cada  6  semanas. Los  explantes  vivos  y  no  contaminados  se  contaron  después  de  tres  
En  los  experimentos  de  micropropagación  se  utilizaron  reguladores   subcultivos.  La  'tasa  de  cultivo  de  iniciación'  se  definió  como
del  crecimiento  vegetal,  BA,  zeatina,  kinetina  y  ácido  indol  3­butírico   el  porcentaje  de  brotes  vegetativos  limpios  totales  obtenidos  y  
(IBA).  Las  concentraciones  añadidas  a  los  medios  fueron:  zeatina  4,56   sobrevivientes  de  cultivos  iniciales  de  yemas  o  puntas  de  brotes.
lM  o  kinetina  4,65  lM;  BA  a  4,44,  8,87,  13,31  o  17,75  lM;  IBA  a  0,49,   La  tasa  de  micropropagación  representa  el  número  total  de  brotes  
0,98,  1,48  o  2,46  lM.  Se  añadió  carbón  activado  (CA)  al  medio  al  0,05  %   vegetativos,  esquejes  o  plantas  producidos  a  partir  de  un  explante.  
(p/v). Todos  los  tratamientos  para  micropropagación  tuvieron  tres  repeticiones,  
Todos  los  cultivos  se  mantuvieron  en  una  sala  de  crecimiento  a  26  ±   con  20  explantes  seleccionados  al  azar  en  cada  tina  individual  y  cada  
1C.  Los  cultivos  se  colocaron  bajo  un  fotoperíodo  de  16  h  de  luz  y  8  h  de   experimento  se  repitió  dos  veces.  Los  datos  se  recogieron  en  la  sexta  
oscuridad,  utilizando  tubos  fluorescentes  de  color  blanco  frío  (30  lmol   semana  después  del  subcultivo.  los  numeros  de
­1
m­2  s )  como  fuente  de  luz.  La  intensidad  de  la  luz  se   los  brotes  se  contaron  después  de  la  disección  de  cada  cultivo,  y  la  
monitorizó  utilizando  el  sensor  LI­190S  Quantum  (Lambda  Instruments   longitud  de  cada  brote  por  separado  se  midió  con  un  calibrador  digital  
Corporation,  EE.  UU.). Digi  matic  (Mitutoyo,  Japón).  Los  datos  se  analizaron  usando  una  prueba  
t  y  la  significancia  se  declaró  en  P\0.05.
Enraizamiento  y  aclimatación

El  medio  de  enraizamiento  consistió  en  medio  basal  MT  de  una  quinta   Resultados

parte  de  potencia  suplementado  con  15  g  L­1  de  sacarosa  como  fuente  
de  carbono  y  0.49–0.98  o  1.48–2.46  lM  de  IBA  si  se  requería  un   explantes
procedimiento  de  enraizamiento.  Las  plantas  enraizadas  se  trasplantaron  
a  maceteros  con  una  mezcla  de  corteza:  piedra  pómez  6:4  bajo  niebla   Se  logró  una  tasa  de  cultivo  de  iniciación  del  35%  al  65%  a  partir  de  muestras  limpias.

intermitente  en  el  invernadero  durante  2  semanas  para y  cañas  sanas  obtenidas  tanto  del  invernadero  como

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20 Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25

el  campo.  No  logramos  iniciar  el  cultivo  a  partir  de  cañas  viejas  al  final  de   Reguladores  del  crecimiento  vegetal

la  temporada,  de  cañas  débiles  o  que  tenían  alguna  salpicadura  por  la  
lluvia  en  el  campo  o  por  el  riego  en  el  invernadero. Se  probaron  kinetina,  zeatina  y  BA  en  varias  concentraciones  para  
determinar  la  mayor  eficiencia  de  propagación  in  vitro.  El  experimento  
Tanto  el  tipo  de  caña  como  el  de  brote  afectaron  la  tasa  de  iniciación   preliminar  mostró  que  a  las  concentraciones  utilizadas,  tanto  la  kinetina  
exitosa  de  cultivos.  Los  genotipos  sin  espinas  se  iniciaron  más  fácilmente   como  la  zeatina  indujeron  la  formación  de  callos,  pero  no  lograron  
en  el  cultivo  que  los  genotipos  espinosos  porque  hubo  menos   promover  la  multiplicación  o  elongación  de  los  brotes.
contaminación.  Las  puntas  de  los  brotes  se  cultivaron  más  fácilmente  que  
las  yemas  laterales  porque  los  cultivos  iniciados  a  partir  de  las  puntas  de   Por  el  contrario,  BA  fue  eficaz  en  la  promoción  del  desarrollo  de  brotes  
los  brotes  produjeron  más  fácilmente  múltiples  brotes  que  los  cultivos  a   en  la  amplia  gama  de  genotipos  utilizados  en  este  estudio.  La  
partir  de  las  yemas  laterales.  Sin  embargo,  las  yemas  laterales  seguían   concentración  más  baja  de  BA  (4,4  lM)  funcionó  para  la  mayoría  de  las  
siendo  una  fuente  de  explante  confiable  y  alternativa,  especialmente  si  la   bayas  híbridas,  Boysenberries,  algunas  frambuesas  y  moras  durante  las  
fase  de  cultivo  de  iniciación  se  extendía  para  permitir  el  desarrollo  de   pruebas  de  propagación  in  vitro.  Triplicar  la  concentración  de  BA  (13,31  
múltiples  brotes. lM)  promovió  el  desarrollo  de  brotes  en  los  cultivares  y  selecciones  de  
La  edad  de  las  cañas  y  su  estado  fisiológico  fueron  fundamentales   Rubus  más  recalcitrantes,  con  tres  a  cuatro  veces  el  número  de  brotes  
para  el  éxito  de  la  fase  de  iniciación  del  cultivo.  Encontramos  imposible   en  desarrollo  en  comparación  con  la  concentración  más  baja  (4,44  lM;  
desarrollar  cultivos  de  brotes  múltiples  o  únicos  a  partir  de  cañas  de   Tabla  2) .  Sin  embargo,  si  los  brotes  se  cultivaron  en  13,31  lM  BA  durante  
frambuesa  y  mora  de  2  años. tres  o  más  subcultivos  consecutivos,  se  atrofiaron,  las  hojas  se  volvieron  
El  cultivo  de  segmentos  de  caña  de  2  años  dio  como  resultado  el   como  agujas  y  el  crecimiento  de  los  brotes  fue  escaso.  Los  signos  de  
desarrollo  de  flores  in  vitro  (Fig.  1c,  d),  seguido  de  la  muerte  de  la  mayoría   vitrificación  también  se  hicieron  evidentes  en  los  cultivos  de  frambuesa  
de  los  explantes.  Aquellos  explantes  que  sobrevivieron  tardaron  entre  6  y   (Fig.  2a).  Pudimos  superar  este  problema  alternando  la  concentración  de  
8  meses  antes  de  que  produjeran  algún  crecimiento  vegetativo  in  vitro.   BA  entre  las  subculturas.  Con  el  uso  alternativo  de  BA  a  4,44  y  13,31  lM,  
Para  resolver  este  problema,  se  utilizó  un  pretratamiento  por  frío  de  las   los  brotes  mantuvieron  su  morfología  normal  y  la  producción  y  el  
plantas  madre  de  2  años  para  obtener  una  mayor  tasa  de  producción  de   crecimiento  de  brotes  mejoraron  significativamente,  con  una  tasa  de  
brotes  limpios  en  cultivo.  Las  cañas  nuevas  que  se  desarrollaron  a  partir   micropropagación  promedio  de  3,5  a  8  brotes,  según  el  genotipo  (Fig.  
de  los  retoños  en  cepas  de  2  años  fueron  la  mejor  fuente  de  material  de   2b) .  Esta  metodología  modificada  de  brotes  múltiples  fue  particularmente  
explante;  dieron  una  media  de  65%  de  tasa  de  éxito  para  el  cultivo  de   efectiva  para  algunas  de  nuestras  líneas  de  frambuesa  más  recalcitrantes  
iniciación  (Tabla  1). y  pudimos  lograr  una  tasa  de  propagación  promedio  de  6.8  por

El  procedimiento  de  pretratamiento  por  enfriamiento  dio  como  
resultado  tasas  de  cultivo  de  iniciación  significativamente  más  altas  que  
las  de  las  poblaciones  no  tratadas  de  cuatro  líneas  seleccionadas  al  azar.

Cuadro  1  Efectos  del  pretratamiento  por  enfriamiento  a  4C  sobre  la  desinfección  in  vitro,  crecimiento  de  yemas  y  tasa  de  supervivencia  de  cuatro  selecciones  de  Rubus

Selección Tratamiento  de   Contaminado Cultivos  que  muestran  signos   Supervivencia   Observaciones

pre­enfriamiento explantes  (%) de  crecimiento  a  partir  de  explantes   del  explante  (%)

a  4C desinfectados  (%)

Frambuesa  selección  1 No 45 sesenta  y  cinco 35b Algunos  explantes  necróticos,  

floración  in  vitro
Sí 25 83 62a creciendo  vigorosamente

Frambuesa  negra  selección  2  No 43 sesenta  y  cinco 37b Algunos  explantes  necróticos,  

floración  in  vitro
Sí 22 85 66a creciendo  vigorosamente

Selección  de  bayas  híbridas  3 No 28 70 50b Algunos  explantes  necróticos

Sí 11 85 75a creciendo  vigorosamente

Selección  de  Boysenberry  2 No 42 63 37b Algunos  explantes  necróticos

Sí 22 83 65a creciendo  vigorosamente

Todas  las  plantas  en  macetas  que  suministraban  explantes  para  el  cultivo  de  iniciación  se  mantuvieron  en  un  invernadero  con  sistema  de  riego  por  goteo.  Se  utilizó  análisis  
estadístico  para  comparar  el  efecto  del  enfriamiento  en  el  cultivo  de  iniciación  dentro  de  la  misma  selección.  Los  valores  seguidos  de  letras  diferentes  son  significativamente  
diferentes  (P  <  0,05)

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Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25 21

Tabla  2  Rendimiento  de  selecciones  de  Rubus  recalcitrantes  cuando  se  cultivan  en  medios  de  cultivo  con  dos  concentraciones  alternas  de  BA  (4,44  y  13,31  lM)  con  luz  reducida

Selección Reguladores  del  crecimiento  vegetal  (lM) Número  promedio  de  brotes  de   Longitud  media  de  los  brotes  (cm)

un  nudo  o  brote

Selección  de  frambuesa  2 BA(4.44) ?  OTROS(0.49) 1,2  ±  0,2b 2,5  ±  0,5a

BA(13.31) ?  OTROS(0.49) 4,6  ±  0,8a 1,2  ±  0,2b

Selección  de  frambuesa  3 BA(4.44) ?  OTROS(0.49) 1,4  ±  0,3b 2,7  ±  0,3a

BA(13.31) ?  OTROS(0.49) 6,8  ±  1,3a 0,7  ±  0,1b

Frambuesa  selección  12 BA(4.44) ?  OTROS(0.49) 2,1  ±  0,3b 2,5  ±  0,3a

BA(13.31) ?  OTROS(0.49) 5.3  ±  1.1a 1,1  ±  0,3b

Selección  de  frambuesa  negra  2 BA(4.44) ?  OTROS(0.49) 1,3  ±  0,3b 2,8  ±  0,4a

BA(13.31) ?  OTROS(0.49) 3,8  ±  0,3a 1,3  ±  0,2b

Los  datos  muestran  el  número  y  la  longitud  de  los  brotes  múltiples  producidos  por  cada  cultivo.  Los  

valores  seguidos  de  letras  diferentes  dentro  de  la  misma  columna  son  significativamente  diferentes  (P  <  0,05).

Fig.  2  Brotes  múltiples  de  frambuesa  recalcitrante  después  del  cultivo  en  medio  MT  de  macro  y  microelementos  de  concentración  media  (Murashige  y  Tucker  1969)  con  13,31  lM  BA  
añadido;  b  4,44  lM  BA

disparar.  Este  es  el  primer  informe  conocido  del  uso  de  una   de  amarillamiento  y  muerte  regresiva  cuando  se  incluyó  AC  en  el  
concentración  alterna  de  BA  entre  subcultivos  para  mejorar  la   medio  (Fig.  3b).
eficiencia  de  la  micropropagación  de  líneas  Rubus  recalcitrantes. En  nuestro  estudio,  encontramos  que  reducir  la  fuerza  del  medio  
La  adición  de  0,49  lM  de  IBA  al  medio  que  contenía  BA  fue  eficaz   basal  MT  a  un  tercio,  combinado  con  la  adición  de  AC,  mejoró  la  
para  mantener  el  crecimiento  sano  de  los  brotes  en  aquellos  cultivos   producción  y  el  crecimiento  de  los  brotes  y  redujo  o  eliminó  la  clorosis  
en  los  que  los  brotes  eran  blandos  y  los  folíolos de  las  hojas  en  el  cultivo  in  vitro  de  Rubus.
eran  muy  delicadas  o  mostraban  signos  de  vitrificación. (Fig.  3c,  d).

Efecto  de  la  fuerza  reducida  de  la  composición  mineral  del   Genotipos  y  estilos  de  propagación
medio  de  cultivo  y  la  adición  de  AC
Los  genotipos  de  Rubus  utilizados  en  este  trabajo  respondieron  de  
Durante  la  fase  de  iniciación  del  cultivo  de  Rubus,  encontramos  que   manera  diferente  al  cultivo  de  tejidos.  Se  observaron  tres  patrones  
la  clorosis  (Fig.  3a)  y  la  oxidación  de  fenoles  (Fig.  4a,  b)  retrasaron  la   de  propagación  in  vitro:  (1)  desarrollo  de  una  estructura  de  brotes  en  
micropropagación  y  redujeron  la  eficiencia  de  la  micropropagación.   roseta  (microbrotes);  (2)  desarrollo  de  brotes  únicos  con  múltiples  
Sin  embargo,  este  efecto  podría  aliviarse  en  parte  mediante  la  adición   nudos  a  partir  de  segmentos  de  brote/nodo  únicos  (microesquejes);  
de  AC,  con  mejoras  en  el  alargamiento  de  los  brotes,  mejor  iniciación   y  (3)  formación  de  brotes  múltiples  a  partir  de  un  solo  segmento  de  
y  crecimiento  de  raíces  y  una  reducción  en  la  oxidación  de  fenoles  de   yema/nodo  (brotes  múltiples).
microesquejes.  Se  obtuvo  una  tasa  de  enraizamiento  de  hasta  el  85   En  el  tipo  de  brote  de  roseta,  los  microbrotes  crecieron  directamente  
%  de  los  esquejes  de  Rubus  cuando  se  agregó  AC  al  medio,  en   de  uno  de  los  brotes  laterales  (Fig.  5a,  b),  los  brotes  en  desarrollo  
comparación  con  el  65  %  cuando  se  omitió  AC.  Ninguno  de  los   eran  compactos  y  se  agruparon  estrechamente  en  una  estructura  de  
esquejes  de  enraizamiento  mostró  signos roseta.  La  separación  y  el  subcultivo  de  los  brotes  dieron  como  resultado

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22 Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25

Fig.  3  Color  de  hojas,  brotes  o  plantas  durante  la  micropropagación  de  Rubus:   brotes  de  múltiples  nudos  con  raíces  en  medio  MT  de  un  tercio  de  fuerza  que  
hojas  cloróticas  en  medio  MT  de  potencia  media  que  contiene  4,44  lM  BA  pero  no   contiene  4.44  lM  BA,  0.05%  AC  y  0.49  lM  IBA  bajo  17  lmol  m­2  s
­1 ­1
AC  ni  IBA  con  una  intensidad  de  luz  de  30  lmol  m­2  s ;  b  color  de  la  hoja  del  cultivo   intensidad  de  luz;  d  plantas  in  vitro  en  medio  MT  de  un  tercio  
in  vitro  en  medio  MT  de  un  tercio  de  concentración  que  contiene  4,44  lM  BA,  0,05%   de  concentración  que  contenía  4,44  lM  de  BA,  0,05  %  de  AC  y  0,49  lM  de  IBA  con  
­1
AC  y  0,49  lM  IBA  bajo  una  intensidad  de  luz  de  17  lmol  m­2  s;  c  microesquejes   una  intensidad  de  luz  de  17  lmol  m­2  s.  La  barra  de  escala  representa  1  cm
­1
que  producen  esbeltos

Fig.  4  Halos  fenólicos  en  medio  MT  de  potencia  media  sin  AC  después  de  la  separación  de  microbrotes  durante  el  subcultivo  de  Rubus.  La  barra  de  escala  representa  1  cm

en  el  desarrollo  de  una  nueva  roseta  de  brotes.  Esta  forma  de   (Fig.  3c,  d).  Sin  embargo,  el  proceso  requería  grandes  cantidades  de  
desarrollo  de  brotes  múltiples  fue  razonablemente  eficiente,  con   material  de  la  planta  madre  si  se  iba  a  producir  un  gran  número  de  
hasta  20  brotes  producidos  por  cultivo  y  una  tasa  de  micropropagación   clones.  El  proceso  fue  eficiente  para  la  mayoría  de  las  bayas  
promedio  de  alrededor  de  7,9.  Sin  embargo,  los  brotes  de  roseta   híbridas,  Boysenberry,  algunos  cultivares  y  selecciones  de  frambuesa  
tardaron  en  alargarse  (tomaron  2  meses)  y  fue  necesario  un  paso  de   y  frambuesa  negra,  y  thimbleberry.
subcultivo  de  enraizamiento  de  IBA  para  la  formación  de  raíces  antes   El  desarrollo  de  brotes  múltiples  fue  típico  para  la  mayoría  de  los  
de  desmuflar  al  invernadero. cultivares  de  frambuesa  y  frambuesa  negra  utilizados  en  este  estudio.
En  contraste,  la  formación  de  un  solo  brote  a  partir  de  yemas   Se  produjeron  grandes  cantidades  de  brotes  a  través  de  subcultivos  
individuales  a  lo  largo  del  segmento  nodal  fue  simple,  eficiente  y   alternos  sucesivos  de  dos  concentraciones  de  BA,  con  hasta  3  o  4  
altamente  exitosa.  Estos  brotes  se  alargaron  fácilmente  y  desarrollaron   brotes  desarrollados  a  partir  de  cada  explante  (Fig.  2a,  b).
raíces  directamente  sin  un  paso  de  enraizamiento  en  el  procedimiento. Aunque  extendió  el  tiempo  requerido,  un  alargamiento  y

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Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25 23

Fig.  5  a  Microbrotes  de  baya  híbrida  derivados  de  un  brote  original,  yb  después  de  la  separación  de  los  microbrotes  individuales  en  el  subcultivo

Se  encontró  que  la  fase  de  enraizamiento  era  necesaria.  Sin  embargo,   CA  al  medio.  Hybridberry  respondió  bien  al  IBA  de  0,49  a  0,98  lM  en  
este  procedimiento  aún  no  requería  tanto  tiempo  como  el  sistema  de   medio  basal  MT  de  1/5  de  fuerza  para  la  formación  de  raíces  sin  formación  
desarrollo  de  brotes  de  roseta  y  fue  efectivo  para  la  propagación  de  todas   de  callos.  La  frambuesa  negra  y  la  frambuesa  enraizaron  bien  cuando  se  
las  selecciones  recalcitrantes  de  Rubus. agregaron  1,48–2,46  lM  de  IBA  a  1/5  de  concentración  de  MT  de  medio  
basal.  En  promedio,  tomó  11  días  para  que  se  formaran  las  raíces  
Intensidad  de  luz después  de  los  brotes  en  el  medio  de  enraizamiento.

Una  reducción  en  la  intensidad  de  la  luz  en  las  salas  de  cultivo  mejoró   Trasplante  a  invernadero
efectivamente  la  formación  de  brotes,  la  elongación  y  el  desarrollo  de  
raíces.  Una  reducción  en  la  intensidad  de  la  luz  bajo  la  cual  se  colocaron   Se  logró  una  tasa  de  supervivencia  global  del  98%  para  los  32
­1
los  cultivos,  de  30  a  17  lmol  m­2  s  motivó  la  elongación  de  los   ,  Pro Los  cultivares  y  las  selecciones  de  Rubus  utilizados  en  este  estudio  
brotes  de  Rubus  in  vitro,  consiguiendo  una  longitud  promedio  de  los   después  de  que  las  plántulas  fueran  desmufladas  y  transferidas  al  invernadero.
brotes  de  4–4.5  cm  (Fig.  3c,  d).  Todos  los  brotes  producidos  bajo   Las  plántulas  estaban  sanas  y  crecieron  vigorosamente  en  el  invernadero  
intensidades  de  luz  más  bajas  se  enraizaron  con  éxito  y  se  trasplantaron   (Fig.  6).
al  invernadero.
­1
La  reducción  de  la  intensidad  de  la  luz  a  17  lmol  m­2  s  mejoró   también

el  desarrollo  de  raíces  en  selecciones  recalcitrantes  de  Rubus  in  vitro,   Discusión
con  hasta  el  80  %  de  los  esquejes  desarrollando  raíces,  en  comparación  
­1
con  solo  el  45  %  cultivado  a  menos  de  30  lmol  m­2  s  Thimbleberry   . Uno  de  los  pasos  más  difíciles  en  el  cultivo  in  vitro  de  Rubus  es  la  
mostró  elongación  de  brotes  y  enraizamiento  en  cada  nudo  a  lo  largo  de   desinfección  de  los  explantes  para  el  cultivo  de  iniciación  (McPheeters  et  
los  brotes  en  el  medio  con  BA  e  IBA  agregados  cuando  se  cultivaron  bajo   al.  1988).  En  nuestro  estudio  encontramos  que  el  manejo  efectivo  de  las  
una  intensidad  de  luz  reducida  (17  lmol  m­2  s  secciones  de  nudos,  cada   madres  era  esencial  para  la  máxima  eficiencia  y  éxito  de  la  propagación  
­1
sección  fue  capaz   ).  Cuando  el  tallo  fue  cortado  en  una  sola in  vitro  de  Rubus.  El  pretratamiento  de  las  plantas  madre  por  enfriamiento  
de  producir  una  planta.  Además  de  mejorar  la  elongación  de  los  brotes  y   a  4°C  mejoró  el  cultivo  de  iniciación  in  vitro.  El  enfriamiento  estimuló  el  
aumentar  la  desarrollo,  la  reducción  de  la  intensidad  de  la  luz  también   crecimiento  vigoroso  de  nuevos  brotes  de  las  plantas  madre  y  resultó  en  
redujo  la  clorosis  de  las  hojas  y  la  muerte  regresiva  de  los  brotes,  y   la  tasa  de  iniciación  más  alta.  Los  brotes  cultivados  bajo  condiciones  de  
promovió  el  desarrollo  de  nuevos  brotes  y  hojas. invernadero  con  riego  por  goteo  tuvieron  menos  contaminación  superficial  
que  las  cañas  más  viejas  y  el  material  cultivado  al  aire  libre,  lo  que  facilitó  
la  desinfección.  Estos  cultivos,  tal  como  se  describen,  no  produjeron  
Enraizamiento flores  in  vitro.  Las  cañas  viejas  o  desarrolladas  a  partir  de  yemas  de  
reemplazo  justo  debajo  del  suelo  no  fueron  de  utilidad  para  el  cultivo  de  
La  mayoría  de  las  selecciones  se  enraizaron  fácilmente  en  el  medio  de   iniciación  in  vitro  debido  a  las  dificultades  para  desinfectar  el  material  y  
propagación  de  brotes  múltiples.  Para  las  pocas  selecciones  que  no   con  la  floración  in  vitro.  Tanto  la  frambuesa  como  la  frambuesa  negra  
formaron  raíces  durante  esta  fase  de  cultivo,  adición  de  IBA  al  medio,   producen  flores  y  frutos  en  madera  de  2  años  (Carew  et  al.  2000),  y  
reducción  de  la  intensidad  lumínica,  adición  de  AC  y/o  reducción  de  la   habría  ocurrido  la  evocación  floral  del  meristemo
concentración  del  medio  basal  MT
desde  la  mitad  de  la  fuerza  hasta  1/5  de  la  fuerza  fueron  beneficiosos.
Se  mejoró  el  enraizamiento  para  algunas  selecciones  de  40–65%  a   antes  del  cultivo  de  iniciación,  de  ahí  el  alto  grado  de  floración  y  muerte  
85%  al  reducir  la  intensidad  de  la  luz  y  agregar asociada  de  los  explantes.

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24 Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25

Fig.  6  Plantas  en  maceta  2  meses  después  del  desmuflado:  a  frambuesa,  b  frambuesa  negra,  c  baya  híbrida  y  d  Boysenberry.  La  barra  de  escala  representa  5  cm

Se  informa  que  algunas  especies  y  cultivares  de  Rubus  son   sobre  y  examinando  el  rendimiento  de  plantas  adultas  criadas  
extremadamente  difíciles  de  cultivar,  con  bajas  tasas  de   por  micropropagación  con  plantas  del  mismo  genotipo  y  edad  
micropropagación.  Esto  se  debe  al  rápido  desarrollo  de  la   propagadas  vegetativamente  por  esquejes  o  por  acodo.
clorosis  de  los  brotes  y  las  hojas  y  la  subsiguiente  muerte  
regresiva  in  vitro  (Snir  1981)  oa  las  dificultades  para  lograr  que  
los  brotes  se  alarguen  de  manera  eficiente  (Welander  1985).   Conclusión
En  consecuencia,  se  ha  realizado  un  esfuerzo  significativo  para  
superar  este  problema,  incluida  la  manipulación  de  la   Investigamos  los  factores  que  afectan  el  cultivo  de  iniciación  in  
composición  y  la  fuerza  del  medio  de  cultivo  (Anderson  1980;   vitro  y  la  micropropagación  de  32  genotipos  diferentes  de  
James  et  al.  1980;  Welander  1985;  Zawadzka  y  Orlikowska   Rubus,  y  desarrollamos  un  protocolo  integrado  para  la  
2006).  En  este  estudio  encontramos  que  la  forma  más  efectiva   micropropagación  de  selecciones  de  frambuesa,  frambuesa  
de  reducir  la  incidencia  de  clorosis  era  reducir  la  intensidad  de   negra,  baya  híbrida  y  Boysenberry  a  partir  de  plantas  madre  
la  luz  bajo  la  cual  se  mantenían  los  cultivos  y  complementar   adultas.  Los  cultivos  se  mantuvieron  hasta  4  años  para  
una  tercera  concentración  de  solución  de  micro  y  macro  
micropropagación  y  conservación  in  vitro.  Este  protocolo  se  
elementos  MT  con  IBA  y  AC.  La  eficacia  de  este  procedimiento   confirmó  como  un  sistema  de  cultivo  de  iniciación  eficiente  para  
podría  deberse  a  una  combinación  de  IBA  y  AC  que  reduce  la   nuevas  selecciones.  Produjo  pequeñas  cantidades  de  brotes  y/
toxicidad  mineral  en  los  cultivos  (Anderson  1980;  Snir  1981;   o  yemas  susceptibles  de  desarrollar  múltiples  brotes  y  plantas  
Welander  1985)  y  mejora  la  formación  de  primordios  de  raíces.   enraizadas.  Un  protocolo  que  incluía  la  alternancia  de  los  
La  inclusión  de  AC  en  el  medio  de  cultivo  redujo  la  intensidad   subcultivos  a  dos  concentraciones  de  BA  combinados  con  0,49  
de  la  luz  en  la  superficie  de  corte  y  puede  haber  mejorado  la   lM  de  IBA  entre  períodos  de  subcultivo  abordó  de  manera  
capacidad  de  enraizamiento.  Esto  plantea  la  pregunta:  ¿cuánto   eficaz  los  problemas  que  surgían  al  usar  altas  concentraciones  
de  la  mejora  en  el  desarrollo  de  raíces  en  cultivos  que   de  BA  y  demostró  su  eficacia  para  las  líneas  de  Rubus  
contenían  AC  se  debió  al  efecto  antioxidante  del  AC  y  cuánto   recalcitrantes.  La  adición  de  concentraciones  apropiadas  de  
a  la  reducción  de  la  intensidad  de  la  luz  alrededor  de  la  base   IBA,  AC  con  medios  basales  MT  de  menor  potencia  y  una  
de  los  brotes?  Los  efectos  combinados  de  AC  e  intensidad  de   reducción  en  la  intensidad  de  la  luz  mejoraron  el  rendimiento  y  el  enraizamien
luz  o  IBA  sobre  la  clorosis  de  Rubus,  el  alargamiento  de  brotes  y  el  enraizamiento  necesitan  más  investigación.
La  variación  somaclonal  durante  la  micropropagación  de   Agradecimientos  Damos  las  gracias  a  M.  Astill  por  proporcionar  datos  de  
Rubus  puede  ser  otro  problema  que  debe  abordarse.  Hay   intensidad  de  la  luz;  R.  Edwards,  T.  Machin,  T.  Dawson,  MJ  Stephens  y  P.
Sutton  por  el  soporte  técnico;  M.  Heffer,  T.  Holmes  y  M.  Pesonen  por  algunas  
numerosas  cuentas  e  informes  en  la  literatura  de  variación  en  
de  las  fotografías;  y  RA  Beatson,  PM  Datson,  AR
plántulas  producidas  a  través  de  organogénesis  con  una  etapa   Ferguson,  L.  Gea,  AR  Granger,  FA  Gunson,  AG  Seal  (Plant  &  Food  Research,  
de  callo.  Solo  se  encontró  una  planta  aberrante  (0.05%)  entre   Nueva  Zelanda),  GJ  de  Klerk  (Universidad  de  Wageningen,  Países  Bajos)  y  
las  moras  sin  espinas  micropropagadas  (Swartz  et  al. al  editor  y  tres  revisores  anónimos  de  la  revista,  por  su  valiosa  comentarios  
sobre  el  manuscrito.  Este  trabajo  fue  apoyado  por  un  proyecto  NSOF  2000/2002.
1983).  Sin  embargo,  en  nuestro  estudio,  en  el  que  se  
trasplantaron  500  plántulas  micropropagadas,  no  se  detectaron  
variantes.  Todas  las  plántulas  exhibieron  una  morfología  normal  
y  un  crecimiento  vigoroso.  Probablemente  esto  esté  relacionado   Referencias
con  el  método  de  propagación  utilizado,  en  el  que  todas  las  
plántulas  se  produjeron  por  microesquejes,  multibrotes  o   Anderson  WC  (1980)  Propagación  por  cultivo  de  tejidos  de  frambuesa  roja  y  
microbrotes,  sin  formación  de  callos.  Sin  embargo,   negra,  Rubus  idaeus  y  R.  occidentalis.  Acta  Hort  112:
13–20
recomendamos  que  para  la  propagación  clonal  de  líneas,  se  
Bobrowski  VL,  Mello­Farias  PC,  Peters  JA  (1996)  Micropropagación  de  
pueda  verificar  la  fidelidad  al  tipo  usando  métodos  moleculares   cultivares  de  moras  (Rubus  sp.).  Rev  Bras  Agrociencia  2:17–20
y/o  citometría  de  flujo  (Gajdosˇova´  et  al.  2006).  También  debe  evaluarse  haciendo  crecer

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Culto  de  órganos  de  tejido  de  células  vegetales  (2009)  99:  17–25 25

Broome  OC,  Zimmerman  RH  (1978)  Propagación  in  vitro  de Seeram  NP,  Adams  LS,  Zhang  Y,  Lee  R,  Sand  D,  Scheuller  HS,  Heber  D  (2006)  Los  
Mora.  HortSci  13:151–153 extractos  de  mora,  frambuesa  negra,  arándano,  arándano  rojo,  frambuesa  roja  y  
Carew  JG,  Gillespie  T,  White  J,  Wainwright  H,  Brennan  R,  Battey  NH  (2000)  El  control  del   fresa  inhiben  el  crecimiento  y  estimulan  la  apoptosis  de  células  cancerosas  humanas  
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