Aislamiento y caracterización de

microorganismos halófilos de
salmuera del Salar de Cauchari
Isolation and caracterization of
halophilic microorganisms from Salt
lake Cauchari

Biohidrometalurgia

Paula Castro
Elizabeth Cáceres
Laboratorio de Biominería del Cipromin (Centro de Procesamiento de Minerales),
Intemin – SEGEMAR, Secretaría de Minería, Ministerio de Energía y Minería, Av. Gral
Paz 5445, Parque Tecnológico Miguelete, edificio 14 (B1650WAB) San Martín, Pcia
de Buenos Aires, paula.castro@segemar.gov.ar 33

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

 RESUMEN

os microorganismos halófilos son considerados microorganis-

mos extremófilos, y como tales, son de especial interés debido a
que poseen un gran potencial de aplicación biotecnológico. La
característica de estos microorganismos es su capacidad de crecer en
ambientes con concentraciones elevadas de sales, de hasta 30%p/v.
En el presente trabajo se utilizó una salmuera proveniente del Sa-
lar de Cauchari (provincia de Jujuy, Argentina) teniendo como primer
objetivo aislar y caracterizar microorganismos halófilos, en particular
aquellos que crecieran en ambientes con altas concentraciones de litio.
Se incubaron distintas alícuotas de salmuera en LB (NaCl, extrac-
to de levadura, triptona) como medio de cultivo nutritivo en agitación,
a 30°C durante 10 días. Se lograron aislar cuatro cepas denominadas
B, C, N y M, que, si bien hasta el momento no fueron identificadas,
fueron sometidas a diferentes estudios de caracterización: observa-
ción de forma, consistencia, elevación y pigmentación de las colo-
nias; tinción con azul de metileno; tinción de Gram y observación al
microscopio electrónico. Se observó que la cepa B está formada por
cocos G-; la cepa C por cocobacilos G+; la cepa N por cocobacilos
G- y la M por bacilos G+.
Por otro lado, se realizaron pruebas de crecimiento de las cuatro
cepas, en las que se ensayó resistencia/tolerancia a diferentes concen-
traciones de litio. En este caso, se empleó como medio de cultivo un
LB con la mitad de NaCl pero adicionado con concentraciones cre-
cientes de LiCl. Hasta el momento, las cuatro cepas crecen hasta 4%
LiCl, que es la concentración máxima ensayada.
Biohidrometalurgia

Palabras Clave: biohidrometalurgia, bacterias halófilas, litio.

ABSTRACT
Halophilic micro-organisms are considered extremophile, and that
34

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

is why they are of special interest in biotechnology. Their principal
characteristic is that they are able to grow in environments with high
concentrations of salts, up to 30%w/v.
In this work, we used a brine from the Cauchari Salt Mine (Jujuy-
Argentina) having as primary objective the isolation and characteri-
zation of halophilic microorganisms, particularly those which tolerate
high lithium concentrations.
Brine was inoculated in nutritive broth LB (NaCl, yeast extract,
tryptone) in a rotary shaker at 30°C for 10 days. We isolated four stra-
ins named B, C, N and M; and examined each of them morphology by
metilene blue and Gram staining, and by electronic microscopy. We
observed that Strain B is formed by gram-negative coccos, strain C by
gram-positive coccobacillus, strain N by gram-negative coccobacillus
and M by gram-positive bacillus.
All strains were tested for tolerance/resistance in nutritive broth
additionated with different concentrations of LiCl, finding positive
results for all of them up to the maximum concentration tested of 4%
LiCl.

Keywords: biohydrometallurgy, halophilic bacteria, lithium.

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos extremófilos son aquellos capaces de crecer
en ambientes con condiciones completamente adversas para la vida,
es así como se los ha encontrado en lugares como volcanes, lagunas
hipersalinas, zonas con radiación solar extrema, etc. Según el ambien-
te en el que se desarrollan se clasifican en distintos grupos: termófi-
los, acidófilos, alcalófilos, halófilos, psicrófilos. Los microorganismos
Biohidrometalurgia

halófilos, habitan zonas donde la concentración de sales puede ser de

hasta diez veces la del océano, como ocurre en el Mar Muerto [1].
La región de la Puna (Perú, Bolivia, Argentina y Chile) es un vasto
altiplano de baja presión atmosférica, menor difusión de oxígeno en
35

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

Los microorganismos extremófilos son aquellos capaces de crecer en ambientes con
condiciones completamente adversas para la vida, es así como se los ha encontrado en lugares
como volcanes, lagunas hipersalinas, zonas con radiación solar extrema, etc. Según el
ambiente en el que se desarrollan se clasifican en distintos grupos: termófilos, acidófilos,
alcalófilos, halófilos, psicrófilos. Los microorganismos halófilos, habitan zonas donde la
concentración de sales puede ser de hasta diez veces la del océano, como ocurre en el Mar
Muerto [1].
La regióneldeaire, escasas
la Puna precipitaciones
(Perú, y clima
Bolivia, Argentina gélido.
y Chile) Se vasto
es un trata altiplano
de una zona en presión
de baja
atmosférica, menor
la que difusión de oxígeno
se encuentran en el aire,
gran variedad de escasas
salares,precipitaciones
que contieneny másclimadel
gélido. Se
trata de una zona en la que se encuentran gran variedad de salares, que contienen más del 80%
80% de las salmueras ricas en litio del planeta [2].
de las salmueras ricas en litio del planeta [2].

Figura 1. 1.
Figura Distribución
Distribuciónde
de salares enlalapuna
salares en punaargentina.
argentina.

En particular, en la puna argentina, en la provincia de Jujuy, se encuentra el Salar de

Cauchari, queEnes particular,
un depósito en la puna
salino actual argentina,
con salinas en la provincia
enriquecidas de en
en litio; Jujuy, se
un ambiente de
encuentra
clima árido, el Salar
localmente de Cauchari,
relacionado quetermales.
con fuentes es un depósito
[3]. salino actual con
El objetivo de este trabajo es la búsqueda de bacterias halófilas, y en particular, aquellas que
salinas enriquecidas en litio; en un ambiente de clima árido, localmen-
sean capaces de crecer en ambientes con altas concentraciones de litio.
te relacionado con fuentes termales. [3].
El objetivo
17, 18de este
y 19 detrabajo
octubre es
de la búsqueda
2018, de bacterias
Catamarca, Argentinahalófilas, y
en particular, aquellas que sean capaces de crecer en ambientes con
altas concentraciones de litio.
Biohidrometalurgia

PARTE EXPERIMENTAL
Los ensayos se realizaron con salmuera natural proveniente de un
pozo de 120m de profundidad del Salar de Cauchari (Figura 1), ubi-
36

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

cado a aprox 4000m.s.n.m. en la provincia de Jujuy- Argentina. La
muestra fue mantenida a temperatura ambiente hasta su tratamiento
en el laboratorio.
Análisis químico
La determinación de litio, potasio, sodio, magnesio y boro se llevó
a cabo siguiendo el método 3120 B del Standard Methods, 23rd Edi-
tion; la de cloruros se realizó por potenciometría de precipitación y
titulación con nitrato de plata; los sulfatos se determinaron por Espec-
trofotometría empleando un equipo HACH y la alcalinidad se deter-
minó siguiendo el método 2320 B del Standard Methods, 23rd Edition.
Aislamiento y conservación
La salmuera se incubó en medio de cultivo nutritivo LB (1g NaCl,
1g peptona, 0,5g extracto de levadura en 100ml) a 30°C, en agitación,
durante unos diez días. El crecimiento se determinó por turbidez en el
medio líquido y se verificó con la aparición de colonias en las placas
de agar.
Las cepas reconocidas como diferentes se sembraron por separado
en el mismo medio nutritivo, sólido, con el objetivo de purificarlas y
aislarlas. Una vez purificadas, las cepas obtenidas fueron conservadas
en glicerol 40% a -80°C.
Caracterización de las cepas
Las bacterias aisladas se clasificaron teniendo en cuenta su mor-
fología. También se realizó tinción con azul de metileno y tinción de
Gram [4], empleando un microscopio binocular LABMED XSZ 107
BN para ver los preparados.
Por último, se realizó observación por microscopía electrónica
empleando un microscopio modelo Philips XL 30 ESEM.
Pruebas de crecimiento.
Biohidrometalurgia

Se analizó para cada una de las cepas aisladas el crecimiento en

el medio nutritivo, pero suplementado con concentraciones crecientes
de cloruro de litio. Se empleó medio LB levemente modificado (0,5g
NaCl, 0,5g extracto de levadura, 1g peptona en 100ml) al que se le
37

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

 Caracterización de las cepas
Las bacterias aisladas se clasificaron teniendo en cuenta su morfología. También se realizó
tinción con azul de metileno y tinción de Gram [4], empleando un microscopio binocular
LABMED XSZ 107 BN para ver los preparados.
Por último, se realizó observación por microscopía electrónica empleando un microscopio
modelo Philips XL 30 ESEM.
Pruebas de crecimiento.
Se analizó para cada una de las cepas aisladas el crecimiento en el medio nutritivo, pero
adicionó con
suplementado de 0,5 a 4 % de LiCl.
concentraciones Cadadebacteria
crecientes cloruro se
de inoculó
litio. Se en medio
empleó lí- LB
medio
levemente
quido,modificado
se incubó (0,5g NaCl, en
a 30°C, 0,5gagitación;
extracto de verificando
levadura, 1g peptona en 100ml) por
su crecimiento al que se
le adicionó de 0,5 a 4 % de LiCl. Cada bacteria se inoculó en medio líquido, se incubó a
30°C,turbidez del medio
en agitación; y formación
verificando de colonias
su crecimiento en placas
por turbidez de agar.
del medio y formación de
colonias en placas de agar.
RESULTADOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Y DISCUSIÓN
En1lase Tabla
En la Tabla 1 se
presentan los presentan losanálisis
resultados del resultados
químicodel
de laanálisis
salmuera.químico de
la salmuera. Tabla 1. Análisis químico de la salmuera
Concentración (mg/l)
Boro 1374,5
Litio 741
Sodio 138200
Potasio 6487
Magnesio 1401,5
Cloruros 203428
Sulfatos 31770
Alcalinidad total (como CaCO3) 891,5
Bicarbonatos (como CaCO3) 890,5
Tabla 1. Análisis químico de la salmuera
17, 18 y 19 de octubre de 2018, Catamarca, Argentina

La temperatura de la salmuera en la zona de muestreo era de 19,9°C

y el pH=6,8. Es importante resaltar que, en particular, el magnesio y el
potasio, son esenciales para el crecimiento bacteriano, ya que ayudan
a regular la presión osmótica con el medio, lo cual les permite a las
bacterias soportar las altas concentraciones de sal [5].
Se lograron aislar cuatro cepas que se identificaron según su pig-
mentación en N (naranja), B (blanco), M (marrón), C (beige); como
se puede ver en la Figura 2. Todas ellas presentaron características
morfológicas similares en cuanto a que todas eran de borde redondo,
forma plana, consistencia mucosa y elevación convexa.
Biohidrometalurgia

38

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

 crecimiento bacteriano, ya que ayudan a regular la presión osmótica con el medio, lo cual les
importante resaltar que, en particular, el magnesio y el potasio, son esenciales para el
permite a las bacterias soportar las altas concentraciones de sal [5].
crecimiento bacteriano, ya que ayudan a regular la presión osmótica con el medio, lo cual les
Se lograron aislar cuatro cepas que se identificaron según su pigmentación en N (naranja), B
permite a las bacterias soportar las altas concentraciones de sal [5].
(blanco), M (marrón), C (beige); como se puede ver en la Figura 2. Todas ellas presentaron
Se lograron aislar cuatro
características cepas que
morfológicas se identificaron
similares en cuanto asegún su pigmentación
que todas eran de bordeenredondo,
N (naranja),
formaB
(blanco),
plana,Mconsistencia
(marrón), C (beige);
mucosa como seconvexa.
y elevación puede ver en la Figura 2. Todas ellas presentaron
características morfológicas similares en cuanto a que todas eran de borde redondo, forma
plana, consistencia mucosa y elevación convexa.

Figura 2. Bacterias aisladas en LB.

Figura 2. Bacterias aisladas en LB.

La observación al microscopio electrónico nos permitió identificar a la cepa M como bacilos

La observación al microscopio electrónico nos permitió identificar
o cocobacilos de un tamaño inferior
Figura a 2µm (Figura
2. Bacterias 3, en
aisladas izquierda);
LB. y la cepa B formada por
a la(Figura
cocos cepa M como bacilos
3, derecha). No nosofuecocobacilos de un tamaño
posible la observación clara deinferior
las otrasados
2µmcepas en
este microscopio; sin embargo, sí se pudo ver que la cepa N también tenía un tamaño menor a
(Figura
La observación
2µm.
3,
al izquierda);
microscopio y la cepa
electrónico B
nosformada
permitió por cocos
identificar a (Figura
la cepa M3, dere-
como bacilos
o cocobacilos de nos
cha). No un tamaño inferior
fue posible la aobservación
2µm (Figuraclara
3, izquierda); y la dos
de las otras cepacepas
B formada
en por
cocos (Figura 3, derecha). No nos fue posible la observación clara de las otras dos cepas en
este microscopio;
este microscopio; sinsíembargo,
sin embargo, síque
se pudo ver se pudo
la cepaver que la cepa
N también N también
tenía un tamaño menor a
2µm. tenía un tamaño menor a 2µm.

Figura 3. Observación al microscopio electrónico. A la derecha, cepa B; a la izquierda cepa M.

17, 18 y 19 de octubre de 2018, Catamarca, Argentina

Biohidrometalurgia

Figura
Figura 3. Observación
3. Observación al microscopio
al microscopio electrónico.
electrónico. A la A la derecha,
derecha, cepa cepa B;izquierda
B; a la a la izquierda
cepa M.
cepa M.
17, 18 y 19 de octubre de 2018, Catamarca, Argentina

Se determinó que dos cepas son gram-positivas (C y M) y dos

39

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

 XII Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales

Se determinó que dos cepas son gram-positivas (C y M) y dos cepas gram-negativas (N y B);
como se puede cepas
ver gram-negativas
en la Figura 4.(N Seycorrobora
B); como que
se puede ver M
la cepa en son
la Figura 4. ySela B cocos
bacilos
corrobora
Mientras que las cepas Nque
y Claestarían
cepa M son bacilos
formadas y la B cocos Mientras que las
por cocobacilos.
cepas N y C estarían formadas por cocobacilos.

N M

B

C

Figura 4. Tinción de Gram.

Figura 4. Tinción de Gram.

Las cuatro cepas Las cuatro cepas

por separado por separado
se hicieron crecerseenhicieron
medio crecer en LB
nutritivo medio nutri- en litio
enriquecido
tivo LBcrecientes
con concentraciones enriquecido en litio verificar
pudiendo con concentraciones crecientes
mediante placas pudiendo
de agar, que en todos los
casos había crecimiento. Hasta el
verificar mediante momento
placas se que
de agar, evaluó la resistencia/tolerancia
en todos de las cuatro
los casos había creci-
bacterias hastamiento.
una concentración de 4% de litio.
Hasta el momento se evaluó la resistencia/tolerancia de las
Biohidrometalurgia

cuatro bacterias hasta una concentración de 4% de litio.

CONCLUSIONES
En el presente trabajo se ha cumplido con el objetivo principal del estudio, que era el
aislamiento deCONCLUSIONES
bacterias halófilas de la salmuera del Salar de Cauchari, del cual no se conocen
Ensuelbiodiversidad.
estudios previos de presente trabajo
Sise ha cumplido
bien con elaún
estas bacterias objetivo principal
no fueron del
identificadas, dada
su adaptación estudio,
al ambiente extremo, son de potencial interés biotecnológico. Por
que era el aislamiento de bacterias halófilas de la salmuera del otro lado,
también se
40 adaptan a crecer en medios suplementados con litio, lo cual las hace aún más
interesantes.
XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales
Se continuará trabajando para lograr la clasificación taxonómica de las bacterias aisladas, así
como también se realizarán estudios sobre su metabolismo, y crecimiento en medios con
mayores concentraciones de litio.
Salar de Cauchari, del cual no se conocen estudios previos de su bio-
diversidad. Si bien estas bacterias aún no fueron identificadas, dada su
adaptación al ambiente extremo, son de potencial interés biotecnoló-
gico. Por otro lado, también se adaptan a crecer en medios suplemen-
tados con litio, lo cual las hace aún más interesantes.
Se continuará trabajando para lograr la clasificación taxonómica
de las bacterias aisladas, así como también se realizarán estudios so-
bre su metabolismo, y crecimiento en medios con mayores concentra-
ciones de litio.

REFERENCIAS
1. Aneela Roohi, Iftikhar Ahmed, Muhammad Iqbal and Muham-
mad Jamil. “preliminary isolation and characterization of ha-
lotolerant and halophilic bacteria form salt mines of Karak,
Pakistan”. Pak. J. Bot., Special Issue March 2012.
2. Mario A. Hernández, Isidoro B. Schalamuk y Nilda González.
“La hidrogeología en la evaluación minera de salmueras de in-
terés económico”. Temas actuales de la hidrología subterránea,
2013.
3. Martín Gozalvez, Víctor Bercheni y Eulogio Ramallo. “Carta
Minero Metalogenética 2366-III, Provincias de Jujuy y Salta”,
SEGEMAR, Buenos Aires, 2016.
4. Dra Diana L. Vullo; Dra Mónica Wachsman; Dra Laura E. Al-
che. “Microbiología en práctica: Manual de técnicas de labo-
ratorio para la enseñanza de microbiología básica aplicada”.
Editorial Atlante, Buenos Aires. 2000.
5. Vivian Marcela Garzón Rublano. “Aislamiento e identificación
de bacterias halófilas con potencial bioactivo aisladas de las
Biohidrometalurgia

Salinas de Zipaquirá, Colombia”. Tesis, Universidad de La Sa-

bana, Colombia, 2015.

41

XIV Jornadas Argentinas de Tratamiento de Minerales