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Introducción al ELISA y sus Aplicaciones

El documento describe el método ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción ligado a Enzimas), incluyendo su principio, los pasos para preparar el conjugado enzimático, soluciones de lavado y sustratos, y cómo se lleva a cabo la prueba. También explica cómo calcular el punto de corte y cómo se interpretan e informan los resultados. Finalmente, compara las diferencias entre pruebas de primera, segunda, tercera y cuarta generación.

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Nesther Adolfo Oseguera Zavala
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El documento describe el método ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción ligado a Enzimas), incluyendo su principio, los pasos para preparar el conjugado enzimático, soluciones de lavado y sustratos, y cómo se lleva a cabo la prueba. También explica cómo calcular el punto de corte y cómo se interpretan e informan los resultados. Finalmente, compara las diferencias entre pruebas de primera, segunda, tercera y cuarta generación.

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Universidad Nacional Autnoma de Honduras Escuela de Microbiologa Internado rotatorio II Periodo acadmico 2012 MB 344 Pasanta en Serologa y Pruebas

Especiales

ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)
Presentado por: Susan Denice Flores Mario Roberto Mendoza Catedrtico supervisor: Dra. Gina Laitano.

Tegucigalpa M.D.C., 28 de Junio de 2012


1

Principio
Esta tcnica utiliza una enzima para analizar reacciones antgeno-anticuerpo sobre una fase slida o inmunoabsorbente.
Ag o Ac fijado a una fase slida Ag o Ac en la muestra

ELISA utiliza un anticuerpo o un antgeno conjugado a una enzima, la cual reacciona con su sustrato para formar un producto coloreado que absorbe luz.
Puede ser utilizado para medir tanto el antgeno como el ELISA anticuerpo.
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Conjugado (Anticuerpo unido a enzima)

Sustrato

COLOR
2

ELISA SANDWICH

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Preparacin del conjugado enzimtico, soluciones de lavado y sustratos


Conjugado enzimtico:
1. Purificacin de los anticuerpos 2. Marcacin de los anticuerpos con la enzima mediante un agente puente (Glutaraldehdo u otra sustancia)
Enzimas utilizadas: Fosfatasa alcalina Peroxidasa
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Solucin de Lavado:
Solucin salina con Tween 20 como agente tensoactivo: ClNa + Tween 20 +Agua destilada.

Sustratos:
Nitrofenil-fosfato (FA) Ortofenilendiamina (P)

Fase de Lavado
Lavar la placa con el buffer de lavado, para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo libre (Eliminar interferencias y evitar falsos positivos). Remover el exceso de lquido golpeando la placa invertida sobre papel absorbente.

Automtico

Manual

Qu es el cut-off? Cmo se obtiene?


Valores considerados positivos

El cut-Off o punto de corte, se refiere al valor mnimo de confianza. Se utiliza para distinguir entre los resultados positivos y negativos. Clculo: El mtodo para determinarlo no siempre es el mismo, ya que existen diferentes criterios segn el productor de la prueba.
6

CUTOFF
Valores considerados negativos

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Informe de Resultados (lectura visual e instrumental)


Automtico: Lector de ELISA (espectrofotometra).

COLOR

Visual: observar el cambio de color.

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Diferencias entre Pruebas de Primera, Segunda, Tercera y Cuarta Generacin


Primera Generacin Segunda Generacin

Deteccin de anticuerpos mediante EIA indirecto con antgeno obtenido de lisado vrico y anticuerpos policlonales. ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Deteccin de anticuerpos mediante EIA indirecto con antgeno obtenido de lisado vrico y anticuerpos monoclonales. 8

Diferencias entre Pruebas de Primera, Segunda, Tercera y Cuarta Generacin


Tercera Generacin Cuarta Generacin

Deteccin de anticuerpos mediante EIA tipo sandwich o de inmunocaptura, con antgeno obtenido de protenas recombinantes y/o pptidos sintticos y deteccin conjunta de anticuerpos especficos IgG, IgM e ELISA IgA. Linked Immunosorbent Assay) (Enzyme

Disponibles en el mercado desde 1997, permiten la determinacin simultnea de antgenos y anticuerpos (HIV con el objetivo de bajar el perodo ventana mediante un solo ensayo).
9

Gracias por su Atencin...


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