El objetivo del presente trabajo fue investigar las características de fermentación de la cepa

AFP184 de E. coli en un medio a base de licor de maíz en maceración utilizando diferentes

monosacáridos y disacáridos como fuente de carbono.

A partir de las densidades celulares obtenidas después de 8 h de crecimiento aeróbico y bajo las
condiciones utilizadas, se pudo concluir que AFP184 creció en todos los azúcares y combinaciones
de azúcar excepto sacarosa. Sin embargo, la tasa de crecimiento específica de la glucosa fue más
lenta que la del crecimiento de la xilosa o la fructosa.

Este resultado es muy probablemente un efecto de la mutación en el sistema de fosfotransferasa

(PTS) de AFP184. El PTS es un sistema de enzimas responsable de la absorción y fosforilación de
diferentes azúcares en bacterias (27, 28). El PTS es específico del azúcar y la mutación en AFP184
está afectando a EIICB glc, una permeasa específica de glucosa en el PTS (12). También hay una
fosfotransferasa permeasa para la fructosa (27, 29), pero en la cepa AFP184 esta permeasa no es
afectados por alguna mutación. Aparte del PTS, E. coli también puede transportar glucosa por
permeasa de galactosa y fosforilarla por la enzima glucoquinasa (30). La glucoquinasa no está
sujeta a cualquier mutación en AFP184. Según la literatura glucosa la captación y fosforilación por
la glucocinasa es más lenta que por el PTS (31), lo que explica por qué la tasa de crecimiento de la
fructosa es mayor que la tasa de crecimiento de la glucosa. A diferencia de la fructosa, la xilosa no
se transporta a las células a través del PTS. en lugar de xilosa la captación se ve facilitada por los
efectos quimiosmóticos (32, 33). Una vez dentro de la célula es isomerizado por xilosa isomerasa a
xilulosa y fosforilada por la xilulosa quinasa a xilulosa 5-fosfato luego, la xilulosa 5-fosfato ingresa a
la ruta de las pentosas fosfato y puede ingresar a la vía glucolítica después de la conversión a
fructosa 6-fosfato o gliceraldehído 3-fosfato. Curiosamente, el crecimiento de la xilosa fue
inicialmente muy lento, mientras que el uso de glucosa y fructosa inició rápidamente un
crecimiento exponencial.

Debido a que los inóculos se cultivaron en un medio de glucosa, las fermentaciones de glucosa y
fructosa pueden tener ya las enzimas requeridas para la utilización de los respectivos azúcares,
mientras que, en el caso de xilosa, primero se debe inducir la expresión de las enzimas antes de
que pueda comenzar el crecimiento exponencial.

Cuando la glucosa se mezcla con otros azúcares, la E. coli suele consumirla primero, y después de
que toda la glucosa ha sido metabolizada se inicia la utilización de otros azúcares, fenómeno
llamado represión catabólica.

Del consumo de azúcar (Figura 1) se observó que en las mezclas de glucosa/fructosa, la fructosa se
metabolizado un poco más rápido durante la fase aeróbica. Este efecto se esperaba como
resultado de la mutación que la cepa AFP184 tiene en la glucosa PTS. Más interesante es la
observación de que cuando se mezclaron glucosa y xilosa, se fermentaron los azúcares
simultáneamente, pero la xilosa se consumió a un nivel sustancialmente puntuación alta. Otros
estudios de fermentaciones de glucosa/xilosa por los mutantes de E. coli PTS muestran resultados
similares donde la glucosa y xilosa son co-metabolizados. El efecto se atribuye a una mutación en
el PTS que afecta a EIICBglc, que a su vez evita que la glucosa de reprimir la absorción de otros
azúcares (30, 34-36).

Estimar rendimientos máximos y flujos metabólicos óptimos entre intermedios se realizaron

balances redox. El Metabolismo anaeróbico de glucosa, fructosa y xilosa de AFP184 para la
producción máxima de succinato se presenta en forma simplificada en la Figura 4. A partir de un
balance redox para la fase anaeróbica, el rendimiento máximo de succinato a partir de 1 mol de
glucosa es de 1,71 mol (1,12 g de succinato por gramo de glucosa), que está de acuerdo con
resultados previos (23).

El balance redox asume la actividad de la enzima isocitrato lisasa, una enzima clave en la
derivación de glioxilato.

Se ha informado previamente que AFP111 muestra actividad de isocitrato liasa después de

crecimiento aeróbico (23). El rendimiento obtenido en este estudio de glucosa era 1,27 mol de
succinato por mol de glucosa, que es 74% de lo teórico. Si la generación de nuevas células durante
la etapa anaeróbica se considera la fase, un balance de carbono puede dar cuenta de más de 95%
del carbono.

El rendimiento teórico de la fructosa es de 1,20 mol de succinato por mol de fructosa, que
corresponde a un rendimiento másico de 0,79, aunque esto requiere otro aceptor de electrones
como el etanol, que no fue detectado. Un balance redox sin considerar el etanol produce 1 mol de
succinato y 1 mol de piruvato por mol de fructosa. Se logró un rendimiento molar de 1,00
(rendimiento másico 0,66) para succinato de fructosa pura. Balances redox bajo condiciones
anaerobias indican que se requiere un flujo 2,5 veces mayor a través del brazo reductor para
igualar el flujo a través del oxidativo.

TCA más la derivación de glioxilato para glucosa o fructosa como sustrato. Durante la fermentación
de la fructosa por AFP184, el fenol piruvato (PEP) se convierte en piruvato por el PTS (29, 37), con
1,0 mol de fructosa que produce 1,0 mol de PEP y 1,0 mol de piruvato debido a los requisitos de
transporte. Este metabolito desequilibrado impide una redistribución equilibrada de la reducción
equivalentes, y como resultado se acumulará y excretará piruvato (38) como se observa en la
Figura 1b. La glucosa mezclada con fructosa debe proporcionar una mayor reserva de PEP para
equilibrar el piruvato generado por el transporte de fructosa y dar como resultado un mayor
rendimiento que la fructosa sola. Sin embargo, los resultados experimentales no confirman esta
hipótesis (Tabla 1), aunque mucho más ácido pirúvico se excretó inicialmente con fructosa/glucosa
mezclas relativas a la fermentación de fructosa pura (12.4 vs 5.2 gL-1)

Se sospecha que la acumulación de concentraciones más altas de ácido pirúvico para la

fermentación de sustrato mixto se debe a la absorción más rápida de ambos azúcares, lo que da
como resultado una acumulación intracelular más rápida de piruvato sin sumidero de electrones
disponible para un metabolismo posterior. Para ambas fermentaciones, la mayor parte de este
ácido pirúvico excretado fue absorbido nuevamente, requiriendo el gasto de reducción de
equivalentes para transporte activo (39). Esta excreción y reutilización de piruvato puede explicar
tanto los bajos rendimientos y las tasas más bajas encontradas para fructosa/glucosa
fermentación.

Un balance redox para xilosa da un rendimiento teórico máximo de 1,43 mol de succinato por mol
de xilosa. En el caso de la xilosa solo se logró alrededor del 45% del rendimiento teórico (0,64 moll-
1). Realizando un balance de carbono, el 60% del carbono se puede contabilizar. Se requiere más
trabajo para identificar el carbono restante. Cuando la xilosa se mezcló con glucosa, el rendimiento
aumentó a 0,83 mol de succinato por mol de azúcar, lo que se esperaba porque la glucosa da
mayores rendimientos. Cuando se usó glucosa como fuente de carbono, la productividad por
célula viable disminuyó drásticamente después de 16 h (Figura 2a).

La productividad de ácido succínico en función de la concentración de ácido succínico mostró una

fuerte disminución en la productividad en aproximadamente 30 g L-1 (Figura 2b). La concentración
de ácido succínico a las 16 h corresponde a casi 30 g L-1. De este resultado se puede concluir que
mientras las células sean viables, conservan su productividad hasta que la concentración de ácido
succínico no sea demasiado alta. La fructosa y la xilosa no mostraron disminuciones drásticas en la
productividad (Figura 2). Ninguna de estas fermentaciones logró concentraciones de succinato
superiores a 20-25 g L-1 durante las primeras 20 h de las fermentaciones (Figura 1b y c). En las
fermentaciones mixtas de azúcar, las mezclas de glucosa/xilosa no dieron como resultado
concentraciones muy altas de succinato y no se observó disminución en la productividad (Figura 3c
y d). Cuando la glucosa y la fructosa se mezclaron y fermentaron, se observó una fuerte
disminución de la productividad después de 16 h (Figura 3a) cuando la concentración de succinato
fue de aproximadamente 20 g L-1 1d)

Cuando se utilizó glucosa como fuente de carbono, las productividades no disminuyeron hasta
alcanzar concentraciones de 30 g L-1. En las demás fermentaciones las concentraciones de
productos finales distintos al succinato fueron bajas, pero en esta fermentación la concentración
de ácido pirúvico fue de 10 g L-1 a las 16 h y la concentración total de productos finales superó los
30 g L-1 (Figura 1d) . A partir de estos resultados, parece probable que las altas concentraciones
finales de los productos finales inhiban la productividad. Se han realizado muchas investigaciones
sobre los efectos de inhibición de los ácidos orgánicos sobre el crecimiento y la productividad de E.
coli (40-42). Los efectos de la inhibición de ácidos orgánicos son mayores a pH bajo cuando los
ácidos no están disociados, pero incluso a pH neutro, altas concentraciones de los ácidos han
mostrado efectos inhibidores (42).

Las fermentaciones en este estudio se realizaron con hidróxido de amonio como base para la
neutralización de los productos finales, y se ha informado que el amonio en concentraciones
superiores a 3gL-1 inhibe el crecimiento (43, 44). En el presente trabajo se obtuvieron
concentraciones de amonio de aproximadamente 10 g/L al final de las fermentaciones con alta
producción de succinato. En otros estudios, se investigaron los cambios en las características de
crecimiento de E. coli bajo diferentes concentraciones de sulfato de amonio, y se tuvieron que usar
concentraciones de sulfato de amonio del 5% antes de que se observara una inhibición severa (45).
Cuando las fermentaciones realizadas en el presente trabajo mostraron disminuciones de
productividad, se encontraban en la fase anaerobia y se produciría muy poco crecimiento aún sin
ninguna inhibición; no está claro si la productividad se vería afectada por las concentraciones de
amonio alcanzadas. La posible inhibición del amoníaco se está investigando más a fondo en
estudios en los que se comparan diferentes bases para comprender mejor las causas de la
disminución de la productividad observada.

Finalmente, conviene hacer un comentario respecto a las productividades volumétricas alcanzadas.

Como se mencionó en la Introducción, la producción biológica de ácido succínico debe alcanzar
preferentemente productividades volumétricas de 2.5 g L-1 h-1 para ser factible. En este estudio se
demostraron productividades volumétricas durante la producción anaeróbica en el rango de 1.5-
2.9 g L-1 h-1. La razón por la que las productividades alcanzan casi 3gL-1 h-1 es porque las células
después del cambio a la fase anaeróbica no están limitadas por el azúcar.

Se usó una carga inicial alta de azúcar, pero se pudieron lograr los mismos resultados alimentando
una corriente de azúcar de alta concentración después del final de la fase aeróbica. La
productividad volumétrica total depende directamente de la densidad celular, y para lograr una
alta densidad celular se requiere el uso de cantidades sustanciales de la fuente de carbono. Por
supuesto, esto podría comprometer la economía general del proceso, y se debe considerar la
densidad celular necesaria para la producción factible de ácido succínico si la tecnología se va a
aplicar a una instalación de producción a gran escala.

En este artículo, hemos demostrado el crecimiento y la producción de succinato de la cepa AFP184

de E. coli en un medio que contiene licor de maceración de maíz, sales y diferentes monosacáridos
y disacáridos.

La reducción de componentes complejos en el medio tiene un efecto positivo en el precio final del
succinato producido debido al menor costo de las materias primas; sin embargo, las
concentraciones finales están en el rango de 30-40 g/ L después de 32 h y deben mejorarse para
que el proceso sea más económico. Los estudios se dirigirán a aumentar el título final y mejorar
aún más el proceso.

Muchas investigaciones sobre los efectos de inhibición por ácidos sobre el crecimiento y la
productividad de E. coli se han llevado a cabo (40-42). Los efectos de la inhibición de ácidos
orgánicos son mayores en pH bajo cuando los ácidos no están disociados, pero incluso en
condiciones neutras. Las altas concentraciones de pH de los ácidos han demostrado inhibición
efectos (42). Las fermentaciones en este estudio se llevaron a cabo con hidróxido de amonio como
base para la neutralización del final productos, y se ha informado que el amonio en
concentraciones arriba de 3gL-1 inhibe el crecimiento (43, 44). En el presente Se obtuvieron
concentraciones de trabajo de amonio de aproximadamente 10 g L-1. obtenido al final de las
fermentaciones con alto contenido de succinato producción. En otros estudios cambios en las
características de crecimiento de E. coli bajo diferentes concentraciones de sulfato de amonio fue
investigado, y las concentraciones de sulfato de amonio del 5% tenían para usarse antes de que se
observara cualquier inhibición severa (45). Cuando las fermentaciones realizadas en el presente
trabajo mostraron disminución de la productividad, se encontraban en la fase anaeróbica y solo se
produciría un crecimiento muy pequeño, incluso sin ningún tipo de inhibición; no está claro si la
productividad se vería afectada por las concentraciones de amonio alcanzadas. posible amoníaco

inhibición se está investigando más a fondo en estudios en los que diferentes

se comparan las bases para comprender mejor las causas de la

disminución de la productividad observada.

Finalmente, se debe hacer un comentario con respecto a la volumetría.

productividades alcanzadas. Como se mencionó en la Introducción,

La producción biológica de ácido succínico debería alcanzar preferentemente

productividades volumétricas de 2.5 g L-1 h-1 sea factible. En

este estudio productividades volumétricas durante la producción anaeróbica

en el rango de 1.5-2.9 g L-1 h-1. La razón por la cual las productividades alcanzan casi 3gL-1 h-1 es
porque las células después del cambio a la fase anaeróbica no son azucaradas

limitado. Se utilizó una alta carga inicial de azúcar, pero los mismos resultados

podría lograrse alimentando una corriente de azúcar de alta concentración

después del final de la fase aeróbica. La volumetría total

la productividad depende directamente de la densidad celular, y para

lograr una alta densidad celular requiere el uso de sustanciales

cantidades de la fuente de carbono. Esto, por supuesto, podría comprometer

la economía general del proceso y la densidad celular necesaria

para la producción factible de ácido succínico debe ser considerado si

la tecnología se va a aplicar a una producción a gran escala

instalación.
The accumulation of higher concentrations of pyruvic acid for the mixed substrate fermentation is
suspected to be due to the more rapid uptake of both sugars, resulting in a faster intracellular
accumulation of pyruvate with no available electron sink for further metabolism.

This excretion and reutilization of pyruvate can explain both the low yields and the lower rates
found for fructose/glucose fermentation.

Succinic acid productivity as a function of succinic acid concentration showed a sharp decrease in
productivity at

approximately 30 g L-1 (Figure 2b). The succinic acid concentration at 16 h corresponds to almost
30 g L-1. From this result it can be concluded that as long as the cells are viable, they retain their
productivity until the concentration of succinic acid is not too high. Fructose and xylose did not
show any drastic decreases in productivity (Figure 2). Neither of these fermentations achieved
succinate concentrations of more than 20-25 g L-1 during the first 20 h of the fermentations
(Figure 1b and c). In the mixed-sugar fermentations glucose/xylose mixtures did not result in very
high succinate concentrations and no decrease in productivity was observed (Figure 3c and d).
When glucose and fructose were mixed and fermented, a sharp productivity decrease was
observed after 16 h (Figure 3a) when the concentration of succinate was approximately 20 g L-1

When glucose was used as the carbon source, productivities did not decline until concentrations of
30 g L-1 were reached. In the other fermentations the concentrations of end products other than
succinate were low, but in this fermentation the concentration of pyruvic acid was 10 g L-1 after 16
h and the total concentration of end products exceeded 30 g L-1 (Figure 1d). From these results it
seems likely that high final concentrations of end products inhibit productivity. Many investigations
regarding the inhibition effects by organic acids on E. coli growth and productivity have been
carried out (40-42). The effects of organic acid inhibition is greatest at low pH when the acids are
undissociated, but even at neutral pH high concentrations of the acids have shown inhibitory
effects (42). The fermentations in this study were carried out with ammonium hydroxide as base
for neutralization of end products, and it has been reported that ammonium in concentrations
above3gL-1 inhibits growth (43, 44). In the present work ammonium concentrations of
approximately 10 g L-1 were obtained at the end of the fermentations with high succinate
production. In other studies, changes in the growth characteristics of E. coli under different
ammonium sulfate concentrations was investigated, and ammonium sulfate concentrations of 5%
had to be used before any severe inhibition was observed (45). When the fermentations carried
out in the present work showed productivity decreases, they were in the anaerobic phase and only
very little growth would take place even without any inhibition; it is not clear if productivity would
be affected by the achieved ammonium concentrations. Possible ammonia inhibition is being
further investigated in studies where different bases are compared to better understand the causes
of the observed productivity decrease.
Finally, a comment should be made regarding the volumetric productivities achieved. As
mentioned in the Introduction, biological production of succinic acid should preferably reach
volumetric productivities of 2.5 g L-1 h-1 to be feasible. In this study volumetric productivities
during anaerobic production in the range of 1.5-2.9 g L-1 h-1 were demonstrated. The reason the
productivities reach almost3gL-1 h-1 is because the cells after the switch to the anaerobic phase
are not sugar-limited. A high initial sugar load was used, but the same results could be achieved by
feeding a high concentration sugar stream after the end of the aerobic phase. The total volumetric
productivity is directly dependent on the cell density, and to achieve a high cell density requires
the use of substantial amounts of the carbon source. This of course could compromise the overall
process economics, and the necessary cell density for feasible production of succinic acid must be
considered if the technology is to be applied to a large scale production facility.

In this paper we have demonstrated growth and succinate production of E. coli strain AFP184 in a
medium containing corn steep liquor, salts, and different mono- and disaccharides.

The reduction of complex components in the medium has a positive effect on the final price of the
produced succinate due to lower cost of raw materials; however, final concentrations are in the
range of 30-40 g L-1 after 32 h and need to be improved for the process to become more
economical. Studies will be directed to increase the final titer and to further improve the process.

Because the inocula were grown in a glucose medium, glucose and fructose fermentations may
already have the enzymes required for utilization of the respective sugars, whereas in the case of
xylose expression of the enzymes first needs to be induced before exponential growth can start.