INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUIMICA E INDUSTRIAS

EXTRACTIVAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA INDUSTRIAL

ACADEMIA DE QUÍMICA ANALITICA

LABORATORIO DE TÉCNICAS DE

SEPARACIÓN

GRUPO 3IV77

PRÁCTICA 2: Preparación de fase móvil para ser usada en HPLC

e Influencia de la cantidad del analito en la respuesta del equipo HPLC

PROFESOR: CAMACHO CAMACHO LUIS ENRIQUE

ALUMNO: ALEJANDRO CARRASCO REYES

BOLETA:2018320311

CIUDAD DE MÉXICO 13 SEPTIEMBRE 2022

OBJETIVOS

• Realizar la filtración de fase móvil para almacenarla en el reservorio correspondiente.

• Inyectar diferentes cantidades de analito para observar cómo afecta las respuestas del
HPLC.
• Realizar una calibración con los datos obtenidos.
• Simular la cuantificación de un analito de una muestra problema

1
INTRODUCCIÓN TEORICA

A) Propiedades fisicoquímicas de la cafeína, sus usos industriales y

alimenticios (o en bebidas).

Propiedades fisicoquímicas: la cafeína es un alcaloide que pertenece a la

familia de las metilxantinas es un polvo incoloro sin olor y amargo se aisló por
primera vez del café en 1819 por Friedrich Ferdinand y en 1827 del té por la
misma persona, pero aún no se lograba identificar su estructura química fue
hasta el año de 1875 donde E. Fischer. mina se relacionan
farmacológicamente con los psicoestimulantes.

La principal fuente de cafeína se obtiene directamente de la semilla del café

madura seca el café contiene una cantidad alta de cafeína entre el 0.8 y el
1.8% Aunque la dosis de cafeína depende de las diferencias genéticas de los
granos del café, así como el tiempo y la forma de preparación de acuerdo con
las variables antes descritas la concentración oscila entre 30 y 175 mg por 150
mL.

Lozano, P., García, A., Tafalla, B., Albaladejo, F., De Mallorca, P., Completo, N.,
& Farré, M. (s/f). "Sociedad Científica Española de Estudios sobre el Alcohol, el
Alcoholismo y las otras Toxicomanías." (“Sociedad Científica Española de
Estudios sobre el Alcohol, el ...”) (P.7)

2
 Punto de fusión 238 °C
punto de ebullición 178 °C14
pKa a 24 °C 14
Densidad a 25 °C 1.23 g/cm3
Solubilidad a 25 °C 21 mg/mL
Peso molecular 194.19 g/mol

Tabla 1 propiedades fisicoquímicas de la cafeína.

Usos industriales y alimenticios (o en bebidas):

Debido a su sabor amargo la cafeína se utiliza en la industria para darle un poco

de sabor amargo a los sabores demasiado dulces con ello se implementó en la
elaboración de bebidas azucaradas como refrescos bebidas energéticas antes
inclusive en la fabricación de helados especialmente en los que están cubiertos
con chocolate ya que el chocolate se fabrica con cacao y el cacao contiene en
pequeñas cantidades cafeína.

gracias a su efecto vasodilatador y aumento de la frecuencia cardiaca se eleva

la presión arterial lo que genera un estado temporal de alerta y percepción de
más energía disminuye el cansancio y estimula la memoria, la industria
farmacéutica la implementa como un aditivo a los medicamentos antigripales.

B) Como se modifica la respuesta de un cromatógrafo con respecto a la

cantidad de analito inyectado:

La cantidad de analito inyectado repercute directamente a la curva de la banda

originada, si nosotros inyectamos una carga grande de analito se originará una
deformación en la curva e incluso se puede llegar a distorsionar, es decir el

3
cromatógrafo comienza a presentar deficiencias en los cromato gramas debido a
las altas cantidades de analito inyectado sumándole las interferencias que se
pueden llegar a dar en la medición.

C) ¿Por qué el área y el altura de pico cromatográfico son buenas medidas

para calibrar un cromatógrafo?

Los picos cromatográficos nos indican que toda la señal del analito ha sido
detectada por el detector esta señal llega en forma de una banda formando así
una campana gaussiana, el pico nos muestra 3 puntos importantes del analito los
cuales son el tiempo de retención, que es el tiempo promedio que tarda el analito
en llegar al detector y medir su señal en la altura máxima, la altura del pico es
una forma de conocer la cantidad de analito que ha pasado a través del detector,
la última es el área bajo la curva de ese equipo que nos indica la cantidad de
analito que ha pasado también por el detector basándonos en esto se puede decir
que si tenemos una sustancia para calibración en donde se conoce su tiempo de
retención promedio y la señal máxima se puede utilizar esa sustancia para
calibrar el equipo y de esa manera sí la altura máxima del pico y el tiempo de
retención coinciden con lo obtenido en él cromato grafo se puede concluir que
hemos calibrado el equipo.

D) Propiedades que debe cumplir un líquido para ser usado como fase
móvil en HPLC

El o los disolventes deben de ser puros y disolver al analito deben de ser inertes
y no interferir en el análisis, debe ser compatible con el detector para lograr una
señal que sea aceptable para nuestro análisis debe de tener baja viscosidad y no
se debe de evaporar con facilidad, se aconseja utilizar una mezcla de disolventes.

4
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Filtración de la fase móvil.
Poner encima del matraz
filtro de vidrio.
Desechar el agua grado HPLC al
vaso de precipitados de
residuos
Agregar 150 mL de
agua grado HPLC al
vaso de filtración
Apagar la bomba y
desconcertar el vacío
y vertír la fase móvil al
reservorio
ENCENDIDO DEL EQUIPO
Para encender el equipo Flexar es necesario seguir los pasos de la práctica 1 ya que en ella
se indica a detalle el procedimiento para el correcto encendido.
Colocar el separador en el
filtro de vidrio
Enjuagar con poca
agua grado HPLC el
vaso de filtración y
conectamos la
manguera
Encender la bomba
Desmontar el vaso de filtración
y dejar trabajando la bomba 2
minutos al filtro de vidrio para
quitar el exceso de agua los
grisáceo del filtro de vidrio.
Alinear bien el matraz y el
filtro de vidrio
Colocar el vaso de
filtración sobre el filtro de
vidrio y sujetar con una
pinza de aluminio al filtro
de vidrio y al vaso de
filtración.
Esperamos a que se
filtre la fase móvil.
Quitar la pinza de
aluminio y la
membrana
5
CREACIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS CON CHROMERA

2.- Creamos un nuevo método, dándole

un nombre, una carpeta donde será
1.- Seleccionamos el botón de
guardado y una descripción en las notas
método
2

3.-Editamos el detector y
seleccionamos el UV-VIS y recibir
los datos por un lapso de 5
segundos y configuramos a
4.- En las opciones de la bomba longitud de onda y tener una
reducción de la línea base a cero.
seleccionamos la forma de trabajo
isocrática y asignar el tiempo de
equilibrio
6
 D

5.- Verificar el flujo en Standby para no 5.- Configurar la presión de 6000 psi
desperdiciar la fase móvil. como límite máximo de trabajo

7.- Guardar el método y seleccionar run 6.- Establecer el tiempo de equilibrio y el

time y seleccionar single run. número de corridas.

9.- En cuanto se alcanza el

8.- Buscamos el método y lo aplicamos y
tiempo de equilibrio aparece una
esperamos que el equipo alcance todos los set
ventana para hacer la inyección
point.
7
USO DE JERINGA PARA INYECTAR LA MUESTRA AL CROMATOGRAFO

Quitar la aguja y con Ponemos el Filtro sobre

Tomar 1mL de
cuidado quitar la la jeringa y la aguja
muestra
burbujas de aire que sobre el Filtro la
hayan podido entrar en muestra está lista para
el cuerpo de la jeringa. ser inyectada

introducimos la aguja por la

Una vez introducida la muestra
puerta delantera de la
realizamos la inyección bajando la
válvula de inyección y
palanca a la posición de inyecte ese es
comenzamos a empujar el
el momento en el que la muestra es
émbolo de la jeringa
transportada por la fase móvil hacia la
debemos introducir 7 veces
columna cromatográfica
de volumen nominal del
loop de muestra en este
caso son 20 microlitros

Cuando el cromato grama haya

terminado podemos subir la palanca a
la posición load y retirar la jeringa para
la siguiente inyección

8
 USO DEL PROGRAMA CHROMERA PARA OBTENER LOS DATOS CONTENIDOS EN UN CROMATOGRAMA.

1.- Se obtiene el cromatograma y vemos

el pico de la cafeína inyectada
2.- Tiene una forma de pico gaussiano

3.- Cuando ya se tiene el cromatograma,

4.-Obtenemos los valores de interés y el debemos ir a la parte de reportes y se
cromatograma. selecciona el de interés.

APAGADO DEL EQUIPO

Para apagar el equipo es necesario seguir los pasos de la práctica 1 ya que ahí se detallan
con detenimiento para hacer un correcto apagado.

9
RESULTADOS EXPERIMENTALES
Cromatograma Metanol 70% Agua 30%
Concentración Metanol 5mg/L
Flujo 1mL/min

10
Cromatograma Metanol 70% Agua 30%
Concentración Metanol 10mg/L
Flujo 1mL/min

11
Cromatograma Metanol 70% Agua 30%
Concentración Metanol 30mg/L
Flujo 1mL/min

12
TABLA DE RESULTADOS
Conc. mg/L tR(min) A(uA.s) H(uA) A/H (S)

5 3.405 406094.8 29502.3 13.7648522

10 3.4 370005.9 31688.2 11.6764569

30 3.406 1189611.4 115261.4 10.3209869

ANALISIS DE RESULTADOS
a) Graficar volumen vs tiempo de retención para analizar la tendencia de los datos y
deducir la razón de ese comportamiento

tR vs Concentración
3.407
3.406
3.405
3.404
tR min

3.403
3.402
3.401
3.4
3.399
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración en mg/L

Se observa que la tendencia es una línea recta, pero existe un punto que sale de la
tendencia esto se dio ya que probablemente la muestra no es de la concentración deseada,
ya que el comportamiento dice que mientras aumenta la concentración debe de aumentar
el tiempo de retención.

13
 b) Graficar volumen vs Área de pico para analizar la tendencia de los datos y deducir la
razón de ese comportamiento

Área vs Concentración
1400000

1200000

1000000
Area (uA.s)

800000

600000

400000

200000

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración en mg/L

Se observa que la tendencia es similar al de una línea recta a excepción de un punto de

concentración y área que quedan fuera de la regla que nos dice que, si aumentamos
concentración, el área debe de aumentar.
c) Graficar volumen vs altura de pico para analizar la tendencia de los datos y deducir la
razón de ese comportamiento

Altura vs Concentración
140000

120000

100000
Altura (uA)

80000

60000

40000

20000

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración en mg/L

Se observa que sigue tendencia de una línea recta y que se cumple la proporcionalidad de que
si aumentamos concentración, también crece el pico, esto crece significativamente y se puede
ver en el gráfico, ya que en los dos primeros punto la pendiente no es tan grande, pero el
cambio de pendiente del punto dos al tres si es más grande.

14
d) Graficar volumen vs (área/altura) para analizar la tendencia de los datos y deducir la razón
de ese comportamiento

A/H vs Concentración
14
13.5
13
12.5
A/H

12
11.5
11
10.5
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración en mg/L

Se observa que al hacer A/H obtenemos unidades de segundos lo cual nos indica la rapidez
que se muestra el pico gaussiano en el cromatograma, ya que a mayor cantidad de analito se
detecta con mayor facilidad en el detector. También se puede considerar que los picos
cromatográficos tienen la forma de un triangulo y al hacer la relación de A/H se mide el ancho
del pico y estos crecen de manera proporcional, ahora bien, si la relación es muy variable se
pude asumir que los picos se están deformando y no estamos en la linealidad de calibración.
CALCULOS
a) Utilizar el método de estándar externo para realizar la calibración del equipo usando
área y altura con los datos obtenidos en clase presencial
Calcular el contenido de cafeína en una muestra ficticia si su área de pico es A = 550160 uA.s
Volumen inyectado 20 microlitros

Área vs Concentración
1400000
1200000
y = 34095x + 143815
1000000
Area (uA.s)

800000
600000
400000
200000
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración en mg/L
15
De la regresión lineal;
𝑦 = 34095𝑥 + 143815
𝑑𝑜𝑛𝑑𝑒 𝑥 = 𝐶 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 , 𝑦 = 𝐴𝑟𝑒𝑎 = 550160 ∴
550160 = 34095 ∗ 𝐶 + 143815
550160 − 143815
𝐶=
34095
𝐶 = 11.9180𝑚𝑔/𝐿
𝑀𝑎𝑠𝑎 = 𝐶 ∗ 𝑉
11.9180𝑚𝑔
𝑀𝑎𝑠𝑎 = ∗ 0.00002𝐿
𝐿
𝑀𝑎𝑠𝑎 = 0.000238 𝑚𝑔

Calcular el contenido de cafeína en otra muestra ficticia si su altura de pico es h = 60610 uA.

Altura vs Concentración
140000

120000
y = 3644.2x + 4154.9
100000

80000
Altura

60000

40000

20000

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración en mg/L

𝑦 = 3644.2𝑥 + 4154.9
𝑑𝑜𝑛𝑑𝑒 𝑥 = 𝐶 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 , 𝑦 = 𝐴𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 = 60610 ∴
60610 = 3644.2 ∗ 𝐶 + 4154.9
60610 − 4154.9
𝐶=
3644.2
𝐶 = 15.4917𝑚𝑔/𝐿

16
 𝑀𝑎𝑠𝑎 = 𝐶 ∗ 𝑉
15.4917𝑚𝑔
𝑀𝑎𝑠𝑎 = ∗ 0.00002𝐿
𝐿
𝑀𝑎𝑠𝑎 = 0.00031 𝑚𝑔

CONCLUSIONES
Es de vital importancia preparar con mucho cuidado las muestras con la concentración
adecuada para no tener errores en las gráficas, ya que como se puede observar en esta
experimentación no siguen muy bien la línea de tendencia de una línea recta, por otra parte,
se cumplieron con los objetivos de la práctica, aprendimos a filtrar la fase móvil de manera
correcta ya inyectar la muestra.
Como recomendación es que los videos sean un poco más cortos ya que por momentos se
vuelve pesado ver todo seguido

REFERENCIAS
Bibliografía
Crouch, S., West, D. M., Holler, F., & Skoog, D. A. (2008). Principios de Analisis
Instrumental (6a ed.). Cengage Learning Editores S.A. de C.V.
Encendido y apagado de equipo HPLC, Flexar Perkin Elmer. (2020, junio 2). Youtube.
https://www.youtube.com/watch?v=bBGMprHci_4
Calibración de equipo HPLC y Filtración de fase Movil. (2020, junio 12). Youtube.
https://www.youtube.com/watch?v=QEyA1i47yaM
Lopez, R. [UCWkcePg-ZG4MXDYehta4YMg]. (2016, junio 8). Filtrado de disolventes para
HPLC. Youtube. https://www.youtube.com/watch?v=yjrCpKMGEfM

17