Determinación de la hemoglobina en sangre total

Objetivo:

Saber los métodos de determinación de hemoglobina en sangre y para qué

sirve

Material:

-Micropipetas.

-Pipetas graduadas.

-Frasco lavador.

-Puntas de micropipeta.

-Pipetas Pasteur.

-Temporizador.

-Papel de filtro.

-Cubetas para el espectrofotómetro.

-Gradilla.

-Tubos de ensayo.

Precaución de seguridad:

El cianuro de potasio: Muy tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto

con la piel.

Reactivos:

-Preparación del reactivo:

Poner 5 ml de cianuro de potasio en un matraz de 250 ml y mezclar con agua

destilada hasta la línea de aforo.
Procedimiento:

1. Rotulamos 5 tubos de ensayo como Blanco de reactivo, Patrón , muestra 1

y muestra 2.

2. En el tubo rotulado Blanco, le añadimos con una pipeta 2,5 ml de Reactivo.

3. En el tubo rotulado Patrón, le añadimos con ayuda de una pipeta 2,5 ml de

Reactivo y con una micropipeta también le añadimos 10 ml de Patrón para
hemoglobina.

4. En el tubo de ensayo rotulado como muestra 1, ponemos 10 ml de la

primera sangre escogida y 2,5 ml de Reactivo .

5. En el tubo rotulado como muestra 2, hacemos lo mismo que para la

muestra 1 pero con la segunda sangre escogida.

6. Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente.

7. Utilizar el espectrofotómetro para calcular la absorbancia del patrón y de

las muestras 1 y 2.

Para calibrar el espectrofotómetro debemos hacerlo diluyendo primero a 1/2 y

después a 1/4, añadiendo en un tubo de hemólisis 1 ml de patrón de
hemoglobina (16.7g/dl), en el segundo tubo añadiendo 0,50 ml de patrón
anterior y 0,50 ml de agua destilada (8.35 g/dl) y en el tercer tubo añadiendo
0.5 ml del tubo anterior y 0,50 ml de agua destilada (4,16 g/dl).
Curva de calibración:

curva de calibración

Resultados :

-Patrón 1:Concentración de hemoglobina= 16.7 g/dl y A540= 0,435

-Patrón 2:Concentración de hemoglobina= 8,35 g/dl y A540= 1,131

-Patrón 3:Concentración de hemoglobina= 4,16 g/dl y A540= 1,262

Cálculos:

y = 0,0765 x + 0,146
y = 0,0765*16.7 + 0,146 = 1.42355

y = 0,0765 x + 0,146
y = 0,0765*8.35 + 0,146 = 0.784775

y = 0,0765 x + 0,146
y = 0,0765*4.17+ 0,146 = 0.465005

Con el espectrofotómetro obtuvimos estos resultados:

Patrón: -0.045

Muestra 1: A540 = 0,712

Muestra 2: A540 = 0,388

Obtuvimos la concentración de hemoglobina de las muestras con esta

fórmula. Se puede hacer mirando la gráfica pero yo prefiero hacerlo de esta
forma
((A) Muestra 1 o 2 / (A) Patrón ) x 15

Muestra 1: (0,712 / -0,045) x 15 = -237,3 g/dl.

Muestra 2: (0,388 / -0,045) x 15 = -129.3g/dl.