Tecnicas Especiales Patologia

CLASE 3: TÉCNICAS ESPECIALES

Contenido
ESTUDIO HISTOLÓGICO TRANSOPERATORIO (BIOPSIA POR CONGELACIÓN).............. 2
INDIACIONES DE LA BIOPSIA POR CONGELACIÓN .......................................................................... 3
TIPO DE EQUIPO UTILIZADO ............................................................................................................ 3
FORMA DEL REPORTE...................................................................................................................... 4
CITOLOGÍA ....................................................................................................................... 5
TIPOS DE CITOLOGÍAS ..................................................................................................................... 6
TÉCNICAS DE ESTUDIO UTILIZADAS EN CITOLOGÍA ........................................................................ 6
INDICACIONES PARA LA TOMA DE CITOLOGÍAS. ............................................................................ 7
TINCIÓN ........................................................................................................................................... 7
VENTAJAS Y LIMITANTES ................................................................................................................. 7
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ......................................................................................... 8
ASPECTOS TÉCNICOS BÁSICOS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA .............................................. 9
TIPOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ........................................................................................ 11
LIMITACIONES DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ..................................................................... 12
ESTUDIO DE CITOGENÉTICA ........................................................................................... 14
¿COMO HACER UNA PREPARACION PARA OBSERVAR EL CARIOTIPO? ........................................ 15
BANDAS CROMOSOMICAS ............................................................................................................ 15
INMUNOHISTOQUIMICA ................................................................................................ 15
ANTICUERPOS COMO REACTIVOS ESPECIFICOS DE TEJIDO .......................................................... 16
PARTES DE UN ANTICUERPO ......................................................................................................... 16
TIPOS DE ANTICUERPOS USADOS ................................................................................................. 17
TECNICAS DE INMUNOHISTOQUIMICA ......................................................................................... 17
APLICACIONES GENERALES ........................................................................................................... 17
TIPOS DE PROTEINAS QUE SE PUEDEN DETECTAR........................................................................ 18
MARCACION NUCLEAR .................................................................................................................. 18
MARCACION MEMBRANA ............................................................................................................. 19
MARCACION CITOPLASMICA ......................................................................................................... 19
INMUNOFLUORESCENCIA .............................................................................................. 19
COMPONENTES ESENCIALES ......................................................................................................... 20
TECNICAS DE FLUORESCENCIA ...................................................................................................... 21
APLICACIONES DE LA INMUNOFLUORESCENCIA........................................................................... 22
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TECNICAS MOLECULARES .............................................................................................. 24

TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN............................................................................................................. 24
HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA ................................................................................ 25
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ........................................................................ 26
CITOMETRÍA DE FLUJO .................................................................................................................. 26
AUTOPSIAS .................................................................................................................................... 28
MÉTODOS DE EXTRACCION DE VISCERAS ..................................................................................... 30
REPORTE DE UNA AUTOPSIA ......................................................................................................... 31
En esta clase se revisarán técnicas utilizadas en anatomía patológica.
ESTUDIO HISTOLÓGICO TRANSOPERATORIO (BIOPSIA POR CONGELACIÓN).

Se realiza en el contexto de una intervención quirúrgica o peri-operatoria
(durante el acto operatorio)
La única indicación es para que el cirujano tratante pueda elegir entre dos
o más opciones quirúrgicas dependiendo del informe anatomopatológico
intraoperatorio
En la mayoría de los casos al cirujano le basta que el

patólogo establezca si la lesión que se esta
estudiando se trata de una lesión benigna o de un
cáncer.
El tiempo estimado para dar respuesta debe ser un

diagnóstico rápido y es entre 20 a 15 minutos.
En términos generales en cuanto a la biopsia por

congelación el diagnostico de malignidad no
presenta problemas para un patólogo con
experiencia, sin embargo, en un bajo porcentaje de casos la decisión debe
postergarse 1 o 2 días hasta que se hayan examinado mas muestras
procesadas por la técnica con parafina, ya que los cortes congelados
pueden dar artefacto al momento de estudiarlos. Ya sea que tengamos una
lesión tumoral demasiado grande que necesita ser muestreada con más
cortes y no tenemos la certeza necesaria para dar un diagnostico preciso
en ese momento, por lo que el diagnostico se difiere a estudio por parafina.
Aquí podemos ver en la imagen unos bloques de parafina.
Otros objetivos de la biopsia por congelación son:
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 Determinar la presencia de lesión en los bordes de resección

quirúrgica: es decir que cuando nos manden el espécimen en fresco,
el cirujano muchas veces nos etiqueta con hilos de reparo quirúrgico
los limites de resección de esta lesión para evaluar ya sea en la biopsia
por congelación, que estos límites no estén infiltrados por la neoplasia
en estudio.
 Determinar la presencia de cáncer en una estructura que apoyaría
estadiaje. Es decir, en ganglios linfáticos o sitios de metástasis a
distancia.
 Como parte de la técnica para inmunofluorescencia o histoquímica
enzimática.
INDIACIONES DE LA BIOPSIA POR CONGELACIÓN

Estas no se deben enviar para satisfacer una curiosidad del cirujano, jugar o
engañar al patólogo o por impericia. Tienen que ser unas indicaciones muy
precisas como:
 Definir los límites, presencia de neoplasia, definir malignidad o

benignidad de la lesión en estudio.
 No se usa para diagnóstico definitivo.
 Se puede apoyar de la biopsia por congelación para realizar técnicas
de inmunofluorescencia o histoquímica enzimática (musculo estriado
y nervios).
TIPO DE EQUIPO UTILIZADO

Se utiliza un criostato o criotomo (también llamado
criostato microtomo) el cual cuenta con un criotomo
de rotación estándar que está encerrado en una
cámara fría y es el encargado de cortar en rebanadas
el material que se ha congelado.
Además, podemos observar en la imagen el microtomo

de congelación, el cual también se conoce como
criostato o criotomo y que es el encargado de cortar en rebanadas el
material congelado, esta encajado o encerrado en una cámara fría.
Cuando recibimos en las biopsias por congelación el espécimen
generalmente viene en fresco. Se toma la muestra y se hacen extendidos
citológicos y luego este tejido se coloca en una materia externa, se le
coloca tichutec (así dijo el Dr. pero ni Google sabe qué es eso xd), el cual le
va a permitir solidificarse al tejido y adherirse a la placa externa para ser
cortado posteriormente por el microtomo.
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Cuando ya se realizan los cortes se diseña un tren de tinción corto para

colorear las laminas obtenidas, posteriormente se coloca el cubreobjeto y
se le entrega al patólogo para interpretación y diagnóstico.
Los tejidos generalmente están congelados a -35°c y encajados en una

matriz de soporte basada en agua. A diferencia de las técnicas estándar, el
tejido no está infiltrado con la matriz; sino que está rodeado y soportado por
ella.
Los cortes se realizan en una cámara fría establecida a temperaturas de -

14°c a -20°c, dependiendo del contenido en agua del tejido que se esté
estudiando. Es decir, menor temperatura para menor contenido en agua y
mayor temperatura para mayor contenido en lípidos.
Los cortes pueden realizarse tan finos como de 12 micras hasta 40 micras o
más. Los tejidos frágiles deben ser embebidos antes de su congelación
(como vemos en la imagen inferior del medio en azul, ya sea en gelatina
10% acuosa o en agarosa 2% acuosa. Este material se encarga de infiltrar los
tejidos que generalmente son muestras o cortes de cerebro y que son muy
difíciles, por lo que se recomienda además de este el tichutec. Otros
materiales que describe el libro es la clara de huevo, para fijar mejor el tejido
a la placa externa y realizar unos cortes óptimos para ser evaluados en el
microscopio.
FORMA DEL REPORTE

Se le puede entregar al clínico y debe incluir:
a) La descripción macroscópica del espécimen en estudio: se le da el

tamaño, se describe el color, la consistencia y si son varias muestras en
conjunto se pesan.
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b) El apartado de la descripción microscópica generalmente se omite.
c) El diagnostico anatomopatológico es el que importa, se hace el

diagnostico cuando la patología en estudio es de fácil diagnóstico, pero si
es muy dificultosa o necesitamos muestrear mejor o se necesitan estudios
especiales como técnicas de inmunohistoquímica que nos den la certeza
diagnostica, este se difiere al diagnostico por parafina. Y también podemos
dar no concluyente el diagnostico, pero diciendo que el espécimen en
estudio está negativo a malignidad o positivo a malignidad.
CITOLOGÍA
Definición: Es la ciencia derivada de la biología que se dedica al estudio de
la célula.
Cito: célula Logos: estudio o tratado
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El objeto de la citología es realizar un diagnostico precoz el cáncer

ginecológico, realizar el screening o tamizaje.
Otro objetivo es realizar diagnósticos de benignos o malignos siempre

acompañado del estudio histopatológico (biopsia).
Y también se usa para hacer recuentos celulares o para el diagnostico de

esterilidad en los hombres con espermatozoides.
TIPOS DE CITOLOGÍAS
1. Citología exfoliativa:
a) Ginecológica: tracto cérvico-vaginal y endometrial.

b) Boca y tracto digestivo.
c) Tracto respiratorio: esputo y cepillados o aspirados
bronquiales.
d) Líquidos: orina, derrames (ascítico, pleural, pericárdico,
articular), líquido cefalorraquídeo, ampollas cutáneas, etc.
e) Semen (estudios de esterilidad).
f) Test de Tzanck, el cual consiste en una toma de muestra del contenido
liquido de las vesículas herpéticas o del frotis de la base de las lesiones
ulcero-costrosas. Esta muestra se fija en un portaobjeto y se tiñe con
tinción de Giemsa o azul de toluidina con el fin de observar el efecto
citopático que ejerce el virus en la célula. A pesar de ser una técnica
clásica, sigue teniendo una gran utilidad y representa un método
sencillo y económico de confirmar de forma rápida el origen
herpético de una lesión cutánea, sobre todo en ámbitos medios en
los que no se dispone de técnicas para el diagnostico de las
infecciones herpéticas.
2. Citología por punción-aspiración con aguja fina

(PAAF), tanto para lesiones cutáneas y de los tejidos
blandos superficiales como glándula mamaria o
glándula tiroides, como para los órganos profundos.
TÉCNICAS DE ESTUDIO UTILIZADAS EN CITOLOGÍA

 Macroscópicas (Macropatología).
 Microscópicas, con el microscopio óptico (Citopatología).
 Generales o convencionales.
 Citoquímica.
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 Inmunocitoquímicas.
 Morfométricas (Morfometría Estática).
 Ultramicroscópicas, con el Microscopio Electrónico.
 Moleculares (Patología Molecular).
 Otras: Citometría de Flujo, etc.
El tiempo de respuesta para estos estudios citologicos es:
Citología urgente: como por recuentos celulares, el diagnostico se da en 60

minutos.
Citología normal: diagnostico de 24-48 horas.
La mayor utilidad de la citología es realizar el diagnosytico precoz del

cáncer. Hay que entender que no es un estudio de certeza, sino un tamizaje
y screening. El mejor éxito y el tipo de muestra mas frecuente a estudiar es
de la region cervico-vaginal. Como vimos en la priemera clase, gracias a
pap nicolau, hace mas de 50 años se diseñó una forma de predecir en
grandes poblaciones de mujeres en riesgo la probabilidad de tener o
adquirir cáncer de cuello uterino, la cual es una enfermedad prevenible
mediante la toma de citologías seriadas en la población que se encuentra
en riesgo.
INDICACIONES PARA LA TOMA DE CITOLOGÍAS.

Nos sirven para estudiar lesiones superficiales de facil abordaje en el estudio
de patología mamaria, patología tiroidea y patología ginecológica
(citología cérvico-vaginal), estudios de ganglio linfático.
Además, otra indicación sería el estudio de lesiones virales con formación

de vesículas (virus herpes), lesiones de la lengua y cavidad oral y estudio del
índice de maduración vaginal.
TINCIÓN
En cuanto a la batería de tinción que se utiliza en la citología son dos, estas
pueden ser coloreadas con la tinción de hematoxilina-eosina, o por tinción
de Papanicolau.
VENTAJAS Y LIMITANTES
Con respecto a las ventajas de la citología:
Podemos decir que cuando el diagnóstico es superficial o la lesión es

superficial o de fácil abordaje, se puede emplear la citología.
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- VENTAJAS DE LA TÉCNICA (citología):

1. La respuesta de estas es rápida.
2. Facilita la terapéutica cuando se diagnostican microorganismos.
3. Fácil abordaje
4. Se pueden estudiar poblaciones fácilmente, para luego hacer
estudios más de cerca a los positivos o sospechosos a una lesión
maligna.
En cuanto a las LIMITANTES DE LA TÉCNICA (citología):
1. No es diagnóstica, es un tamizaje. Como recordamos esta técnica no

es un diagnóstico certero; únicamente se utiliza para realizar
tamizajes.
2. La negatividad no excluye malignidad. La negatividad de estos
reportes de la citología no excluye que en estudios posteriores
histopatológicos la lesión se reporte como maligna.
3. La positividad acelera más, la necesidad de hacer biopsia. Cuando
tenemos un resultado de citología positivo o sospechoso de
malignidad, esto acelera más la necesidad de realizar una biopsia.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
En este apartado se abordará otra técnica especial en los

laboratorios de anatomía patológica como es la microscopía
electrónica
Las principales aplicaciones de la microscopía electrónica para la

patología de diagnóstico están:
- En los campos de la patología renal y;

- La patología tumoral.
En la patología tumoral los exámenes ultraestructurales han demostrado ser

muy útiles para determinar la histogénesis o, es decir; la diferenciación de
estos. Incluyendo diversos tumores, pero por desgracias no han mostrado
diferencias consistentes entre las condiciones reactivas, tumores benignos,
tumores malignos del mismo tipo de células. Las lesiones de carácter
polémico en la que la microscopia electrónica ha proporcionado
información crucial y ha ayudado a estudiar la histogenética de estos
tumores; podemos mencionar los siguientes:
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• El tumor de células • Mesotelioma

granulares • Timoma de células fusiformes
• El schwannoma • Los tumores carcinoides
• Histiocitocitosis de células de • Carcinomas de células
Langerhans pequeñas de diversos sitios
• Las células fusiformes o • Seminoma espermatocítico
sarcomatoides del testículo.
• Carcinoma
Para concluir podemos decir que las áreas de diagnostico en la cual
interviene la microscopía electrónica en la patología, esta interviene en:
1. La patología renal, en combinación con microscopía de luz e

inmunofluorescencia.
2. Ultraestructura de los tumores de histiogénesis incierta.
3. En el estudio subcelular de los macrófagos en las enfermedades de o
por almacenamiento.
4. Para fines de investigación.
PRIMER MICROSCOPIO ELECTRONICO SE ATRIBUYE A ERNST RUSKA (ALEMAN)

Y SUS COLABORADORES EL CUAL FUE CONSTRUIDO ENTRE 1931 Y 1934.
Entre las aplicaciones de la microscopía electrónica podemos mencionar:
 la identificación de partículas virales, intranucleares y citoplasmáticas.

 Puede ayudar al estudio de enfermedades metabólicas para estudiar
el tipo de inclusiones o cuerpos de inclusión en células afectadas
(enfermedad de Niemann-Pick, Tay-Sachs, amiloide, etcétera).
 Juega un rol o papel muy importante en el estudio de las
enfermedades del riñón, en particular en glomerulopatías primarias y
secundarias.
 Junto con la inmunofluorescencia directa representan el estudio
básico para llegar a un diagnostico preciso en cada caso que se
sospeche de una enfermedad renal.
ASPECTOS TÉCNICOS BÁSICOS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
En cuanto a la microscopia electrónica está una técnica que requiere
instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Si se
utiliza la microscopía electrónica; las muestras deben llevar un proceso, para
la microscopía electrónica (en los siguientes puntos parafraseó diapositiva,
información en color celeste es de la diapo):
1. FIJACIÓN: Deben fijarse en glutaraldehído que se solicita al laboratorio
de patología con las instrucciones para toma y fijación de la muestra;
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los fragmentos deben ser pequeños y deben fijarse en forma de varios

trocitos cuboideos de no más de 1 mm, obtenidos con hojas de afeitar
o bisturí limpio.
 Piezas delgadas de tejido de no más de 1 mm de espesor deben
fijarse en glutaraldehído tamponado al 2-4% o en mezcla de formalina
y glutaraldehído.
 Posteriormente debe de fijarse en solución tamponada de tetróxido
de osmio para aumentar el contraste.
2. INCLUSIÓN: Las muestras incluyen resinas sintéticas o EPON™; en una

rejlla.
 Con resina en una rejilla.
3. SECCIONES SEMIFINAS: No se agregó nada más.
 Las secciones semifinas se cortan en un espesor de 1 micra y se tiñen
con azul de metileno o azul de toluidina.
4. CORTES ULTRAFINOS: Se practican cortes 10 veces más delgados que
la microscopía de luz, llamados cortes ultrafinos. La tinción de estos se
realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo,
tetróxido de osmio y acetato de uranilo.
 Para el examen ultraestructural, los cortes ultrafinos se cortan con un
bisturí de diamante.
 Con el fin de aumentar la densidad de los electrones, las secciones
delgadas se pueden teñir haciendo inmersión de la rejilla en una
solución de citrato de plomo y urinyl acetato que permiten un
contraste adecuado al tejido, bajo el haz de electrones.
 Los cortes ultrafinos se montan sobre grillas de cobre, se tiñen y se
observan al microscopio electrónico
Para documentar estos hallazgos es necesario:
✓ Tener fotografías en blanco y negro de las preparaciones.
✓ Las grillas, muestras e inclusiones se guardan en un archivo especial
donde puedan durar muchos años.
NOTA: AL FINALIZAR LA DIAPOSITIVA MENCIONÓ QUE SE PUEDE VER UN
RESUMEN DE LO QUE ACABA DE EXPONER, EN CUANTO AL PROCESO PARA
LOGRAR OBSERVAR EN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO Y LEYÓ DIAPO.
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Con ayuda de la microscopía

electrónica se logra observar a
mayor profundidad las
características o ultraestructuras
celulares. Esto se refiere al estudio
de las organelas, partes de las
organelas de una célula o las
sustancias contenidas en estas
mismas.
TIPOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Existen dos tipos de microscopía electrónica: Microscopía electrónica y

microscopía de barrido.
1- LA MICROSCOPÍA DE TRANSMISIÓN:
Es la técnica más usada en el diagnóstico patológico.
 En esta técnica la preparación teñida es traspasada por un haz de
electrones, lo cual proporciona la imagen ultrafina sobre una pantalla
ad hoc.
 El microscopio electrónico de transmisión es capaz de generar un haz
de electrones a alta tensión (80kV) y concentrarlo sobre la
preparación mediante un complejo sistema de campos
electromagnéticos equivalentes a las "lentes" del microscopio de luz.
 La mayor utilidad de la microscopía electrónica de transmisión es en
la Oncología.
2- MICROSCOPÍA DE BARRIDO:
 La microscopía electrónica de barrido permite el estudio de
superficies celulares.
 La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un
haz electrónico ultrafino.
 Las señales generadas se recolectan, amplifican y captan en un tubo
de rayos catódicos.
 Se utiliza en forma rutinaria en el estudio de enfermedades del tallo
piloso.
 En estas condiciones hay anomalías estructurales y de superficie de
los pelos, que pueden identificarse fácilmente con esta técnica.
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 De esta forma, es posible incluso establecer un pronóstico de

reversibilidad de las alteraciones utilizando esta técnica.
LIMITACIONES DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

En la actualidad el papel de la microscopía electrónica en cuanto al
diagnóstico ha disminuido, considerablemente debido a que la llegada de
técnicas muy especiales o más avanzadas como la inmunización química y
otras que abordaremos en esta clase. Sin embargo; sigue siendo una
poderosa herramienta que puede ser de gran utilidad para el patólogo,
para realizar un diagnostico adecuado si se utiliza de forma selectiva e
inteligente, cumpliendo conocimiento de sus posibles contribuciones y
limitaciones. El patólogo ante un tumor que se encuentre diagnosticándolo
mediante microscopía óptica; si se envía una muestra para estudio de
microscopía electrónica con la esperanza de que algún rasgo de
importancia diagnostica se encuentre, es probable que el clínico u
patólogo se decepcione con los resultados.
Podemos observar en la imagen de la

izquierda, tomada con microscopía
electrónica de un paciente con una
nefropatía por IgA, en la cual se pueden
ver depósitos nodulares en el mesangio y
paramesangio. Así como dentro de él,
granos escapilares (no se entiende).
Para concluir; podemos decir que las limitaciones de la microscopía

electrónica se pueden resumir de la siguiente forma:
 Dificultades en el muestreo, ya que sólo una pequeña proporción de

la neoplasia o del tejido a procesar, puede ser estudiado.
 La escasez de características ultraestructurales verdaderamente
específicos, ya que el número de orgánulos u otras estructuras que son
exclusivos de un tipo de célula o tejido es muy pequeña.
 Posible interpretación errónea de elementos no neoplásicas como
pertenecientes al tumor. Ciertamente, esta posibilidad existe con
cualquier técnica, pero es particularmente notable con microscopía
electrónica debido a las dificultades en la evaluación de las
relaciones espaciales en una pequeña muestra de tejido.
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En la diapositiva se presenta una imagen en la cual:

A: Se presencian lesiones observadas en microscopía de luz.
B: Se observa, las microfotografías dadas por el microscopio electrónico, se
observan lesiones con citoplasmas eosinofílicos granulares por lo que en la
letra A podemos observar un oncomitoma. Si vemos por microscopía
electrónica, el oncocitoma, vamos a observar el citoplasma ocupado por
abundantes mitocondrias.
C: Tenemos células acinares del páncreas, con un aspecto eosinofílico
granular y en la microscopía electrónica vamos a observar gránulos de
zimógeno y RER (letra D).
E: Se tiene una neoplasia, un carcinoma de células en anillo de sello. En
microscopía electrónica podemos observar el grado variable de
hidratación que presentan debido a los gránulos de mucina o mucinógeno
(letra F).
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En esta diapositiva podemos observar imágenes obtenidas a través de

microscopía electrónica.
A: Se observa un núcleo de un carcinoma bronquiolo alveolar con las
características de inclusiones nucleares verdaderas, las cuales son
microtubulares y responsables de grados variables de aclaramiento nuclear
en el microscopio.
B: Podemos observar bolsillas nucleares propias de las células linfoides, pero
no indican necesariamente su carácter maligno.
C: Se observan linfocitos T con irregularidades nucleares o del contorno
nuclear.
D: Un estroma mixoide, en la cual, la porción del colágeno es muy baja y
predominan los polisacáridos, los cuales adoptan un característico
reticulado.
ESTUDIO DE CITOGENÉTICA
En este apartado abordaremos estudios de citogenética
La citogenética realiza un estudio de los cromosomas de forma gruesa, es

decir; puede ser diagnóstico en las enfermedades donde los cromosomas
son los afectados. En genética los cinco síndromes más importantes de
trastornos cromosómicos son los siguientes:
1. Los de autosomas • S. Klinefelter y;
2. El síndrome de Down • S. Turner
(trisomía 21)
3. Trisomía de Edwards
(trisomía 18)
4. Trisomía de los cromosomas
sexuales:
Para avanzar debemos tener claro los siguientes términos:
¿Qué es el cariotipo?
• El cariotipo es el conjunto de cromosomas de una célula.
• Si cuando una célula está en metafase se realiza una preparación y
se fotografían sus cromosomas y se ordenan, siguiendo determinados
criterios, obtendremos el ideograma de un cariotipo.
• Al observar el ideograma de un cariotipo podemos ver que los
cromosomas están por pares de homólogos. Esto es, tenemos dos
juegos de cromosomas (2n cromosomas). Un juego aportado por
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nuestra madre en el ovulo y el otro por nuestro padre en el

espermatozoide.
• Los cariotipos son muy útiles pues permiten detectar las mutaciones
cromosómicas. Estas mutaciones pueden ser las causas de graves
alteraciones.
¿COMO HACER UNA PREPARACION PARA OBSERVAR EL CARIOTIPO?
 Se toma la sangre periférica y se separan los glóbulos blancos.

 Se incuban en presencia de productos que inducen a la mitosis como
la fitohemaglutinina.
 Se detiene la mitosis en la metafase (utilizando colchicina, que
interfiere con los microtúbulos del huso).
 Se rompen las células por choque osmótico introduciéndolas en un
medio hipotónico.
 Se deposita una gota de la preparación entre porta y cubre (sobre el
cual se hace presión).
 Se fijan, colorean y fotografían los núcleos estallados.
 La foto se amplifica y los cromosomas se recortan y se ordenan.
BANDAS CROMOSOMICAS
Debido al tratamiento de los cromosomas
con determinadas sustancias revela la
presencia en estos de bandas, en ciertos
lugares fijos para cada cromosoma, que
sirven para reconocerlos e individualizarlos.
De esta manera es más fácil ordenarlos y

hacer un ideograma.
INMUNOHISTOQUIMICA
La inmunohistoquímica (IHQ), o inmunocitoquímica, es un método para

localizar antígenos específicos en tejidos o células basados en el
reconocimiento antígeno-anticuerpo. Esto corresponde a un grupo de
técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de
antígenos presentes en las células o tejidos, utilizando anticuerpos
marcados. Esta técnica se basa en la capacidad de los anticuerpos de
unirse específicamente a los correspondientes antígenos. La reacción es
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visible solo si el anticuerpo esta marcado con una sustancia que absorbe o
emite luz, o que la sustancia produce coloración.
ANTICUERPOS COMO REACTIVOS ESPECIFICOS DE TEJIDO

Un anticuerpo es una molécula que tiene la
propiedad de combinarse específicamente con una
segunda molécula, conocida como antígeno, esto le
dará al anticuerpo la capacidad de reaccionar
como reactivo especifico de tejido.
ANTIGENO: es cualquier sustancia que es capaz de

inducir la formación de anticuerpos cuando se introduce en un organismo,
reaccionando específicamente con los anticuerpos que son formados.
ANTICUERPO: proteína del suero o inmunoglobulina que se forma en

respuesta a la invasión de una sustancia ajena al cuerpo, y al unirse a esta
le confiere protección al organismo.
PARTES DE UN ANTICUERPO
Los anticuerpos consisten en dos

unidades básicas, un par de
cadenas ligeras, constituida por
KAPPA o LAMBDA, y un par de
cadenas pesadas que pueden ser
GAMMA, ALFA, MU, DELTA, o
EPSILON. Dando así la fracción
constante y la fracción variable.
Aquí podemos observar parte del

equipo que se utiliza en el hospital
general en el departamento de
patología para poder realizar la
técnica de inmunohistoquímica
automatizada.
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TIPOS DE ANTICUERPOS USADOS
 Desde que fue concebida la técnica por COONS (1942) se ha

avanzado mucho en la obtención de los anticuerpos.
 KOHLER Y MILLSTEIN (1975) idearon una técnica para obtener
anticuerpos monoclonales, fusionaron las células de un mieloma
murino y los linfocitos del bazo de un ratón inmunizado con hematíes
de carnero, cultivo resultante formaron hibridomas capaces de
producir inmunoglobulinas que reconocen a los antígenos empleados
en la inmunización.
 TIPOS DE ANTICUERPOS
o POLICLONALES: mezcla anticuerpos contra diferentes antígenos
de una misma proteína.
o MONOCLONALES: cuando mezcla anticuerpos contra un único
antígeno de una proteína
 VENTAJAS DE LA MONOCLONALIDAD
o Los anticuerpos obtenidos son homogéneos
o No se requiere de antígenos purificados para las
inmunizaciones, a pesar de ellos se obtienen antígenos de gran
pureza
o Los cultivos permanentes pueden proporcionar el anticuerpo
de manera ilimitada
TECNICAS DE INMUNOHISTOQUIMICA
 El principio esta basado en la presencia de sustancias antigénicas que
se albergan tanto en la membrana citoplasmática, el citoplasma,
como en el núcleo celular.
 Básicamente es una reacción de tipo AG-AC, en donde conocemos
nosotros el AC que vamos a utilizar y queremos detectar el AG con
una molécula marcadora que puede ser:
o FLUOROCROMO
o ENZIMA
o METAL PESADO
o ISOTOPO RADIOACTIVO
APLICACIONES GENERALES
 Clasificación de neoplasias: linfoides/hematológicas
 Identificación de origen primario desconocido
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 Identificación de sobreexpresión de proteínas asociadas a

translocaciones
 Identificación de blancos terapéuticos
 Infecciones
 Caracterización de sustancias extracelulares
TIPOS DE PROTEINAS QUE SE PUEDEN DETECTAR

 Proteínas estructurales
o Citoesqueleto (CK, GFAP)
o Uniones intercelulares (E-cadherina, B-catenina)
 Proteínas asociadas a vesículas secretoras
o Cromogranina A, sinaptofisina, CD68
 Receptores
o HER2, EGFR1, RE, RP
 Factores de transcripción/ciclo celular
o P53, Ki67, TTF1, PAX5, Miogenina
MARCACION NUCLEAR
Cuando se utiliza la técnica de inmunohistoquímica estas son las
coloraciones que evalúa el patólogo en el microscopio. Se puede ver que
la técnica de inmunohistoquímica puede dar una marcación nuclear en la
cual el cromógeno va a pintar el núcleo de la célula o de la neoplasia en
estudio, vamos a observar 3 ejemplos de marcadores:
El CDX2, el cual nos va a pintar en una

neoplasia, de origen colónico.
El PAX-5, que también nos da una tinción o

marcación nuclear.
Y el Ki-67 que esta involucrado en

el ciclo celular y nos da una tinción
nuclear.
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MARCACION MEMBRANA
Otra marcación que podemos observar con
la técnica de inmunohistoquímica es la
marcación de membrana, la cual podemos
ver con la técnica de E-cadherina, Distrofina
y CD30.
La técnica de inmunohistoquímica utiliza

como inmuno localizador una enzima, por
eso en el lugar de la reacción la unión del
antígeno anticuerpo se visualiza añadiendo
al final de esta el sustrato de la enzima mas
una sustancia denominada cromógeno.
Generalmente en el país se utiliza la técnica

de avidinabiotina, y el cromógeno de amino
bencidina.
MARCACION CITOPLASMICA
Aquí podemos observar el
cromógeno nos está
identificando las mitocondrias.
Podemos ver el CD68 con una
tinción citoplasmática, y el A-
100 que puede tener una
tinción citoplasmática y de
núcleo.
INMUNOFLUORESCENCIA
La técnica de inmunofluorescencia se emplea para localizar moléculas de
antígeno en las células por el examen microscópico. Esto se hace mediante
el uso de anticuerpos específicos contra la molécula antigénica formando
así un complejo antígeno – antígeno en el sitio antigénico especifico que se
hace visible mediante el empleo de un fluorocromo que tiene la propiedad
19
de absorber la radiación en la forma de luz ultravioleta de manera que sea

visible dentro del espectro de la luz en el examen microscópico.
Aquí podemos observar que a diferencia de la técnica de

inmunohistoquímica aquí no se usa un cromógeno, sino un fluorocromo, de
ahí el nombre de inmunofluorescencia.
COMPONENTES ESENCIALES
1. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
• Se basa en el principio de que la radiación de excitación de la
luz ultravioleta de longitud de onda mas corta (360nm) o la de
la luz azul (longitud de onda 400nm) provoca la fluorescencia
de ciertas sustancias y posteriormente re – emite la luz de una
longitud de onda más larga, la cual se puede observar en el
microscopio, y podemos observarla debido a unas sustancias
que son fluorescentes, usándose como fluorocromos, que son
moléculas capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor
energía o de mayor longitud de onda.
• FLUORESCENCIA PRIMARIA (natural o auto fluorescencia):
vitamina A, porfirina, clorofila.
• FLUORESCENCIA SECUNDARIA: es la producción de
fluorescencia tras la adición de colorantes o productos
químicos denominados fluorocromos
Como podemos ver los fluorocromos usados comúnmente, tenemos la

fluoresceína, la rodamina, que pueden ser utilizados en la técnica de
inmunofluorescencia.
2. FUENTE DE LUZ
• Lámparas de vapor de mercurio y gas xenón
3. FILTROS
• Filtro de absorción de calor, filtro de stop de luz roja, filtro
excitador
20
•La luz excitadora es removida por otro filtro llamado filtro de

barrera el cual se encuentra entre el objetivo y el observador
4. CONDENSADOR
• Se utiliza un condensador de campo oscuro de manera que la
luz no cae directamente en el objeto y en cambio da fondo
oscuro que hace contraste con la fluorescencia
TECNICAS DE FLUORESCENCIA
Existen dos técnicas de fluorescencia:
 MÉTODO DIRECTO
o Introducido por primera vez por Coons (1941) en la cual sobre el
tejido se produce la reacción antígeno anticuerpo,
generalmente usando inmunofluorescencia. Se utiliza un
anticuerpo específico frente al antígeno que se desea detectar
conjugado con un fluorocromo.
 MÉTODO INDIRECTO
o Se aplica para detectar autoanticuerpos en el suero del
paciente, ya sea anticuerpos primarios específicos no
marcados frente al antígeno e inicia la reacción, o se añade
después un segundo anticuerpo marcado con el
correspondiente fluorocromo en reacción especifica con el
anticuerpo primario. Esta técnica es mas sensible y permite
utilizar un único anticuerpo secundario conjugado con
fluorocromo frente a muchos antisueros primarios. En la técnica
indirecta, también llamada técnica de sándwich, hay una
interacción entre el antígeno y el anticuerpo específico del
tejido. Se lleva una etapa de lavado y luego de adición a un
fluorocromo, para que se dé por finalizada la reacción.
21
APLICACIONES DE LA INMUNOFLUORESCENCIA
• Detección de autoanticuerpos en el suero.

• En enfermedades renales para la detección de depósitos de
inmunoglobulinas, complementos y fibrina.
• En enfermedades de la piel para detectar depósito de
inmunoglobulina, por la sección de tejido congelados;
particularmente se detectan estos depósitos en la unión
dermoepidérmica de la dermis superior y también se puede utilizar en
diversas dermatosis bulosas.
• Diagnostico específico de trastornos infecciosos para especificar
nuestras formas, por ejemplo, virus de la hepatitis.
En siguientes imágenes se demuestra la utilidad de la inmunofluorescencia

en el diagnóstico de biopsias renales y biopsias no tumorales como la
glomerulopatía en la cual vamos a ver el fluorocromo se ha depositado en
diferentes partes o componentes del glomérulo, dando así la posibilidad de
dar un diagnóstico acertado y preciso para el paciente, para que esté
reciba un tratamiento oportuno y adecuado.
22
Las técnicas de inmunofluorescencia también ayudan a demostrar agentes

infecciosos como:
Virus H1N1 Candida albicans
Trypanosoma Mycoplasma pneumoniae
Otro aporte que nos permite realizar la inmunofluorescencia es en

enfermedades de la piel ya sea que estos depósitos con fluorocromo se
depositen en la unión dermoepidérmica o pueden depositarse en la dermis
superior.
23
La inmunoglobina G (IgG) se deposita en forma intercelular en la

enfermedad del pénfigo vulgar
Otros patrones de inmunofluorescencia que pueden ser representativos de
cada enfermedad de la piel:
Tabla. Patrones inmunofluorescentes en enfermedades cutáneas

seleccionadas
enfermedades de la Sustancias presentes Ubicación de los
piel depósitos
Pénfigo, IgG, C3 Epidermis intercelular
Penfigoide C3, IgG Zona de la membrana

basal (patrón lineal)
Lupus eritematoso IgG, C3 (± IgM, IgA) Zona de la membrana
sistémico ampolloso (granular basa
Dermatitis herpetiforme IgG y C3 (granular) Papilas dérmicas de

piel lesionada (patrón
granular)
TECNICAS MOLECULARES
TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN
Aplicaciones
• Neoplasias: hematológicas y no hematológicas
• Enfermedades infecciosas: agentes causales, estudios
epidemiológicos e identificación de nuevos agentes infecciosos
24
• Enfermedades genéticas heredadas: prueba de portador,

diagnóstico prenatal y diagnóstico directo de la enfermedad
genética.
• Determinación de identidad: trasplante de tejidos, patología forense
y test de parentescos
HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA
permite la detección y localización de secuencias de ácidos nucleicos en

estructuras biológicas morfológicamente conservadas.
en 1969 en Universidad de Yale desarrollaron un protocolo experimental

alternativo llamado hibridación in situ que se utilizó para establecer la
localización del ADN satélite. El término in situ significa “en el lugar” y se
refiere al hecho de que el ADN del cromosoma se mantiene en el sitio
mientras se permite que reaccione una preparación particular de ADN
marcado llamado Sonda de ADN, este se marcó de forma reactiva y se
identificó por medio de autoradiografías.
Aplicaciones:
• Detección de infecciones virales, ya sea las provocadas por el virus
del papiloma humano (VPH), virus de Epstein Barr (EBV), virus de
inmunodeficiencia humana (HIV), o el citomegalovirus(CMV).
• En tumores humanos (detección de la expresión de genes y
oncogenes).
• Desórdenes cromosómicos. Mediante la hibridación in situ con
fluorescencia pueden detectarse deleciones por pocas kilobases
(kb) de ADN; también puede ayudar a detectar aneuploidías y
25
traslocaciones. RNA también puede ser estudiado también

mediante hibridación in situ con fluorescencia.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) constituye un sencillo

método para la clonación in vitro de cualquier segmento de ADN, sin
necesidad de recurrir a la metodología convencional.
Por esta invención de gran valor en biotecnología y como herramienta de
investigación científica y forense en 1993 recibió el premio en Japón y el
premio Nobel de química compartido con el canadiense Michael Smith.
En cuanto a los aportes o indicaciones en la que se puede haber
involucrado la Reacción en Cadena de la Polimerasa podemos mencionar:
A. la amplificación de ADN para clonación o análisis
• investigaciones criminales,
• investigación fósil,
• secuenciación de ADN
B. Pruebas para la presencien de secuencias de ADN específicas
C. Comparación de moléculas de ADN
Aporte clínico:
• Detección de trastornos hereditarios,
• Enfermedades genéticas adquiridas (cáncer, autoinmunidad)
• Medicina forense y legal
• Detección de patógenos infecciosos
• Enfermedades monogénicas.
CITOMETRÍA DE FLUJO
consiste en la medición de diversos parámetros, mientras que una

suspensión de células fluye a través de un haz de luz detectores
estacionarios últimos.
El instrumento se enfoca hidrodinámicamente una suspensión del celular
en una cámara de muestra y pasa a las células individuales a través de
una fuente de luz, generalmente un hacer laser.
26
La luz dispersada en varios ángulos por las células he registrado por los
detectores y se convierte en señales electrónicas, que luego son
digitalizados, almacenados y analizados por el ordenador para producir un
histograma. Esta técnica permite el análisis de 5000 a 10000 células por
segundo.
En cuanto a las características celulares que pueden ser evaluados con la
citometría de flujo incluyen: el tamaño de celda, granularidad
citoplasmática, viabilidad celular, tiempo del ciclo celular en la fase S de
fracción, el contenido de ADN (haploidia), fenotipo marcador de superficie
y el contenido de enzima. Los avances técnicos ahora permiten varios
parámetros que se evalúan simultáneamente
En función de su contenido de ADN, los tumores se dividen en: diploides y
aneuploides
La citometría de flujo puede ser utilizado para analizar la ploidía del ADN.
El índice de ADN (DI) es la relación del contenido de ADN del pico
aneuploide para el contenido de ADN del pico diploide. Tumores
tetraploides son un subconjunto de tumores en los que el DI es 1.9-2.1.
La fracción hiperdiploide es el porcentaje de células por encima del límite
superior de la población diploide y constituye una medida de la fase S o
fracción de proliferación de una población de células.
La principal limitación de la citometría de flujo es que las células necesitan
estar en una única suspensión de células con el fin de ser analizado.
Este requisito se consigue fácilmente en sangre y otros fluidos.
De hecho, el análisis de citometría de flujo de las leucemias y linfomas se ha
convertido en rutina.
Para ser justos, es preciso señalar que el papel de la citometría de flujo el
diagnóstico inicial de los tumores es bastante limitado.
Su función principal parece ser como un indicador pronóstico, ya que la
vasta literatura sobre el tema lo indica.
La categoría de tumores que han sido evaluados con mayor intensidad son:
el carcinoma de mamá, el linfoma no Hodgkin, carcinoma de vejiga,
carcinoma de próstata, neoplasias endocrinas, sarcoma de tejidos blandos
y presuntos embarazos molares.
27
AUTOPSIAS
La autopsia es una técnica utilizada en los laboratorios de patología. En la
actualidad la autopsia no se realiza con frecuencia, en el país solo se
realizan en el hospital Benjamín Bloom y hospital Zacamil.
Finalidades de la autopsia clínica:

• Determina o corrobora la naturaleza de la enfermedad, así como su
extensión
• Investiga la causa principal o básica de muerte y aquellos procesos
contribuyentes.
• Estudia los procesos secundarios o asociados y los accesorios.
• Correlaciona signos y síntomas clínicos de la enfermedad con los
hallazgos morfológicos terminales.
• Comprueba los resultados de la terapéutica médica o quirúrgica
• Investiga, en su caso, aquellas enfermedades contagiosas,
hereditarias o transmisibles.
Indicaciones de la autopsia clínica
1. Muertes en las que la autopsia pueda ayudar a explicar las
complicaciones médicas existentes.
2. Todas las muertes en las que la causa de muerte o diagnóstico
principal (padecimiento fundamental) no sea conocido con
razonable seguridad.
3. Casos en los que la autopsia pueda aportar a la familia o al público
en general datos importantes.
4. Muertes no esperadas o inexplicables tras procedimientos
diagnósticos o terapéuticos, médicos o quirúrgicos.
5. Muertes de pacientes que han participado en protocolos
hospitalarios.
6. Muertes aparentemente naturales no esperadas o inexplicables, no
sujetas a la jurisdicción forense.
7. Muertes por infecciones de alto riesgo y enfermedades contagiosa.
8. Todas las muertes obstétricas
9. Todas las muertes perinatales y pediátricas
10. Muertes por enfermedad mental ocupacional
11. Muerte de donantes de órganos en los que se sospeche alguna
enfermedad que puede repercutir en el receptor.
28
12. Muertes ocurridas en las primeras 24 horas del ingreso en el hospital y

aquellas que pudieran estar influidas por su estancia hospitalaria.
Tipos de autopsias:
• autopsias clínicas: son las que se realizan a pacientes que fallecen por
causas naturales o por una enfermedad. La autopsia confirma o, en
su caso, determina el padecimiento fundamental, las alteraciones
secundarias al mismo y aquellas otras derivadas del tratamiento
además describen los hallazgos accesorios asintomáticos silentes
clínicamente e investiga la causa de muerte. Este tipo de autopsias la
realiza un médico anatomopatólogo.
• Autopsias judiciales o médico-legales: las sometidas a un proceso

judicial. El principal objetivo de autopsia es establecer la causa de
muerte, muchas veces en circunstancias violentas, extrañas o poco
claras, sospechosas de criminalidad.
este tipo de autopsia las realiza un médico forense y el patólogo, a
instancias de aquel, puede erigirse en consultor. Este tipo de informes
o estudios forman parte, pues, de los denominados genéricamente
“interconsultas.”
Técnicas de autopsias
1. Técnica de Letulle: consiste en la apertura oval del tórax permitiendo
observar claramente las visceras.
2. Técnica de Mata: Consiste en la apertura desde la apófisis mastoide

hasta la clavícula unidas por un corte supraesternal. Por otro lado, se
29
realiza la apertura desde la cavidad torácica hasta la fosa iliaca

anterosuperior.
Tiempo de respuesta medio:

• Informe provisional en 48 horas
• Informe final 1 mes
3. Técnica de Virchow: consiste en la apertura del cadáver desde el

mentón hasta los genitales bordeando el ombligo por la parte izquierda.
4. Técnica en T: consiste en realizar una incisión biacromial por la parte

superior del esternón y una incisión medial al anterior.
MÉTODOS DE EXTRACCION DE VISCERAS
• Metodo de Virchow: se basa en extracción de órganos de forma

individual lo cual requiere levados conocimientos anatómicos.
• método de Rokitansky se basa en extracción de órganos en forma

de bloque lo cual requiere un examen previo in situ.
30
REPORTE DE UNA AUTOPSIA
El reporte de una autopsia debe incluir portada, descripción

macroscópica, exámenes de laboratorio postmorten, la descripción
microscópica con interpretación de tinciones hisquímica e
inmunohistoquímica requerida si el caso lo aplica y por último un listado
de diagnósticos anatomopatológicos.
31

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CLASE 3: TÉCNICAS ESPECIALES

CLASE 3: TÉCNICAS ESPECIALES

TECNICAS MOLECULARES .............................................................................................. 24

En esta clase se revisarán técnicas utilizadas en anatomía patológica.

ESTUDIO HISTOLÓGICO TRANSOPERATORIO (BIOPSIA POR CONGELACIÓN).

En la mayoría de los casos al cirujano le basta que el

El tiempo estimado para dar respuesta debe ser un

En términos generales en cuanto a la biopsia por

Aquí podemos ver en la imagen unos bloques de parafina.

Otros objetivos de la biopsia por congelación son:

 Determinar la presencia de lesión en los bordes de resección

INDIACIONES DE LA BIOPSIA POR CONGELACIÓN

 Definir los límites, presencia de neoplasia, definir malignidad o

TIPO DE EQUIPO UTILIZADO

Además, podemos observar en la imagen el microtomo

Cuando ya se realizan los cortes se diseña un tren de tinción corto para

Los tejidos generalmente están congelados a -35°c y encajados en una

Los cortes se realizan en una cámara fría establecida a temperaturas de -

FORMA DEL REPORTE

a) La descripción macroscópica del espécimen en estudio: se le da el

b) El apartado de la descripción microscópica generalmente se omite.

c) El diagnostico anatomopatológico es el que importa, se hace el

Cito: célula Logos: estudio o tratado

El objeto de la citología es realizar un diagnostico precoz el cáncer

Otro objetivo es realizar diagnósticos de benignos o malignos siempre

Y también se usa para hacer recuentos celulares o para el diagnostico de

a) Ginecológica: tracto cérvico-vaginal y endometrial.

2. Citología por punción-aspiración con aguja fina

TÉCNICAS DE ESTUDIO UTILIZADAS EN CITOLOGÍA

El tiempo de respuesta para estos estudios citologicos es:

Citología urgente: como por recuentos celulares, el diagnostico se da en 60

Citología normal: diagnostico de 24-48 horas.

La mayor utilidad de la citología es realizar el diagnosytico precoz del

INDICACIONES PARA LA TOMA DE CITOLOGÍAS.

Además, otra indicación sería el estudio de lesiones virales con formación

Con respecto a las ventajas de la citología:

Podemos decir que cuando el diagnóstico es superficial o la lesión es

- VENTAJAS DE LA TÉCNICA (citología):

En cuanto a las LIMITANTES DE LA TÉCNICA (citología):

1. No es diagnóstica, es un tamizaje. Como recordamos esta técnica no

En este apartado se abordará otra técnica especial en los

Las principales aplicaciones de la microscopía electrónica para la

- En los campos de la patología renal y;

En la patología tumoral los exámenes ultraestructurales han demostrado ser

• El tumor de células • Mesotelioma

1. La patología renal, en combinación con microscopía de luz e

PRIMER MICROSCOPIO ELECTRONICO SE ATRIBUYE A ERNST RUSKA (ALEMAN)

 la identificación de partículas virales, intranucleares y citoplasmáticas.

los fragmentos deben ser pequeños y deben fijarse en forma de varios

2. INCLUSIÓN: Las muestras incluyen resinas sintéticas o EPON™; en una

Con ayuda de la microscopía

TIPOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Existen dos tipos de microscopía electrónica: Microscopía electrónica y

 De esta forma, es posible incluso establecer un pronóstico de

LIMITACIONES DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Podemos observar en la imagen de la

Para concluir; podemos decir que las limitaciones de la microscopía

 Dificultades en el muestreo, ya que sólo una pequeña proporción de

En la diapositiva se presenta una imagen en la cual:

En esta diapositiva podemos observar imágenes obtenidas a través de

En este apartado abordaremos estudios de citogenética

La citogenética realiza un estudio de los cromosomas de forma gruesa, es

nuestra madre en el ovulo y el otro por nuestro padre en el