Manual de Procedimientos Microbiologicos V4

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
MICROBIOLÓGICOS
Contenido
I. NTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 4
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 4
III. ALCANCE ............................................................................................................................................ 4
IV. RESPONSABLES............................................................................................................................... 4
V. DEFINICIÓN DE CONCEPTOS ....................................................................................................... 4
VI. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO ........................................................................................ 5
1. PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS ................................ 5
1.1. PREANALÍTICO ...................................................................................................................... 5
1.2. ANALITICO .............................................................................................................................. 6
1.3. POSTANALITICO ................................................................................................................. 14
2. HEMOCULTIVOS ......................................................................................................................... 15
3. PROCEDIMIENTO TECNICA DE MAKI ................................................................................... 18
4. PROCEDIMIENTO MUESTRAS OCULARES ......................................................................... 19
5. PROCEDIMIENTO MUESTRAS RESPIRATORIAS............................................................... 20
6. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS ............................... 26
7. PROCESAMIENTO DE TEJIDO ÓSEO Y MÉDULA OSE .................................................... 29
8. PROCEDIMIENTO LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) Y OTROS LIQUIDOS
ESTERILES ........................................................................................................................................... 32
9. PROCEDIMIENTO UROCULTIVOS ......................................................................................... 35
10. PROCEDIMIENTO MUESTRA DE DEPOSICIONES......................................................... 39
11. PROCEDIMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SECRECIONES GENITALES
FEMENINOS ......................................................................................................................................... 45
12. PROCEDIMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SECRECIONES GENITALES
MASCULINO ......................................................................................................................................... 47
13. PROCEDIMIENTO ESTUDIO DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA............................... 49
14. PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA ... 52
15. PROCEDIMIENTO ESTUDIO MICOLÓGICO (HONGOS) ................................................ 56
16. PROCEDIMIENTO V.D.R.L. ................................................................................................... 57
17. MHA-Tp ...................................................................................................................................... 64
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18. CULTIVO DE ANAEROBIOS ................................................................................................. 67

19. PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE CRYPTOCOCCUS SP.
(“CrAg Lateral Flow Assay”) ................................................................................................................ 68
20. PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Y
LEGIONELLA PNEUMOPHILA .......................................................................................................... 70
21. PROCEDIMIENTO DE PANEL MOLECULAR (FILMARRAY) .......................................... 74
22. MICRODILUCION EN CALDO PARA DETERMINACIÓN DE SUSCEPTIBILIDAD A
COLISTIN .............................................................................................................................................. 79
23. PROCEDIMIENTO DE NOTIFICACIÓN DE AGENTES DE ENFERMEDADES DE
NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA (ENO) ............................................................................................ 80
VII. ANEXOS ............................................................................................................................................ 82
ANEXO 1: REALIZACIÓN DE PRUEBA PARA C. DIFFICILE....................................................... 82
ANEXO 2: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS PARA PRUEBA C. DIFFICILE ................. 89
VIII. REFERENCIAS................................................................................................................................. 90
IX. CONTROL DOCUMENTAL ............................................................................................................ 90
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MICROBIOLÓGICOS
I. NTRODUCCIÓN
El estudio microbiológico de una muestra permite determinar y aislar el o los agentes etiológicos
de una probable infección, con el fin de apoyar al clínico en la confirmación diagnóstica, la
elección de la terapia antimicrobiana y la conducta epidemiológica a tomar frente al paciente y su
entorno.
Para asegurar lo anterior es necesario contar con procedimientos estandarizados para el análisis
de las muestras clínicas.
II. OBJETIVOS
Establecer las directrices relacionadas con las fases preanalítica, analítica y postanalítica de los
estudios microbiológicos realiza el Área Técnica de Microbiología.
III. ALCANCE
AT. Microbiología.
IV. RESPONSABLES
Personal de Tecnología Médica, personal técnico de laboratorio, personal de microbiología y

bioquímica del Área Técnica de Microbiología.
V. DEFINICIÓN DE CONCEPTOS
● Cultivo: Es el crecimiento in vitro de microorganismos en medios de cultivos líquidos y sólidos

(agares diferentes), lo que permite el aislamiento del agente y su identificación posterior.
● Directo: Es la observación microscópica de la muestra extendida en un portaobjeto. Puede

ser al fresco (sin tinción) o con tinción (Gram, Ziehl-Nielsen, Tinta China, etc.).
● Estudio Microbiológico: El estudio bacteriológico y micológico comprende el examen directo,

el cultivo y en aquellos agentes que se justifica, estudios de susceptibilidad a los
antimicrobianos.
● AT de Microbiología: Área Técnica de Microbiología.
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VI. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO
1. PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS
1.1. PREANALÍTICO
ES RESPONSABILIDAD DEL TÉCNICO PARAMÉDICO (TP):
1.1.1. RECEPCIÓN
● Recepcionar muestras de pacientes hospitalizados o ambulatorios, provenientes

de policlínicos, CESFAM de la red y consultorios, en la ventanilla del servicio.
● Revisar la solicitud de examen y muestra y rechazar las que no cumplen con los
requisitos establecidos, indicados en el Manual de Toma de Muestras.
1.1.2. INGRESO A SISTEMA LIS
● Ingresar solicitudes de exámenes al sistema informático del laboratorio.
● Trasladar las muestras desde ventanilla a sala de siembra en un recipiente

dispuesto para este uso.
● En la sala de siembra constatar los datos del paciente en contenedor de la muestra

y orden respectiva, verificando el tipo de cultivo que se solicita. Comprobar que la
muestra cumpla con las condiciones adecuadas para ser procesada.
● Ingresar petición de examen en sistema LIS, el cual asigna un número correlativo

de ingreso. El sistema requiere datos obligatorios para el ingreso de una nueva
petición los cuales son:
o RUT: cada solicitud debe venir con este dato. En caso de situaciones
especiales como paciente recién nacido, extranjeros o pacientes sin
identificación (NN), el sistema asignará automáticamente un RUT ficticio para
poder realizar el ingreso de la solicitud. Este RUT provisorio podrá ser
modificado una vez que se cuente con la identificación correcta del paciente.
o Nombre del paciente
o Fecha de nacimiento
o Sexo
o Servicio de procedencia
o Tipo de examen solicitado
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o Tipo de muestra
● Todos los ingresos realizados en sistema LIS automáticamente se traspasan al

software de Microbiología con el mismo número de petición asignado por LIS.
● Para el caso de muestras provenientes de servicios en los cuales realizan sus

propios ingresos, la muestra debe ser recepcionada en el módulo TRAZABILIDAD
en el sistema LIS para que pueda entrar al proceso.
● Una vez confirmado el ingreso de las muestras se debe obtener una etiqueta del
sistema LIS con los datos de la petición que será utilizada para etiquetar la
solicitud.
● Del software de microbiología obtener una etiqueta con los datos de la petición
que será utilizado para rotular las placas, tubos, frascos y láminas para tinción de
Gram.
● Sembrar las muestras según los procedimientos descritos en Tabla de Siembra

del Laboratorio.
1.2. ANALITICO
ES RESPONSABILIDAD DEL TÉCNICO PARAMÉDICO (TP):
1.2.1. SIEMBRA Y PREPARACIÓN DE TINCIÓN DE GRAM
● El orden de la siembra es: agar Chocolate, agar Sangre y finalmente agar Mc Conkey
y Tioglicolato si procede.
● Posterior a la siembra preparar extendido y hacer tinción de Gram en portaobjetos

individuales para todas las muestras y rotular cada lámina con la etiqueta
correspondiente.
● Cultivo corriente: permite el desarrollo de la mayoría de las bacterias aerobias y

anaerobias facultativa de diversas muestras biológicas. Dada la diversidad de medios
de cultivo que se pueden utilizar para la siembra, a continuación, se detallan los
procedimientos comunes y específicos de las muestras más frecuentemente recibidas
detallando los medios que se utilizan de rutina en cada caso.
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1.2.2. TABLA DE SIEMBRAS
Agar Agar
Agar Agar Agar Agar Caldo Agar
Tipo de estudio cromoUTI / Agar SS Thayer Frotis
sangre chocolate MacConkey Sabouraud tioglicolato TCBS
CNA Martin
Urocultivo X
Tinción
Coprocultivo X X X
Campylobacter
Si sembrado en
Ocular X X Sab → ingresar
cultivo hongos
Nasal
X
(portación SAMR INCA)
Cavidad paranasal
X X X
(sinusal)
Ótica X X
X
(oído medio y externo) (oído medio)
Faríngea X
Expectoración, secreción
X X X Gram
bronquial
Aspirado endotraqueal
X X X Gram
cuantitativo
X (3 tubos)
Lavado broncoalveolar
X X X (ingresar como Gram
(vórtex por 3 min y 10 µl)
cultivo hongos)
Uretral y endocervical X Gram
Rectal (proctitis) X Gram
Flujo vaginal X X Gram
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Agar Agar
Tipo de muestra Agar sangre Agar Sabouraud Caldo tioglicolato Frotis
chocolate MacConkey
LCR (punción lumbar) X X Gram
X
LCR (drenaje ventricular) X X (ingresar como cultivo Gram
anaerobio)
Pleural, ascítico y articular X X X Gram
X
Abscesos y colecciones X X (ingresar como cultivo Gram
anaerobio)
Líquido peritoneal X X X
X
Punta de catéter
(Maki)
Tejido
X X X
(cultivo corriente)
Tejido
Realizado por personal de tecnología médica
(cultivo cuantitativo)
Hueso X X X
Procuramiento de tejido óseo /
X X X
banco de hueso
Cultivo corriente
X X
(muestra no estéril)
Cultivo corriente
X X X
(muestra estéril)
● NOTAS:
o Los LCR deben centrifugarse a 1500 rpm por 5 min y sembrar sedimento.
o Todas las placas de agar sangre y chocolate deben colocarse en la estufa en CO2.
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1.2.3. INCUBACIÓN DE LAS PLACAS
● Todas las placas y tubos sembrados se incuban a 35 ºC en atmósfera normal, excepto

las placas de ASC y ACh que se colocan en medio con CO2 (tarro con vela o estufa
5% CO2, según disponibilidad).
● El plazo estándar de incubación antes de dar un cultivo por negativo es 72 horas (salvo
casos especiales y a consideración del TM).
● El TP debe retirar a diario las placas desde la estufa de cultivo hasta que se cumpla
el período de incubación y colocar ordenadamente en la mesa de trabajo del TM para
su análisis e interpretación.
● Realizar las tinciones de Gram, tareas o técnicas a seguir para la identificación y

estudio de susceptibilidad que indique el TM de los cultivos que lo requieran.
1.2.4. PREPARACIÓN TINCIÓN DE GRAM
Realizar el frotis y la tinción de Gram a las muestras que se le solicite. En los hemocultivos se
realiza de aquellas botellas que sean identificadas como positivas por el equipo automatizado.
● Preparación desde colonias bacterianas o de hongos:

o Rotular un portaobjetos con la etiqueta impresa desde el software de
microbiología.
o Colocar unas gotas de suero fisiológico al centro del portaobjetos.
o Con un asa estéril tomar 1 a 3 colonias y realice una suspensión directamente en
la lámina.
o Dejar secar la lámina cerca del mechero o a Tº ambiente.
o Cuando esté visiblemente seca proceder con la tinción
● Preparación desde muestras líquidas (LCR, orina, otros líquidos estériles):

o Rotular un portaobjetos con la etiqueta correspondiente a la muestra analizada.
Utilice en muestras de líquidos estériles un portaobjeto lavado, desinfectado con
alcohol y previamente flameado o en su defecto una lámina nueva.
o En caso de muestras muy escasas delimite un área en el portaobjetos con un lápiz
graso.
o Colocar con una pipeta estéril o flameada en mechero una o dos gotas de la
muestra en el área delimitada. En el caso de LCR se realiza desde la muestra
centrifugada y tomando desde el fondo del tubo.
o Dejar secar la lámina cerca del mechero o a Tº ambiente
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● Preparación desde muestras en hisopo:

o Rotular un portaobjetos con la etiqueta correspondiente a la muestra analizada.
o Si cuenta con un solo hisopo para Gram y cultivo, realizar primero el cultivo y
posteriormente el Gram
o Para preparar el frotis rotar el hisopo suavemente sobre el portaobjetos para
formar una película fina y no alterar las características de las estructuras.
o Deje secar la lámina cerca del mechero o a Tº ambiente
● Procedimiento de tinción: El procedimiento se realiza sobre los frotis preparados

según el punto anterior. Se requiere contar con los siguientes reactivos: Cristal violeta,
Lugol, Alcohol- acetona (o en su defecto Alcohol 95%), safranina (o en su defecto
Fucsina diluida 0,8%).
o Colocar los portaobjetos en una rejilla para tinción en el lavadero para tinciones
o Cubrir todo el frotis con Cristal violeta y deje actuar por 1 minuto
o Eliminar el exceso de tinción y enjuague con agua corriente
o Cubrir todo el frotis con Lugol y deje actuar por 1 minuto.
o Eliminar el exceso y enjuague con agua corriente
o Cubrir el portaobjetos con Alcohol acetona y dejar actuar hasta que no se
desprenda más colorante.
o Enjuagar con agua corriente
o Cubrir todo el frotis con safranina y dejar actuar por 1 minuto.
o Enjuagar y dejar la lámina inclinada sobre un papel absorbente.
o Informar al TM para que realice la lectura del Gram.
ES RESPONSABILIDAD DEL TECNÓLOGO MÉDICO (TM):
1.2.5. LECTURA E INFORME DE LA TINCIÓN DE GRAM
● Realizar la lectura definitiva de los frotis utilizando microscopio óptico (Aumento

10x100x). Se deben examinar entre 20 y 40 campos.
● Las variables básicas en el informe de una tinción de Gram son:

o Coloración: Gram positivo, negativo o variable.
o Morfología: cocáceas, bacilos, cocobacilos, bacilos curvos, elementos
levaduriformes, hifas, etc.
o Disposición: racimos, cadenas, empalizada, etc.
o Presencia o ausencia de bacterias o elementos fúngicos.
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o Presencia o ausencia de células epiteliales (según tipo de muestra).

o Presencia o ausencia de leucocitos.
o Presencia o ausencia de otros elementos.
● El informe de la tinción de Gram dependerá del tipo de muestra, pero en general

considera lo indicado previamente.
● Registrar el informe en el REAL, identificando los elementos reconocidos en forma

semicuantitativa:
o No se observan (-)
o Escasa cantidad (+)
o Regular cantidad (++)
o Abundante cantidad (+++)
● Los informes de Gram de LCR, otros líquidos estériles y aspirados endotraqueales o

lavado bronqueoalvelar deben quedar informados en el sistema inmediatamente
luego de la lectura.
1.2.6. LECTURA DE LAS MUESTRAS PROCESADAS
● Realizar diariamente la lectura de las placas sembradas registrando los hallazgos en

la sección “notas” o “Flujo de trabajo” del software de microbiología.
● Los cultivos negativos deberán volver a incubarse hasta completar el plazo estándar
de incubación.
● Seleccionar las colonias de los cultivos positivos, que deban ser trabajadas para
identificación y estudio de susceptibilidad.
● En el caso de muestras de sitios no estériles el estudio se realizará solo sobre las

colonias que se sospeche no correspondan a microbiota. Las colonias que
correspondan a microbiota se informarán como microbiota comensal o habitual.
● Las colonias que se seleccionen para estudio seguirán algoritmos para diagnóstico
final de género y/o especie. Además, se realizará estudio de susceptibilidad según
protocolo (ver Manual de antibiogramas).
● Si se observan Levaduras en la tinción de Gram, se debe traspasar a medio

Sabouraud y Cromoagar de levaduras según lo indicado en tabla de siembra. La
interpretación del Cromoagar, se realiza de acuerdo a las indicaciones proporcionadas
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por el proveedor. En caso de aislamiento de hongos filamentosos, la identificación

presuntiva se realiza efectuando una preparación con azul de lactofenol para observar
morfología.
● Si se observan colonias que no orientan a un género determinado, realizar tinción de

Gram.
1.2.7. IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA: EL TM REALIZARÁ LA LECTURA DE LOS

PROCESOS EFECTUADOS POR MÉTODO MANUAL O AUTOMATIZADO
(VITEK® MS).
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR MALDI-TOF MS
FUNDAMENTO:
El instrumento VITEK® MS corresponde a un espectrómetro de masas, el cual emplea

espectrometría de tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-
TOF MS) para la identificación de microorganismos. Un espectrofotómetro de masas se compone
de tres unidades funcionales, una fuente ionizante para transferir iones a las moléculas de la
muestra en una fase gaseosa, un analizador de masas el cual separa los iones de acuerdo a su
relación masa/carga y un dispositivo de detección para monitorizar los iones separados. Una vez
cargada la muestra en el equipo, ésta es irradiada con un rayo láser provocando su desorción y
posterior ionización. Posteriormente, las proteínas son aceleradas en un campo electroestático y
separadas en función de su tiempo de vuelo, llegando finalmente al detector de masas, el cual
genera información característica de la composición del microorganismo mediante un espectro
de picos graficado en función de su relación masa/carga. La identificación de los microorganismos
por MALDI-TOF MS se basa en que las huellas espectrales varían entre los microorganismos,
dado que algunos picos son específicos el género y otros de las especies.
El portaobjetos para análisis VITEK® MS-DS corresponde al dispositivo sobre el cual se

depositan las muestras para insertarlas en el instrumento, y cuenta con un código de barras único.
Un portaobjetos cuenta con 51 pocillos (48 para muestras y 3 para calibración automática y el
control interno).
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METODOLOGÍA:
❖ Tomar una pequeña porción de la colonia en estudio a partir de un medio de cultivo

sólido.
❖ Extender la colonia uniformemente en el portaobjetos para análisis VITEK® MS-DS
dejando una fina capa de la muestra sobre el pocillo correspondiente, tal como se
aprecia en la imagen a continuación:
❖ En caso de realizar estudio de hongos, adicionar 0,5 µL de ácido fórmico sobre la
colonia extendida.
❖ Cargar el control interno correspondiente para cada corrida analítica.
❖ Adicionar 1 µL de matriz a cada pocillo cargado.
❖ Dejar secar todos los pocillos con el fin de que la muestra se cristalice.
❖ Realizar la petición de las determinaciones en el software de Estación de Preparación
VITEK® MS.
❖ Posteriormente, registrar el portaobjetos en el software Estación de adquisición VITEK
® MS y presionar el botón “Abrir”.
❖ El instrumento expulsará la placa de determinaciones, en la cual se cargará el
portaobjetos.
❖ Introducir la placa en el instrumento, con la misma orientación que se observa en la
imagen:
❖ Una vez introducida la placa en el instrumento, presionar el botón “Arrancar”.
RESULTADOS:
Los resultados de las determinaciones son enviadas al software MYLA®, donde pueden ser
revisados y enviados al software SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA También es posible
observar el espectro de cada microorganismo analizado.
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA (VER MANUAL DE PROCEDIMIENTO E INFORME

DE ANTIBIOGRAMAS):
● En bacilos Gram negativos de procedencia ambulatoria: realizar difusión en agar

(método Kirby Bauer).
● En bacilos Gram (-), cocáceas Gram (+) y levaduras de procedencia

hospitalizados: realizar estudio de susceptibilidad por sistema automatizado (tarjeta
de susceptibilidad Vitek 2 AST-GN, AST-GP y AST-YST respectivamente).
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1.3. POSTANALITICO
ES RESPONSABILIDAD DEL TM:
1.3.1. INFORME Y REGISTRO DE RESULTADOS:
● Informar el resultado definitivo en el software de microbiología (Validación):

Identificación del microorganismo y susceptibilidad antimicrobiana de las muestras
positivas. Las muestras negativas serán informadas a los 3, 5, 10, 14 o 21 días de
incubación dependiendo de la muestra y el tipo de estudio. Estos resultados
traspasan automáticamente al momento de ser validados en software de
microbiología al sistema LIS para su visualización en sala.
● En los consultorios que no cuentan con sistema LIS implementado se les entrega el
examen impreso y enviado por valija.
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2. HEMOCULTIVOS
2.1. HEMOCULTIVOS AEROBIOS (En frascos Bact/Alert)
El hemocultivo es el examen fundamental en el estudio de las bacteriemias o fungemias. Consiste

en la inoculación de sangre total en un medio líquido enriquecido para la detección de bacterias
u hongos. En nuestro laboratorio se emplea exclusivamente sistema de hemocultivo aerobio
automatizado mediante el equipo Bact/Alert® VIRTUO®.
FUNDAMENTO:
El sistema BACT/ALERT® VIRTUO® corresponde a un sistema automatizado el cual permite

incubar, agitar y controlar de manera continua el crecimiento de microorganismos aerobios,
facultativos y anaerobios. Este sistema está basado en tecnología colorimétrica, ya que detecta
el crecimiento bacteriano de acuerdo a un aumento en la producción de CO 2 en el medio, por lo
cual éste sufre una modificación en su pH conduciendo a un cambio de color en el sensor de la
base del frasco.
● HEMOCULTIVOS PERIFERICOS: Para determinar estos cuadros clínicos se

recomienda la recogida de dos o tres muestras de sangre periférica ya que existen
estudios que describen las bacteriemias o septicemias como cuadros intermitentes
o continuos. Por lo tanto, esta cantidad de tomas de muestras es necesaria para
asegurar la detección de microorganismos en sangre ya que los signos clínicos de
la sepsis, que corresponden a una respuesta por el ingreso de estos
microorganismos al torrente sanguíneo, disminuyen la cantidad de estos en la
sangre.
● HEMOCULTIVOS POR TIEMPO DIFERENCIAL: Esta técnica compara el tiempo

diferencial de positividad de hemocultivos de sangre obtenida a través del catéter
y por venopunción (Periféricos), utilizando sistemas de hemocultivos
automatizados. Se ha señalado como indicativo de bacteriemia relacionada a CVC
un tiempo diferencial (valor de corte) de 120 minutos a favor del hemocultivo
central con respecto del periférico. Este método se fundamenta en que, a mayor
carga bacteriana, menor es el tiempo necesario para que un hemocultivo se
positivice en un sistema automatizado con monitorización continua.
● HEMOCULTIVO PARA CONTROL MICROBIOLOGICO PRE-LEUCOAFERESIS

PARA TRASPLANTE DE PRECURSORES HEMATOPOYÉTICOS (TPH): Esta
técnica permite evaluar la presencia de microorganismos en el sitio anatómico
donde se ejecutará la aféresis para extracción de precursor hematopoyéticos para
trasplante. Se estudia una botella.
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2.2. PREANALÍTICO
● Recipiente de la Muestra: actualmente está en uso el Frasco FAN aeróbico adultos (etiqueta
verde), FAN aeróbico pediátrico (etiqueta amarilla) y FAN anaeróbico (etiqueta naranja) para
hemocultivos del equipo BacT/Alert VIRTUO. Pueden ser utilizados para la inoculación de
otras muestras estériles que no sean sangre, con excepción de Líquido cefalorraquídeo.
● Tipo de muestra: sangre periférica sin anticoagulante, venosa o arterial.
ES RESPONSABILIDAD DEL TP:
Ingreso de las Muestras:
● Recepción de la muestra:
o En la recepción de los frascos de hemocultivos se debe corroborar los datos
demográficos de la solicitud del examen y la muestra, en donde se debe aplicar
los criterios de aceptación y rechazo de la muestra o solicitud médica.
● Registro en LIS y software de microbiología:

o Para poder facilitar el ingreso de datos demográficos del paciente al equipo
BACT/ALERT 3D se debe imprimir 2 etiquetas por muestra desde el sistema
SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA Una se colocará en la solicitud del paciente y
la segunda en el frasco de hemocultivo correspondiente. Además, es imperante
superponer la etiqueta obtenida desde R.E.A.L sobre la etiqueta que venía
previamente en el frasco, esto con el fin de que el equipo lea el código de barras
asociado correctamente.
● Ingresar frascos al equipo BACT/ALERT VIRTUO:

o Posterior al registro de las muestras tanto en el sistema LIS como en SOFTWARE
DE MICROBIOLOGÍA, se debe proceder a dejar los frascos de hemocultivo en la
zona de carga del equipo (ver imagen), donde la cinta transportadora detectará la
presencia de los frascos y comenzará el movimiento para que ingresen los frascos
al incubador de manera automática. El equipo reconoce las botellas y etiquetas a
través de un escaneo inteligente de 360°.
● Descarga de frascos de hemocultivos desde el equipo BacT/Alert VIRTUO:

o Se produce cuando un frasco ha cumplido su periodo de incubación
manteniéndose como negativo (el tiempo de incubación es 5 días para botellas de
adultos y 7 días para botellas pediátricas), o bien, se ha hecho positivo y es
necesaria su descarga para el pertinente análisis diagnóstico.
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● Descarga de frascos positivos:

o Cuando la presencia de microorganismos es detectada por el equipo, éste emite
una señal luminosa y sonora la cual indica que hay frascos positivos para retirar.
Al detectar un frasco positivo, el equipo lo retira automáticamente de incubación y
lo deja en la estación de positividad (ver imagen), donde se debe hacer retiro del
frasco directamente.
● Descarga de frascos negativos:

o El equipo elimina de manera automatizada a los frascos negativos en un recipiente
de desechos (ver imagen), cada vez que éste se llena o cuando se solicita de
manera manual.
o Para solicitar la descarga manual, presionar el botón de la pantalla con el símbolo
“-” ubicado en el cuadro del centro. Luego, presionar el botón “Descargar” para
que el equipo elimine los frascos negativos hacia el recipiente de desechos.
● Procesamiento de frascos positivos:

o Tinción de Gram y siembra de los respectivos subcultivos: realizar en placas de
AS y Agar MC con las medidas de bioseguridad correspondientes y con jeringa
estéril. Se debe agregar un subcultivo en ACh según la morfología observada en
el Gram y en Agar Sabouraud y/o agar Cromo-Candida en el caso que en la tinción
de Gram se observen levaduras.
2.3. ANALITICO
● Lectura de la tinción de Gram y anotar lo observado en la orden.

● Informar telefónicamente al Médico tratante o a la Enfermera del Servicio correspondiente
el resultado de lo observado al microscopio, dejando constancia del nombre del
profesional que recibió el recado. Si no se pude comunicar telefónicamente con el servicio,
se debe informar vía mail el informe de la tinción de Gram (ver Procedimiento de
Resultados críticos). En caso de no observar bacterias al Gram, el frasco debe ser
reincubado inmediatamente.
● Análisis de los cultivos: revisar diariamente las resiembras de los hemocultivos que
hayan sido descargados como positivos, para realizar los estudios correspondientes.
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2.4. POSTANALITICO
● Informe y registro de resultados: Informar el resultado definitivo en el SOFTWARE DE

MICROBIOLOGÍA (Validación): Identificación del microorganismo y susceptibilidad
antimicrobiana de las muestras positivas. Estos resultados traspasan automáticamente al
momento de ser validados en SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA al sistema LIS para su
visualización en sala.
● Plazo entrega de resultados: 24hrs a 72hrs desde el momento de su positividad.
3. PROCEDIMIENTO TECNICA DE MAKI
OBJETIVO: técnica semicuantitativa que tiene por objetivo el diagnóstico y etiología de

bacteremia o fungemia asociada a catéter venoso central. Los agentes aislados con mayor
frecuencia son: Staphylococcus, bacilos Gram (-) y Levaduras.
3.1. PREANALITICO
● Tipo de muestra: 5 cm del extremo distal de un catéter endovascular, el cual debe venir en
tubo seco estéril sin anticoagulante y sin ningún tipo de dilución. No se aceptarán tubos con
suero fisiológico ya que alteran el recuento. Nunca aceptar dispositivos completos.
● Siembra de la muestra:
o El segmento de catéter de 5 cm debe hacerse rodar con pinza esterilizada (flameada),
sobre una placa de AS, adelante y hacia atrás por lo menos 4 veces.
o Incubar placa en estufa a 35ºC hasta 72 horas.
3.2. ANALITICO
● Revisar la placa diariamente hasta que cumpla el tiempo de incubación. La lectura de estos
cultivos debe ser realizada cada 24 horas.
● Recuento de colonias:
o La presencia de un recuento ≥ 15 UFC de un solo tipo, debe considerarse significativa,
continuando con la identificación bacteriana y sensibilidad.
o El resultado de este tipo de muestras solo tiene validez clínica cuando se interpreta en
conjunto a hemocultivos aerobios tomados con una diferencia de 12 a 24 horas.
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3.3. POSTANALITICO
Informe y registro de resultados: el informe de las muestras positivas se hace indicando el Nº

de colonias que hay presentes en la placa:
● Si hay ≥ 15 UFC de un solo tipo, informar identificación bacteriana y sensibilidad.

● Si hay menos de 15 colonias de un solo tipo, informar < 15 UFC o negativo dependiendo
del microorganismo.
● Si hay menos de 15 colonias de más de un tipo bacteriano, informar negativo.
● Si hay Candida informar cualquier recuento, dado que menos de 15 colonias puede ser
significativo.
● Plazo entrega de resultados: 48hrs a 72hrs.
4. PROCEDIMIENTO MUESTRAS OCULARES
Debido a la complejidad de la recogida de muestras para el diagnóstico de infecciones oculares

es que el médico Oftalmólogo será el encargado de esta. Por lo general la muestra obtenida es
muy pequeña y puede haber en ella una cantidad relativamente pequeña de microorganismos.
Los distintos tipos de muestras se describen a continuación y el procedimiento para procesar
estos cultivos se detallan en el punto 4.4.
4.1. SECRECIÓN CONJUNTIVAL/OCULAR
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de la Conjuntivitis aguda. Los agentes aislados

con mayor frecuencia son: Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus.
4.2. DACRIOADENITIS, DACRIOCISTITIS, CANALICULITIS
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de la inflamación de la glándula lagrimal, saco

lagrimal y conducto lagrimal respectivamente. Los agentes aislados con mayor frecuencia son:
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y ocasionalmente bacilos Gram (-).
4.3. ULCERA CORNEAL
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de la queratitis. Los agentes aislados con mayor
frecuencia son: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa
negativo y bacilos Gram (-) no fermentadores especialmente Pseudomonas sp y hongos como
Fusarium spp y Aspergillus spp.
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MICROBIOLÓGICOS
4.4. PROCEDIMIENTO DE LAS MUESTRAS
4.4.1. PREANALÍTICO
Para el cultivo de úlcera corneal, será responsabilidad del OFTALMÓLOGO la siembra de esta
muestra, al lado de la cama del enfermo en placas de AS, Ach, agar Sabouraud y tioglicolato,
medios de cultivo que serán proporcionados por el laboratorio al servicio. Para el resto de las
muestras, éstas serán sembradas en el AT. Microbiología.
4.4.2. ANALITICO y POSTANALITICO
Ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS.
5. PROCEDIMIENTO MUESTRAS RESPIRATORIAS
Para la obtención de muestras respiratorias se pueden utilizar una variedad de técnicas que
varían de acuerdo al tipo de muestra que se requiere o de acuerdo al sitio de obtención. A
continuación, se detallan los procesamientos de los distintos tipos de muestras que pueden llegar
al laboratorio.
5.1. VIA AREA SUPERIOR
5.1.1. MUESTRA DE OÍDO EXTERNO
OBJETIVO: Confirmar diagnóstico y etiología de infecciones del oído externo. Agentes como
Pseudomonas aeruginosa se asocian generalmente a este tipo de cuadros (Oído de nadador)
y junto a Staphylococcus aureus son los más frecuentemente aislados.
5.1.2. MUESTRA DE OÍDO MEDIO
OBJETIVO: Confirmar diagnóstico de Otitis Media. Debe ser cultivada fundamentalmente

frente a la sospecha de Otitis tanto aguda como crónica. Los principales agentes son:
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.
5.1.3. SECRECIÓN FARÍNGEA
OBJETIVO: Confirmar diagnóstico y etiología de la Faringoamigdalitis. Debe ser cultivada

fundamentalmente, frente a la sospecha de faringoamigdalitis bacteriana. Además de
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MICROBIOLÓGICOS
Streptococcus ß hemolítico grupo A (S. pyogenes), se deben estudiar los grupos C y G, los
cuales también son patógenos. Otras bacterias como Staphylococcus aureus causan
absceso amigdaliano, Haemophilus influenzae: epligotitis y Corynebacterium diphteriae:
difteria.
5.1.4. SENOS PARANASALES
OBJETIVO: Confirmar diagnóstico y etiología de Sinusitis. Debe ser cultivada

fundamentalmente, frente a la sospecha de Sinusitis tanto aguda como crónica. Los
principales agentes son: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus
influenzae y anaerobios en las infecciones crónicas.
5.1.5. PROCEDIMIENTO DE LAS MUESTRAS
Nota:
Cultivo Faríngeo: el período máximo de incubación de este cultivo es de 48 horas. No dar
por negativo el cultivo a las 24 horas ya que en dicho tiempo puede haber ausencia de
hemólisis.
5.2. VIA AREA INFERIOR
5.2.1. EXPECTORACIÓN O SECRECIÓN BRONQUIAL
OBJETIVO: Confirmar diagnóstico y etiología de Bronquitis Aguda y/o Neumonía de la

comunidad. Los agentes aislados con mayor frecuencia corresponden a: Streptococcus
pneumoniae, Moraxella catharralis, Haemophilus sp, Staphylococcus aureus y Klebsiella
pneumoniae (en pacientes alcohólicos).
● PREANALITICO
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MICROBIOLÓGICOS
● ANALITICO
● Lectura de la tinción de Gram: evaluar calidad de la muestra utilizando el objetivo de

menor aumento del microscopio (10x).
o Muestra de buena calidad: < 10 células epiteliales y > 25 PMN por campo
100x. Se realizará estudio completo de identificación y susceptibilidad.
o Muestra de mala calidad para estudio microbiológico: > 10 células epiteliales
y < 25 PMN por campo 100x. Las muestras de mala calidad no se estudiarán. El
informe se realizará en un plazo máximo de 24 horas y se informará que la muestra
presenta desarrollo de microbiota comensal y que ésta no es apta para estudio
microbiológico. Lo ideal sería evaluar la calidad de la muestra y luego ver si
esta es apta para su procesamiento (siembra), si no lo es la muestra no
debería sembrarse.
o Identificación y susceptibilidad: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS
MICROBIOLÓGICAS.
● POSTANALITICO
● Informe y registro de resultados: informar calidad de la muestra, identificación y

susceptibilidad.
● Plazo entrega de resultados: 48 a 72 horas.
5.2.2. CULTIVO CUANTITATIVO DE ASPIRADO ENDOTRAQUEAL (CCAET)
OBJETIVO: Confirmar diagnóstico y etiología de Neumonía asociada a ventilación mecánica

(NAVM). Los agentes más frecuentes son variables dependiendo de la UPC de cada centro
hospitalario. Son en general bacilos Gram (-) no fermentadores, Klebsiella spp. y
Staphylococcus aureus MR.
● PREANALITICO
Tipo de muestra: el aspirado endotraqueal es una muestra tomada en pacientes con

ventilación mecánica con un catéter estéril (Nº 22) a través del tubo endotraqueal (30
cm. por lo menos). El primer aspirado se descarta y el segundo se deja caer en tubo
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MICROBIOLÓGICOS
estéril o se envía en la misma jeringa o recolector. El volumen mínimo a procesar es 1

ml. No se debe instilar suero, ni diluir la muestra.
Método Cultivo Cuantitativo de Aspirado Endotraqueal (CCAET): este cultivo se

realiza según indicación médica en pacientes que estén en ventilación mecánica por más
de 48 horas y en quienes se sospeche neumonía o traquebronquitis asociada a
ventilación mecánica (NAVM Y TAVM). Proceder como se describe a continuación:
1) Diluir la muestra a la mitad con NaCl al 0.9% estéril.

2) Homogenizar con perlas de vidrio estériles en agitador por 2 min.
3) Extraer 100 μl de dicha emulsión y diluir con 9.9 ml de suero fisiológico.
4) Agitar por un instante.
5) Rotular como Placas A, una placa de AS, una de Agar MC. (Chocolate)
6) Rotular otro set idéntico como Placas B.
7) Sembrar 100 μl de la dilución preparada en el punto 1, en cada placa A. Diseminar
la muestra por medio de un rastrillo y dejar secar.
8) Sembrar 10 μl de la dilución preparada en el punto 3, en cada placa B. Diseminar
la muestra del mismo modo que en el punto 7.
9) Incubar según lo descrito previamente. El tiempo máximo de incubación es de 72
horas.
● ANALITICO
ES RESPONSABILIDAD DEL TECNÓLOGO MÉDICO:
Lectura de la tinción de Gram: en caso de que se detecte crecimiento en alguna de las

placas observar al microscopio el tipo de bacteria obtenida (puede ser más de una
especie bacteriana)
Recuento de colonias: contar el número de colonias de cada especie, obtenidas en la

placa y cuantificar:
o Placa A: 1 colonia = 2.000 ufc/ ml (2 x 103)

o Placa B: 1 colonia = 20.000 ufc/ ml (2 x 104)
Identificación y susceptibilidad: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS.
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MICROBIOLÓGICOS
● POSTANALITICO
Informe y registro de resultados:
o Si el número de colonias es tal que no permite ser contado, se informará como

>106 UFC/ml. Registrar en el informe: identificación del patógeno, número de
colonias y antibiograma.
o Siempre que se observe crecimiento en las placas B, realizar informe en base a
este recuento. En el caso que exista desarrollo únicamente en las placas A,
realizar cálculo en base a este recuento.
o Las especies de Streptococcus Grupo Viridans, Staphylococcus coagulasa
negativo, Corynebacterium spp no son considerados agentes de NAVM por lo
que no se informan.
o El desarrollo de especies de Candida spp. se considera sólo como colonización
por lo que se informará su presencia, pero sin cuantificación.
o La presencia de hongos filamentosos debe ser estudiado caso a caso según los
antecedentes clínicos del paciente (en la mayoría de los casos es necesario
contactar al médico tratante).
Plazo de entrega del informe: 48 a 72 horas.
5.2.3. MUESTRA DE LAVADO BRONCOALVEOLAR POR BRONCOSCOPÍA
OBJETIVO: Dado que ésta es una muestra invasiva de baja frecuencia, aun cuando se
solicite sólo cultivo corriente se buscará la presencia de hongos, en especial del género
Aspergillus.
● PREANALITICO
● Tinción de Gram y siembra de la muestra:

o Homogeneizar la muestra en el Vortex por 3 min. aproximadamente.
o Rotular las placas y realizar tinción de Gram.
o Con una pipeta estéril agregar 10 μl de muestra en cada uno de los siguientes
medios: AS y Agar MC.
o Sembrar tres tubos de Agar Sabouraud
o El resto del procedimiento debe seguir como cualquier cultivo corriente y de
hongos
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MICROBIOLÓGICOS
● ANALITICO
● Lectura de la tinción de Gram y recuento de colonias: en caso de desarrollo, realizar

recuento de los diferentes tipos de colonias encontradas. El informe se hace de manera
cuantitativa indicando el Nº de UFC/ml. El factor de dilución es 100 (1 colonia= 100
ufc/ml).
● Identificación y susceptibilidad: Continuar el estudio según lo indicado en

procedimiento general GENERAL DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS.
● POSTANALITICO
● Informe y registro de resultados: registrar en el informe: identificación del patógeno,

número de colonias y antibiograma.
● Plazo de entrega del informe: 48- 72 hrs.
5.2.4. TEJIDO PULMONAR
OBJETIVO: El cultivo broncoscópico o de tejido pulmonar es un examen de laboratorio

utilizado para aislar e identificar los organismos que causan infección en los pulmones.
● PREANALITICO, ANALITICO Y POSTANALITICO
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MICROBIOLÓGICOS
6. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS
Este procedimiento se utiliza para confirmar el diagnóstico y etiología en infecciones de piel y

tejidos blandos.
DEFINICIONES:
● Infecciones superficiales: comprometen la dermis, epidermis y tejido subcutáneo:

ulceras, quemaduras, heridas superficiales, erisipela, celulitis, impétigo, foliculitis y
furunculosis.
● Infecciones profundas: involucran a la fascia y músculo, pudiendo o no

comprometer cavidades u órganos. Pueden ocurrir luego de cirugía o traumatismo:
ulceras, quemaduras y heridas profundas (incluyendo herida operatoria), mordeduras,
gangrena gaseosa, fascitis necrotizante, enfermedad de Fournier. Se aíslan diferentes
microorganismos dependiendo de si son superficiales o profundas: Streptococcus
Beta hemolítico grupo A y otros B, C, G., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.,
Enterobacterias y Bacilos Gram (-) no fermentadores, especialmente Pseudomonas
spp.
6.1. CULTIVO DE PIEL, TEJIDO, HERIDA, ULCERAS Y PIE DIABETICO
OBJETIVO: Confirmar diagnósticos y etiología en infecciones en esta amplia variedad de

tipos de muestras.
6.1.1. PREANALITICO, ANALITICO y POSTANALITICO
6.2. PROCEDIMIENTO CULTIVO CUANTITATIVO DE TEJIDOS
OBJETIVO: Cuantificar la carga microbiana para tratamiento, en determinados casos.
6.2.1. PREANALITICO
Tipo de muestra: tejido obtenido por curetaje de lesiones superficiales previo aseo con
suero fisiológico o a través de procedimiento quirúrgico. La muestra se deposita en un contenedor
o tubo hermético estéril.
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MICROBIOLÓGICOS
Procesamiento y siembra de la muestra:
● Pesar el contenedor con la muestra recibida (Peso X en gramos).
● Pesar contenedor sin muestra (Peso Y en gramos).
● Con técnica aséptica, vaciar la muestra en mortero estéril o en placa Petri estéril para
macerar con gotas de suero fisiológico y homogenizar.
● Con pipeta automática preparar 3 diluciones seriadas del macerado:

o 0.1 ml del macerado + 0.9 ml de suero fisiológico, dilución 1/100
o 0.1 ml de solución anterior + 0.9 ml de suero fisiológico, dilución 1/1000
o 0.1 ml de solución anterior + 0.9 ml de suero fisiológico, dilución 1/10000
● Agitar las diluciones en Vortex.
● Sembrar con pipeta automática 0.1 ml (100 ul) del homogenizado original (1/10) y
cada dilución en placas de AS y agar MC marcadas con la dilución correspondiente:
(1/100,1/1000,1/10000).
● Sembrar 0.1 ml de la dilución 1/10 y 1/100 en placas de agar Feniletilalcohol agar

rotuladas con las diluciones correspondientes.
● En caso de que se solicite estudio de hongos inocular en agar Sabouraud unas gotas
del macerado.
● Distribuir homogéneamente con asa todas las siembras.
● Incubar las placas a 35 ºC en atmósfera normal.
6.2.2. ANALITICO
Recuento de colonias: evaluar y cuantificar crecimiento a las 24 hrs.
● Si no hay desarrollo incubar hasta 72 hrs.
● Si hay desarrollo: contar el número de colonias en cada placa, registrar y definir el

recuento final de cada tipo de colonia seleccionando la placa con la más alta dilución que
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MICROBIOLÓGICOS
le permita contar fácilmente entre 30 y 300 colonias. En caso de desarrollo de bacilos

Gram negativos utilice sólo las placas de agar MC.
● Mediante la siguiente fórmula calcular el número de unidades formadoras de colonias por

gramo de tejido (UFC/g):
N Número de colonias
D Factor de dilución del conteo
10 Factor para 0.1 ml inóculo sembrado

𝑈𝐹𝐶 𝑁 𝑥 𝐷 𝑥 10
=
𝑔 𝑑𝑒 𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜 (𝑋 − 𝑌) X–Y Peso del tejido en gramos
X Peso del contenedor con la muestra
Y Peso del contenedor sin la muestra
Identificación y susceptibilidad: ver procedimiento 4.
6.2.3. POSTANALITICO
Informe y registro de resultados: todos los recuentos se informan. Si el número de

colonias es tal que no permite ser contado, se informará como >106 UFC/ml. Registrar en el
informe: identificación del patógeno, número de colonias y antibiograma.
Plazo entrega de resultados: ver Procedimiento 4.
6.3. ACARO TEST
OBJETIVO: Determinar a través de un raspado de piel la presencia del acaro Sarcoptes

scabiei, agente causal de la sarna.
6.3.1. PREANALITICO
● Tipo de muestra: Raspado de piel.
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MICROBIOLÓGICOS
6.3.2. ANALITICO Y POSTANALITICO
Agregar KOH 20% al portaobjeto en el cual se envía la muestra. Mirar al microscopio con
aumento de 40X. La aparición de ácaros, huevos o heces indica que el examen es
positivo. Lo contrario, será un resultado negativo.
6.4. MICROSCOPIA DEMODEX
OBJETIVO: Determinar a través de un raspado de piel la presencia de un acaro asociado a

Rosácea, Demodex spp.
6.4.1. PREANALITICO
● Tipo de muestra: Raspado de piel.
Agregar KOH 20% al portaobjeto en el cual se envía la muestra. Mirar al microscopio con
aumento de 10X. La aparición de ácaros, huevos o heces indica que el examen es
positivo. Lo contrario, será un resultado negativo.
7. PROCESAMIENTO DE TEJIDO ÓSEO Y MÉDULA OSE
7.1. CULTIVO CUALITATIVO DE HUESO
OBJETIVO: Confirmar diagnósticos y etiología en infecciones en tejido osteoarticular.
7.1.1. PREANALITICO
● Tipo de muestra: Hueso o tejido osteoarticular obtenido por curetaje a través de

procedimiento quirúrgico. La debe obtener el cirujano en un procedimiento quirúrgico
estéril. La muestra se deposita en contenedor o tubo hermético estéril.

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MICROBIOLÓGICOS
7.2. CULTIVO DE TEJIDO ÓSEO PARA PROCURAMIENTO/BANCO DE HUESOS
OBJETIVO: Realizar un control microbiológico (Evaluando negatividad) de los huesos que

serán preservados en el Banco de Hueso para su posterior utilización en implante. Los
agentes aislados con mayor frecuencia son: Staphylococcus coagulasa negativo y en menor
proporción Staphylococcus aureus.
7.2.1. PREANALITICO
● Cultivo de la muestra:
o Se realizarán cultivos:
▪ Aerobio: Agar Sangre, Chocolate y MacConkey; incubándose a 35-
37°C por 5 días (AS Y ACh en CO2).
▪ Anaerobio: Tioglicolato se cultivará 7 días con traspaso al 7° día a AS
(este vendrá sembrado desde el pabellón).
▪ Cultivo de Hongos: Agar Sabouraud, que será incubado a 35-37°C por
14 días.
o Se realizará tinción de Gram a partir de la tórula que se usó para la siembra.
● Incubación: Los caldos serán incubados por 7 días a 35-37°C, al cabo de los cuales
se harán traspasos ciegos a placas de AS.
7.2.2. ANALITICO
● Observar el crecimiento presente en los distintos medios en los cuales se sembró la

muestra
● Informe y registro de resultados: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS.
● Plazo entrega de resultados: Se informarán los resultados a los 10 días para el

estudio de Bacterias y a los 14 días para el estudio de hongos de acuerdo al flujograma
de trabajo que se detalla a continuación:
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MICROBIOLÓGICOS
7.3. CULTIVO DE MEDULA ÓSEA
OBJETIVO: Realizar un control microbiológico (evaluando negatividad) de las muestras

de médula ósea en proceso de trasplante. Los agentes aislados con mayor frecuencia son:
Staphylococcus coagulasa negativo y en menor proporción Staphylococcus aureus.
7.3.1. PREANALITICO
● Proveer frascos de hemocultivos al Pabellón quirúrgico: el Laboratorio de

Microbiología proveerá al Pabellón quirúrgico de 1 frasco pediátrico de hemocultivo,
previo aviso de transplante programado. El frasco de hemocultivo debe ser retirado
del Laboratorio de Microbiología previo inicio del procedimiento.
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MICROBIOLÓGICOS
PROCEDIMIENTO CLÍNICO REALIZADO POR MÉDICO ESPECIALISTA:
● Se punciona el hueso esternal o cresta iliaca, con técnica aséptica y se aspira.
● La primera muestra se destina a hacer frotis.
● La segunda muestra de idealmente de 3 a 5 ml se coloca en un frasco de hemocultivo.

Tapar la jeringa con tapón rojo y enviar con la botella de hemocultivo para realizar
Gram. (En caso de muestra escasa se aceptan no menos de 1.5 a 2ml).
● La tercera muestra de 6 ml se separa en dos partes iguales de 3 ml, se vierten en tubo

con EDTA para posterior estudio de inmunofenotipo y los 3 ml restantes en un tubo
con EDTA derivados a estudio de biología molecular.
● Envío inmediato al laboratorio.
VER PROCEDIMIENTO 2.1. HEMOCULTIVOS AEROBIOS (En frascos Bact/Alert)
8. PROCEDIMIENTO LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) Y OTROS LIQUIDOS

ESTERILES
Este procedimiento se utiliza para confirmar el diagnóstico y etiología en infecciones de una

variedad de líquidos estériles. En algunos de estos líquidos es posible tomar un gran volumen de
líquido por lo que se recomienda inocular en frascos de hemocultivos que contienen medios
nutritivos. En otros casos la cantidad de muestra recolectada es escasa por lo que es importante
procesar inmediatamente luego de la obtención. Independiente de esto, muchos
microorganismos se asocian con infecciones en estas localizaciones, incluidas las muestras
polimicrobianas, por lo que la tinción de Gram es muy útil para identificar los distintos
microorganismos responsables de la infección. Los distintos tipos de muestras y su
procesamiento se detallan a continuación.
8.1. LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (POR PUNCIÓN LUMBAR, DRENAJE

VENTRICULAR INTERNO Y DRENAJE VENTRICULAR EXTERNO):
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de Meningitis aguda y Ventriculitis asociada

a DVE y DVP. Meningitis bacteriana: los agentes aislados con mayor frecuencia en el adulto
son: Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes.
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MICROBIOLÓGICOS
Ventriculitis: los agentes aislados con mayor frecuencia son: Staphylococcus coagulasa
negativo, Staphylococcus aureus, Enterobacterias, bacilos Gram (-) no fermentadores.
8.1.1. PREANALITICO
La muestra de LCR es una muestra considerada crítica, por lo que se debe tratar con
especial atención, con el fin de realizar adecuadamente los exámenes que se han
solicitado. Estos pueden ser:
● Cultivo corriente y Gram.
● Cultivo de hongos y tinta china.
● Inmunocromatografía para Cryptococcus.
● No se realiza en nuestro laboratorio: Cultivo de Koch y baciloscopía, Látex para meningitis,

Látex para Cryptococcus sp. y PCR de agentes virales.
ES RESPONSABILIDAD DEL TÉCNICO PARAMÉDICO:
● Tinción de Gram y siembra de la muestra: En el caso de un estudio de Meningitis

bacteriana, se debe:
o Centrifugar la muestra de LCR, en tubo estéril, a 3000 rpm por 10 minutos. Si la
cantidad de muestra es menos a 1 ml no centrifugar.
o Traspasar el sobrenadante a otro tubo estéril. Agitar el sedimento y realizar la
tinción de Gram, avisando de inmediato al TM para que lo informe.
o Realizar siembra según tabla de siembra.
o En el caso de una muestra con citoquímico alterado y cultivo negativo, con
diagnóstico clínico de Meningitis bacteriana se debe enviar la muestra al ISP. Para
este efecto se debe separar a lo menos 500 µl de muestra en tubo estéril para
mantener refrigerado de 2-8ºC para estudio por PCR en caso de ser solicitado.
Esto aplica para todas las muestras provenientes de pacientes hospitalizados y
provenientes del servicio de urgencia.
8.1.2. ANALITICO
Ver procedimiento general de muestras microbiológicas.
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MICROBIOLÓGICOS
8.2. OTROS LIQUIDOS ESTERILES
TIPOS DE MUESTRAS
8.2.1. LÍQUIDO PLEURAL.
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de Empiema pleural. Los agentes

aislados con mayor frecuencia son: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y
en los casos de IAAS considerar Enterobacterias y bacilos Gram (-) no fermentadores.
8.2.2. LÍQUIDO ARTICULAR.
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de Artritis séptica. Los principales

agentes aislados en artritis del adulto son: Staphylococcus aureus, Neisseria
gonorrhoeae, y con menor frecuencia Streptococcus ß-hemolíticos grupo A, B y C.
8.2.3. LÍQUIDO PERITONEAL/ASCÍTICO.
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de Peritonitis bacteriana espontánea. Los

agentes más frecuentes son Enterobacterias, Enterococcus spp y en forma excepcional
Streptococcus pneumoniae.
8.2.4. BILIS
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de infección de la vía biliar (Colangitis)

Los agentes más frecuentes aislados en colangitis son Enterobacterias y Enterococcus
spp.
PREANALITICO: Estas muestras idealmente deben venir inoculadas directamente desde el

servicio en frascos de hemocultivo (Ver procedimiento 14), excepto en las muestras de bilis. Las
muestras que no lleguen al servicio en frascos de hemocultivos se deben procesar como detalla
el procedimiento 4.
● El tiempo de incubación será el habitual para los hemocultivos (5 días para botellas de
adultos, 7 días para botellas pediátricas y 10 días para botellas con solicitud de búsqueda
de hongos).
● Se puede recibir un tubo sin anticoagulante para realizar tinción de Gram.

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MICROBIOLÓGICOS
● En caso que se verifique que la muestra viene en frasco de hemocultivo NO es necesario

hacer un cultivo directo en placas.
ANALITICO y POSTANALITICO: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS.
9. PROCEDIMIENTO UROCULTIVOS
El cultivo de orina es la muestra que se remiten con mayor frecuencia para cultivo en el
Laboratorio. Debido a que los microorganismos patógenos pueden crecer también en orina es
importante el transporte inmediato de las muestras para ser procesadas inoculando 1 o 10ul
(Según tipo de muestras) en los medios de cultivos correspondientes para así cuantificar el
número de microorganismos presentes. Los distintos tipos de muestras y sus procesamientos se
detallan a continuación.
OBJETIVO (Aplica a todos los tipos de muestras): Confirmar diagnóstico y etiología de la

infección del tracto urinario (ITU). Los agentes aislados con mayor frecuencia son:
Enterobacterias, Enterococcus spp. y en los casos de IAAS se agregan bacilos Gram (-) no
fermentadores.
9.1. MUESTRA DE ORINA DE SEGUNDO CHORRO (MUESTRA MICCIONAL)
Orina para urocultivo que se toma en forma no invasiva. Se desecha primera parte de la
micción para evitar contaminación de muestras con bacterias de la uretra o de la vagina. Ver
procesamiento en punto N°9.6.
9.2. CATETERISMO POR SONDEO
Muestra obtenida a través de la instalación de una sonda transitoria. Ver procesamiento en

punto N°9.6.
9.3. CATETER URINARIO PERMANENTE (CUP) SONDA FOLEY
Corresponde a la toma de muestra desde una sonda ya instalada. Ver procesamiento en

punto N°9.6.
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MICROBIOLÓGICOS
9.4. PUNCIÓN SUPRAPUBICA
Muestra obtenida con una técnica invasiva por lo que se evita contaminación de la muestra
con bacterias uretrales. Ver procesamiento en punto N°9.6.
9.5. UROSTOMIAS (CONDUCTO ILEAL/UROSTOMÍA CONVENCIONAL, NEFROSTOMIA,

URETEROSTOMÍA, CISTOSTOMÍA)
Muestra obtenida con una técnica invasiva o procedimiento quirúrgico por lo que se evita
contaminación de la muestra con bacterias uretrales. Ver procesamiento en punto N°9.6.
9.6. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
9.6.1. PREANALITICO
● Tipo de muestra: según la técnica de recolección se clasifican en orina de 2° micción,

orina por sondeo vesical, recolector pediátrico, orina por punción vesical, Nefrostomía
y Ureterostomía. Todas deben enviarse en frasco estéril de tapa rosca. Para
procedimiento correcto ver flujograma de estudio en punto 9.6.3.
● Recepción y registro: Si la muestra no puede ser sembrada antes de 2 horas deberá

mantenerse refrigerada por 24 horas a 2-8ºC, sin que ello incida en el recuento de
colonias.
● Tinción de Gram: ver procedimiento general. Ya no se realiza.
● Siembra de Muestras:
o Método del asa calibrada: método cuantitativo, en que se siembra la orina por
agotamiento con un asa calibrada de 1 µl o 10 µl en medio de AS (CNA) y
CromoUTI. Sembrar en Agar Sabouraud, sólo cuando esté explicita la solicitud
de Cultivo de Hongos en la orden de examen.
● Incubación: las placas de AS (CNA) y CromoUTI se mantienen en estufa a 35°C por

18 a 24 horas. El agar Sabouraud se debe mantener en la estufa por 72 horas previo
a su interpretación definitiva.
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MICROBIOLÓGICOS
9.6.2. ANALITICO
● Recuento de Colonias e Identificación Presuntiva: Si la placa tiene desarrollo

bacteriano se debe llevar a cabo el análisis según el agar donde se observa el
crecimiento, la morfología y el recuento de las colonias (100 colonias = 105 UFC/ml).
La identificación y susceptibilidad antimicrobiana se realizará de acuerdo al número
de patógenos significativos.
9.6.3. FLUJOGRAMAS DE INTERPRETACIÓN PARA UROCULTIVOS
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MICROBIOLÓGICOS
Identificación presuntiva: En caso de evidenciar crecimiento en agar CromoUTI

proceder como se describe a en el flujograma punto 9.6.3.
Informe y Registro de resultados:
● La ausencia de desarrollo bacteriano en el AS (CNA) y CromoUTI se informa como

negativo a las 24 horas.
● En caso de ser positivo el resultado registrar en el informe: identificación del patógeno o
en su defecto color de la colonia observada, recuento de colonias y antibiograma a
realizar.
● En caso de informe polimicrobiano, se solicita nueva muestra.
Plazo de entrega del informe:
● Cultivos negativos: Se informan como negativo a las 24 horas de observación.
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MICROBIOLÓGICOS
● Cultivos positivos: Se informa la identificación bacteriana, número de colonias e informe

de susceptibilidad a antimicrobianos a las 48-72 horas.
9.6.4. POSTANALITICO: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS.
10. PROCEDIMIENTO MUESTRA DE DEPOSICIONES
10.1. PROCEDIMIENTO COPROCULTIVO
10.1.1. PREANALITICO
Recolección, transporte y almacenamiento de la Muestra:
● La muestra debe ser deposición fresca recién emitida o un hisopado rectal.
● Si entre la toma de muestra y la siembra no transcurre un tiempo mayor de 2 horas, la

muestra puede enviarse sin medio de transporte.
● Si se supera este plazo debe usarse medio de Cary–Blair proporcionado por el laboratorio
a los servicios o pacientes ambulatorios.
● La muestra debe mantenerse a temperatura ambiente hasta su siembra.
10.1.2. ANALITICO
Siembra de Muestras:
● Coprocultivo Corriente: Asignar estudio de Salmonella y Shigella. Sembrar la

muestra en Agar MC y Agar SS.
● Yersinia spp.: Asignar estudio de Yersinia spp. (aplica a todos los coprocultivos
recibidos).
● Vibrio spp.: luego de sembrar la muestra como coprocultivo (corriente) se debe

inocular la tórula en agar TCBS para el cultivo (aplica a todos los coprocultivos
recibidos).
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MICROBIOLÓGICOS
Incubación de Muestras: las placas de coprocultivo corriente y TCBS se mantienen en

estufa a 35º C por 18 a 24 horas. Las placas para estudio de Yersinia requieren incubación
adicional a temperatura ambiente por 24 horas.
Tinción para Campylobacter: aplica para todos los coprocultivos recibidos.

Procedimiento:
● En un portaobjetos limpio realizar un extendido fino de la deposición a estudiar y dejar

secar completamente a Tº ambiente.
● Una vez seca, cubrir la lámina con partes iguales de Cristal violeta y una solución de
Bicarbonato 1% y dejar actuar por 1 a 2 minutos.
● Lavar con agua corriente.
● Dejar secar a Tº ambiente.
● Entregar al TM para su lectura.
Identificación Presuntiva:
● Colonias lactosa (-) en MC y SS sospechosas de Salmonella y Shigella (VITEK-

MS).
● Colonias puntiformes lactosa (+/-) sospechosas de Yersinia realizar pruebas

bioquímicas.
● Colonias amarillas en agar TCBS, lactosa negativa en agar MC, sospechosas de Vibrio
cholerae (otros Vibrios no cólera pueden dar colonias verdes en TCBS), sembrar en
AS (máximo 3 colonias de cada placa).
● Si se confirma la presencia de Vibrio cholerae u otro Vibrio, se le realiza antibiograma.
Lectura de la tinción de Campylobacter: Realizar lectura de la lámina en microscopio

con aumento 100X en búsqueda de bacilos finos con forma de “gaviota” o curvos. Se
deben recorrer al menos 50 campos antes de informar la lámina como negativa. Informar
su presencia como negativo o positivo
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MICROBIOLÓGICOS
Informe y registro de resultados: se realiza preinforme como Salmonella, Shigella,

Yersinia o Vibrio spp en espera del informe definitivo desde el ISP.
Envío a ISP:
● Cepas de Salmonella deben ser enviadas al ISP para confirmación.
● Cepas de Shigella, según normativa, Reglamento Nª 712, se deben enviar todas las
cepas en los laboratorios que aíslen menos de 50 cepas.
● Vibrio cholerae u otro Vibrio, la cepa es enviada al ISP para reconfirmación y vigilancia.
Plazo de entrega de informe: Se reconocen distintos tiempos de respuesta de los

coprocultivos, de acuerdo a los estudios que se le realizan a la muestra.
● Cultivo Corriente: El preinforme es enviado a las 48 a 72 horas después de recibida

la muestra. El informe final de las cepas enviadas al ISP será entregado al recibir la
confirmación del Laboratorio de Referencia, más o menos a los 15 días.
● Yersinia spp: se envía un informe a las 72 horas.
● Vibrio spp: el preinforme se envía a las 72 horas y el confirmatorio final, al momento

de recibirlo del ISP.
10.2. LEUCOCITOS FECALES
PRINCIPIO: examen microscópico de frotis de deposiciones o rectal para búsqueda de

leucocitos.
MUESTRA: deposición.
10.2.1. ANALÍTICO
PROCEDIMIENTO:
● En un portaobjetos limpio realizar un extendido fino de la deposición a estudiar y dejar

secar completamente a Tº ambiente.
● Una vez seca, cubrir la lámina con azul de metileno durante 5 minutos.
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MICROBIOLÓGICOS
● Lavar con agua corriente.
● Dejar secar a Tº ambiente.
● Entregar al TM para su lectura microscópica.
RESULTADOS:
● POSITIVO: Se observan leucocitos en la preparación.
● NEGATIVO: No se observan leucocitos.
10.2.2. POSTANALÍTICO ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS.
10.3. HEMORRAGIA OCULTA EN DEPOSICIONES
PRINCIPIO: método inmunocromatográfico que reconoce de forma exclusiva la hemoglobina

humana presente en la muestra de heces al reaccionar con un anticuerpo monoclonal específico
marcado con oro.
10.3.1. ANALÍTICO
PROCEDIMIENTO:
● Sujetar el tubo en posición vertical y extraer el bastoncillo azul incluido en el tubo.
● Insertar el bastoncillo azul en el frasco con las heces, en tres lugares diferentes.
● Colocar el bastoncillo azul en el tubo y cerrarlo herméticamente.
● Rotular el tubo y agitar vigorosamente.
● Extraer el cassette de prueba de su envoltura y rotular.
● Desenroscar la tapa protectora blanca. Para evitar salpicaduras, se recomienda utilizar

una toalla de papel y desprender el pasador del tubo de obtención de heces con un
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MICROBIOLÓGICOS
movimiento de giro. Sujetar el tubo de obtención de heces en posición vertical y transferir

4 gotas de solución al pocillo de muestra del cassette (S).
● Leer los resultados en 5 minutos.
RESULTADOS:
● POSITIVO: aparición de ambas líneas (C y T).
● NEGATIVO: aparición de 1 línea en C.
● No válido: ninguna aparición de líneas o aparición de 1 línea en T.

MICROBIOLÓGICAS.
10.4. PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE GRASA FECAL (TEST DE SUDÁN

III)
PRINCIPIO: Detección cualitativa de grasa neutra (triglicéridos intactos no hidrolizados) y ácidos

grasos (grasa parcial o totalmente hidrolizada). La muestra se colorea directamente con Sudán
III y se examina al microscopio para detectar la grasa neutra, la que aparece en forma de gotas
grandes de color rojo o anaranjado. Los ácidos grasos y otras formas de grasa hidrolizadas
normalmente no se tiñen con este procedimiento. El resultado se expresa de acuerdo al número
y diámetro de las gotas (glóbulos) de grasa visualizada en cada lámina.
10.4.1. ANALÍTICO
PROCEDIMIENTO:
● Tomar un portaobjeto, rotular con lápiz graso y agregar 1 gota de muestra de heces
fecales.
● Añadir 1 gota del reactivo Sudán III, mezclar con una varilla y cubrir con un cubreobjeto.
● Observar al microscopio en 40X y registrar el resultado.

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MICROBIOLÓGICOS
INTERPRETACION:
● POSITIVO: Forma de gotas grandes de color rojo o anaranjado.
● NEGATIVO: No se observa forma de gotas grandes de color rojo o anaranjado.

MICROBIOLÓGICAS.
10.5. DETECCIÓN DE TOXINA DE C. difficile (STANDARD FIA)
10.5.1. INTRODUCCIÓN
La infección por Clostridioides difficile (ICD) se asocia a cuadros de diarrea que pueden
derivar en una colitis pseudomembranosa y megacolon tóxico. El uso de antimicrobianos y el
antecedente de una ICD son los principales factores de riesgo de la enfermedad. Es un importante
problema de salud pública, no solo por la morbilidad y mortalidad asociadas, sino por la transmisión
entre pacientes, ya que la bacteria produce esporas que permanecen por largo tiempo en el
ambiente y fomites. El C. difficile produce una gran cantidad de glutamato deshidrogenasa (GDH),
por lo que la medición de este antígeno ha demostrado ser un buen screening por su alto valor
predictivo negativo.
La patogenicidad de C. difficile está dada principalmente por la presencia de dos exotoxinas (toxina
A y toxina B).
La identificación de C. difficile toxigénico permite un correcto manejo, tanto desde el punto de vista
clínico, como de control de infecciones asociadas a la atención de salud
10.5.2. PREANALITCA
● La recolección de las muestras se realiza en los distintos servicios clínicos, según el

Manual de Toma de Muestras (APL 1.2).
● Las muestras son recepcionadas en el AT de Microbiología, donde son revisadas por si

se presentara alguna causa de rechazo, descritas en el Manual de Toma de Muestras
(APL 1.2). En el caso de este estudio, se deben rechazar las deposiciones sólidas o
formadas.
● Antes de comenzar a trabajar las muestras, se deben contar con todos los elementos de
protección personal descritos en el Manual de bioseguridad de laboratorio clínico (APL
1.5).
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MICROBIOLÓGICOS
10.5.3. ANALITCA
Seguir indicaciones del fabricante según MIC-DE-01 y MIC-DE-02 en Anexo 1.
10.5.4. POSTANALITCA
Seguir indicaciones del fabricante según MIC-DE-01 y MIC-DE-02 en Anexo 2.
11. PROCEDIMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SECRECIONES GENITALES FEMENINOS
11.1. FLUJO VAGINAL Y FLUJO CERVICAL
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de Infección vaginal y cervical. Los

principales agentes aislados en flujo vaginal son: Gardnerella vaginalis, Streptococcus grupo
B, Candida albicans y Trichomona vaginalis. En cervicitis considerar Neisseria gonorroheae.
● Preparación del Directo al fresco: se utiliza fundamentalmente en la evaluación de

secreciones o flujo vaginal, con el objetivo principal de identificar elementos móviles
sugerentes de Trichomonas vaginalis.
o Preparación de la lámina para lectura:

▪ Rotule un portaobjetos con el Nº correspondiente a la muestra analizada.
▪ Coloque 1 o dos gotas de la muestra en el centro del portaobjetos
▪ Inmediatamente cubra la muestra con un cubreobjetos. No debe dejar que
la muestra se seque.
● Tinción de Gram:
o Se realiza a todas las placas que estén positivas a las 24 hrs.

o Flujo vaginal y secreción uretral: se debe informar además cuando hay presencia de
diplococos Gram negativos intracelulares, clue cells.
● Siembra de la muestra: sembrar la muestra en los medios correspondientes:
o Secreción flujo vaginal: Placa AS, agar Sabouraud.

o Secreción endocervical: AS, agar Sabouraud y Thayer Martin si ya no viene
sembrado.
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MICROBIOLÓGICOS
● Incubación: incubar a 35° C por 24 horas. Si a las 24 horas se mantiene negativo, se

espera positividad a las 48 o 72 horas. Las placas de Thayer Martin se incuban a 35ºC en
tarro con vela o estufa CO2 5%.
11.1.2. ANALITICO
● Lectura e informe del directo al fresco: La lectura definitiva del directo se hace
utilizando microscopio óptico, primero con aumento 10x y luego 40x recorriendo toda el
área del cubreobjetos. Los elementos a considerar e informar son ausencia o presencia
(semicuantitativo) de elementos parasitarios con movimiento flagelar (sugerente de
Trichomonas vaginalis), células epiteliales, leucocitos/piocitos, eritrocitos, elementos
bacterianos o levaduriformes.
● Lectura tinción de Gram y análisis de los cultivos:
o Staphylococcus coagulasa negativa y Corynebacterium spp corresponden a

microbiota comensal habitual.
o Otras especies como Streptococcus ß-hemolíticos (A, B u otros), Staphylococcus
aureus, Enterobacterias, bacilos Gram (-) no fermentadores, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenza y Candida spp deben ser informados como tal.
o Si se observa en la tinción de Gram de la muestra, escasos lactobacilos y abundantes
bacilos Gram (-) curvos y células epiteliales cargadas de bacilos Gram variable y
pequeños (clue cells) junto con colonias hemolíticas muy pequeñas al cultivo,
sospechar Gardnerella vaginalis. Es fundamental informar el examen directo y el
cultivo con este agente.
o Si se observan cocáceas Gram (+) en diplococo y cadena al Gram y colonias ß-
hemolíticas en el cultivo, traspasar a agar granada para detección de Streptococcus
agalactiae. De no contar con este medio se puede realizar susceptibilidad a
Bacitracina, test de CAMP o aglutinación con látex.
o En caso de Streptococcus alfa hemolíticos sembrar en agar bilis-esculina y caldo sal.
o Frente a sospecha de Levaduras sembrar en cromo-Candida para diagnóstico de
Candida spp.
o Si es un bacilo Gram (-), se le realizan pruebas bioquímicas: TSI, LIA, MIO, Citrato,
Urea.
o Si la bacteria es una cocácea Gram (+) sospechosa de Staphylococcus se realiza
coagulasa.
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MICROBIOLÓGICOS
o Si se observan cocáceas Gram (-) aisladas o en diplococo al Gram junto con colonias
sospechosas de Neisseria al cultivo, realizar identificación por Vitek 2 (tarjeta NH) o
API NH según disponibilidad.
o No se realiza estudio en nuestro laboratorio de Ureaplasma urealyticum, o
Mycoplasmas genitales.

MICROBIOLÓGICAS.
12. PROCEDIMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SECRECIONES GENITALES MASCULINO
12.1. SECRECIÓN URETRAL
OBJETIVO: Confirmar el diagnóstico y etiología de la Uretritis y Prostatitis. Los agentes

etiológicos de uretritis son Neisseriae gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Ureaplasma
urealyticum. Los de prostatitis y epididimitis son fundamentalmente Enterobacterias,
Staphylococcus, Enterococcus y Neisseria gonorrhoeae.
● Tinción de Gram:
o Se realiza a todas las placas que estén positivas a las 24 hrs.
o Secreción uretral: se debe informar además cuando hay presencia de diplococos
Gram negativos intracelulares.
● Siembra de la muestra: sembrar la muestra en los medios correspondientes:

o Secreción uretral: AS, VCA3 y agar Sabouraud.
● Incubación: incubar a 35° C por 24 horas. Si a las 24 horas se mantiene negativo, se

espera positividad a las 48 o 72 horas. Las placas de Thayer Martin se incuban a 35ºC en
tarro con vela o estufa CO2 5%.
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MICROBIOLÓGICOS
12.1.2. ANALITICO
● Lectura tinción de Gram y análisis de los cultivos:
o Staphylococcus coagulasa negativa y Corynebacterium spp corresponden a

microbiota comensal habitual.
o Otras especies como Streptococcus ß-hemolíticos (A, B u otros), Staphylococcus
aureus, Enterobacterias, bacilos Gram (-) no fermentadores, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenza y Candida spp deben ser informados como
tal.
o Si se observan cocáceas Gram (+) en diplococo y cadena al Gram y colonias ß-
hemolíticas en el cultivo, traspasar a agar granada para detección de
Streptococcus agalactiae. De no contar con este medio se puede realizar
susceptibilidad a Bacitracina, test de CAMP o aglutinación con látex.
o En caso de Streptococcus alfa hemolíticos sembrar en agar bilis-esculina y caldo
sal.
o Frente a sospecha de Levaduras sembrar en cromo-Candida para diagnóstico de
Candida spp.
o Si es un bacilo Gram (-), se le realizan pruebas bioquímicas: TSI, LIA, MIO, Citrato,
Urea.
o Si la bacteria es una cocácea Gram (+) sospechosa de Staphylococcus se realiza
coagulasa.
o Si se observan cocáceas Gram (-) aisladas o en diplococo al Gram junto con
colonias sospechosas de Neisseria al cultivo, realizar identificación por Vitek 2
(tarjeta NH) o API NH según disponibilidad.
o No se realiza estudio en nuestro laboratorio de Ureaplasma urealyticum, o
Mycoplasmas genitales.
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MICROBIOLÓGICOS
13. PROCEDIMIENTO ESTUDIO DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA
OBJETIVO: Estudio activo de portación de microorganismos asociados a infecciones

asociadas a la atención en salud (IAAS).
13.1. ESTUDIO DE PORTACIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE

CARBAPENEMASAS
13.1.1. ANALITICO
• Siembra: En agar cromogénico selectivo indicado en tabla de siembra.
• Incubación: a estufa a 35 °C por 18 a 24 horas.
• Identificación y test de screening: Si la placa tiene desarrollo bacteriano se debe

llevar a cabo el análisis según el agar donde se observa el crecimiento y se
procede al test de screening de carbapenemesas (TEST PARA DETECCIÓN
FENOTIPICA DE CARBAPENEMASAS “BLUE CARBA” o “CARBA NP” según
disponibilidad del laboratorio). Si test positivo, se procede a confirmar con
INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA CONFIRMACIÓN DE CARBAPENEMASAS
e identificación y estudio de susceptibilidad antimicrobiana. Toda carbapenamasa
confirmada debe ser notificada y avisada al servicio correspondiente, IAAS y en
software de Microbiología por el TM a cargo.
Informe y registro de resultados: En sistema informático de microbiología.
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MICROBIOLÓGICOS
13.2. ESTUDIO DE PORTACIÓN DE ENTEROCOCCUS RESISTENTE A

VANCOMICINA ERV
13.2.1. ANALÍTICO
• Siembra: En agar cromogénico selectivo indicado en tabla de siembra.
• Incubación: a estufa a 35 °C por 18 a 24 horas.
• Identificación: Si la placa tiene desarrollo bacteriano se debe llevar a cabo el

análisis según el agar donde se observa el crecimiento y se procede a la
identificación. Si corresponde a E. faecium o E. faecalis se procede con el estudio
de susceptibilidad antimicrobiana.
• Susceptibilidad antimicrobiana: ver Manual de Procedimiento e Informe de

Antibiogramas.
13.3. ESTUDIO DE PORTACIÓN NASAL DE Staphylococcus aureus RESISTENTE

A METICILINA (SARM)
● Tipo de muestra: hisopado nasal.
● Reunir materiales necesarios.
● Rotular tubo con medio Stuart con el nombre completo del paciente, fecha, Servicio
y tipo de estudio (estudio portación SAMR).
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MICROBIOLÓGICOS
● Lavado clínico de manos con jabón antiséptico.
● Uso de elementos de protección personal correspondientes: delantal desechable con

manga, guantes de procedimiento.
● Solicitar al paciente que ponga su cabeza hacia atrás y no se mueva.
● Con una tórula estéril seca, obtener muestra representativa de la fosa nasal anterior y
del vestíbulo nasal.
● Hacer frotis para Gram en portaobjetos.
● Repetir el procedimiento con la tórula del medio transporte y depositar la muestra en

el tubo.
● Enviar inmediatamente a AT Microbiología.
● Retirar elementos de protección personal y realizar lavado clínico de manos con jabón
antiséptico.
● Consideraciones: Trasladar al laboratorio lo antes posible con un máximo de 24

horas a Tº ambiente.
13.3.2. ANALÍTICO
• Siembra: En agar sangre indicado en tabla de siembra.
• Incubación: a estufa a 35°C por 18 a 24 horas.
• Identificación: Si la placa tiene desarrollo sugerente de Staphylococcus aureus

se procede a la identificación. Si corresponde a dicha especie, se procede con el
estudio de susceptibilidad antimicrobiana. Sensibilidad (ver Manual de
Procedimiento e Informe de Antibiogramas).
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MICROBIOLÓGICOS
• Susceptibilidad antimicrobiana: ver Manual de Procedimiento e Informe de

Antibiogramas.
14. PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA
14.1. TEST PARA DETECCIÓN FENOTIPICA DE CARBAPENEMASAS “BLUE

CARBA”
Fundamento: Se basa en un método rápido de identificación de la hidrolisis del anillo

betalactámico de un carbapenémico en presencia de un indicador de pH. Para esto se utiliza las
Diatabs de ROSCO; Imipenem(X2)+Bromothymol Blue. Este método permite realizar lecturas
rápidas en plazo que comprenden de 15 minutos a 1 hora.
Metodología:
● Colocar 400 µL de una solución NaOH 0,9% en un tubo Eppendorf o Khan. Esta solución
debe tener un pH ajustado entre 8-9.
● Agregar la cepa en estudio a partir de un cultivo fresco (<24 horas) en agar sangre
(Solución McFarland 2.0).
● Vortexear durante 1 minuto la solución, para posteriormente incubar a T° ambiente por 30

minutos.
● Volver a Vortexear y separar la solución en 2 tubos con 200 µL cada uno. Agregar en un
tubo la tableta “Test” (Imipenem(X2)+Brthymol Blue) y en el otro una de “Control” y rotular
adecuadamente cada tubo.
● Vortexear cada tubo hasta disolverse la tableta que contiene y posteriormente incubar a
35-37°C. Realizar lecturas a los 15, 30 minutos y a la hora.
● Resultados: Un cambio de color desde azul a amarillo o a un verde amarillento en el tubo

con la tableta Imipenem(X2)+Brthymol Blue, encontrándose el tubo control azul, indican
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MICROBIOLÓGICOS
una reacción positiva, lo cual indica la presencia de cepas productoras de

carbapenemasas.
14.2. TEST PARA DETECCIÓN FENOTÍPICA DE CARBAPENEMASAS RAPIDEC

CARBA NP
Fundamento: La prueba RAPIDEC CARBA NP consiste en un sistema cualitativo para la

detección rápida de bacilos Gram negativos productores de carbapenemasas. Esta técnica se
basa en la detección de hidrólisis del carbapenem por bacterias productoras de carbapenemasa.
La hidrólisis acidifica el medio, lo que provoca un cambio de color en el indicador de pH. Después
de la lisis bacteriana que posibilita la extracción de la enzima, se añade el lisado a una solución
de detección que contiene: carbapenem: imipenem (sustrato de carbapenemasa), rojo de fenol
(indicador de pH), zinc, requerido para la detección de cepas productoras de
metalobetalactamasas. Después de incubar durante un máximo de 2 horas, la lectura se realiza
visualmente, comparando un pocillo de control sin imipenem con un pocillo de reacción que
contenga imipenem.
Realizar a todo microorganismo aislado que presente resistencia a cualquiera de los

carbapenémicos disponibles y un resultado de tamizaje de carbapenemasas positivo.
14.2.2. ANALÍTICO
Materiales:
● 10 tiras de test Carba NP.

● 10 ampollas API de 2 mL.
● 10 tapas de incubación.
● 1 bolsa de bastones para agitar.
● 1 soporte bicolor (blanco y negro)
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MICROBIOLÓGICOS
Metodología (ver figura 1):
● Preparar tira individual del reactivo.
● Abrir una ampolla de API de 2 mL.
● Dispensar 100 mL en pocillos A, B y C.
● Colocar tapa y dejar 4-10 minutos a temperatura

ambiente.
● Resuspender pocillo B con bastones proporcionados en
el kit.
● Colocar cartón de contraste entre pocillos B y C para la

preparación de la turbidez de la muestra.
● Inocular varias colonias de la muestra a analizar en

pocillo C e intentar igualar la turbidez del pocillo B.
Suspensión debe ser homogénea.
● Esperar 30 minutos a temperatura ambiente.
● Después de pasados los 30 minutos dispensar 25 uL del

pocillo C en el pocillo D y E.
● Dispensar 25 uL desde pocillo A (indicador) a pocillos D

y E. Dejar por 30 minutos en estufa de incubación a 35-
37°C con aire ambiental.
● Realizar primera lectura a los 30 minutos. Un cambio de

color del pocillo E de color rojo a amarillo indica un
resultado positivo. Si la muestra sigue negativa volver a
incubar a la misma temperatura por 1 hora y 30 minutos
más.
● Un pocillo E de color rojo indica un resultado negativo.
14.2.3. POSTANALÍTICO
Toda carbapenamasa confirmada debe ser notificada y avisada al servicio

correspondiente, IAAS y en software de Microbiología por el TM a cargo.
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MICROBIOLÓGICOS
14.3. INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA CONFIRMACIÓN DE CARBAPENEMASAS
Procedimiento.
1. Distribuir 5 gotas (150 uL) de tampón de extracción en uno de los microtubos

proporcionados.
2. De un cultivo de agar sólido, extraer 3 colonias con un asa, y suspenderlas en un

microtubo con 150 uL de tampón de extracción.
3. Cerrar microtubo y llevarlo al vortex para homogeneizar. Colonias mucosas deben ser
homogeneizadas durante 3 minutos e incubar 10 minutos a temperatura ambiente antes
de realizar la prueba.
4. Abrir bolsa y sacar dispositivo.
5. Añadir 100 uL del microtubo con la suspensión bacteriana en el pocillo de muestra

marcado con la letra S, la pipeta está marcada con una línea negra que indica un volumen
de 100 uL.
6. Leer resultado a los 15 minutos.
7. Interpretar resultado según la figura.
Figura.
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MICROBIOLÓGICOS
15. PROCEDIMIENTO ESTUDIO MICOLÓGICO (HONGOS)
Este procedimiento se utiliza para confirmar el diagnóstico y etiología en infecciones por agentes
fúngicos. El cultivo se considera como método de diagnóstico más sensible y que es útil también
para la correcta identificación del agente causante de la infección.
Tipos de estudios:
● MICOLÓGICO DIRECTO: Es la observación microscópica de la muestra extendida en

un porta-objeto para la búsqueda de elementos fúngicos. Puede ser al fresco (sin
tinción) o con tinción (Gram, Tinta China, etc.). Ver Procedimiento 4.
● CULTIVO DE HONGOS. Es el crecimiento in vitro de microorganismos fúngicos en

medios de cultivos específicos, lo que permite el aislamiento del agente y su
identificación posterior. Ver Procedimiento 15.3
El cultivo de hongos se realiza solo si la orden médica lo solicita salvo en:
o LCR en que se solicita tinta China siempre sembrar cultivo de hongos.

o Si en la tinción de Gram se observan elementos micóticos sembrar en medio
para hongos.
o LBA se realiza siempre cultivo para hongos.
● ANTIFUNGIGRAMA: estudio de la susceptibilidad in vitro a fármacos antifúngicos.

Este estudio se hace a todas las muestras en que corresponda, independiente si se
solicita o no en la orden médica.
15.1. MICOSIS SUPERFICIAL
Son muestras generalmente obtenidas por raspado.
Son muestras superficiales de: pelo, piel (dermatofitosis o tiña), uñas (onicomicosis), cavidad
oral y micosis genitales. Ver Procedimiento 15.3.
15.2. MICOSIS SISTEMICAS
Son muestras profundas de: sangre (Hemocultivos), LCR, expectoración, lavado bronquial,
biopsia pulmonar y orina. Ver Procedimiento 15.3.
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MICROBIOLÓGICOS
Ver Procedimiento General de Muestras Microbiológicas.
15.3.2. ANALITICA Y POST ANALITICA
El cultivo de hongos es en Agar Sabouraud y agar lactrimel (sujeto a disponibilidad solo

para muestras superficiales) preparado en tubos. El tiempo de incubación es de 14 días
salvo para las muestras de orina y secreciones genitales en que se busca específicamente
levaduras y el tiempo de incubación es de 72 horas.
16. PROCEDIMIENTO V.D.R.L.
Procedimiento utilizado como apoyo de diagnóstico de sífilis. Este procedimiento corresponde a

una técnica semicuantitativa no treponémica, es una reacción antígeno anticuerpo de floculación
en lámina que se realiza en suero calentado e inactivado y en LCR sin calentar. Emplea una
suspensión de antígeno, que se prepara con antígeno V.D.R.L. y una solución amortiguada.
El antígeno es una solución alcohólica incolora que contiene cardiolipina al 0.03%, colesterol al
0.9% y suficiente lecitina purificada para producir una reactividad estándar.
La solución salina amortiguada contiene formaldehido neutro, fosfato disódico, fosfato

monopotásico y cloruro de sodio.
La técnica V.D.R.L. permite el análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras de suero y LCR
para la detección y control de tratamiento de Sífilis.
Los tipos de muestras utilizadas y el procesamiento de estas se describen a continuación.
• SANGRE
Muestra utilizada para medición de la floculación del antígeno cardiolipínico con el suero del
paciente. Para ver procesamiento ir al punto 16.1.1.
• LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO
Esta muestra se utiliza para analizar los pacientes con sospecha de neurosífilis. Para ver
procesamiento ir al punto 16.1.2
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MICROBIOLÓGICOS
16.1.1. SUERO
● PREANALITICO
Reactivos y controles:
● Antígeno: Mantener a Temperatura ambiente. Si se observa precipitado desechar.

● Solución salina amortiguada a pH de 6.0 +/- 0.1: verificar el pH de la solución en caso de
cambios en la reactividad de la prueba.
● Solución salina al 0.9 %
● Solución salina al 10%
● Sueros controles (comerciales): Reactivo, Reactivo débil y No Reactivo.
Materiales:
● Rotor.
● Agujas hipodérmicas sin bisel: usar calibre 18 para reacción en suero y calibre 21 para
reacción en LCR.
● Láminas de vidrio neutro de 2 x 3 pulgadas con 12 anillos de cerámica de 14 mm de
diámetro.
● Jeringas de 1 ó 2 ml (vidrio o plástico).
● Frasco redondo de 35 mm de diámetro, fondo plano, de 30 ml de capacidad y con tapón
de vidrio esmerilado.
● Pipetas serológicas graduadas hasta la punta: 1.0 ml (graduada en 1/100 ml), 5.0 ml
(graduada en 1/10 ml), 10.0 ml (graduada en 1/10 ml)
● Micropipetas con punta desechable de 50 µl.
● Recipientes y desinfectantes para descontaminar.
● Guantes de procedimiento.
● Tubos Khan.
Preparación de la suspensión del antígeno para la reacción con suero: el antígeno y la

solución salina amortiguada deben estar a una temperatura que debe oscilar entre 23º y 29ºC
(óptima 25ºC, temperatura ambiente). Una vez hecho lo anterior, debe proceder como se describe
a continuación:
● Enjuagar previamente con acetona (frasco debe estar seco)
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MICROBIOLÓGICOS
● Depositar 0.4 ml de solución salina con pipeta de 1 ml (medida del 0.2 al 0.6) en el fondo
del frasco (frasco Pyrex redondo de 30 ml con tapa de vidrio y fondo plano). La solución
debe distribuirse uniformemente.
● En 6 seg. añadir gota a gota, 0.5 ml de antígeno (desde la mitad inferior de una pipeta de
1.0 ml) directamente sobre la solución salina, haciendo girar el frasco suave y
continuamente sobre una superficie plana. Agregar la última gota de antígeno de la pipeta,
sin que ésta toque la solución salina y sin dejar de rotar.
● Proseguir la rotación del frasco durante 10 seg.
● Añadir 4.1 ml de solución salina con pipeta de 5.0 ml (del 0.4 al 4.5) dejándola escurrir
libremente.
● Tapar el frasco y agitar de abajo hacia arriba y viceversa, aproximadamente 30 veces en
10 segundos.
Precauciones con la suspensión de antígeno:

● Estabilidad: 8 horas.
● Mantener entre 23º y 29ºC.
● Mezclar suavemente la suspensión de antígeno cada vez que se use.
● Controlar con sueros controles de reactividad conocida, calentados a 56ºC durante 30
min.
● Se distribuye con una jeringa de 1 o 2 ml unida a una aguja despuntada de calibre 18, que
debe dar 60+/- 2 gotas de suspensión de antígeno por ml, cuando la jeringa y la aguja
están sostenidas verticalmente.
● Este volumen alcanza para alrededor de 180 reacciones.
Preparación de los sueros:

● Numerar en orden correlativo cada paciente inscrito en las listas.
● Revisar que los nombres de los tubos coincidan con los de las listas y dar el número
correspondiente a cada tubo con etiqueta adhesiva.
● Colocar los tubos numerados en las gradillas.
● Desprender coagulo evitar hemólisis.
● Tarar los tubos en balanza granataria o balanza digital.
● Centrifugar las muestras 5 min a 2500 rpm.
● Transferir los sueros a tubos limpios y secos, descartando los que estén hemolizados,
quilosos o contaminados y rotular.
● Calentar el suero por 30 min en baño María a 56º C antes de analizarlos. Al sacar del
baño, volver a centrifugar los que tengan restos visibles de partículas.
● Si no se analizan dentro de 4 horas, deben volver a calentarse a 56ºC durante 10 min.
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MICROBIOLÓGICOS
● Al momento de la prueba los sueros deben estar a temperatura ambiente.
Preparación del Rotor: Preparar el rotor a +/- 180 r.p.m., esto es 45 vueltas en 15 seg. y fijar el
reloj en 4 min.
Calibración de la aguja: La aguja de 18 (despuntada) debe dispensar 60+/- 2 gotas por ml. Se
debe controlar diariamente.
● ANALITICO
Reacción cualitativa de V.D.R.L. en lámina con suero: la reacción debe realizarse a

temperatura ambiente entre 23º y 29ºC (óptimo 25ºC):
● Depositar 50 µl de suero inactivado y a temperatura ambiente en un pocillo de la lámina y

esparcirlo por toda la superficie.
● Añadir 1 gota de antígeno (1/60) a cada suero con jeringa de vidrio unida a aguja calibre
18.
● Agitar la lámina durante 4 min en rotor a 180 rpm.
● Inmediatamente después de la agitación, leer las reacciones al microscopio con aumento
10X y anotar los resultados en la forma siguiente:
o Grumos medianos y grandes: Reactivo (R)
o Grumos pequeños: Reactivo débil (Rd)
o Sin grumos: No reactivo (NR)
o Ligera rugosidad: NR (rugoso)
● NOTA: Ocasionalmente un exceso de componente reactivo puede producir grumos

grandes y/o pequeños entremezclados con partículas libres de antígeno (Reacción Zonal).
Se debe informar como reactiva (este efecto zonal puede ser tan pronunciado que llega a
producir un resultado Reactivo débil o No Reactivo.
Reacción cuantitativa de V.D.R.L. en lámina con suero:
● Disponer de todos los sueros que den resultado Reactivo, Reactivo débil o No Reactivo
rugoso para su preparación de análisis cuantitativo en otra gradilla.
● Las diluciones de sueros que se analizan son: sin diluir (1:1), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64, 1:128, 1:256, o más, hasta obtener un resultado no reactivo.
● Depositar 50ul del suero del paciente en los pocillos de las láminas preparadas para la
reacción.
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MICROBIOLÓGICOS
● Añadir 50ul de suero fisiológico 0,9% en el pocillo que le continúa hacia debajo de la
lámina y en el subsiguiente.
● Depositar 50ul de suero del paciente en el primer pocillo con 50ul de suero fisiológico,
mezclar por aspiración ocho veces con la pipeta automática, evitando la formación de
burbujas y transferir 50ul de esta mezcla al siguiente pocillo con 50ul de suero fisiológico
y mezclar ocho veces de igual forma como se explicó anteriormente. Descartar los últimos
50ul.
● Añadir 1 gota de la suspensión de antígeno a cada pocillo con jeringa unida a aguja calibre
18G.
● Completar la reacción del mismo modo para la reacción cualitativa de VDRL en suero
(agitar las láminas x 4 min. en rotor).
● Colocar 0,7 ml de solución salina al 0.9% delante de cada suero en que las diluciones
analizadas dieron resultados reactivos, o reactivo débil en la dilución al 1:4.
● Preparar una dilución de 1:8 con cada uno de estos sueros agregando 0.1 ml de suero del
paciente a los 0.7 ml de solución salina al 0.9 %, mezclar bien.
● Repetir proceso de cuantificación detallado anteriormente.
● Repetir este procedimiento hasta que las muestras sean no reactivas.
● POSTANALITICO
Informe de resultados: anote los resultados en términos de la mayor dilución del suero que dé
un resultado reactivo y reactivo débil.
Diluciones del suero Informe

S/diluir (1:1) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
R Rd - - - - Reactivo sin diluir
R R Rd - - - R. en dilución 1:2
R R R Rd - - R. en dilución 1:4
Rd R R R Rd - R. en dilución 1:8
NR (rugoso) Rd R R R - R. en dilución 1:16
Rd - - - - - Reactivo débil
R R - - - - R. en dilución 1:2
R: Reactivo, Rd: Reactivo débil, NR: No reactivo
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MICROBIOLÓGICOS
DILUCIÓN EN SUERO. INFORME.
16.1.2. V.D.R.L. EN LÁMINA CON LCR
Las muestras de LCR se centrifugan y se analizan sin calentamiento previo. Muestras

visiblemente contaminadas se descartan.
● PREANALITICO
Suspensión de antígeno sensibilizada:

● A partir del antígeno usado para la técnica de VDRL en suero, diluir a la mitad con solución
salina al 10%.
● Mezclar por rotación suave del frasco o por inversión del tubo.
Precauciones con la solución de antígeno sensibilizada:

● Dejar en reposo por lo menos 5 minutos
● Estabilidad 2 horas.
● Mantener a T° ambiente entre 23° y 29°C.
● Distribuir con jeringa de 1 o 2 ml unida a una aguja despuntada de calibre 21G.
Prueba preliminar de la suspensión de antígeno sensibilizada:

● A partir del suero control Reactivo comercial marca BD difco, preparar diluciones
seriadas:
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MICROBIOLÓGICOS
o A 0.5 ml de suero control Reactivo, añadir 0.5 ml de suero fisiológico (Dilución

1:1).
o Mezclar 8 a 10 veces evitando la formación de espuma.
o Tomar 0.5 ml de esta dilución y pasarlo a otro tubo que contiene 0.5 ml de
suero fisiológico (Dilución 1:2).
o Repetir este procedimiento en cinco tubos que contienen cada uno 0.5 ml de
suero fisiológico, con lo que se obtienen las diluciones 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 y
1:64.
o Analizar las diluciones del suero control como está descrito en “Reacción
Cualitativa en lámina con LCR”.
Calibración de la aguja: la aguja calibre 21G (despuntada) debe dispensar 100 +/- 2 gotas por
ml. Se debe controlar diariamente.
● ANALITICO
Reacción cualitativa de V.D.R.L. en lámina con LCR: La reacción debe realizarse a

temperatura ambiente entre 23º y 29ºC (óptimo 25ºC):
● Depositar 50 µl de LCR en un pocillo de la lámina.

● Agitar suavemente la suspensión de antígeno con jeringa de vidrio unida a aguja calibre
21 o 22, añadir 1 gota (10 ul) de antígeno.
● Agitar la lámina durante 8 min. en rotor a 180 rpm.
● Inmediatamente después de la agitación, leer las reacciones al microscopio con aumento
100x.
● Anotar los resultados en la forma siguiente:
o Grumos definidos: Reactivo (R)
o Sin grumos o con ligera rugosidad: No reactivo (NR)
Reacción cuantitativa de V.D.R.L. en lámina con LCR:
● Ver procedimiento N° 19.4.2. Recordar que para LCR se debe utilizar antígeno diluido en
partes igual con suero al 10%.
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MICROBIOLÓGICOS
● POSTANALITICO
Informe de resultados: Analizar cada LCR diluido según técnica cualitativa en lámina para
VDRL. Informe de resultado considerando la mayor dilución del LCR que de un resultado (ver
tabla de diluciones).
17. MHA-Tp
17.1. PROCEDIMIENTO PREANALÍTICO
• La recolección de las muestras se realiza en los servicios autorizados, según el Manual de

Toma de Muestras (APL 1.2).
• Las muestras son recepcionadas en el AT de Microbiología, donde son revisadas por si se

presentara alguna causa de rechazo, descritas en el Manual de Toma de Muestras (APL 1.2).
En el caso de este estudio, se deben rechazar pacientes con historial de MHA-Tp reactivo.
• Antes de comenzar a trabajar las muestras, se deben contar con todos los elementos de
protección personal.
• Seguir indicaciones según ANEXO 3 y MIC-DE-03.
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
Materiales
● Tubos de vidrio Khan.

● Placas de microtitulación con fondo en U.
● Soporte con espejo de aumento para lectura del fondo de los pocillos.
Reactivos
● Kit de MHA-Tp.
● Reactivo antígeno: Suspensión de eritrocitos de pollo sensibilizados.
● Reactivo Control: Suspensión de eritrocitos de pollo no sensibilizados.
● Solución diluyente: Tampón fosfato salino que contiene componentes solubles de
Treponema Reiter y agentes estabilizadores.
● Control positivo: Suero de conejo inmune.
● Control negativo: Suero de conejo no inmune.
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MICROBIOLÓGICOS
Equipos
● Centrífuga.
● Micropipetas automáticas.
● Refrigerador (2-8ºC).
● Freezer para -20ºC.
● Verificar que las muestras tengan un volumen adecuado, estén libres de hemólisis,
lipemia y/o contaminación, condiciones que constituyen causal de rechazo.
● Centrifugar a 2.500 rpm por 5 minutos para separar el suero y rotular el tubo primario, o
secundario si sólo se dispone de una muestra del paciente y es necesario alicuotar para
MHA-Tp.
● Congelar las muestras a -20°C hasta su procesamiento
● Pegar las etiquetas de cada paciente en la hoja de trabajo de MHA-Tp
17.2. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
Preparación.
● Permitir que los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente antes de su uso.
● Mezclar adecuadamente la suspensión de eritrocitos antes de su uso.
● Para cada muestra se requieren 3 pocillos de la placa.
● Para cada control se requieren 2 pocillos de la placa.
Procesamiento.
El procedimiento indicado aplica para cada muestra a analizar.
Muestra.
● Pipetear 190 uL de diluyente en el pocillo n°1 de la placa.

● Agregar 10 uL del suero del paciente en el pocillo n°1 y mezclar.
● Transferir 25 uL desde el pocillo n°1 al pocillo n°2 y al pocillo n°3.
Control.
● Pipetear 25 uL de control positivo en sus pocillos correspondientes.

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MICROBIOLÓGICOS
● Pipetearl 25 uL de control negativo en sus pocillos correspondientes.
Ejecución del examen.
● Agregar 75 uL de eritrocitos control al pocillo n°2 de la muestra.

● Agregar 75 uL de eritrocitos sensibilizados al pocillo n°3 de la muestra.
Incubación.
● Mezclar por 1-2 minutos agitando gentilmente la placa en un movimiento orbital. Tener
cuidado de no contaminar el contenido de los pocillos.
● Cubrir la placa para evitar evaporación y dejarla por 45-60 minutos en una superficie
horizontal a temperatura ambiente sin riesgo de vibración y alejada de luz solar.
17.3. PROCEDIMIENTO POSTANALÍTICO
Resultados e interpretación
Los resultados se leen sobre un contraste blanco o con un espejo para placas de
microtitulación. Deben interpretarse en comparación a los controles.
Un suero positivo reacciona con los eritrocitos sensibilizados, pero no reacciona con los
eritrocitos control.
Tabla 1.
Lectura e interpretación de resultados de prueba de hemaglutinación
Grado de hemaglutinación Lectura Resultado
Tapiz homogéneo de células cubriendo totalmente el fondo del +++/+++++ Reactivo

pocillo
Tapiz homogéneo más pequeño, margen arrugado o un centro ++/+++ Reactivo

claro rodeado de un anillo rojo
Anillo rojo de células con un centro claro que es más grande que el + Reactivo
control
Botón de células con una pequeña abertura central +/- Borderline
Botón con un borde definido - Negativo

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MICROBIOLÓGICOS
Los resultados Borderline deben repetirse y si dan igual, se informa No Reactivo.
Control de calidad
Referirse al Instructivo de Control de Calidad Interno (MIC-IT-52).
18. CULTIVO DE ANAEROBIOS
Este procedimiento se utiliza para confirmar diagnóstico y etiología de infecciones por bacterias
anaerobias. El cultivo de bacterias anaerobias permite el crecimiento e identificación de aquellas
bacterias que se desarrollan sólo en ausencia de oxígeno, a partir de una muestra clínica que
cumpla con los requisitos exigidos en su obtención.
18.1. PREANALITICO
Tipo de muestra: se consideran muestras aceptables para estudio de anaerobios: líquidos,

pus, trozos de tejido y secreciones no contaminadas con flora comensal:
● TRACTO RESPIRATORIO: Aspirado sinusal, pulmonar, pleural, biopsia. NO SE

ESTUDIA EXPECTORACION.
● TRACTO URINARIO: Aspiración por punción suprapúbica. NO SE ESTUDIA ORINA

EMITIDA.
● TRACTO GENITAL: Aspirado del Douglas y endometrial con catéter protegido. NO SE

ESTUDIA LOQUIO NI FLUJO VAGINAL.
● TRACTO DIGESTIVO: Punción y aspiración de abscesos intrabdominales (hepático,

pancreático, subfrénico, etc.) en forma intraoperatoria o percutánea. NO SE ESTUDIAN
ANAEROBIOS EN MUESTRAS DE DEPOSICIÓN O CONTENIDO INTESTINAL.
Recolección de la muestra:
● Punción y aspiración con técnica aséptica, descartando el aire. Enviar de inmediato en la

misma jeringa en horas de funcionamiento del laboratorio.
● Sólo se procesarán muestras en jeringa tapada de colecciones o líquidos estériles,
muestras de tejidos o biopsias, LCR en casos justificados.
Siembra de la muestra: Sembrar en placa de agar sangre aerobio y anaerobio (según

disponibilidad) y en caldo tioglicolato regenerado (hervido por 10 min y enfriado rápidamente).
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MICROBIOLÓGICOS
Extender finalmente muestra en portaobjetos para Gram. Colocar placa anaerobia en el

contenedor o jarra anaerobia.
Incubación: las placas se incubarán a 35ºC en anaerobiosis utilizando:
● Bolsa hermética Anaerocult® (2 placas por bolsa) o en jarra de anaerobiosis.

● Generador de anaerobiosis.
● Cada bolsa o jarra debe tener un indicador de anaerobiosis.
● Recordar rotular la bolsa o jarra con la fecha de inicio de la incubación.
● El tiempo de incubación es 7 días antes de informar el cultivo como negativo.
● La observación de las bolsas o jarra será cada 48 a 72 horas.
● No abrir las bolsas o jarras si no se observa crecimiento.
18.2. ANALITICO
Identificación: la identificación de las colonias será realizará utilizando la morfología y Gram

característicos más el uso de tarjeta Vitek2 ANC.
18.3. POSTANALITICO
Informe y registro de resultados: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS.
Plazo entrega del informe: hasta 10 días.
19. PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE CRYPTOCOCCUS SP. (“CrAg

Lateral Flow Assay”)
El examen detecta antígenos polisacáridos capsulares de Cryptococcus species complex

(Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii), hongo oportunista que afecta principalmente a
personas con alteración de la inmunidad celular, pudiendo presentarse como enfermedades
respiratorias y enfermedades diseminadas.
.
Tipo de muestra: LCR, Suero.
19.1. PREANALITICO
ES RESPONSABILIDAD DEL TÉCNICO PARAMÉDICO: Recepción de la muestra.
ES RESPONSABILIDAD DEL TM: Procesamiento de la muestra.
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MICROBIOLÓGICOS
19.2. ANALITICO
PROCEDIMIENTO CUALITATIVO:
● Añadir 1 gota de LF diluyente (REF GLF025) a un depósito apropiado (tubo eppendorf,

etc).
● Agregar 40 ul de la muestra al tubo que contiene la gota de LF diluyente (REF GLF025) y
homogenizar.
● Sumergir el extremo blanco de una tira de prueba de antígeno de Cryptococcus (REF
LFCR50) dentro del tubo que contiene la muestra a ensayar.
● Esperar 10 min.
● Leer y registrar el resultado.
INTERPRETACION:
● POSITIVO: Aparición de ambas líneas (C y T), en caso de ser un procedimiento

semicuantitativo el título del paciente debe ser informado con la mayor dilución presente.
● NEGATIVO: Aparición de 1 línea en C.
● INVÁLIDO: Ninguna aparición de líneas o aparición de 1 línea en T.
19.3. POSTANALITICO
Informe de resultados: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS.
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MICROBIOLÓGICOS
20. PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Y LEGIONELLA

PNEUMOPHILA
GENERALIDADES
El inmunoensayo fluorescente (Fluorescent Immunoassay, FIA) para S. pneumoniae del sistema

Sofia emplea inmunofluorescencia para la detección cualitativa del antígeno de Streptococcus
pneumoniae en muestras de orina de pacientes con neumonía y en muestras de líquido
cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con meningitis. Los resultados de la prueba están pensados
para usarse como ayuda en el diagnóstico de la neumonía neumocócica y la meningitis
neumocócica. Un resultado negativo no excluye infecciones con Streptococcus pneumoniae. Los
resultados de la prueba están pensados para utilizarse de forma conjunta con información
obtenida en la evaluación clínica del paciente y otros procedimientos diagnósticos.
• TIPO DE MUESTRA Y ESTABILIDAD
o Muestras de orina
Las muestras de orina se deben recoger en recipientes para muestras estándares. Es

posible que se utilice ácido bórico como conservante. Si las muestras no se pueden
analizar pronto tras su obtención, pueden conservarse a temperatura ambiente (de 15 °C
a 30 °C) y analizarse en las 24 horas siguientes a su obtención. Alternativamente, las
muestras se pueden refrigerar a una temperatura de 2°C a 8°C o congelar a –20 °C y
analizarse en cualquier momento hasta pasados 15 días. Asegúrese de descongelar por
completo las muestras antes de analizarlas.
o Muestras de Líquido Cefalorraquídeo
Las muestras de líquido cefalorraquídeo se deben recoger en recipientes para muestras

estándares. Si las muestras no se pueden analizar pronto tras su obtención, pueden
conservarse a temperatura ambiente (de 15 °C a 30 °C) y analizarse en las 24 horas
siguientes a su obtención. Alternativamente, las muestras se pueden refrigerar a una
temperatura de 2 °C a 8 °C y analizarse en cualquier momento hasta pasados 7 días.
20.1. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO

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MICROBIOLÓGICOS
1) Verifique que el sistema Sofia 2 está configurado en el modo deseado: Lectura inmediata
o diferida.
2) Llene la pipeta de volumen fijo pequeña y transparente de 120 μl suministrada con la
muestra de orina o LCR del paciente.
Para llenar la pipeta de volumen fijo con la muestra

del paciente:
a. Apriete FIRMEMENTE la perilla superior.

b. Mientras sigue apretando, coloque la punta de
la pipeta en la muestra.
c. Con la punta de la pipeta en la muestra líquida,
suelte la perilla para llenar la pipeta.
3) Apriete firmemente la perilla superior para vaciar el contenido de la pipeta de volumen fijo
en el pocillo de muestra del casete de prueba. Es aceptable que haya líquido adicional
en la perilla de desborde.
NOTA: la pipeta de volumen fijo se ha diseñado para recoger y

dispensar la cantidad correcta de muestra líquida. Deseche la pipeta
con sus residuos de riesgos biológicos.
4) Ingresar el casete de reacción en el Equipo Sofia 2. Incubar 10 minutos a temperatura

ambiente si se selecciona el modo de lectura inmediata.
PRINCIPIO: Este método diagnóstico consiste en una inmunoflourescencia de flujo lateral

(fluoroinmunoanálisis, FIA), basados en cassette cuya lectura se hace en un analizador
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MICROBIOLÓGICOS
automático (equipo Sofia®). Se basa en una reacción antígeno (muestra)-anticuerpo (cassete

diagnóstico), la cual se puede realizar desde muestras de hisopado nasofaríngeo, aspirado
nasofaríngeo o muestras de LBA.
El Sistema Sofia Influenza A+B emplea un kit de inmunofluorescencia para detectar antígenos de
nucleoproteína viral de influenza A y B en muestras de hisopado nasofaríngeo desde pacientes
sintomáticos. Este sistema de tipo cualitativo está diseñado para entregar un diagnóstico
diferencial rápido en cuadros agudos de infecciones virales por Influenza A y B.
MANEJO DEL EQUIPO:
1) Encender y apagar.
● Encendido:
● Encienda el sistema Sofia 2 mediante el interruptor de alimentación situado en
el panel trasero.
● El sistema Sofia 2 mostrará la pantalla de progreso del encendido y realizará

una prueba automática de encendido. Cuando el encendido se haya
completado, el sistema Sofia 2 mostrará la pantalla Ejecutar prueba (ver
imagen) y estará listo para su uso.
● Apagado: Apague la unidad manteniendo pulsado el interruptor de alimentación en la

parte posterior de la unidad. El apagado se ha completado cuando la pantalla se
apaga.
2) Condiciones ambientales.
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MICROBIOLÓGICOS
El almacenamiento del kit es a temperatura ambiente (De 15°C a 30°C), a cubierto de la luz solar.
Los contenidos del kit son estables hasta la fecha de expiración impresa en el exterior de la caja.
No refrigerar.
Las muestras deben ser procesadas tan pronto fueron tomadas. En caso de ser requerido
transporte, pueden ser usados medios como solución salina (hasta 4 horas a temperatura
ambiente) o MTU (hasta 72 horas a temperatura ambiente).
3) Procesamiento de muestras.
Para iniciar el procesamiento de muestras en el equipo, en la pantalla del equipo hay que
presionar el botón “Run Test” como aparece en la imagen.
Luego, se debe introducir el ID del usuario y de la muestra a analizar (con el lector de código de
barras).
Posteriormente se debe elegir el modo de desarrollo deseado, entre las opciones “WALK AWAY”
o “READ NOW”.
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MICROBIOLÓGICOS
● Modo WALK AWAY: Este modo es útil cuando se está analizando una única
muestra. En este modo, el usuario dispensa la muestra del paciente dentro del casete
de prueba y, luego, introduce el casete inmediatamente en el sistema Sofia 2. El
sistema Sofia 2 permitirá automáticamente que el casete de prueba proceda al
desarrollo durante el tiempo necesario (resultado en 15 minutos), leerá el casete,
analizará e interpretará los datos y mostrará el resultado de la prueba de forma
automática y objetiva.
● Modo READ NOW: Este modo es útil cuando se está procesando un gran número
de muestras. El usuario dispensa la muestra del paciente dentro del casete de prueba.
Luego, el usuario cronometra manualmente el período de desarrollo fuera del sistema
Sofia 2. Esto puede realizarse encima del mostrador o la mesa con la ayuda de un
cronómetro (incubación de 15 minutos, con resultado en Sofia 2 en 1 minuto).
4) Calibración.
El proceso de calibración del Equipo Sofia 2 se debe realizar cada 15 días. Este procedimiento
corrobora los sistemas ópticos y de cálculo con un cassette especifico. Este cassette es
suministrado con el equipo.
El procedimiento para iniciar la calibración es:
● Para iniciar, en la pantalla del equipo, se debe seleccionar la opción “run calibration”.
● Siguiendo las indicaciones dadas por el equipo, insertar el cassette de calibración en el
equipo. Sofia 2 realizara el proceso de calibración automáticamente pasado 1 minuto, sin
necesidad que el usuario realice otras indicaciones.
5) Control de calidad.
El control de calidad se realizará cada vez que se haga cambio de lote de reactivos. Para esto se
utilizarán torulas positivas y negativas como control. El procedimiento se debe realizar igual al de
una torula sin suero fisiológico.
20.2. POSTANALITICO
Informe de resultados: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS
21. PROCEDIMIENTO DE PANEL MOLECULAR (FILMARRAY)
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MICROBIOLÓGICOS
OBJETIVO: Técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) múltiple para el diagnóstico in

vitro de diversos patógenos de interés clínico. Esta prueba se realiza de forma directa sobre
muestras clínicas obtenidas de pacientes. Esta técnica se realiza a través del uso de un cartucho
que cuenta con todos los reactivos necesarios para la preparación de la muestra, reacción de
PCR y la detección a fin de aislar y detectar diversos patógenos y genes de resistencia, según el
tipo de tarjeta.
Actualmente existen 5 paneles disponibles, dependiendo del tipo de muestra suministrada para
su análisis, encontrándose los paneles BioFire Blood Culture Identification 2 (BCID 2), FilmArray
Panel Pneumia, FilmArray Panel Meningitis, FilmArray Panel Gastrointestinal y FilmArray Panel
Respiratorio.
• PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA
ES DEBER DEL TM DE MICROBIOLOGÍA el procesamiento íntegro de este tipo de

muestras.
21.1. PREANALÍTICO
1. Paso 1: Preparación del cartucho:

1.1. Limpie cuidadosamente la zona de trabajo y la estación de carga de cartuchos con cloro
al 10% o algún desinfectante adecuado.
1.2. Extraiga el cartucho de su envase sellado al vacío.
1.3. Comprobar fecha de caducidad del cartucho.
1.4. Deslice el cartucho en la estación de carga de forma que las etiquetas rojo y azul están
alineadas con las flechas del mismo color en la estación de carga.
1.5. Coloque el vial de inyección de muestra, con tapón rojo, en la estación de carga.
1.6. Coloque el vial de inyección de hidratación, con tapón de color azul, en la estación de
carga.
2. Paso 2: Hidratación del cartucho:

2.1. Desenrosque el vial de inyección de hidratación del tapón azul.
2.2. Retire el vial de hidratación, dejando el tapón azul en la zona de carga.
2.3. Introduzca la punta de la cánula del vial de inyección de hidratación en el puerto de
hidratación del cartucho, ubicado justo debajo de la zona azul de la estación de carga.
2.4. Presione hacia abajo energéticamente con un movimiento firme y rápido para perforar el
sello hasta que se sienta un ruido y disminuya la resistencia, y compruebe que los pocillos
del cartucho hayan quedado hidratados.
3. Paso 3: Preparación de la muestra:

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MICROBIOLÓGICOS
3.1. Incorpore el tampón de la muestra (Dosificador rojo) en el vial de inyección de la muestra

3.2. Para esto presione firmemente la pestaña con textura de plástico hasta que se rompa el
precinto y vierta el contenido apretando lentamente y con fuerza.
3.3. El siguiente paso varía según el casete de FilmArray utilizado por el usuario.
3.3.1. FilmArray Sepsis (BCID 2):

3.3.1.1. Mezcle bien el frasco de hemocultivo positivo invirtiéndolo varias veces.
3.3.1.2. Humedezca el septo del frasco con alcohol y espere a que se seque.
3.3.1.3. Con una jeringa extraiga 0,2 mL de muestra del hemocultivo a través del
septo del frasco, intentado que no se formen burbujas.
3.3.1.4. Añade la muestra directamente en el vial de muestra. Deseche la jeringa
adecuadamente en un recipiente para elementos cortopunzantes con riesgo
biológico y cierre bien la tapa del vial de muestra.
3.3.1.5. Retire el vial de muestra de la estación de trabajo y invierta suavemente al
menos unas 3 veces.
3.3.1.6. Vuelva a poner el vial de muestra en la zona roja de la estación de muestra.
3.3.2. FilmArray Pneumonia:

3.3.2.1. Con el hisopo de muestra que se proporciona en el kit de reactivos, agite
cuidadosamente la muestra de Lavado Broncoalveolar (BAL) o esputo durante uno
10 segundos.
3.3.2.2. Introduzca el hisopo de muestra en el vial de muestra y luego rompa el
mango del hisopo, en la zona de ruptura.
3.3.2.3. Cierre bien el vial de muestra y deseche el extremo del hisopo en el
contenedor adecuado.
menos unas 3 veces.
3.3.3. FilmArray Meningitis:

3.3.3.1. Homogenice adecuadamente la muestra del paciente. Utilizando la pipeta
de transferencia proporcionada en el kit de prueba, extraiga muestra de líquido
cefalorraquídeo (LCR) hasta la segunda línea (aproximadamente 0,2 mL) de la
pipeta de transferencia.
3.3.3.2. Agregue la muestra al Tampón para muestra que está dentro del vial de
inyección de muestra.
menos unas 3 veces.
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MICROBIOLÓGICOS
3.3.4. FilmArray Gastrointestinal:

3.3.4.1. Homogenice adecuadamente la muestra del paciente. Utilizando la pipeta
de transferencia proporcionada en el kit de prueba, extraiga muestra de líquido
cefalorraquídeo (LCR) hasta la segunda línea (aproximadamente 0,2 mL) de la
pipeta de transferencia.
3.3.4.2. Agregue la muestra al Tampón para muestra que está dentro del vial de
inyección de muestra.
menos unas 3 veces.
4. Paso 4: Análisis del cartucho:

4.1. Compruebe que el ordenador y los módulos BioFire están encendidos, y que el software
BioFire se ha iniciado adecuadamente.
4.2. Seleccione un módulo disponible.
4.3. Escanee el código de barras del cartucho BioFire mediante el lector de código de barras.
Los datos de identificación del cartucho (Lot Number [Número de lote], Serial Number
[Número de serie]), Pouch Type (Tipo de cartucho) y Protocol (Protocolo) están
preprogramados en el código de barras que se encuentra en el cartucho BioFire y se
introducirán automáticamente al escanear el código de barras. Si no es posible escanear
el código de barras, el Pouch Lot Number (Número de lote del cartucho), el Serial Number
(Número de serie), el Pouch Type (Tipo de cartucho) y el Protocol (Protocolo) del cartucho
se pueden introducir manualmente a partir de la información proporcionada en la etiqueta
del cartucho. Para reducir los errores de introducción de datos, se recomienda
encarecidamente que la información del cartucho se introduzca escaneando el código de
barras.
4.4. Introduzca la Sample ID (ID de la muestra). La Sample ID (ID de la muestra) se puede
introducir manualmente, o bien escanearse mediante el lector de código de barras si se
utiliza una Sample ID (ID de la muestra) con código de barras.
4.5. Si es necesario, seleccione y/o confirme un protocolo en la lista desplegable Protocol
(Protocolo). En el caso del panel FilmArray Pneumonia en este paso se deberá elegir entre
el protocolo BAL o SPUTUM, según el tipo de muestra utilizado.
4.6. Introduzca el cartucho BioFire en el instrumento, con el código azul hacia el interior (Como
se muestra en el diagrama en pantalla del equipo.
4.7. Introduzca un nombre de usuario y una contraseña en los campos Name (Nombre) y
Password (Contraseña).
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MICROBIOLÓGICOS
4.8. Haga clic en el botón Start Run (Iniciar análisis) de la pantalla. Tras iniciarse la prueba, la
pantalla muestra una lista de los pasos que el instrumento está llevando a cabo y el
número de minutos que faltan para finalizar la prueba.
4.9. Tras finalizar la prueba, los resultados se muestran automáticamente en la sección de
informe de la pantalla. El informe se guarda automáticamente en la base de datos
4.10. Finalmente retire el cartucho que ha sido arrojado hacia el exterior y proceda a
eliminar inmediatamente el cartucho en un recipiente para materiales con riesgo biológico.
21.2. ANALITICO
La obtención de los resultados para cartucho dependerá del resultado de los controles internos
suministrados en esta técnica, los cuales corresponden a dos tipos:
1. RNA Process Control (Control de proceso de ARN): La prueba RNA Process Control
(Control de proceso de ARN) tiene como blanco un transcripto de ARN procedente de la
levadura Schizosaccharomyces pombe. La levadura se encuentra en el cartucho en forma
liofilizada y se rehidrata cuando se carga la muestra. El material de control experimenta
todas las etapas del proceso de la prueba, incluyendo la lisis, la purificación del ácido
nucleico, transcripción inversa, la 1a etapa de la PCR, la dilución, la 2a etapa de la PCR
y la fusión del ADN. Un resultado de control positivo indica que todos los pasos realizados
en el cartucho fueron correctos.
2. PCR2 Control (Control PCR2): La prueba PCR2 Control (Control PCR2) detecta un ADN
diana que está liofilizado en los pocillos de la matriz junto con sus correspondientes
cebadores. Un resultado positivo indica que la 2a etapa de la PCR fue correcta
Ambas pruebas de control deben ser positivas para que el análisis se considere aprobado. Si uno
de los controles no es correcto, el campo Controls (Controles) del informe de la prueba (esquina
superior derecha) mostrará el mensaje Failed (No aprobado) y todos los resultados se mostrarán
como Invalid (No válido). Si hay un fallo en los controles, la muestra se debe volver a analizar en
un cartucho nuevo.
21.3. POST ANALITICO
● Informe y registro de resultados: Informar el resultado definitivo en el software de

microbiología (Validación): Estos resultados traspasan automáticamente del equipo
BIOFIRE. Igualmente ocurre un traspaso automático al momento de ser validados en
REAL al sistema SYSLAB para su visualización en sala.
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MICROBIOLÓGICOS
● Resultados: El análisis recabado por esta técnica en caso de ser un análisis cualitativo
aparecerá como DETECTADO de haber sido pesquisado o como NO DETECTADO en
caso de no haber amplificación para el analito en cuestión. En caso de corresponder a un
análisis semicuantitativo, se informará como DETECTADO junto con el valor de BIN
(Copias/mL) en caso de existir pesquisa de algun patógeno, y como NO DETECTADO en
caso de no haber amplificación.
● Plazo entrega de resultados: 4 hrs. desde la recepción del examen en el laboratorio.
22. MICRODILUCION EN CALDO PARA DETERMINACIÓN DE SUSCEPTIBILIDAD A

COLISTIN
FUNDAMENTO: El colistin está siendo recuperada como opción terapéutica para el tratamiento
de infecciones graves producidas por microorganismos multirresistentes, tales como
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Enterobacterias resistentes a los
carbapenémicos. No obstante, se conoce la existencia de cepas resistentes al colistin lo que hace
necesario determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) antes de que el fármaco sea
empleado. Se han desarrollado diferentes test comerciales para este fin, basados en diferentes
técnicas, pero actualmente la microdilución en caldo se considera la técnica más adecuada para
determinar la sensibilidad frente a la colistin.
22.1. ANALITICO
METODO:
● Retire un panel de su envoltorio y déjelo a temperatura ambiente durante 10 min, NO TIRE
EL ENVOLTORIO hasta que haya agotado los 4 tests.
● Prepare una suspensión del microorganismo a ensayar, directamente a partir de colonia
o mediante crecimiento en caldo.
● Ajuste la suspensión a una densidad McFarland 0.5.
● Antes de 15 minutos, diluya 1:20 la suspensión estandarizada en salino; Esta será la
Solución A.
● Añada 0.4 ml de la solución A al tubo de MH II Broth proporcionado, para obtener la
Solución B.
● Dispense 100 μl de la solución B en cada uno de los pocillos de una fila.
● Cubra el panel con la tapa proporcionada e incúbelo en atmósfera aerobia a 36 ± 2 °C
durante 16-20 horas
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MICROBIOLÓGICOS
RESULTADOS: Tras la incubación, observe el crecimiento en los pocillos y registrar el valor CMI
de la menor concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible. La lectura visual
se ve facilitada mediante el uso de luz indirecta y fondo oscuro. El crecimiento se manifiesta como
turbidez o como un botón en el fondo del pocillo (Compare con el pocillo control) Lea primero el
pocillo control y asegúrese de que hay crecimiento. En caso contrario compruebe la viabilidad del
cultivo empleado para preparar el test y repita con un cultivo fresco. El valor de CMI obtenido
debe ser interpretado de acuerdo a los criterios EUCAST o CLSI en vigor (Consultar manual de
informe de antibiograma).
22.2. POSTANALITICO
Informe de resultados: ver procedimiento GENERAL DE MUESTRAS

MICROBIOLÓGICAS
23. PROCEDIMIENTO DE NOTIFICACIÓN DE AGENTES DE ENFERMEDADES DE

NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA (ENO)
Este procedimiento se realiza para cumplir con el Decreto Supremo N° 158/04 que establece la
obligación de notificar los agentes aislados, ya sean sospechosos o confirmados de las
enfermedades definidas como ENO en dicho decreto.
23.1. RESPONSABLES
● Médicos Microbiólogos.
● Tecnólogos Médicos del Laboratorio de Microbiología.
23.2. PROCEDIMIENTO
Frente a los siguientes agentes aislados se notificará de INMEDIATO, telefónicamente:
● Al médico tratante, sala correspondiente.
● Epidemiología del Área: 25753001
● Oficina de IAAS: 25754732
● SEREMI de Salud: 26384691 - 09-2323666
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MICROBIOLÓGICOS
Se enviará simultáneamente informe escrito del resultado microbiológico con los datos de Nombre
del paciente, Rut, Procedencia y Comuna.
La oficina de IAAS es la encargada de informar vía Fax o correo electrónico a la SEREMI de

Salud.
Las cepas aisladas serán enviadas al ISP mediante formulario exigido por esta institución (ver
Anexo)
Agentes de Notificación Inmediata:
● Clostridium botulinum
● Brucella sp
● Bacillus antracis
● Vibrio cholerae
● Corynebacterim diphteriae
● Haemopilus influenzae b de enfermedad invasora
● Neisseria meningitidis
● Agentes de enfermedades transmitidas por alimentos en caso de brotes.
Agentes de Notificación diaria:
Frente a los siguientes agentes aislados se procederá a informar telefónicamente al médico

tratante, y Oficina de IAAS la que se encargará de enviar informe al Epidemiología del Área.
● Salmonella Typhi y Paratyphi

● Neisseria gonorrhoeae
Agentes de vigilancia de laboratorio:
Los siguientes agentes aislados serán enviados semanalmente al ISP de acuerdo a norma de
vigilancia epidemiológica del MINSAL, Artículos 9, 10 y 11 de Decreto 158/04, con formulario
exigido.
● E.coli productor de Toxina Shiga 0157 y otros.

● Streptococcus pyógenes Grupo A de enfermedad invasora
● Streptococcus pneumoniae de enfermedad invasora
● Salmonella sp
● Shigella sp
● Vibrio parahaemolyticus
● Campylobacter sp
● Yersinia sp
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MICROBIOLÓGICOS
● Listeria monocytógenes de enfermedad invasora

● Streptococcus agalactiae de enfermedad invasora.
● Staphylococcus aureus VISA –VRSA
● Enterobacter, E. coli, Klebsiella pneumoniae con sospecha de carbapenemasas
● Agentes aislados de brotes de infecciones nosocomiales, de acuerdo a Norma Técnica
de
● IAAS.
23.3. REGISTROS
Las cepas enviadas serán registradas en libro de correspondencia del Laboratorio de

Microbiología.
Los resultados del ISP serán archivados en carpeta “INFORMES ISP” y digitados en Sistema
Informático REAL.
VII. ANEXOS
ANEXO 1: REALIZACIÓN DE PRUEBA PARA C. DIFFICILE
Kit STANDARD F C. difficile GDH FIA, equipo SD BIOSENSOR

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MICROBIOLÓGICOS
A. Algoritmo
La prueba para C. difficile de Standard F trae las determinaciones de GDH y toxina A/B por
separado. Se realizarán los kits según el siguiente algoritmo:
Muestra
deposición
líquida
Realizar kit
antígeno GDH
(C. difficile GDH

FIA)
Positivo Negativo Inválido
Realizar kit Informar

Toxinas A/B C. antígeno GDH
difficile negativo Solicitar nueva
muestra
(C. difficile Toxin Informar toxina
A/B FIA) A/B no procede
Positivo para Negativo para

Inválido
toxina A o B toxina A y B
Informar Informar antígeno Informar

antígeno GDH GDH positivo antígeno GDH
positivo Informar toxina A positivo
y B negativas Solicitar nueva
Informar toxina A Derivar a biología muestra para
o B positiva molecular repetir kit toxina
B. Procedimiento
Este procedimiento aplica para ambos kits (GDH y toxina A/B).
B.1 Preparación
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MICROBIOLÓGICOS
● Verificar la fecha de caducidad al reverso de la bolsa de aluminio. Utilizar otro lote si la

fecha de caducidad ha sido sobrepasada.
● Abrir la bolsa de aluminio y verificar el estado del dispositivo de prueba y del desecante
en el interior.
● No utilizar el dispositivo si la banda de verificación de color violeta no se encuentra

presente.
● No utilizar el dispositivo si el color del desecante ha cambiado de amarillo a verde.
B.2 Recolección de la muestra
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MICROBIOLÓGICOS
● Untar 4 áreas diferentes de la muestra fecal utilizando el hisopo estéril para recolectar una
porción de heces (aprox. 40-70 mg.). Si la muestra es líquida, impregnar el hisopo estéril
completamente en la muestra fecal líquida.
● Retirar la tapa del tubo buffer de extracción e insertar el hisopo en el tubo. Mezclar con el
hisopo al menos diez veces en el tubo buffer de extracción para disolver la muestra.
● Retirar el hisopo utilizado y desechar en contenedor amarillo. Asegurar firmemente la tapa

filtro en el tubo.
B3. Análisis de la muestra
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MICROBIOLÓGICOS
● Seleccionar el modo, según la cantidad de muestras a testear:

● Modo “Standard test” 🡪 realiza todo el proceso dentro del equipo. Utilizar cuando
se realice solo una muestra.
● Modo “Read only” 🡪 realiza solo la lectura dentro del equipo. Utilizar cuando hay
más de una muestra para testear.
● Modo “Standard test”

● Ingresar identificación del operador y folio de la muestra en el equipo.
● Insertar el dispositivo de prueba en la ranura del analizador.
● Aplicar 3 gotas de la mezcla de muestra en el pocillo de muestra del dispositivo de

prueba, invirtiendo para ello el tubo buffer de extracción.
● Presione de inmediato el botón “TEST START” (iniciar prueba).
● Modo “Read only”

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MICROBIOLÓGICOS
● Sacar los dispositivos de prueba de la bolsa de aluminio y colocarlos sobre una

superficie plana y seca. Anotar el folio de la muestra en la etiqueta del dispositivo
de prueba.
● Preparar las muestras extraídas.
● Aplicar 3 gotas de cada muestra extraída en el respectivo dispositivo de prueba,

en secuencia y con un intervalo de aproximadamente 30 segundos entre una y
otra.
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MICROBIOLÓGICOS
● Dejar los dispositivos de prueba durante 15 minutos sobre una superficie plana
para su incubación.
I. Preparar el equipo y seleccionar el modo “Read Only”.
● Introducir el dispositivo de prueba en el analizador. El analizador escaneará

automáticamente y mostrará el resultado de la prueba inmediatamente.
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MICROBIOLÓGICOS
ANEXO 2: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS PARA PRUEBA C. DIFFICILE
Kit STANDARD F C. difficile GDH FIA, equipo SD BIOSENSOR
A. Prueba antígeno GDH
B. Prueba toxina A/B
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MICROBIOLÓGICOS
VIII. REFERENCIAS
● Murray PR y col: Microbiología Médica. 8° Edición. Editorial Elsevier Mosby. 2017.
● Tejido cuantitativo: Técnica según York M K. En Isenberg HD ed.: Clinical Microbiology

Procedures Handbook. Ed ASM Press 2004; Cap 3.13.2.1.
● Manual de procedimientos y actividades prácticas Laboratorio Microbiología Universidad

Diego Portales. 2012.
IX. CONTROL DOCUMENTAL
Actualización Elaborado por Páginas Descripción Fecha de

actualización elaboración
2 Profesionales del 90 Ingreso y Febrero 2019
AT. eliminación de
Microbiología nuevos
exámenes
3 Profesionales del 90 Ingreso y Febrero 2023
AT. eliminación de
Microbiología nuevos
exámenes
Página 90 de 90

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

18. CULTIVO DE ANAEROBIOS ................................................................................................. 67

Personal de Tecnología Médica, personal técnico de laboratorio, personal de microbiología y

● Cultivo: Es el crecimiento in vitro de microorganismos en medios de cultivos líquidos y sólidos

● Directo: Es la observación microscópica de la muestra extendida en un portaobjeto. Puede

● Estudio Microbiológico: El estudio bacteriológico y micológico comprende el examen directo,

● AT de Microbiología: Área Técnica de Microbiología.

VI. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO

1. PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS

ES RESPONSABILIDAD DEL TÉCNICO PARAMÉDICO (TP):

● Recepcionar muestras de pacientes hospitalizados o ambulatorios, provenientes

1.1.2. INGRESO A SISTEMA LIS

● Ingresar solicitudes de exámenes al sistema informático del laboratorio.

● Trasladar las muestras desde ventanilla a sala de siembra en un recipiente

● En la sala de siembra constatar los datos del paciente en contenedor de la muestra

● Ingresar petición de examen en sistema LIS, el cual asigna un número correlativo

● Todos los ingresos realizados en sistema LIS automáticamente se traspasan al

● Para el caso de muestras provenientes de servicios en los cuales realizan sus

● Sembrar las muestras según los procedimientos descritos en Tabla de Siembra

ES RESPONSABILIDAD DEL TÉCNICO PARAMÉDICO (TP):

1.2.1. SIEMBRA Y PREPARACIÓN DE TINCIÓN DE GRAM

● Posterior a la siembra preparar extendido y hacer tinción de Gram en portaobjetos

● Cultivo corriente: permite el desarrollo de la mayoría de las bacterias aerobias y

1.2.2. TABLA DE SIEMBRAS

Rectal (proctitis) X Gram

Flujo vaginal X X Gram

1.2.3. INCUBACIÓN DE LAS PLACAS

● Todas las placas y tubos sembrados se incuban a 35 ºC en atmósfera normal, excepto

● Realizar las tinciones de Gram, tareas o técnicas a seguir para la identificación y

1.2.4. PREPARACIÓN TINCIÓN DE GRAM

● Preparación desde colonias bacterianas o de hongos:

● Preparación desde muestras líquidas (LCR, orina, otros líquidos estériles):

o Cuando esté visiblemente seca proceder con la tinción

● Preparación desde muestras en hisopo:

● Procedimiento de tinción: El procedimiento se realiza sobre los frotis preparados

ES RESPONSABILIDAD DEL TECNÓLOGO MÉDICO (TM):

1.2.5. LECTURA E INFORME DE LA TINCIÓN DE GRAM

● Realizar la lectura definitiva de los frotis utilizando microscopio óptico (Aumento

● Las variables básicas en el informe de una tinción de Gram son:

o Presencia o ausencia de células epiteliales (según tipo de muestra).

● El informe de la tinción de Gram dependerá del tipo de muestra, pero en general

● Registrar el informe en el REAL, identificando los elementos reconocidos en forma

● Los informes de Gram de LCR, otros líquidos estériles y aspirados endotraqueales o

1.2.6. LECTURA DE LAS MUESTRAS PROCESADAS

● Realizar diariamente la lectura de las placas sembradas registrando los hallazgos en

● En el caso de muestras de sitios no estériles el estudio se realizará solo sobre las

● Si se observan Levaduras en la tinción de Gram, se debe traspasar a medio

por el proveedor. En caso de aislamiento de hongos filamentosos, la identificación

● Si se observan colonias que no orientan a un género determinado, realizar tinción de

1.2.7. IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA: EL TM REALIZARÁ LA LECTURA DE LOS

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR MALDI-TOF MS

El instrumento VITEK® MS corresponde a un espectrómetro de masas, el cual emplea

El portaobjetos para análisis VITEK® MS-DS corresponde al dispositivo sobre el cual se

❖ Tomar una pequeña porción de la colonia en estudio a partir de un medio de cultivo

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA (VER MANUAL DE PROCEDIMIENTO E INFORME

● En bacilos Gram negativos de procedencia ambulatoria: realizar difusión en agar

● En bacilos Gram (-), cocáceas Gram (+) y levaduras de procedencia

ES RESPONSABILIDAD DEL TM:

1.3.1. INFORME Y REGISTRO DE RESULTADOS:

● Informar el resultado definitivo en el software de microbiología (Validación):

2.1. HEMOCULTIVOS AEROBIOS (En frascos Bact/Alert)

El hemocultivo es el examen fundamental en el estudio de las bacteriemias o fungemias. Consiste

El sistema BACT/ALERT® VIRTUO® corresponde a un sistema automatizado el cual permite

● HEMOCULTIVOS PERIFERICOS: Para determinar estos cuadros clínicos se