PRÁCTICA N°1:

USO Y CUIDADO DEL ESPECTROFOTÓMETRO DE ABSORCIÓN UV-VISIBLE Y

OBTENCIÓN DE ESPECTROS

1.1 OBJETIVOS

a. Operar correctamente el espectrofotómetro de absorción UV-visible MODELO

GENESYS 10S UV-VIS MARCA THERMO SCIENTIFIC.
b. Adquirir experiencia en la obtención de espectros de absorción.
c. Demostrar la interacción de la energía radiante y la materia a través de los espectros
de absorción

1.2 MARCO TEÓRICO

Los métodos espectroscópicos de análisis están basados en la medida de la radiación

electromagnética (REM) que es absorbida o emitida por una sustancia. La espectrofotometría
de absorción en las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético es,
posiblemente, la más utilizada en la práctica del análisis cuantitativo de todas las técnicas
espectroscópicas.
La espectroscopía de absorción es la medición de la cantidad de luz que absorbe un
compuesto como la función de la longitud de onda de la luz.

La espectroscopía de absorción molecular UV Visible:

Utiliza la radiación del espectro electromagnético cuya longitud de onda está comprendida
entre los 100 y los 800 nm (energía comprendida entra las 286 y 36 Kcal/mol) y su efecto sobre
la materia orgánica, es producir transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y/o
moleculares de la sustancia.

El aspecto típico de un espectro UV es el que se muestra en la figura:

U L T R A V I O L E T A V I S I B L E

100nm 200nm 350 nm 800nm

Estas transiciones electrónicas se traducen en una CURVA ESPECTRAL o espectro de

absorción.

En estos espectros de absorción, los máximos de absorción de deben a la presencia de

CROMÓFOROS en la molécula, por ejemplo, puede darse el caso de que existan dos
absorciones a 190 y 270 nm, pero para caracterizar dichas absorciones además de la longitud
de onda máxima para cada absorción debemos de recordar la ley de Lambert-Beer, según la
cual: Dependiendo del tipo de enlace que consideremos como cromóforo la excitación
electrónica que puede observarse es:
 Absorbancia= ϵ.l.c

Donde:

ϵ = coeficiente de extinción molar, es una constante relacionada con el área de incidencia del
cromóforo y la probabilidad de que produzca la absorción.

l = recorrido en cm de la radiación a través de la muestra

c= concentración de la muestra en moles/litro

Consideremos que cuando ϵ es inferior a 10 000 esa absorción se debe a una transición
electrónica prohibida por las reglas de selección.

En general, un espectrofotómetro irradia la muestra con luz, mide la cantidad de luz trasmitida
como función de la longitud de onda y grafica los resultados ofreciendo la información sobre el
estado electrónico de la molécula en la muestra. Dado que un espectrofotómetro es un aparato
muy importante en el análisis química instrumental, a la par que costoso y delicado, la práctica
se ha dividido en dos partes. En la primera parte se aprenderá los aspectos prácticos de
carácter básico y en la segunda se explorará y aprenderá a utilizar todas las capacidades que
puede ofrecer un instrumento determinado.

1.3 APUNTES DE CLASE

1.4 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

 Espectrofotómetro UV-visible
 Celdas de vidrio y/o de cuarzo
 Manual de instrucción.
 Pipetas de 10 y 25ml
 Vasos de precipitados
 Fiolas de 100ml
 Soluciones adecuadas (coloreadas y/o incoloras)

1.5 PROCEDIMIENTO

 NORMAS GENERALES PARA EL USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO

Los espectrofotómetros son aparatos de precisión delicados y deben

manejarse con cuidado. Si una palanca, perilla o botón no se mueve con
facilidad no hay que forzarlos NUNCA. Hay que detenerse y considerar si lo
que se está haciendo es lo apropiado. No golpear nunca con violencia las
palancas o botones, sino al contrario, moverlos con suavidad. El tiempo que se
pueda ganar con un trato brusco es de una pequeña fracción de segundo; el
perjuicio que se ocasione puede acorar en años la vida del instrumento.

Las cubetas de sílice (cuarzo) son indispensables para efectuar

determinaciones por debajo de 340nm, que es el límite de transparencia del
vidrio. La sílice transmite hasta 200nm y aún menos. Las cubetas de sílice son
caras y se rompen fácilmente. Sus caras ópticas pulidas se rayan con facilidad.
Películas invisibles de suciedad o de grasa, incluyendo las huellas dactilares,
pueden absorber luz ultravioleta. Las cubetas se han de tocar solo por sus
caras rugosas, nunca por las pulidas, y se deben mantener escrupulosamente
limpias. Después de llenar una cubeta y antes de colocarlas en el
espectrofotómetro se enjuagan las caras lisas exteriores con unas gotas de
gua destilada y se secan suavemente con papel blando. No se debe tratar
nunca de forzar su colocación pues se podría romper la cubeta. Tan pronto se
haya terminando el trabajo, se lavan las cubetas completamente y se secan
interiormente lavando con acetona y dejando escurrir. Cuando están secas, se
vuelven a colocar en su caja. Las cubetas de sílice llevan habitualmente
marcas para identificarlas, pero si hay cualquier duda acerca de si son de sílice
o de vidrio, basta colocar una cubeta vacía en el espectrofotómetro y comparar
su absorbancia por debajo de 300nm con la del aire.
Si el instrumento es del tipo de doble haz, la cubeta vacía se coloca en el sitio
reservado a la muestra y se deja vacío el sitio de la referencia. Fácilmente se
verá si la cubeta transmite luz o no; si la transmite, es de sílice.

 INSTRUCCIONES DE OPERACIÓN DEL ESPECTROFOTOMETRO UV-VISIBLE

Dispositivo de lectura

Fuente de
radiación
 El profesor realizará las instrucciones de operación extraídas del manual de
instrucciones que aparecen a continuación. También hará demostraciones de la
forma correcta de operar el equipo. Los estudiantes practicarán el uso del
equipo, bajo la supervisión directa del profesor.

 OPERACIÓN MANUAL SIMPLE

1. Verificar que el suministro de energía eléctrica estabilizada se encuentra activado.

Los interruptores “llave general”, “luz de módulos” y “tomacorriente de mesas y
módulos” deben estar en posición superior y el medidor del estabilizador de voltaje
deberá indicar 220V.
2. Conectar el instrumento a la red de energía eléctrica estabilizada y encenderlo
oprimiendo el interruptor principal a la posición “ON”. El instrumento realizará una
auto diagnóstico mostrando los resultados en la pantalla, los sonidos emitidos por el
instrumento pueden ser algo molestos, pero son parte del funcionamiento normal. La
secuencia del autodiagnóstico es:

Verificación de la batería.
Iniciación de la rueda de filtros.
Verificación de la lámpara de tungsteno (según sea el caso).
Verificación de la lámpara de deuterio (según sea el caso).
Verificación de la lámpara de xenón (según sea el caso).
Alineación de lámparas.
Calibración de longitud de onda.
Calentamiento de lámpara.

3. Familiarícese con el teclado de la consola y verifique qué comprende la función de

cada tecla. El profesor le dará instrucciones. NUNCA PRESIONE LAS TECLAS CON
LAS UÑAS PUES LAS DETERIORA, USE SOLO LAS YEMAS DE LOS DEDOS. NO
PRESIONE TECLAS QUE NO HAYAN SIDO AUTORIZADAS POR EL PROFESOR.

4. Si no va a efectuar mediciones en el rango ultravioleta, presione la tecla UTILITY y

apague la lámpara de deuterio si es que estuviese encendida. LA LAMPARA DE
DEUTERIO ES CARA Y TIENE UNA VIDA LIMITADA, POR LO TANTO, NO DEBE
ESTAR ENCENDIDA SI NO SE ESTÁ USANDO. Presione la tecla EXIT hasta volver
a la pantalla original.

5. En el tablero Ud. Verá funciones definidas (modo: A/%T/CONC, FACTOR).

Seleccione el modo de medición con la tecla MODE correspondiente, no use el
modo de concentración si el instrumento no ha sido previamente calibrado en
concentración.
 6. Verificar que las celdas estén limpias y listas para ser utilizadas.

7. Colocar el blanco y las muestras en celdas respectivas, abrir el compartimiento del

instrumento y colocar cuidadosamente las celdas en el portaceldas, EVITE
DERRAMAR LOS BLANCOS O MUESTRAS DENTRO DEL INSTRUMENTO, SI
ESTO LLEGARA A OCURRIR AVISE DE INMEDIATO AL PROFESOR. Verifique
que la celda que contiene el blanco ocupe siempre la posición 1. Cierre el
compartimiento.

8. Seleccione el modo de medición (Absorbancia, % de transmitancia o concentración)

presionando la tecla MODE correspondiente hasta obtener la opción deseada.

9. Seleccione la longitud de onda a emplear mediante la tecla WAVELENGTH.

10. Tire del pasador del compartimiento de muestra para hacer avanzar o retroceder el
portaceldas hasta que el blanco quede insertado en el paso de luz.

11. Lleve a cero la absorbancia o 100% de transmitancia oprimiendo la tecla

correspondiente.

12. Inserte cada muestra en el paso de luz tirando del pasador.

13. Anote el resultado de la medición que aparece en la pantalla.

14. Luego de realizar las medidas deseadas, abrir el compartimiento del portaceldas y
retirar las celdas cuidadosamente. Cerrar el compartimiento, descartar el contenido
de las celdas y lavarlas con jabón líquido enjuagando con abundante agua destilada.
Secar las celdas con papel suave y colocarlas en su estuche.

15. Apagar el instrumento. Esperar 10 minutos y cubrirlo con su funda.

 OBTENCIÓN DE ESPECTROS

1. Preparar soluciones de concentración adecuadas cuya lectura de

transmitancia tenga valores entre 20%T a 70%T y/o según sea indicado por los
profesores.
2. Realice las lecturas individuales desde 200 a 450 y de 450 a 850nm,
registrando los valores de absorbancia y %transmitancia.
1.6 RESULTADOS

 Use papel milimetrado para representar en una gráfica las lecturas de absorbancia (Y)
vs longitud de onda (X) y %T vs longitud de onda de las muestras y compárelas.
 Determine en los espectros obtenidos, la longitud de onda que presenta una máxima
absorbancia, como también otros picos secundarios.
 Aplicando sus conceptos teóricos sobre interacción de la energía radiante y la materia,
analice y explique a qué se debe la diferencia de los espectros de cada una de las
sustancias estudiadas.

1.7 CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los parámetros que definen a las radiaciones electromagnéticas?

2. ¿Cuáles son los valores de número de onda y de frecuencia de una radiación de 425nm?
3. Determine la energía asociada a las siguientes radiaciones: 250nm, 500nm, 900nm e
indique la zona del Espectro electromagnético que les corresponde.
4. Explique las diferencias entre los instrumentos de un solo haz y doble haz para las
mediciones de absorbancia.
5. Defina cada término: Exactitud fotométrica. Ruido. Ancho de banda. Sistema dispersor.
6. ¿Qué es el ERROR ABSOLUTO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO? ¿Cuál es su valor
numérico?
7. ¿Cómo se califica el buen estado de la fuente luminosa de un espectrofotómetro?
8. ¿Cómo se hace la limpieza de las cubetas de muestras luego de ser usadas con una
solución coloreada y grasa?

USO del Equipo Genesys 10S UV-Vis

Parte 1

https://www.youtube.com/watch?v=C-M7EtSuD40

parte 2

https://www.youtube.com/watch?v=wmkKVQhjpec&t=20s