Tema 3 (ParteI) Espectrofotometria

Tema 3
Métodos espectrofotométricos.
Espectroscopía UV-visible
Objetivos:
1. Introducción
2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)

2.1 Comportamiento de RE
2.2 Espectro electromagnético
3. Interacción de la RE con la materia. Absorción.
4. Espectroscopía UV-visible:
4.1 Especies absorbentes y transiciones electrónicas
4.2 Espectro de absorción
4.3 Leyes básicas de la absorción de RE UV-visible
4.4 Instrumentación en espectroscopía UV-visible
4.5 Aplicaciones
1. Introducción
- Las espectroscopías son técnicas de análisis molecular basadas

en el estudio de las interacciones que se establecen entre las
radiaciones electromagnéticas y las moléculas.
- En concreto en este tema se describe la técnica basada en la

absorción de las radiaciones electromagnéticas UV y visible (luz)
por parte de las moléculas biológicas.
- Presenta importantes aplicaciones en biología, química, física y

astronomía, entre otras disciplinas científicas.
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
La RE, por su comportamiento, puede considerarse tanto como una onda o

como un haz de fotones. :
a) En el electromagnetismo (modelo clásico de onda sinusoidal) la RE es

un campo oscilante que se propaga como una onda sinusoidal desde la
fuente emisora. Este modelo se utiliza para explicar las propiedades de
la RE.
b) En la mecánica cuántica (modelo corpuscular) la RE se comporta como

una corriente de partículas discretas (fotones) emitidas por una fuente.
Este modelo se utiliza para explicar la interacción de la RE con la
materia.
Por tanto, el electromagnetismo clásico y la mecánica cuántica ofrecen

descripciones diferentes y complementarias de la RE.
2. Propiedades de la radiación electromagnética
a) Modelo clásico de onda sinusoidal: Jamen Clerk Maxwell
RE = onda electromagnética que se define mediante dos parámetros:
- Longitud de onda (λ): distancia recorrida por un ciclo completo (de cresta a
cresta de la onda). En la espectroscopía UV-visible se expresa en nm.
- Frecuencia (γ): número de oscilaciones completas que realiza la onda por

unidad de tiempo (herzios = s-1) Longitud
onda
λ
Frecuencia (γ)
La RE viaja a velocidad cte en un medio dado. En el vacío, la RE viaja a la

velocidad de la luz (C)
C = λ× γ; C = 3 × 108 m/s
b) Modelo corpuscular: Max Plank
 La radiación electromagnética se puede considerar también como un haz o flujo de

partículas, llamadas fotones, que se propagan en línea recta.
 Existe una ecuación que relaciona el modelo ondulatorio con el corpuscular a través
de la cte de Plank (cte de proporcionalidad entre la Energía (E) de un fotón y la v de la
onda electromagnética)
La E de los fotones viene determinada por :
𝑐 h cte de Plank (h=6,6252(10-34) Js)

𝐸 = ℎ𝑣 = ℎ γ frecuencia
λ
c velocidad de la luz
λ longitud de onda
 La E que tiene un fotón es directamente proporcional a la v de la radiación e
inversamente proporcional a la λ:
- A mayor λ, menor E
- A menor λ, mayor E
𝑐
𝐸 = ℎ𝑣 = ℎ
λ
El espectro electromagnético es el conjunto de las RE de todas las λ
pm nm Km
+ energía - energía
El espectro electromagnético es el conjunto de las RE de todas las λ
pm nm Km
La luz roja (con mayor λ y menor γ) es menos energética que la luz azul (con menor λ y mayor γ)
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
3. Interacción de la radiación con la materia
Cuando se hace incidir RE de energía adecuada sobre la materia, ésta interacciona

con las moléculas que lo componen, pudiéndose producir tres fenómenos distintos:
- Dispersión – cambios de dirección que sufre la RE incidente (difracción rayos x por

ej. para ver estructura de proteínas cristalizadas)
ESPECTROSCOPIA
- Absorción – la RE es absorbida por las moléculas produciendo un incremento de

energía en éstas. (Espectroscopía de luz polarizada, de infrarrojo, de resonancia
magnética nuclear, de UV-visible)
- Emisión– Tras la absorción de la RE, algunas moléculas ceden o emiten el exceso

de energía en forma de fotones (Espectroscopía de fluorescencia/fosforescencia)
3. Interacción de la radiación con la materia
Cuando se hace incidir RE de energía adecuada sobre la materia, ésta interacciona

con las moléculas que lo componen, pudiéndose producir tres fenómenos distintos:
- Dispersión – cambios de dirección que sufre la RE incidente (difracción rayos x por

ej. para ver estructura de proteínas cristalizadas)
ESPECTROSCOPIA
- Absorción – la RE es absorbida por las moléculas produciendo un incremento de

energía en éstas. (Espectroscopía de luz polarizada, de infrarrojo, de resonancia
magnética nuclear, de UV-visible)
- Emisión– Tras la absorción de la RE, algunas moléculas ceden o emiten el exceso

de energía en forma de fotones (Espectroscopía de fluorescencia/fosforescencia)
3. Interacción de la radiación
< con la materia: absorción
Niveles energéticos de una molécula
- Cuando una molécula absorbe la RE, pasa desde un estado basal (E1) a un estado
excitado (E2), de mayor contenido energético (se produce la transición de un electrón a
un estado de energía superior).
- La absorción de E sólo es muy probable si la cantidad de E corresponde a la diferencia

entre los dos niveles energéticos (ΔE = E2-E1)
- Por ello, las moléculas sólo absorberán RE de unas determinadas λ
Estado excitado
(E2)
ΔE= hv
ΔE = E2-E1 Estado fundamental
(E1)
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
4. Espectroscopía de absorción UV- visible
- La espectroscopía UV-Vis está basada en el proceso de absorción de la RE

ultravioleta-visible (radiación con λ entre los 160 - 400 (UV) y 400 - 750 nm (visible))
por una molécula.
UV – lejano: 160-250 nm
UV – próximo: 250- 400 nm
- La absorción de RE causa la promoción de un electrón de un estado fundamental a un

estado excitado. Estos electrones que absorben son los electrones de enlace de las
moléculas, por lo que el espectro de absorción de una molécula dependerá del tipo
de enlaces que presenta.
- Por tanto las moléculas absorben RE en función de su estructura molecular.

Teoría de orbitales moleculares

El que una molécula absorba RE del UV-visible depende de su estructura molecular.
Cuando dos átomos forman un enlace químico, los orbitales atómicos de cada uno
de ellos se combinan para formar dos orbitales moleculares:
Orbital enlazante Orbital antienlazante

Electrones en estado fundamental E1: Electrones en estado excitado E2:
de baja energía y mayor estabilidad de energía mayor y menor estabilidad
Estado excitado (E2)

ΔE= hv
Estado fundamental (E1)
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
4. 1 Especies absorbentes en UV-visible
Son moléculas que tienen electrones en orbitales moleculares (Orbitales σ y

Orbitales π) y orbitales no enlazantes (Orbitales n)
 Electrones enlazantes que contribuyen directamente a la formación del enlace :

Benceno
- e- σ enlazantes (Orbitales σ). Metano
enlaces sencillos (C-C)
- e- π enlazantes (Orbitales π).

enlaces múltiples (C=C) o (C C)
 Electrones no enlazantes que no participan en el enlace y están localizados

alrededor de átomos como el oxigeno, azufre o nitrógeno (Orbitales n)
4. 1 Especies absorbentes en UV-visible y transiciones electrónicas
Estado
Los orbitales antilenlazantes excitado (E2)
σ* y π* son la versión ΔE= hv
Estado
excitada del σ y π enlazantes fundamental (E1)
Estado
Los orbitales antilenlazantes excitado (E2)
σ* y π* son la versión ΔE= hv
Estado
excitada del σ y π enlazantes fundamental (E1)
Transiciones electrónicas entres niveles de energía moleculares en UV-visible
Cuando las moléculas absorben fotones de E adecuada (UV-visible) se pueden dar

4 tipos de transiciones:
- σ-> σ*
- π -> π*
- n-> σ*
- n-> π*

Absorción de radiación UV-visible por compuestos orgánicos
Energía Transición Región del espectro Ejemplo
(λ max absorción)
σ → σ* U.V vacío (<185nm) Metano (125nm)
n→σ* U.V lejano (185-250nm) Acetona (190nm)
aplicaciones
Mayoría de
π → π* U.V. cercano (250-400nm) Benceno (203 y 250 nm)
n → π* Visible (400-800nm) Nitrobenceno (665nm)
Metano Acetona
Benceno Nitrobenceno
4. Espectroscopía de absorción UV-visible
4.1 Especies absorbentes en UV-visible
Grupos cromóforos y auxocromos
- Cromóforo: son los grupos funcionales de la molécula responsables de la

absorción.
- Auxocromos: grupos funcionales que por sí mismas no dan color a la molécula,

pero son capaces de aumentar la intensidad de color de un cromóforo.
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
4.2 Espectro de absorción de una molécula
- El espectro de absorción de cromóforo es la representación de la cantidad de RE que

puede absorber en función de la λ de luz incidente.
- El espectro de absorción de una molécula es una característica diferencial de una

molécula en disolución, es reflejo directo de su estructura y del entorno que la rodea.
- La λ de mayor absorción (pico máximo de absorción) es usada para determinar su

concentración.

Ejercicio: determinar el espectro de absorción del naranja de metilo

La determinación del espectro de absorción de una molécula se realiza

midiendo la absorción de la RE a distintas λ.
λ (nm) Absorbancia
420 0,53
460 0,71
500 0,47
540 0,078
580 0

Λ (nm) Absorbancia
420 0,53
460 0,71
500 0,47
540 0,078
580 0
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
4.3 Leyes básicas de la absorción de luz UV- visible
Cuando la RE de una λ de intensidad I0 incide perpendicularmente sobre una

disolución de un compuesto químico que absorbe RE (cromóforo), el compuesto
absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de
forma que se cumple:
RE absorbida
I0 = Ia + It
RE incidente RE transmitida
It = I0 - Ia
En espectroscopía UV- visible se determinan: Transmitancia y Absorbancia

(son adimensionales)
Transmitancia
La transmitancia (T) nos indica la cantidad de RE transmitida por la muestra.
Se expresa como la relación entre la cantidad de RE transmitida una vez que ha

atravesado la muestra (It) y la cantidad de RE que incidió sobre ella (I0) y se
representa normalmente en tanto por ciento:
RE absorbida
𝑰𝒕 RE transmitida
%𝑻 = 𝒙𝟏𝟎𝟎 RE incidente
𝑰𝟎
Absorbancia
La absorbancia (A) nos indica la cantidad de RE absorbida por la muestra.
Se expresa como la relación logarítmica entre la RE incidente (I0) y la transmitida (It)
RE absorbida
𝑰𝟎
𝑨 = 𝒍𝒐𝒈 𝑨 = −𝒍𝒐𝒈𝑻
𝑰𝒕 RE incidente RE transmitida
Si I0 = It; log 1 = 0
A = 0 y T = 100%
(indica que la muestra no absorbe a una determinada λ)
Ley de Lambert-Beer: relaciona A con C

La ley de Lambert-Beer indica que la fracción de I0 que es absorbida por una
solución es proporcional a la C de soluto, al espesor del medio atravesado b y a
la absortividad específica de cada cromóforo a.
RE absorbida
𝑰𝟎 a = absortividad
𝒍𝒐𝒈 =abc
𝑰𝒕
RE incidente a RE transmitida
A=abc
c C = concentración
A = ε·l·C
b Paso óptico (longitud medio absorbente)
La variación de la A con la
concentración de soluto sigue una
proporcionalidad directa.
Ley de Lambert-Beer
A = ε·l·C
La absorbancia de una solución es:
- Directamente proporcional a su concentración

> número de moléculas > interacción de la luz con ellas
- Depende de la distancia que recorre la RE por la solución

= concentración > distancia recorre la luz por la muestra > número
moléculas se encontrará
- Depende de ε (coeficiente de extinción molar)

una constante de proporcionalidad específica de cada cromóforo.
ε es la A de una disolución 1M de un soluto, para un paso óptico de 1cm.
Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l.

- (l) en cm
- (c) en M
- (ε) en L.moles-1·cm-1
Ley de Lambert-Beer
La A de una disolución es la suma de las A de sus componentes.
- 1 solo componente
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1
- Varios componentes
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1 + Adisolvente2 + Asoluto2 ….
Ley de Lambert-Beer
La A de una disolución es la suma de las A de sus componentes.
- 1 solo componente
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1
- Varios componentes
Adisolución = Adisolvente1 + Asoluto1 + Adisolvente2 + Asoluto2 ….
 Cuando se hace una medida hay que descontar la contribución del

disolvente.
 Para ello siempre se requiere un tubo blanco que contenga todos los
reactivos excepto el soluto que se desea medir.
 La absorbancia de este tubo se restará de la que presente la muestra a
medir.
Limitaciones de la ley de Lambert-Beer
La relación proporcional entre A y C no es lineal en cualquier situación. La ley de LB

solo se cumple con RE monocromáticas y soluciones diluidas.
Limitaciones de la Ley de Lambert-Beer:
- Características del analito:

- C analito relativamente pequeña y C elevadas de electrolitos en la muestra.
Produce una alteración de la absortividad del analito.
- C analito elevada. Si supera 0,01M se altera la capacidad de absorción por
interacciones electrostáticas entre las moléculas.
- Impurezas en la muestra que presentan absorción.
- Limitaciones químicas.
- Por características de la técnica se produce una interacción del analito con
otras sustancias y se genera un compuesto con un espectro diferente.
Objetivos:
1. Introducción

4.5 Aplicaciones
Los instrumentos diseñados para cuantificar la absorción son los espectrofotómetros
𝑰𝟎 𝑰𝒕
Cubetas
4.4 Instrumentación: espectrofotómetro
Lámpara de luz
Función: responsable de emitir RE.
- Tungsteno-Halógeno: fuentes para visible y UV

próximo (350-750nm)
- Deuterio: fuentes para UV (200-350nm)
𝑰𝟎 𝑰𝒕
Monocromador
Función: seleccionar una banda estrecha de λ de todas las que proceden de la fuente
de luz para aumentar la sensibilidad de la medida de A.
Monocromador formado por:
- Colimador, lente que concentra la radiación de la lámpara en el monocromador.

- Prisma de vidrio o red de difracción que permite dispersar la luz en todas las λ
individuales
- Selector λ, rendija por la que pasa la radiación seleccionada y se concentra sobre la
muestra
𝑰𝟎 𝑰𝒕
Compartimento muestra
Función: Aloja el recipiente donde se pone la disolución a analizar
- Aislado de radiación exterior para evitar interferencias
- Recipiente empleado se denomina cubeta, transparente a la radiación empleada
- Dimensiones condicionan: volumen y paso óptico de muestra
𝑰𝟎 𝑰𝒕
Compartimento muestra
Cubetas de un material que permita el paso de la RE en la región de interés. Para ello

se utilizan diferentes materiales:
- Cuarzo o sílice fundido - UV

- Cristal óptico y plástico - Visible
Características:
- Espacio interior habitualmente de 1 cm, aunque puede ser superior o inferior

dependiendo de la muestra.
- Ventanas perpendiculares a la direccionan del haz, que minimizan las pérdidas por
reflexión. No debe desviar la trayectoria de la luz.
Detector y registrador digital
- Detector: dispositivo que detecta la It una vez que la RE ha atravesado la

muestra (I0) y parte de ella se ha absorbido (Ia). Convierten la energía
luminosa en energía eléctrica
- Pantalla digital: dispositivo de lectura que digitaliza la señal eléctrica y la

convierte en un número (absorbancia o transmitancia)
𝑰𝟎 𝑰𝒕

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2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)

3. Interacción de la RE con la materia. Absorción.

4.1 Especies absorbentes y transiciones electrónicas

4.2 Espectro de absorción

4.3 Leyes básicas de la absorción de RE UV-visible

4.4 Instrumentación en espectroscopía UV-visible

- Las espectroscopías son técnicas de análisis molecular basadas

- En concreto en este tema se describe la técnica basada en la

- Presenta importantes aplicaciones en biología, química, física y

2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)

3. Interacción de la RE con la materia. Absorción.

4.1 Especies absorbentes y transiciones electrónicas

4.2 Espectro de absorción

4.3 Leyes básicas de la absorción de RE UV-visible

4.4 Instrumentación en espectroscopía UV-visible

La RE, por su comportamiento, puede considerarse tanto como una onda o

a) En el electromagnetismo (modelo clásico de onda sinusoidal) la RE es

b) En la mecánica cuántica (modelo corpuscular) la RE se comporta como

Por tanto, el electromagnetismo clásico y la mecánica cuántica ofrecen

a) Modelo clásico de onda sinusoidal: Jamen Clerk Maxwell

RE = onda electromagnética que se define mediante dos parámetros:

- Frecuencia (γ): número de oscilaciones completas que realiza la onda por

La RE viaja a velocidad cte en un medio dado. En el vacío, la RE viaja a la

b) Modelo corpuscular: Max Plank

 La radiación electromagnética se puede considerar también como un haz o flujo de

La E de los fotones viene determinada por :

𝑐 h cte de Plank (h=6,6252(10-34) Js)

2.2 Espectro electromagnético

El espectro electromagnético es el conjunto de las RE de todas las λ

2.2 Espectro electromagnético

El espectro electromagnético es el conjunto de las RE de todas las λ

2.2 Espectro electromagnético

2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)

3. Interacción de la RE con la materia. Absorción.

4.1 Especies absorbentes y transiciones electrónicas

4.2 Espectro de absorción

4.3 Leyes básicas de la absorción de RE UV-visible

4.4 Instrumentación en espectroscopía UV-visible

Cuando se hace incidir RE de energía adecuada sobre la materia, ésta interacciona

- Dispersión – cambios de dirección que sufre la RE incidente (difracción rayos x por

- Absorción – la RE es absorbida por las moléculas produciendo un incremento de

- Emisión– Tras la absorción de la RE, algunas moléculas ceden o emiten el exceso

Cuando se hace incidir RE de energía adecuada sobre la materia, ésta interacciona

- Dispersión – cambios de dirección que sufre la RE incidente (difracción rayos x por

- Absorción – la RE es absorbida por las moléculas produciendo un incremento de

- Emisión– Tras la absorción de la RE, algunas moléculas ceden o emiten el exceso

Niveles energéticos de una molécula

- La absorción de E sólo es muy probable si la cantidad de E corresponde a la diferencia

- Por ello, las moléculas sólo absorberán RE de unas determinadas λ

2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)

3. Interacción de la RE con la materia. Absorción.

4.1 Especies absorbentes y transiciones electrónicas

4.2 Espectro de absorción

4.3 Leyes básicas de la absorción de RE UV-visible

4.4 Instrumentación en espectroscopía UV-visible

- La espectroscopía UV-Vis está basada en el proceso de absorción de la RE

- La absorción de RE causa la promoción de un electrón de un estado fundamental a un

- Por tanto las moléculas absorben RE en función de su estructura molecular.

Teoría de orbitales moleculares

Orbital enlazante Orbital antienlazante

Estado excitado (E2)

2. Propiedades de la radiación electromagnética (RE)

3. Interacción de la RE con la materia. Absorción.