UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

Producción de embriones
transgénicos bovinos por
microinyección de un vector
lentiviral pre y pos fertilización

Dennis Herrera, Hugo Castillo, Erika

Pilliza, Angie Calispa
 Microinyección
Consiste en la inyección directa de ADN en el núcleo celular mediante una microjeringa y un
microscopio óptico,llamado micromanipulador, para poder introducir el material genético a
una célula blanco.

Ventajas
Desventajas
-Sepuede optimizar la cantidad de
-Solamente una célula recibe el

DNA descargado DNA por cada inyección

-Se puede escoger la célula a
-El manejo de la técnica

transformar requiere personal entrenado

-Ladescarga del DNA foráneo es

precisa
01
INTRODUCCIÓN
Los organismos geneticamente modificados o
trangenicos son aquellos que por accios del
hombre tienen secuencias de ADN de otra
especie en su genoma

Cuando se usan vectores retrovirales, los

lentivirus son los más utilizados

Los primeros animales transgénicos

generados utilizando la tecnología de
vectores lentivirales se desarrollaron a partir
de la microinyección de un vector lentivial
derivado del virus de inmunodeficiencia
humana (VIH-1) en el espacio perivitelino de
ovocitos fertilizados
 LIMITACIÓN DEL
LENTIVIRUS
Especialmente cuando se hace necesario el
uso de altos títulos virales, pues el lentivirus
debe sobrepasar la zona pelúcida (ZP) del
embrión y la matriz extracelular
glicoprotéica que confiere protección externa
al embrión incluso contra agentes infecciosos
í, la ZP acaba actuando como una barrera
Los animales transgénicos pueden ser física que evita la penetración del lentivirus
utilizados para la producción de proteínas
humanas recombinantes, xenotransplantes,
en el estudio in vivo de la función de un gen
durante la organogénesis, el desarrollo y el
envejecimiento, la generación de modelos
experimentales en animales para el
conocimiento de los mecanismos
involucrados en el desarrollo de
enfermedades
02
MÉTODO
 COLECTA DE LOS OVARIOS Y
MANIPULACIÓN DE LOS OVOCITOS
Fueron utilizados 720 Los ovarios fueron removidos Los ovarios fueron lavados con

ovarios colectados de e inmersos en nevera térmica solución fisiológica, previamente

hembras bovinas, sin con solución fisiológica (0,9% colocada en baño de maría a

definir la raza en diferente NaCl) suplementada con 37°C, los folículos ováricos (≤10
fase del ciclo estral sulfato de estreptomicina mm) fueron succionados con

(0,05 g/L) jeringa

Una vez ocurrida la

decantación de los ovocitos,
éstos fueron almacenados en
medio Talp-Hepes
 Maduración in vitro (MIV)
Se utilizaron 1777 ovocitos madurados en
medio TCM, suplementado con FSH y suero
de vaca en celo (10%). La maduración se
realizó en grupos de 50-60 estructuras,
depositadas en placas Nunc de cuatro
pozos

Los ovocitos se cultivaron en estas

condiciones de temperatura 38,5°C
con atmósfera de 95% de humedad y
5% de CO₂. Durante 22 a 24 horas.
 Tratamientos
T1 = Control (n=577). Fecundados
T2PRE = Control de medio de

in vitro con complejos cumulus-

cultivo (n=200).Fecundados in vitro

oócito (CCOs) con una

con una concentración de 1x106

concentración de 1x106
espermatozoides (SPTZ)/m
SPTZ/mL, cultivados en medio SOF

T2POS = Control de medio de cultivo T3PRE = Control de microinyección

T3POS = Control de

(n=200). Fecundados in vitro con (n=200). microinyectados con medio microinyección (n=200).

una concentración de 4x106 TALP y seguidamente fecundados in

Fecundados in vitro con una

SPTZ/mL durante 6 h, cultivados en vitro con una concentración de 1x106

concentración de 4x106

medio SOF SPTZ/mL SPTZ/mL

T4PRE = Microinyectados con el T4POS = Microinyectados con el

lentivirus (n=200). microinyectados

lentivirus (n=200).Fecundados in vitro

con el vector lentiviral y seguidamente

fecundados in vitro con una

con una concentración de

concentración de 1x106 SPTZ/mL 4x106SPTZ/m

 Fertilización in vitro (FIV)
Para la fecundación se utilizó semen de un mismo
toro y lote de la raza Gir, previamente evaluado en
cuanto al vigor
En los tratamientos de microinyección PRE-fertili-
zación (T2PRE, T3PRE y T4PRE), el semen fue diluido, a
una concentración de 1x106 espermatozoides/mL, y
transferido a las gotas de fecundación (100 μL de me-
dio FERT-TALP
En los tratamientos de microinyección POS-
fertilización (T2POS, T3POS y T4POS), el semen fue
diluido a una concentración de 4x106
espermatozoides/mL, y transferido a las gotas de
fecundación (100 μL de medio FERT-TALP
 VECTOR LENTIVIRAL
El vector lentiviral fue .Se prepararon dos mezclas
producido por transfección La transfección con los
por separado: una mezcla de
transitoria, utilizando cuatro vectores lentivirales se
polietilenoimina 18 mM (PEI,
plásmidos: realizó con una mezcla que
Sigma) más glucosa al 5% y
el plásmido de empaque contenía los cuatro
otra mezcla de ADN
(pMDLg/pRRE) plásmidos,en concentració
plasmidial más glucosa al 5%.
El que codifica para la de 6 μg de ADN
proteína de envoltura
(pMD2.G)
El plásmido que
codificapara la proteína
Rev (pRSV-Rev) (Addgene,
EE.UU.)
El plásmido que contiene
el transgén (pLGW).
 Microinyección de los ovocitos
PRE-fertilización (T3PRE y T4PRE)
Los ovocitos desnudos fueron lavados con medio TALP-Hepes y vertidos en placa
de Petri para recuperación de los mismos. Los ovocitos fueron nuevamente
lavados en medio TALP y mantenidos en gotas de 20 μL del medio cubierto con
acei-te mineral hasta el momento de la microinyección
 MICROINYECCIÓN DE
LOS OVOCITOS POS-
07 FERTILIZACIÓN (T3POS
Y T4POS)
los presumibles cigotos fueron retirados de
la gota de fecundación, lavados en medio
TALP-HEPES, y divididos en dos placas de
CULTIVO IN VITRO DE
08 LOS EMBRIONES (CIV)
cultivo.

Después de la fertilización, los presumibles cigotos

fueron retirados de la gota de fecundación,
lavados en medio TALP-HEPES, y divididos en dos
placas de cultivo.

El cultivo fue realizado en incubadora de cultivo

celular a 38,5°C, 5% de CO2 y humedad relativa
del 95% .
 EVALUACIÓN DEL
DESARROLLO
09 EMBRIONARIO Y DE LA
EXPRESIÓN DEL EGFP

La tasa de producción blastocistos fue evaluada al día octavo de

cultivo (D8) utilizando estereoscopio (Nikon SMZ 645)

La evaluación de la expresión del eGFP fue realizada visualmente,

en blastocistos al D8, por medio de la exposición a la luz blanca y
ultravioleta en estereomicroscopio
03
RESULTADOS
La mayor tasa de formación Al igual que lo encontrado en
de blastocistos se encontró los tratamientos PRE-
en T1, posiblemente debido fertilización, en el T2POS los
a que este grupo no fue blastocistos producidos fueron
sometido a la manipulación menos respecto al T1, pero sin
de remoción de las células desviaciones significativas lo
de los cúmulos y además que confirma que las
permanecieron por 20 h en condiciones de CIV no
incubación con los afectaron la producción de
espermatozoides durante el blastocistos al D8 .
proceso de FIV.
Se verifico el 5,5% de los ovocitos del T4PRE
y el 3,5% del T4POS se desarrollaron hasta
blastocisto al día ocho, estos porcentajes
difirieron de los tratamientos T1, PRE y POS
sugiriendo, que la tasa de producción de
blastocistos estuvo influenciada por la
presencia del vector lentiviral, cuando este
fue microinyectado antes y después de la
fertilización.

La inyección de vectores lentivirales

en el espacio perivitelino de cigotos de
bovinos logró que entre el 21% y el 22%
de los cigotos infectados se
desarrollaron hasta el estadio de
blastocistos.
En el tratamiento T4PRE el 100% de los
blastocistos producidos al día ocho
expresaron el transgén de interés (eGFP),
mientras que, solo el 71,4% de los
blastocistos producidos en el T4POS
expresaron la proteína eGFP.

Se obtubo la expresión de la proteína eGFP en

embriones bovinos en el estadio de blastocisto
con un vector lentiviral.
A y B corresponden al T4PRE.
C y D corresponden al T4POS.
Micrografía de campo claro (A y C) y de campo
oscuro (B y D) expuestos a la radiación
ultravioleta, estereomicroscopio (Nikon,
SMZ800, filtro de 450-490nm).
04
CONCLUSIONES
 CONCLUSIONES
Las condiciones de cultivo utilizadas y el método de microinyección
del vector lentiviral fueron adecuadas.

El vector lentiviral influyó en el desarrollo embrionario, deducido a

partir del porcentaje de blastocistos encontrado en T4PRE y T4POS.

La expresión del transgén en los cigotos producidos fue alta,

indicando que las técnicas aquí empleadas (PRE y POS fertilización)
son altamente eficientes para la obtención de animales transgénicos
al compararse con los reportes de la literatura.

La inyección PRE fertilización resultó mayor tasa (p<0,05) de

producción embriones transgénicos.
BIBLIOGRAFÍA
-RAFAEL OTERO-ARROYO, DARWIN HERNÁNDEZ-HERRERA, JAIR PÉREZ .(2019).
Producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre
y pos fertilización. Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial,18(1). 64-
73, DOI:http://dx.doi.org/10.18684/bsaa.v18n1.1412. Obtenido de:
file:///C:/Users/Usuario/Downloads/DialnetProduccionDeEmbrionesTransgenicosBovinosPo
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-Sandoval, A. & Armendáriz, J. & Salazar, A. & Díaz, R . (2013). Capítulo 27: Terapia génica. En
Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud (255-257). México:
McGraw Hill.
-Cremades, N. (1970) Microinyeccion y maduracion in vitro de Espermatidas, Dialnet.
Universidad Miguel Hernández. Available at: https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?
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Cascales, L., García-Osorio, O., Ten, J., Girela, J. L., Moliner, B., de Juan, J., & Bernabeu, R.
(2015). Influencia de la criptozoospermia y la azoospermia obstructiva en la calidad
embrionaria tras microinyección intracitoplasmática de espermatozoides. Medicina
Reproductiva y Embriología Clínica, 2(2), 62-69.
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