Aislamiento de bacterias participes en el ciclo del fósforo a partir de un cuerpo fluvial artificial

Isolation of bacteria involved in the phosphorus cycle from an artificial river body
Luis Alexander Baloco Sanchez, Daniela Guerrero Rivera, Anny Marcela Sanchez Guerra, Emerson
Yesid Zamora Adrada.
Laboratorio de Microbiología Ambiental, Facultad de Ciencias Básicas
e-mail: daniela.guerrero04@usc.edu.co

RESUMEN

Antecedentes. El ciclo del fósforo es un ciclo biogeoquímico, el cual explica como es el movimiento
del elemento dentro de un ecosistema determinado. La importancia del fósforo en el planeta se debe
a que constituye los fosfolípidos de la membrana celular y del material genético cumpliendo
funciones en el metabolismo energético celular, en procesos de fotosíntesis, glucolisis, respiración y
síntesis de ácidos grasos. Los microorganismos solubilizadores de fósforo cumplen un papel
fundamental en el ciclo debido a su capacidad de solubilizar fosfatos mediante enzimas bacterianas
como lo son las fosfatasas, que catalizan la hidrolisis de esteres y anhidros del ácido fosfórico.
Objetivo. Comprobar la capacidad bacteriana de solubilizar fósforo en un cuerpo fluvial artificial y
aprender como influyen los microorganismos en el ciclo del fósforo. Metodología. Para aislar
bacterias solubilizadoras de fósforo se realizó de primero un pre-enriquecimiento de la muestra en
agar SMRS 1 sin indicador, luego se realizó dilaciones seriadas hasta 10 -4 sembrando masivamente
las diluciones 10-1, 10-3 y 10-4 en agar Pikovskaya y SMRS1 con indicador de pH por duplicado para
por último realizar tinción de Gram. Resultados. Para el recuento en placa de Pikovskaya y SMRS 1
con indicador de pH se obtuvo como resultado >1*102 UFC/ ml de cuerpo fluvial artificial para las
diluciones 10-1, >1*104 UFC/ ml de cuerpo fluvial artificial para las diluciones 10 -3 en las placas A y B,
mientras que para la dilución 10 -4 de Pikovskaya las placas A - B dieron 6,0x10 7 UFC/ ml de cuerpo
fluvial artificial y las placas A - B de SMRS1 dieron 6,4x10 7 UFC/ ml de cuerpo fluvial artificial y
6,5x107 UFC/ ml de cuerpo fluvial artificial respectivamente. Para las tinciones de Gram todas las
muestras analizadas fueron bacilos Gram negativos con morfologías macroscópicas de colonias
blancas transparentosa. Conclusiones. No se puede negar afirmar o negar la presencia de
microorganismos solubilizadores de fósforo en el cuerpo fluvial artificial, el crecimiento de los
microrganismos solubilizadores de fosforo para el recuento en placa no cumplió con el rango
establecido de 30-300 colonias, por lo tanto, se afirma que el recuento no es el óptimo disminuyendo
así su nivel de confiabilidad y las bacterias solubilizadoras de fósforo influyen de manera
significativa en el ciclo del fósforo al facilitar la movilidad del elemento en el ecosistema.

Palabras clave: Bacterias solubilizadoras de fósforo, Cuerpo fluvial artificial, Ciclo del fósforo, Halos
de hidrolisis.
 ABSTRACT

Background. The phosphorus cycle is a biogeochemical cycle, which explains what the movement of
the element within a given ecosystem is like. The importance of phosphorus on the planet is due to
the fact that it constitutes the phospholipids of the cell membrane and of the genetic material fulfilling
functions in the cellular energy metabolism, in processes of photosynthesis, glycolysis, respiration
and synthesis of fatty acids. The phosphorus cycle is a biogeochemical cycle, which explains what
the movement of the element within a given ecosystem is like. The importance of phosphorus on the
planet is due to the fact that it constitutes the phospholipids of the cell membrane and of the genetic
material fulfilling functions in the cellular energy metabolism, in processes of photosynthesis,
glycolysis, respiration and synthesis of fatty acids.Goal. Check the bacterial capacity to solubilize
phosphorus in an artificial river body and learn how microorganisms influence the phosphorus cycle.
Methodology. In order to isolate phosphorus solubilizing bacteria, the sample was first pre-enriched in
SMRS 1 agar without indicator, then serial dilations were carried out until 10 -4, massive seeding of the
dilutions 10-1. 10-3 and 10-4 in Pikovskaya agar and SMRS1 with duplicate pH indicator for finally
Gram stain. Results. For the plate count of Pikovskaya and SMRS 1 with pH indicator, results were
>1*102 CFU/ ml of artificial fluvial body for dilutions 10 -1, >1*104 CFU/ ml of artificial fluvial body for
dilutions 10-3 in plates A and B, while for the Pikovskaya dilution 10-4 the plates A - B gave 6.0x107
CFU/ ml of artificial fluvial body and the plates A - B of SMRS1 gave 6.4x107 CFU/ ml of artificial
fluvial body and 6.5x107 CFU/ ml of artificial fluvial body respectively. For Gram stains all samples
analyzed were Gram-negative bacilli with macroscopic morphologies of transparent white colonies.
Conclusions. The presence of phosphorus solubilizing microorganisms in the artificial fluvial body
cannot be denied, growth of phosphorus solubilizing microorganisms for plate counting did not meet
the established range of 30-300 colonies, therefore, it is stated that the count is not optimal thus
decreasing its level of reliability and phosphorus solubilizing bacteria significantly influence the
phosphorus cycle by facilitating the mobility of the element in the ecosystem.

Key words: Artificial river body, Hydrolysis halos, Phosphorus-solubilizing bacteria, Phosphorus
cycle.

INTRODUCCIÓN para que distintos elementos sean reciclados.

El fósforo es importante porque este elemento
constituye los fosfolípidos de la membrana
celular y del material genético cumpliendo
funciones en el metabolismo energético
celular, en procesos de fotosíntesis, glucolisis,
respiración y síntesis de ácidos grasos
(Corrales Ramírez., 2014).
El ciclo del fósforo describe el movimiento del
elemento dentro de un ecosistema
determinado formando parte de los ciclos
biogeoquímicos, en el que la vida y los
elementos inorgánicos mantiene un balance
El fósforo es un elemento no metálico,
multivalente y sumamente reactivo que se
encuentra en la naturaleza en los sedimentos
rocosos y en el cuerpo de los seres vivos
(Editorial Etecé, 2021).
En comparación con otros ciclos bioquímicos
como el del agua, el carbono y el nitrógeno,
este ciclo es sedimentario, lo que significa que
el ciclo es más lento porque el fósforo se
encuentra principalmente en los sedimentos
del suelo y el agua. Es un ciclo bastante
relevante debido a la escasa cantidad de
fósforo que existe en comparación a otros tinción de Gram a las colonias presentes en
elementos (Aldariz, 2022). los agares.
Los microorganismos en el ciclo de fósforo se
han convertido en un tema de investigación
importante para la agricultura, por ende, se RESULTADOS
buscan microrganismos solubilizadores de
fosfatos, donde se destacan Bacillus sp, Para la siembra masiva en superficie de
Stenotrophomonas sp, Burkholderia sp, microrganismos de un cuerpo fluvial artificial
Pseudomonas so, Rhiobium sp, Vibrio para las placas A y B con medio de cultivo
proteolyticus, Enterobacter aerogenes y Pikovskaya ,10-1, 10-3 y 10-4 como se puede
Streptomyces sp (Corrales, 2014). La observar en las figuras 1, 2, 3, 4, 5 y 6,
presencia de estos microorganismos en el presentaron un crecimiento mayor al optimo
ecosistema aumenta la cantidad de iones de del rango de 30-300 colonias, donde el
fosforo, al hidrolizar mediante la enzima resultado del recuento en placa se puede
fitasas los fosfatos inorgánicos, lo cual facilita observar en la tabla 1.
la movilidad de este elemento en el ambiente
y lo convierte en un compuesto accesible para Diluciones Muestra A Muestra B
las plantas. 10-1 >1*102 UFC/ >1*102 UFC/
ml de ml de
Como se mencionó anteriormente este ciclo cuerpo cuerpo
es lento y en comparación con los otros ciclos fluvial fluvial
no contiene una fase gaseosa, por lo tanto, artificial artificial
permanece en el ecosistema como un 10 -3
>1*10 UFC/ >1*104 UFC/
4

elemento limitante, esto afecta el crecimiento ml de ml de

microbiano de solubilizadores de fósforo cuerpo cuerpo
especialmente en ecosistemas acuáticos de fluvial fluvial
agua dulce. artificial artificial
10 -4
6,0x10 7
6,0x107
MATERIALES Y MÉTODOS UFC/ ml de UFC/ ml de
cuerpo cuerpo
fluvial fluvial
La práctica se realizó con una muestra de artificial artificial
agua de un cuerpo fluvial artificial. Tabla 1. Recuento en placa por superficie de
El procedimiento a seguir fue tomar 50 ml de los medios de cultivo Pikovskaya.
la muestra con ayuda de una pipeta, la cual
se pasó a un erlenmeyer con 45 mL con
medio SMRS1 sin indicador de pH, se dejó
incubar a 30°C durante 2 días, pasado el
tiempo se procedió a realizar diluciones
seriadas hasta 10-5, sembrando por superficie
masivamente 0.1 mL de las diluciones 10 -1,10-
3
y 10 -4 por duplicado en agares SMRS1 con
indicador de pH y agar Pikovskaya por
duplicado, se dejó incubando a 30°C durante
48 horas, a las placas se le procedió hacer
recuento en placa y por último, se realizó

Figura 1. Siembra masiva Agar Pikovskaya de
la dilución 10-1 muestra A.
Figura 2. Siembra masiva en Agar Pikovskaya
de la dilución 10-1 muestra B.
Figura 3. Siembra masiva en Agar Pikovskaya
de la dilución 10-3 muestra A.
Figura 4. Siembra masiva en Agar Pikovskaya
de la dilución 10-3 muestra B.
Figura 5. Siembra masiva en Agar Pikovskaya
de la dilución 10-4 muestra A.
Figura 6. Siembra masiva Agar Pikovskaya de
la dilución 10-4 muestra B.
Se debe tener en cuenta que para realizar el
recuento en placa de la dilución 10-4 se dividió
la placa en cuatro y se realizó el conteo a uno
de los cuadrantes y luego se multiplico por 4
para calcular un recuento aproximado, como
se puede observar en la figura 7.
Figura 7. Recuento en placa en Agar
Pikovskaya de la dilución 10-4 muestra A y B. Figura 8. Siembra masiva en Agar SMRS1
con indicador de pH de la dilución 10 -1
Para la siembra masiva en superficie de muestra A.
microrganismos de un cuerpo fluvial artificial
para las placas A y B con medio de cultivo
SMRS 1 con indicador de pH 10-1, 10-3 y 10-4
como se puede observar en las figuras 8, 9,
10, 11, 12 y 13, presentaron un crecimiento
mayor al optimo del rango de 30-300 colonias,
donde el resultado del recuento en placa se
puede observar en la tabla 2.

Diluciones Muestra A Muestra B

10-1 >1*10 UFC/ >1*102 UFC/
2

ml de ml de
cuerpo cuerpo
Figura 9. Siembra masiva en Agar SMRS1
fluvial fluvial
artificial artificial con indicador de pH de la dilución 10 -1
10-3 >1*104 UFC/ >1*104 UFC/ muestra B.
ml de ml de
cuerpo cuerpo
fluvial fluvial
artificial artificial
10-4 6,4x107 6,5x107
UFC/ ml de UFC/ ml de
cuerpo cuerpo
fluvial fluvial
artificial artificial
Tabla 2. Recuento en placa por superficie de
los medios de cultivo SMRS 1 con indicador Figura 10. Siembra masiva en Agar SMRS1
de pH. con indicador de pH de la dilución 10 -3
muestra A.
 para calcular un recuento aproximado, como
se puede observar en la figura 14.

Figura 11. Siembra masiva en Agar SMRS1

con indicador de pH de la dilución 10 -3
muestra B. Figura 14. Recuento en placa en Agar SMRS1
con indicador de pH de la dilución 10-4
muestra A y B.

Los resultados arrojados por la tinción de

Gram para la siembra masiva en Agar
Pikovskaya de las diluciones 10 -1, 10-3 y 10-4
fueron bacilos Gram negativos y Levaduras
como se pueden observar en las figuras 15,
16, 17, 18, 19 y 20.

Figura 12. Siembra masiva en Agar SMRS1

con indicador de pH de la dilución 10 -4
muestra A.

Figura 15. Tinción de Gram de las colonias

blancas transparentosas donde se observaron
Figura 13. Siembra masiva en Agar SMRS1 levaduras y bacilos Gram negativos de la
con indicador de pH de la dilución 10 -4 dilución 10-1 de la muestra A.
muestra B.
Se debe tener en cuenta que para realizar el
recuento en placa de la dilución 10 -4 se dividió
la placa en cuatro y se realizó el conteo a uno
de los cuadrantes y luego se multiplico por 4
Figura 16. Tinción de Gram de las colonias Figura 17. Tinción de Gram de las colonias
blancas transparentosas donde se observaron blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-1 de la muestra B. dilución 10-3 de la muestra B.

Figura 18. Tinción de Gram de las colonias

Figura 16. Tinción de Gram de las colonias blancas transparentosas donde se observaron
blancas transparentosas donde se observaron levaduras y bacilos Gram negativos de la
levaduras y bacilos Gram negativos de la dilución 10-4 de la muestra A.
dilución 10-3 de la muestra A.
Figura 19. Tinción de Gram de las colonias Figura 21. Tinción de Gram de las colonias
blancas transparentosas donde se observaron blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-4 de la muestra B. dilución 10-1 de la muestra B.

Los resultados arrojados por la tinción de

Gram para la siembra masiva en Agar
SMRS11 con indicador de pH de las
diluciones 10-1, 10-3 y 10-4 fueron bacilos Gram
negativos y Levaduras como se pueden
observar en las figuras 20, 21, 22, 23, 24 y 25.

Figura 22. Tinción de Gram de las colonias

blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-3 de la muestra A.

Figura 20. Tinción de Gram de las colonias

blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-1 de la muestra A.
Figura 23. Tinción de Gram de las colonias
blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-3 de la muestra B.
Figura 24. Tinción de Gram de las colonias
blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-4 de la muestra A.
Figura 25. Tinción de Gram de las colonias
blancas transparentosas donde se observaron
levaduras y bacilos Gram negativos de la
dilución 10-4 de la muestra B.
DISCUSIÓN
Durante el estudio de los resultados se logra
observar algunos microrganismos con
potencial para solubilizar el fósforo presente
en los fosfatos de un medio, teniendo en
cuenta que la mayoría de los microrganismos
solubilizadores hacen parte del grupo PGPM,
que son aquellos con potencial promotor para
el crecimiento de las plantas, en el cual no
solo se encuentran bacterias si no algunos
hongos que presentan la capacidad de
solubilizar fosfatos minerales que han sido
fijados en los medios como en el agar
Pikovskaya o el medio SMRS1 enriquecido
con fosfato tricálcico, los cuales permiten un
óptimo crecimiento de estos microorganismos
(Beltrán, 2015). Entre los géneros de
microrganismos comúnmente asociados a los
procesos de solubilización del fosforo se
encuentran algunos hongos y bacterias
siendo entre las bacterias los géneros
Bacillus spp. los más comunes como se logra
observar en las figuras de la 15 a la 25, en la
cual se puede diferenciar la presencia de
bacilos Gram negativos y algunas levaduras
(Innovatione AgroFood Design, 2021). Estos
microorganismos en especial el género
Bacillus sp tiene un buen crecimiento en
medios enriquecidos como lo son el agar
Pikovskaya debido a su composición que
consta de fosfatos como lo son el fosfato de
calcio y cloruro de fósforo, que son
recomendados para detectar la solubilización
de estos por microrganismos (Pikovskaya
Agar, 1919), y el agar SMRS1 el cual esta
enriquecido con fosfatos tricálcicos que
permite crear una zona clara en los
alrededores de las colinas debido a la
solubilización de fosfatos mediante enzimas
bacterianas como lo son las fosfatasas, que
catalizan la hidrolisis de esteres y anhidros del
ácido fosfórico (Corrales, 2014). Como se
puede evidenciar en las figuras de la 1 a la 13
el crecimiento de los microrganismos supera
las capacidades contables en las diluciones
10-1 y 10-3 como se observar en la tabla 1 y 2
para el recuento en placa por superficie, esto
pudo ser debido al pre-enriquecimiento
realizado en el caldo SMRS1 sin indicador de
pH que al sembrarlo en los agares Pikovskaya
y SMRS1 con indicador de pH favoreció al
crecimiento microbiano siendo su recuento de
>1*102 UFC/ ml de cuerpo fluvial artificial y
>1*104 UFC/ ml de cuerpo fluvial artificial en
las diluciones por duplicados (Ramírez, 2017).
Para las diluciones en 10 -4 en agar
Pikovskaya se logró obtener un recuento de
6.0x10^7 UFC/ml de cuerpo fluvial artificial en
las muestras por duplicado (tabla 1) debido a
que esta era la dilución mayor, la cual
presentaba una concentración menor de
microrganismos como se evidencia en las
figuras 5 y 6; al igual que en el agar SMRS1 la
dilución 10-4 en la muestra A presento un
recuento de 6.4x107 UFC/ ml de cuerpo fluvial
artificial mientras que para la muestra b el
recuento fue de 6.5x107 UFC/ ml de cuerpo
fluvial artificial (tabla 2). Se esperaba
evidenciar la formación de halos de
aclaramiento en los medios SMRS1 con el fin
de determinar si los microrganismos aislados
presentaban capacidad enzimática para
solubilizar el fosfato tricálcico presente en
este medio además de un cambio de color del
medio por el indicador de pH (Becerra, 2011),
sin embargo esto no se logró evidenciar como
se puede observar en las figuras de la 1 a la
13, principalmente porque los microrganismos
asilados aunque tengan forma de bacilos y
pertenezcan al género Bacillus spp, estos no
poseen la capacidad enzimática de solubilizar
los fosfatos, además la falta de presencia de
halos de hidrolisis, se puede deber a la
cantidad de microrganismos en el recuento ya
que es más del estimado en su densidad
poblacional impidiendo así la formación de
halos en el medio. Finalmente
complementando el análisis de los resultados
obtenidos se encuentra que en las tinciones
realizadas tanto para los microrganismos en
el agar Pikovskaya y el agar SMRS1 el
género que se evidencio fue Bacillus sp Gram
negativos con morfologías macroscópicas de
colonias blancas transparentosa; además de
la presencia de algunas levaduras,
posiblemente pertenecientes al género
Hanseniaspora presentes comúnmente en
lagos artificiales (Silva Bedoya, L. 2012).
CONCLUSIONES
 Con este estudio no se logró
evidenciar halos de hidrolisis de los
microrganismos solubilizadores de
fósforo debido al alto crecimiento
poblacional de los microrganismos,
más no por la falta de los mismo en el
cuerpo fluvial artificial.
 No se puede negar afirmar o negar la
presencia de microorganismos
solubilizadores de fósforo en el
cuerpo fluvial artificial.
 El crecimiento de los microrganismos
solubilizadores de fosforo para el
recuento en placa no cumplió con el
rango establecido de 30-300 colonias,
por lo tanto, se afirma que el recuento
no es el óptimo disminuyendo así su
nivel de confiabilidad.
 Se recomienda para futuros estudios
que para optimizar los resultados se
deben sembrar diluciones mayores a
la 10-4.
 Las bacterias solubilizadoras de
fósforo influyen de manera
significativa en el ciclo del fósforo al
facilitar la movilidad del elemento en
el ecosistema.
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fósforo o ciclo biogeoquímico del fósforo.
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