Manual de Laboratorio

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
PRÁCTICA No. 1
Bacterias
OBJETIVOS
• Realizar la técnica de siembra y recuento en superficie a partir de una muestra de interés industrial.
• Realizar la técnica de siembra por aislamiento a partir de una muestra de interés industrial.
• Comprobar la utilidad que tienen los medios de cultivos enriquecidos, selectivos y diferenciales
para el aislamiento e identificación de bacterias.
• Reconocer diferentes morfologías, agrupaciones y otros aspectos a nivel macroscópico de
bacterias.
• Observar y caracterizar diferentes estructuras bacterianas a nivel microscópico empleando
diferentes métodos de tinción.
1. INTRODUCCIÓN
Los organismos más simples que viven en la tierra hoy en día son las bacterias. Demasiado pequeñas
para verlas a simple vista, las bacterias son las más abundantes de todos los organismos y son las
únicas que se caracterizan por la organización celular procariota. La vida en la Tierra no podría existir
sin bacterias ya que hacen posible muchas de las funciones esenciales de los ecosistemas, incluyendo
la captura de nitrógeno de la atmósfera, la descomposición de la materia orgánica y, en muchas
comunidades acuáticas, la fotosíntesis. De hecho, se cree que la fotosíntesis bacteriana ha sido la
fuente de gran parte del oxígeno en la atmósfera terrestre. La investigación bacteriana continúa
proporcionando conocimientos extraordinarios sobre genética, ecología y medicina.
2. CONSULTAS PRELIMINARES
• Mencione algunos productos que se obtienen a partir de bacterias.

• ¿Qué son los mecanismos de resistencia y virulencia? Mencione algunos característicos de las
bacterias.
• ¿Cómo interactúan los colorantes de la tinción de Gram con la pared celular?
• ¿Cómo se vería una endoespora bacteriana cuando se usa la tinción de Wayson y la de verde
malaquita?
• ¿En qué consiste la tinción de Ziehl Neelsen?
• ¿Cuál es el papel de las bacterias en el tratamiento de residuos domésticos?
• ¿Qué diferencias existen en la digestión aerobia y digestión anaerobia de residuos domésticos?
Lectura Obligatoria: Zhao K, Xu R, Zhang Y, Tang H, Zhou C, Cao A, Guozhu Z, Guo H. Development
of a novel compound microbial agent for degradation of kitchen waste. Brazilian Journal of
Microbiology, 2017; 48, 442 – 450.
3. FUNDAMENTO TEÓRICO
Las bacterias son las formas de vida más antiguas, estructuralmente más simples y más abundantes
en la tierra. También son los únicos organismos con organización celular procariota. Representadas
en las rocas más antiguas de las que se han obtenido fósiles, de 3,5 a 3,8 mil millones de años, las
bacterias fueron abundantes durante más de 2 mil millones de años antes de que los eucariotas
aparecieran en el mundo. Las bacterias fotosintéticas (cianobacterias) alteraron la atmósfera terrestre
con la producción de oxígeno que conduce a una diversidad bacteriana y eucariota. Las bacterias
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desempeñan un papel vital tanto en la productividad como en el ciclo de las sustancias esenciales
para todas las otras formas de vida.
Actualmente se reconocen cerca de 5000 tipos diferentes de bacterias, pero sin duda hay muchos
miles más a la espera de una identificación adecuada. En los años 70s y 80s se analizó un nuevo tipo
de bacteria que eventualmente condujo a la clasificación de un nuevo tipo de células procariotas, la
archeabacteria (o Archaea) y que hoy en día representan un dominio diferente a Eukarya y Prokarya.
Incluso cuando se ven con un microscopio electrónico, las diferencias estructurales entre las diferentes
bacterias son menores en comparación con otros grupos de organismos. Debido a que las diferencias
estructurales son tan leves, las bacterias se clasifican principalmente en función de sus características
metabólicas y genéticas. Las bacterias se pueden caracterizar adecuadamente sólo cuando se cultivan
en un medio definido porque las características de estos organismos a menudo cambian, dependiendo
de sus condiciones de crecimiento.
Las bacterias son omnipresentes en la Tierra. Muchos de los ambientes más extremos en los que se
encuentran las bacterias serían letales para cualquier otra forma de vida. Las bacterias viven en aguas
termales, ambientes hipersalinos que deshidrataran otras células y en atmósferas ricas en gases
tóxicos como metano o sulfuro de hidrógeno que matarían a la mayoría de los otros organismos. Estos
ambientes ásperos pueden ser similares a las condiciones presentes en la Tierra temprana, cuando la
vida comenzó. Es probable que las bacterias evolucionaron a vivir en estas duras condiciones
temprano y han conservado la capacidad de explotar estas áreas como el resto de la atmósfera ha
cambiado.
3.1 Morfología Bacteriana

Las bacterias son en su mayoría simples en forma y exhiben tres tipos de morfologías básicas: bacilo
recto y en forma de barra, cocos esféricos y espirilos largos y helicoidales, también llamado
espiroqueta. Las espiroquetas generalmente no forman asociaciones con otras células y nadan
individualmente a través de sus ambientes. Tienen una estructura compleja dentro de sus membranas
celulares que les permiten girar sus cuerpos en forma de sacacorchos que los impulsa a lo largo.
Algunas bacterias en forma de bacilos y cocos forman colonias, adheridas de extremo a extremo
después de que se han dividido, formando cadenas. Algunas colonias bacterianas crecen en
filamentos largos, ramificados o forman estructuras erectas que liberan esporas, cuerpos unicelulares
que se convierten en nuevos individuos bacterianos. Algunas bacterias filamentosas son capaces de
deslizarse por el movimiento, a menudo combinadas con la rotación alrededor de un eje longitudinal.
3.2 Diferenciación
Los Procariotas -eubacteria y archaea- difieren de los eucariotas en numerosas características

importantes. Estas diferencias representan algunas de las distinciones más fundamentales que
separan a los procariotas de cualquier otro grupo de microorganismos.
1. Multicelularidad. Todos los procariotas son fundamentalmente unicelulares. En algunos tipos, las
células individuales se adhieren entre sí dentro de una matriz y forman filamentos, sin embargo las
células conservan su individualidad. Las cianobacterias, en particular, son propensas a formar tales
asociaciones, pero su citoplasma no está directamente interconectado, como suele suceder en los
eucariotas multicelulares. Las actividades de una colonia bacteriana son menos integradas y
coordinadas que las de los eucariotas multicelulares. Una forma primitiva de organización colonial
ocurre en las bacterias de deslizamiento, que se mueven juntas y forman esporas. Tales formas
multicelulares coordinadas son raras entre las bacterias.
2. Tamaño de la célula. A medida que se descubren nuevas especies de bacterias, descubrimos que
el tamaño de las células procariotas varía enormemente, en hasta cinco órdenes de magnitud. La
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mayoría de las células procariotas tienen sólo 1 micrómetro o menos de diámetro. La mayoría de las
células eucarióticas tienen más de 10 veces ese tamaño.
3. Cromosomas. Las células eucariotas tienen un núcleo de membrana que contiene cromosomas
compuestos de ácidos nucleicos y proteínas. Las bacterias no tienen núcleos ligados a la membrana,
ni tienen cromosomas del tipo presente en eucariotas, en el que el ADN forma un complejo estructural
con proteínas. En cambio, su ADN circular desnudo se localiza en una zona del citoplasma llamada
nucleoide.
4. División celular y recombinación genética. La división celular en eucariotas tiene lugar por mitosis
e implica husos compuestos de microtúbulos. La división celular en las bacterias tiene lugar
principalmente por fisión binaria. La reproducción sexual verdadera ocurre solamente en eucariotas e
implica la singamia y la meiosis, con una alternancia de formas diploides y haploides. A pesar de su
falta de reproducción sexual, las bacterias tienen mecanismos que conducen a la transferencia de
material genético. Estos mecanismos son mucho menos regulares que los de los eucariotas y no
implican la participación igualitaria de los individuos entre los cuales se transfiere el material genético.
5. Compartimentación interna. En eucariotas, las enzimas para la respiración celular se envasan en

las mitocondrias. En las bacterias, las enzimas correspondientes no se envasan por separado sino
que se unen a las membranas celulares. El citoplasma de las bacterias, a diferencia de los eucariotas,
no contiene compartimentos internos ni citoesqueleto y organelos excepto ribosomas.
6. Flagelo. Los flagelos bacterianos son de estructura simple, compuestos de una sola fibra de la
proteína flagelina. Los flagelos eucariotas son complejos y tienen una estructura 9 + 2 de microtúbulos.
Los flagelos bacterianos también funcionan de manera diferente, girando como hélices, mientras que
los flagelos eucariotas tienen un movimiento parecido a un hilo.
7. Diversidad metabólica. Sólo un tipo de fotosíntesis se produce en eucariotas e implica la liberación

de oxígeno. Las bacterias fotosintéticas tienen varios patrones diferentes de fotosíntesis anaeróbica y
aeróbica, involucrando la formación de productos finales como azufre, sulfato y oxígeno. Las células
procariotas también pueden ser quimioautotrófas utilizando la energía almacenada en enlaces
químicos de moléculas inorgánicas para sintetizar carbohidratos.
3.3 Superficie Bacteriana
La pared celular bacteriana es una estructura importante porque mantiene la forma de la célula y
protege a la célula del hinchamiento y la ruptura. La pared celular suele consistir en peptidoglicano,
una red de moléculas de polisacáridos conectados por enlaces cruzados polipéptidicos. En algunas
bacterias, el peptidoglicano forma una red gruesa y compleja alrededor de la superficie externa de la
célula. Esta red está entrelazada con cadenas peptídicas. En otras bacterias una fina capa de
peptidoglicano se encuentra intercalada entre dos membranas plasmáticas. La membrana externa
contiene grandes moléculas de lipopolisacáridos, lípidos con cadenas de polisacáridos unidas. Estos
dos tipos principales de bacterias pueden identificarse usando un proceso de tinción llamado tinción
de Gram. Las bacterias Gram positivas tienen la pared más gruesa del peptidoglicano y se tiñen de un
color púrpura. Las bacterias Gram negativas más comunes contienen menos peptidoglicano y no
conservan el colorante de color púrpura quedando rosadas. La capa de membrana externa hace que
las bacterias Gram negativas resistan a muchos antibióticos que interfieren con la síntesis de la pared
celular en bacterias Gram positiva. En algunos tipos de bacterias, una capa gelatinosa adicional, la
cápsula, rodea la pared celular.
Muchos tipos de bacterias tienen flagelos delgados y rígidos compuesto de la proteína flagelina. Estos
flagelos varían de 3 a 12 micrómetros de longitud y son muy finos, sólo de 10 a 20 nanómetros de
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espesor. Están anclados en la pared celular y giran tirando de las bacterias a través del agua como
una hélice.
El Pili (singular, pilus) son otras estructuras más cortas que los flagelos bacterianos y ayudan a las
células bacterianas a adherirse los sustratos apropiados y el intercambio de información genética.
Algunas bacterias forman endosporas de paredes gruesas alrededor de su cromosoma y una pequeña
porción del citoplasma circundante cuando están expuestas a condiciones pobres en nutrientes. Estas
endosporas son altamente resistentes al estrés ambiental, especialmente el calor, y pueden germinar
para formar nuevos individuos después de décadas o incluso siglos.
3.4 Estructura Interna

La característica fundamental de las células bacterianas es su organización procarióta. Las células
bacterianas carecen de la compartimentación funcional extenso observado dentro de las células
eucariotas.
1. Membranas internas. Muchas bacterias poseen regiones invaginadas de la membrana plasmática

que funcionan en la respiración o la fotosíntesis.
2. Región del nucleótido. Las bacterias carecen de núcleos y no poseen los cromosomas complejos
característicos de los eucariotas. En su lugar, sus genes están codificados dentro de un único anillo
de doble cadena de ADN que se amontonan en una región de la célula conocida como la región
nucleóide. Muchas células bacterianas también poseen pequeños círculos de ADN que se replican
independientemente llamados plásmidos. Los plásmidos contienen sólo unos pocos genes,
generalmente no esenciales para la supervivencia de la célula. Se los considera mejor como una
porción extirpada del cromosoma bacteriano.
3. Ribosomas. Los ribosomas bacterianos son más pequeños que los de eucariotas y difieren en el
contenido de proteína y ARN. Los antibióticos como la tetraciclina y el cloranfenicol pueden decir
la diferencia: se unen a los ribosomas bacterianos y bloquean la síntesis de proteínas, pero no se
unen a los ribosomas eucarióticos.
3.5 Mutación
Las mutaciones pueden surgir espontáneamente en las bacterias, ya que se producen errores en la
replicación del ADN. Ciertos factores tienden a aumentar la probabilidad de que ocurran tales errores
como radiación, luz ultravioleta y diversos productos químicos. En una bacteria típica como Escherichia
coli hay unos 5000 genes. Es muy probable que una mutación ocurra por casualidad en uno de cada
millón de copias de un gen. Con 5000 genes en una bacteria, las leyes de probabilidad predicen que
1 de cada 200 bacterias tendrá una mutación. Una cucharada de tierra típicamente contiene más de
mil millones de bacterias y por lo tanto debe contener algo del orden de 5 millones de individuos
mutantes. Con alimentos y nutrientes adecuados, una población de E. coli puede duplicarse en menos
de 20 minutos. Debido a que las bacterias se multiplican tan rápidamente, las mutaciones pueden
propagarse rápidamente en una población y pueden cambiar las características de esa población. La
capacidad de las bacterias para cambiar rápidamente en respuesta a nuevos desafíos a menudo tiene
efectos adversos en los seres humanos. Recientemente han aparecido varias cepas de
Staphylococcus aureus asociadas a infecciones graves en pacientes hospitalizados, algunas de ellas
con frecuencia alarmante. Desafortunadamente, estas cepas han adquirido resistencia a la penicilina
de modo que las infecciones causadas por ellos son muy difíciles de tratar. Las infecciones por
estafilococos proporcionan un excelente ejemplo de la forma en que la mutación y la selección
intensiva pueden provocar un cambio rápido en las poblaciones bacterianas.
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4. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA
a. Normas de seguridad:
El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.
b. Equipos de protección personal:
Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:
• Bata de laboratorio.
• Guantes de nitrilo.
• Gafas de seguridad.
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.
c. Manejo de residuos químicos:
Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:
• Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales
están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.
• Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.
• No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo.
5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES
Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:
ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

1 Cultivo de Staphylococcus aureus 1 UN
2 Cultivo de Escherichia coli 1 UN
3 Cultivo de Bacillus subtilis 1 UN
4 Cultivo de Streptomyces sp 1 UN
5 Paquete de Asas desechables 1 UN
6 Caja Láminas porta objetos 1 UN Por mesón de trabajo
7 Caja Laminillas cubre objetos 1 UN Por mesón de trabajo
8 90mL de Caldo Casoy estéril 1 mL
9 Cajas con Agar Casoy 7 UN
10 Cajas con Agar Chromocult 1 UN
11 Cajas con Agar Celulosa 1 UN
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12 Cajas con Agar Leche 1 UN
13 Cajas con Agar Almidón 1 UN
14 Cajas con Agar Cetrimide 1 UN
Tubos de 16 * 150 con 9mL de
15 5 UN Estériles
agua peptonada estéril
16 Rack de puntas de 1mL 1 UN Estéril
17 Frasco lavador 1 UN Por mesón de trabajo
5.2 REACTIVOS
No aplica para esta práctica.
5.3 EQUIPOS
Tabla 2. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

1 Microscopio 1 UN
2 Mechero 1 UN
3 Balanza analítica 1 UN
4 Micropipeta 100 – 1000µL 1 UN
5.4 SOLUCIONES
Tabla 3. Listado de soluciones que requieren estar listas para el día de la práctica:

1 Kit de tinción de Gram 1 UN Por mesón de trabajo
1 Aceite de Inmersión 1 UN Por mesón de trabajo
1 Verde Malaquita 1 UN Por mesón de trabajo
5.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.5.1 Desinfección del Área de Trabajo

• Desinfectar toda el área de trabajo con alcohol 70% (v/v). Deje que la superficie se seque.
• Organice todo su material de trabajo de acuerdo a lo que va a ir siendo empleado a lo largo de esta
guía.
5.5.2 Siembra y Recuento en Placa
5.5.2.1 Preparación de Diluciones

• Adicionar 10mL de la muestra en 90mL de caldo casoy estéril.
• Agitar vigorosamente durante 5 segundos. Este frasco corresponde a dilución 10-1.
• Tomar 1mL de la dilución 10-1 y adicionarlos en 9mL de agua peptonada 0.1% (p/v) estéril. Este
tubo corresponde a la dilución 10-2.
• Homogenizar la muestra con ayuda de la micropipeta.
• Realizar este procedimiento hasta completar la dilución 10-7.
5.5.2.2 Siembra en superficie

• Marcar las cajas de Petri con la siguiente información: Iniciales de los integrantes del grupo y
Dilución
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• Tomar 0.1mL de cada dilución y adicionarlo en la superficie de la caja de Petri con Agar Casoy
correspondiente a cada dilución. Realizar cambio de punta entre dilución si siembra de la dilución
más concentrada a la más diluida. Puede emplear la misma punta si siembra de la dilución más
diluida a la más concentrada.
Nota: Recuerde abrir lo menos posible las cajas de Petri y tenga mucha precaución con la cercanía al
mechero.
• Homogenice la muestra con ayuda de un asa estéril. Si cuenta con un asa metálica, flamee
previamente.
• Incubar a una temperatura de 35°C ± 2°C durante 48 horas bajo condiciones aerobias.
• Finalizado el tiempo de incubación, realizar el recuento de las UFC obtenidas empleando la
siguiente fórmula:
No. de Colonias × FD × 10
Dónde:
FD: Factor de Dilución
5.5.3 Siembra por Aislamiento/Agotamiento
• Realizar todas las siembras a partir de la dilución 10-1 preparada en el numeral anterior.
• Tomar una asada del cultivo y realice una siembra en ¼ de cada medio de cultivo (1).
• A partir de esta siembra masiva, arrastre una porción realizando un movimiento ondulatorio (2).
• Repetir este paso 2 veces más (3 y 4)
5.5.3.1 Siembra para Aislamiento de Coliformes

• Realizar siembra por agotamiento en el medio Chromocult.
• Realizar la descripción de las colonias obtenidas.
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5.5.3.2 Siembra para Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa
• Realizar siembra por agotamiento en el medio Cetrimide.
5.5.3.3 Siembra para Aislamiento de bacterias productoras enzimas

• Realizar siembra por agotamiento en los medios leche, celulosa y almidón.
5.5.4 Métodos de Tinción
5.5.4.1 Tinción de Gram

• Marcar la lámina con el nombre de la muestra.
• Adicionar una pequeña gota de agua destilada en el centro de la lámina portaobjetos.
• Tomar una pequeña porción de la colonia del cultivo.
• Homogenizar en la lámina con la gota de agua sobre toda la superficie de la lámina.
• Dejar secar al lado del mechero.
• Adicionar de 5 – 10 gotas de Cristal Violeta sobre la lámina y dejar actuar durante 1 minuto.
• Retirar el colorante con agua evitando tocar directamente la muestra.
• Adicionar de 5 – 10 gotas de Lugol sobre la lámina y dejar actuar durante 1 minuto.
• Adicionar de 5 – 10 gotas de Alcohol Acetona sobre la lámina y dejar actuar durante 30 segundos.
• Adicionar de 5 – 10 gotas de Fucsina sobre la lámina y dejar actuar durante 1 minuto.
• Observar en el microscopio las diferentes morfologías y características.
• Reporte en su bitácora los resultados obtenidos.
5.5.4.2 Tinción de Esporas

• Marcar la lámina con el nombre de la muestra.
• Adicionar una pequeña gota de agua destilada en el centro de la lámina portaobjetos.
• Tomar una pequeña porción de la colonia del cultivo.
• Homogenizar en la lámina con la gota de agua sobre toda la superficie de la lámina.
• Colocar una tira de papel de cocina sobre la lámina y saturar con colorante Verde Malaquita.
• Cuando se comiencen a emitir vapores, adicionar más colorante durante 5 minutos sin dejar que el
colorante se seque.
• Retirar la lámina del calor y retirar la tirilla de papel.
• Dejar enfriar la lámina.
• Adicionar de 5 – 10 gotas de Fucsina sobre la lámina y dejar actuar durante 2 minutos.
• Observar en el microscopio las diferentes morfologías y características.
• Reporte en su bitácora los resultados obtenidos.
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5.6 PAUTAS PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.6.1 Siembra y Recuento en Superficie

• Realice el reporte del recuento en UFC/g o UFC/mL de su muestra analizada. Consulte en la
literatura si con el resultado obtenido su muestra podría ser un potencial inóculo para el tratamiento
de residuos domésticos.
Ejemplo:
Si en la dilución 10-4 usted contó 150 colonias, entonces:
150 × 10000 × 10 = 15000000
• En microbiología, se reporta en notación científica con dos cifras significativas, luego:
15000000 = 15 × 106 𝐔𝐅𝐂/𝐦𝐋

UFC = Unidades Formadoras de Colonia
5.6.2 Siembras por Aislamiento

• Complete la tabla a continuación realizando la descripción de las colonias observadas:
Nombre de la Muestra
Agar Casoy Agar Chromocult Agar Cetrimide Agar Celulosa
Agar Almidón Agar Leche
Tenga en cuenta las siguientes características de los medios de cultivo:
Medio de Cultivo: McConkey Medio de Cultivo: Chromocult

Medio Sin Inocular Cultivo Crecido Medio Sin Inocular Cultivo Crecido
La presencia de coliformes en este medio se La presencia de coliformes en este medio se

caracteriza por la aparición de colonias rosadas. caracteriza por la aparición de colonias rojas
La flora acompañante en el medio no presenta (coliformes totales) y moradas (E. coli). Flora
estas características. acompañante no presenta estas características.
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Medio de Cultivo: Agar Cetrimide
Medio Sin Inocular Cultivo Crecido
La presencia de Pseudomonas en este medio se caracteriza por la aparición de colonias amarillas,

verdes e incluso azules que en presencia de luz UV emiten fluorescencia.
Medio de Cultivo: Almidón Medio de Cultivo: Leche

Medio Sin Inocular Cultivo Crecido Medio Sin Inocular Cultivo Crecido
La presencia de bacterias amilolíticas La presencia de bacterias proteolíticas y/o ácido

(productoras de amilasas) se evidencia por la lácticas en este medio se caracteriza por la
adición de lugol al medio de cultivo y dejando aparición de colonias con un halo traslúcido a su
actuar por 1 minuto. Las colonias donde la zona alrededor
no se colorea son productoras de enzimas.
Medio de Cultivo: Celulosa
La presencia de bacterias celulolíticas se evidencia por la adición de 15mL de una solución de rojo
Congo 0.1% (p/v) durante 15 minutos. Finalizado el tiempo de contacto de este colorante se retira el
exceso de colorante y se adicionan 15mL de NaCl 1M durante otros 15 minutos. Se retira el exceso
de solución y la producción de enzimas se evidencia por la formación de un halo traslúcido alrededor
de las colonias.
• ¿Cuáles posibles géneros pueden estar asociados al tipo de muestra dependiendo del crecimiento
en los medios de cultivo? En caso de presentarse, ¿A qué se debe el no crecimiento en alguno de
los medios de cultivo?
• ¿Qué representa el crecimiento de esos microorganismos en la muestra? Consulte en la literatura
si es común o si representa algún riesgo la presencia de las bacterias obtenidas en su muestra.
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5.6.3 Tinciones
• Complete la tabla a continuación:
Muestra Lámina en Fresco Tinción de Gram Tinción de Esporas
6 BIBLIOGRAFÍA
• Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biología de los microorganismos. 13ª
Edición. Prentice Hall International. (2014).
• López J.A, López M.J, Vargas M.C, Suárez F, Jurado M, Moreno J. Tracking organic matter and
microbiota dynamics during the stages of lignocellulosic waste composting. Bioresource
Technology, 2013; 146, 574–584.
• Mammert J. Techniques in Microbiology: A student Handbook. Pearson. (2007).
• Zhao K, Xu R, Zhang Y, Tang H, Zhou C, Cao A, Guozhu Z, Guo H. Development of a novel
compound microbial agent for degradation of kitchen waste. Brazilian Journal of Microbiolog, 2017;
48, 442 – 450.
• Zhao X, Wei Y, Fan Y, Zhang F, Tan W, He X, Xi B. Roles of bacterial community in the
transformation of dissolved organic matter for the stability and safety of material during sludge
composting. Bioresource Technology, 2018; 267, 378 - 385
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PRÁCTICA No. 2
Hongos
OBJETIVOS
• Realizar la técnica de siembra y recuento en superficie a partir de una muestra de interés industrial.
• Realizar la técnica de siembra por aislamiento a partir de un cultivo de hongos y levaduras.
• Realizar la técnica de recuento en cámara de Neubauer.
• Reconocer diferentes morfologías, agrupaciones y otros aspectos a nivel macroscópico de hongos.
• Observar y caracterizar diferentes estructuras fúngicas a nivel microscópico empleando diferentes
métodos de tinción.
1. INTRODUCCIÓN
Hasta la fecha se han descrito cerca de 80,000 a 120,000 especies de hongos, aunque el número total
de especies se estima en alrededor de 1,5 millones. Esto convertiría a los hongos en uno de los
recursos de biodiversidad menos explorados de nuestro planeta. Es notoriamente difícil delimitar los
hongos como un grupo contra otros eucariotas, y los debates sobre la inclusión o exclusión de ciertos
grupos han estado ocurriendo durante más de un siglo.
Los hongos se han caracterizado por su mecanismo de toma de nutrientes, que se lleva a cabo por
absorción, los hongos producen un amplio arsenal de enzimas que, al ser secretadas, les permiten
descomponer polímeros en moléculas más simples. Esta característica les ha conferido en gran
medida la habilidad de comportarse como parásitos, simbiontes o saprótrofos. Entre las enzimas que
producen, se incluyen las proteasas, amilasas, xilanasas, pectinasas y glucosa isomerasas que son
empleadas en la industria alimentaria, principalmente para el mejoramiento de sabores, texturas,
aromas y propiedades nutricionales. Adicionalmente, las peroxidasas, monooxidasas, lacasas y
oxidasas son utilizadas en procesos de descontaminación. Otras como las alfa-galactosidasas,
glutatión transferasas, lactasas y oxigenasas son aprovechadas en la industria farmacéutica, y las
lipasas son de gran provecho para la industria de manufactura de productos como papel, cuero y
detergentes.
• Mencione algunas organizaciones que empleen hongos (mohos/levaduras) como materia prima o
producto.
• ¿Qué son los pellets en micología? ¿Cuál es su importancia en la producción de hongos a nivel
industrial?
• Realice un diagrama en donde compare las estructuras de los principales filos de hongos:
Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota y Hongos Imperfectos.
• ¿Qué son las micorrizas? Realice un dibujo donde demuestre este tipo de relación simbiótica.
• ¿Qué son los promotores de crecimiento vegetal y controladores biológicos?
Lectura Obligatoria: Murali M, Amruthesh K.N, Sudisha J, Niranjana S.R, Shetty H.S. Screening for
plant growth promoting fungi and their ability for growth promotion and induction of resistance in pearl
millet against downy mildew disease. Journal of Phytology, 2012; 4, 30 – 36.
Los hongos son un reino distinto de organismos, que comprende alrededor de 77.000 especies
nombradas. Los micólogos, científicos que estudian los hongos, creen que puede haber muchas más
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especies en existencia. Aunque los hongos han sido tradicionalmente incluidos en el reino vegetal,
carecen de clorofila y se asemejan a las plantas sólo en su apariencia general y la falta de movilidad.
Las diferencias significativas entre hongos y plantas son las siguientes:
1. Los hongos son heterótrofos. Tal vez lo más obvio, un hongo no es verde. Prácticamente todas
las plantas son fotossintetizadores, mientras que ningún hongo tiene clorofila o lleva a cabo la
fotosíntesis. En cambio, los hongos obtienen su alimento secretando enzimas digestivas sobre el
sustrato y luego absorbiendo las moléculas orgánicas que son liberadas por las enzimas.
2. Los hongos tienen cuerpos filamentosos. Los hongos son básicamente filamentosos en su forma
de crecimiento (es decir, sus cuerpos consisten en largos filamentos delgados llamados hifas), aunque
estas hifas pueden ser empacadas juntas para formar estructuras complejas. Las plantas, por el
contrario, están hechas de varios tipos de células organizadas en tejidos y órganos.
3. Los hongos tienen modos reproductivos inusuales. La mayoría de los hongos se reproducen
sexualmente con intercambio nuclear en lugar de gametos.
4. Los hongos tienen paredes celulares hechas de quitina. Las paredes celulares de los hongos
están construidas de polisacáridos (cadenas de azúcares) y quitina, el mismo material resistente del
que está hecho el exoesqueleto del cangrejo está hecho. Las paredes celulares de las plantas están
hechas de celulosa, también un material de construcción fuerte.
5. Los hongos tienen mitosis nuclear. La mitosis en los hongos es diferente de la de las plantas o
la mayoría de los otros eucariotas: la envoltura nuclear no se descompone y se vuelve a formar. En su
lugar, la mitosis tiene lugar dentro del núcleo. Un aparato del huso forma allí, arrastrando los
cromosomas a polos opuestos del núcleo (no la célula, como en la mayoría de los otros eucariotas).
3.1 Estructura Fúngica

Los hongos existen principalmente en forma de filamentos delgados, apenas visibles al ojo humano,
que se llaman hifa (singular, hifas). Estas hifas se componen típicamente de largas cadenas de células
unidas de extremo a extremo, divididas por paredes cruzadas llamadas septos. Los septos raramente
forman una barrera completa, excepto cuando separan las células reproductivas. El citoplasma fluye
libremente a través de las hifas, pasando a través de los poros mayores de los septos. Debido a esta
transmisión, las proteínas sintetizadas a través de las hifas pueden ser llevadas a sus extremidades
que crecen activamente. Como resultado, las hifas de hongos pueden crecer muy rápidamente cuando
el alimento y el agua son abundantes y la temperatura es óptima.
Una masa de hifas conectadas se llama micelio. El micelio de un hongo constituye un sistema que, en
conjunto, puede tener muchos metros de largo. Este micelio crece y penetra su sustrato, dando por
resultado una relación única entre el hongo y su ambiente. Todas las partes de dicho hongo son
metabólicamente activas, interactuando continuamente con el suelo, la madera u otro material en el
que crece el micelio.
En dos de los tres filos de hongos, se producen estructuras reproductivas formadas de hifas
entrelazadas, como hongos, bolas y morillas, en ciertas etapas del ciclo de vida. Estas estructuras se
expanden rápidamente debido al rápido alargamiento de las hifas. Por esta razón, las setas pueden
aparecer repentinamente en su césped.
Las paredes celulares de hongos están formadas por polisacáridos y quitina, no celulosa como las de
plantas y muchos grupos de protistas. La quitina es el mismo material que constituye la mayor parte
de los exoesqueletos de los artrópodos, un grupo de animales que incluye insectos y crustáceos. El
Página | 13
carácter común de la quitina es uno de los rasgos que ha llevado a los científicos a creer que los
hongos y los animales comparten un antepasado común. La mitosis en hongos difiere de la de la
mayoría de los otros organismos. La envoltura nuclear no se rompe y se vuelve a formar; En su lugar,
el aparato de huso se forma dentro de él. Carece de centriolos, en su lugar, los hongos regulan la
formación de microtúbulos durante la mitosis con pequeñas estructuras relativamente amorfas
llamadas placas del huso. Esta combinación única de características sugiere fuertemente que los
hongos se originaron a partir de algún grupo desconocido de singulares eucariotas con estas
características.
3.2 Reproducción de Hongos

Los hongos son capaces de reproducción tanto de forma sexual como asexual. Cuando un hongo se
reproduce sexualmente, forma un cigoto diploide, al igual que los animales y las plantas. Cuando los
hongos se reproducen sexualmente, las hifas de dos tipos genéticamente diferentes se unen y se
fusionan. Una hifa hongos que contienen núcleos derivados de dos individuos genéticamente distintos
se llama hifa heterocariótica. Si todos los núcleos son genéticamente similares entre sí, se dice que la
hifa es homocariótica. Si hay dos núcleos distintos dentro de cada compartimiento de las hifas, son
dicarióticos. Si cada compartimiento tiene solamente un solo núcleo, es monocariótico. Las hifas
dicarióticas tienen algunas de las propiedades genéticas de los diploides, porque ambos genomas son
transcritos. Estas distinciones son importantes en la comprensión de los ciclos de vida de los grupos
individuales.
El citoplasma en hifas fúngicas fluye normalmente a través de septos perforados o se mueve

libremente en su ausencia. Las estructuras reproductivas son una excepción importante a este patrón
general. Cuando se forman estructuras reproductivas, se cortan con septos completos que carecen de
perforaciones o tienen perforaciones que pronto se bloquean. Tres tipos de estructuras reproductivas
se producen en los hongos:
1. Esporangios, que están involucrados en la formación de esporas.
2. Gametangios, estructuras dentro de las cuales se forman los gametos
3. Conidióforos, estructuras que producen conidias, esporas asexuadas multinucleadas.
Las esporas son un medio común de reproducción entre los hongos. Pueden formarse como resultado
de procesos asexuales o sexuales y poder ser móviles o no móviles, siendo dispersados por el viento.
Cuando las esporas aterrizan en un lugar adecuado, germinan, dando lugar a una nueva hifa de
hongos. Debido a que las esporas son muy pequeñas, pueden permanecer suspendidas en el aire
durante largos períodos de tiempo. Debido a esto, las esporas de hongos se pueden soplar a grandes
distancias desde su lugar de origen, un factor en la distribución amplio de muchos tipos de hongos.
Desafortunadamente, muchos de los hongos que causan enfermedades en plantas y animales se
propagan rápida y ampliamente por tales medios. Las esporas de otros hongos se dispersan
rutinariamente por insectos y otros animales pequeños.
4.1 Normas de seguridad:
4.2 Equipos de protección personal:
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4.3 Manejo de residuos químicos:
estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

Cajas de Agar Sabouraud con
1 3 UN
cloranfenicol
2 Cajas con Agar Rosa de Bengala 8 UN
6 Cinta transparente 1 UN
Cultivo de Sacharomyces
7 1 UN
cerevisiae
8 Cultivo de Penicillium sp 1 UN
9 Cultivo de Trichoderma sp 1 UN
10mL de Suspensión de
10 1 UN
Levaduras
10mL de Suspensión de esporas
11 1 UN
de A. niger
12 Cámara de Neubauer 1 UN
13 Capilares 1 UN
Tubos de 13 x 150 con 9mL de
14 4 UN
agua peptonada estéril
17 Mechero 1 UN
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5.2 REACTIVOS
Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

NA NA NA NA NA
5.3 EQUIPOS

1 Microscopio 1 UN
5.4 SOLUCIONES

3 Azul de Lactofenol 1 UN Por mesón de trabajo

guía.
5.5.2 Siembra y Recuento en Placa
6.1.1.1 Preparación de Diluciones

• Pesar 10g de la muestra en 90mL de caldo casoy estéril.
• Agitar vigorosamente durante 5 segundos. Este frasco corresponde a dilución 10-1.
• Tomar 1mL de la dilución 10-1 y adicionarlos en 9mL de agua peptonada 0.1% (p/v) estéril. Este
tubo corresponde a la dilución 10-2.
• Homogenizar la muestra con ayuda de la micropipeta.
• Realizar este procedimiento hasta completar la dilución 10-5.
6.1.1.2 Siembra en superficie

• Marcar las cajas de Petri con la siguiente información: Iniciales de los integrantes del grupo y
Dilución
• Tomar 0.1mL de cada dilución y adicionarlo en la superficie de la caja de Petri con Agar Casoy
correspondiente a cada dilución. Realizar cambio de punta entre dilución si siembra de la dilución
más concentrada a la más diluida. Puede emplear la misma punta si siembra de la dilución más
diluida a la más concentrada.
Nota: Recuerde abrir lo menos posible las cajas de Petri y tenga mucha precaución con la cercanía al
mechero.
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• Homogenice la muestra con ayuda de un asa estéril. Si cuenta con un asa metálica, flamee
previamente.
• Incubar a una temperatura de 35°C ± 2°C durante 7 días bajo condiciones aerobias.
• Finalizado el tiempo de incubación, realizar el recuento de las UFC obtenidas empleando la
siguiente fórmula:
No. de Colonias × FD × 10
Dónde:
FD: Factor de Dilución
5.5.3 Recuento en Cámara de Neubauer

Realizar este procedimiento para la muestra de cultivo de Levaduras
• Colocar un cubreobjetos sobre el sector central de la cámara de Neubauer.

• Con ayuda de una punta de micropipeta tomar 100µL o un capilar poner en contacto con la muestra
y permitir que esta suba por capilaridad.
• Colocar la punta de la micropipeta/capilar en el borde del cubreobjetos y dejar que el líquido penetre
entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral por capilaridad. No ejercer presión sobre la
cámara.
• Colocar la cámara en sobre la platina del microscopio.
• Enfocar la cuadrícula central con el objetivo de 4X y a aumentar hasta 40X.
• Una vez identificada la cuadrícula (círculo con el No. 3), contar los 25 cuadrantes y reportar el
resultado de células contadas. Si observa una alta densidad de células, realice 1 o 2 diluciones y
repita el proceso de montaje de la cámara.
• Calcular el valor de biomasa empleando la siguiente fórmula:
𝐍𝐨. 𝐝𝐞 𝐂é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 × 𝐅𝐚𝐜𝐭𝐨𝐫 𝐝𝐞 𝐃𝐢𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧

𝒏
(𝟏 × 𝟏𝟎−𝟒 ) ×
𝟐𝟓
El valor obtenido corresponde a la concentración de células/mL presente en la muestra
Página | 17
5.5.4 Siembra por Aislamiento/Agotamiento
5.5.4.1 Aislamiento de Levaduras

• Tomar el cultivo de levadura del numeral anterior.
• Realizar siembra por agotamiento en el medio Sabouraud con Cloranfenicol y Rosa de Bengala.
5.5.4.2 Aislamiento de Hongos Filamentos

• A partir del cultivo obtenido en el numeral No. 5.5.3, seleccione el hongo con mayor predominancia
en el cultivo
• Con ayuda del asa (previamente flameada), retirar una porción del cultivo de interés y colocarla de
forma invertida en una caja con agar Rosa de Bengala.
• Incubar a una temperatura de 28°C ± 2°C durante 7 días bajo condiciones aerobias.
5.5.5 Caracterización Macroscópica

• Observar las diferentes morfologías de los cultivos obtenidos y los cultivos de Saccharomyces
cerevisiae, Trichoderma sp y Penicillium sp
• Describir las características del anverso.
• Describir las características del reverso.
5.5.6 Caracterización Microscópica de Mohos

• Adicionar 1 gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjetos.
• Tomar una tira de cinta transparente. Abrir cuidadosamente el cultivo y tomar una impresión de la
superficie del medio generando presión sobre el cultivo.
• Colocar la impresión sobre la lámina. Retirar el excedente de colorante.
• Enfocar al microscopio y realizar la descripción microscópica de sus cultivos. Tenga en cuenta las
características de las hifas, coloraciones y tipos de esporas/conidios
5.5.7 Caracterización Microscópica de Levaduras

• Realizar una lámina en fresco de cultivo, tomando una porción de la muestra líquida y colocándola
en la superficie de la lámina portaobjetos sin fijar con calor.
• Realizar una lámina por tinción de Gram.
Página | 18
• Enfocar al microscopio y realizar la descripción microscópica de sus cultivos.
5.6.1 Siembra y Recuento en Superficie

• Realice el reporte del recuento en UFC/g o UFC/mL de su muestra analizada.
Medio de Cultivo: Rosa de Bengala

En el medio de cultivo la rosa de Bengala es un agente selectivo que inhibe el crecimiento bacteriano
y restringe el tamaño y la altura de colonias de los mohos de más rápido crecimiento facilitando su
conteo.
Ejemplo:
Si en la dilución 10-4 usted contó 150 colonias, entonces:
150 × 10000 × 10 = 15000000
• En microbiología, se reporta en notación científica con dos cifras significativas, luego:
15000000 = 15 × 106 𝐔𝐅𝐂/𝐠

UFC = Unidades Formadoras de Colonia
5.6.2 Recuento en Cámara de Neubauer
Ejemplo:
Si en la dilución 10-2 usted contó 150 células en sólo 5 cuadrantes, entonces:

𝒏
(𝟏 × 𝟏𝟎−𝟒 ) ×
𝟐𝟓
𝟏𝟓𝟎 × 𝟏𝟎𝟎
= 𝟕𝟓𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎 = 𝟕𝟓 × 𝟏𝟎𝟖 𝒄é𝒍/𝒎𝑳
𝟓
(𝟏 × 𝟏𝟎−𝟒 ) ×
𝟐𝟓
Nota: Usted puede reportar células/mL o Levaduras/mL.
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5.6.3 Caracterización Microscópica
Origen de la Muestra Descripción Macroscópica Descripción Microscópica
Para la caracterización microscópica identifique las siguientes estructuras de su hongo seleccionado:
6. BIBLIOGRAFÍA
• Mahendra R. Bridge P. Applied mycology. 1ª Edición. CABI Publishing (2009).
• Murali M, Amruthesh K.N, Sudisha J, Niranjana S.R, Shetty H.S. Screening for plant growth
promoting fungi and their ability for growth promotion and induction of resistance in pearl millet
against downy mildew disease. Journal of Phytology, 2012; 4, 30 – 36.
• Okafor, N. Modern industrial microbiology and biotechnology. Enfield: Science. (2007).
• Steinberg G, Schuster M. The dynamic fungal cell. Fungal Biology Reviews, 2011; 25, 14 – 37.
• Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. Microbiology: an introduction. Harlow: Pearson. (2016)
Página | 20
PRÁCTICA No. 3
Microalgas
OBJETIVOS
• Reconocer diferentes morfologías de microalgas y diferentes agrupaciones nivel microscópico.
• Realizar la técnica de recuento en cámara de Neubauer para cuantificación de microalgas.
• Conocer el metabolismo de las microalgas bajo diferentes condiciones nutricionales.
1. INTRODUCCIÓN
Los dinoflagelados, las algas verdes (clorofíceas), las algas doradas (cryosofíceas) y las diatomeas
(bacillariophyceae) son algunos tipos de microalgas. Su contenido de proteínas, carbohidratos y lípidos
varía en diferentes especies. La mayoría de las microalgas pueden almacenar lípidos altamente
concentrados que pueden superar el 70% en peso de biomasa seca. También se caracterizan por el
contenido de carbohidratos cercano al 50% de peso seco para algunas especies de Scenedesmus,
Chlorella y Chlamydomona. Factores como la luz, la temperatura, el contenido de nutrientes, el pH, el
nivel de O2 y CO2, la salinidad y los productos químicos tóxicos influyen en el contenido de lípidos y
carbohidratos de las microalgas. Algunos de los componentes comunes en la pared celular de
microalgas son celulosa, proteína, lignina, pectina, hemicelulosas y otros carbohidratos que se pueden
convertir en monómeros a través de una hidrólisis ácida o enzimática para producir bioetanol.
• Mencione algunas organizaciones que produzcan microalgas, los géneros que emplean y los
productos que obtienen.
• ¿Qué efectos adversos pueden tener las microalgas en los ecosistemas?
• Dibuje la estructura de una microalga flagelada y no flagelada y compárela con una cianobacteria.
¿Qué relación existe entre este tipo de microorganismos?
• ¿Cuáles mecanismos emplean las microalgas para adaptarse al agua dulce y agua salada?
• ¿Cuál es la importancia biotecnológica de la producción y extracción de carotenoides y ácidos
grasos de las microalgas?
Lectura Obligatoria: Mitra D, van Leeuwen H, Lamsal B. Heterotrophic/mixotrophic cultivation of

oleaginous Chlorella vulgaris on industrial co - products. Algal Research, 2012; 1, 40 – 48.
Las microalgas tienen una historia antigua dejando una huella de 3,4 mil millones de años atrás,
cuando la microalga más antigua conocida perteneciente al grupo de cianobacterias, se fosilizó en
rocas de Australia Occidental. Los estudios confirmaron que hasta nuestros días su estructura
permanece inalterada y por más primitivas que sean, todavía representan formas de vida bastante
complejas y organizadas. Sin embargo, otros informes estiman que el tiempo real de evolución de las
cianobacterias se cree que está cerca de hace 2,7 millones de años. Por lo tanto, los biólogos
evolucionistas estiman que las algas podrían ser los antepasados de las plantas. Así, a través del
tiempo las algas dieron lugar a otras plantas marinas y se trasladaron a la tierra durante la Edad
Paleozoica hace 450 millones de años, al igual que el escenario de los animales que se trasladan del
agua a la tierra.
Al igual que cualquier otro fitoplancton, las microalgas tienen un valor nutricional. Los primeros en
consumir la microalga verde azul fueron los aztecas y otros mesoamericanos, quienes utilizaron esta
Página | 21
biomasa como fuente importante de alimento. Hoy en día, estos organismos microscópicos se siguen
consumiendo como complemento alimenticio como Chlorella vulgaris y Spirulina platensis y sus
productos también se utilizan para diferentes propósitos como tintes, productos farmacéuticos,
piensos, acuicultura y cosméticos. Durante las dos últimas décadas, las microalgas comenzaron a
tomar un nuevo rumbo con aplicaciones cada vez mayores motivadas por el agotamiento de las
reservas de combustibles fósiles, el consiguiente aumento de los precios del petróleo y la preocupación
por el calentamiento global. Estos dramáticos umbrales están forzando al mundo a encontrar
estrategias globales para la mitigación del dióxido de carbono al proponer materias primas alternativas
renovables e intensificar la investigación sobre los biocombustibles de tercera generación. En este
contexto, las microalgas se consideran hoy en día como un recurso energético sostenible muy
prometedor debido a su capacidad de acumular grandes cantidades de lípidos adecuados para la
producción de biodiesel que se comporta como el petróleo. También demostraron ser una fuente de
productos tales como proteínas, carbohidratos, pigmentos, vitaminas y minerales. Además, las
microalgas captan la luz solar y realizan la fotosíntesis produciendo aproximadamente la mitad del
oxígeno atmosférico en la tierra y absorbiendo cantidades masivas de dióxido de carbono como
alimento principal. Por lo tanto, su crecimiento junto a las centrales eléctricas de combustión es de
gran importancia debido a su notable capacidad de absorber el dióxido de carbono que se convierten
en potencial biocombustible, alimentos, piensos y componentes de alto valor añadido.
Las microalgas pueden crecer tanto en agua dulce como en agua marina, así como en casi todas las
condiciones ambientales en la tierra desde las tierras heladas de Escandinavia a los suelos calientes
del desierto del Sahara. Si las plantas de producción se instalasen de manera inteligente, las
microalgas no competirían con las tierras agrícolas, no habría conflicto con la producción de alimentos
y especialmente no causaría deforestación.
Las microalgas representan una enorme biodiversidad, de la que ya se describen o analizan unas
40.000 especies. Una de las más notables es la microalga C. vulgaris la cual fue descubierta por
Martinus Willem Beijerinck, un investigador holandés y la describio como la primera microalga con un
núcleo bien definido. El nombre Chlorella proviene de la palabra griega chloros, que significa verde, y
el sufijo latino “ella” refiriéndose a su tamaño microscópico. Es una microalga unicelular que crece en
agua dulce y que ha estado presente en la tierra desde el período pre-Cambriano hace 2.500 millones
de años y desde entonces su integridad genética se ha mantenido constante. Hoy en día, Japón es el
líder mundial en el consumo de Chlorella y lo utiliza para el tratamiento médico, ya que mostró tener
propiedades inmunomoduladoras y anticancerigenas. Después realizar pruebas usándola como
alimentos para ratas, ratones y conejos en forma de polvo, demostró propiedades de protección contra
las enfermedades relacionadas con la edad, como los son las enfermedades cardiovasculares, la
hipertensión y la catarata; Disminuye el riesgo de aterosclerosis y estimula la síntesis de colágeno
para la piel. Además, C. vulgaris también es capaz de acumular importantes cantidades de lípidos,
especialmente después de la inanición de nitrógeno con un perfil de ácidos grasos adecuado para la
producción de biodiesel.
Página | 22
estudiante debe:

5 PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

Cultivo con 250mL de medio
1 2 UN
CHU 13
2 1 UN
CHU 13 + Glucosa Distribuir a cada grupo de
Cultivo con 250mL de medio trabajo con 15mL cada uno
3 1 UN
CHU 13 + Glicerol
4 1 UN
Vinaza 0.1%
5 Erlenmeyer con agua residual 1 UN
Tubos de 13 x 150 con 9mL
6 solución salina 0.85% (p/v) 6 UN
estériles
Cajas con agar Sabouraud con
7 1 UN
Cloranfenicol
8 Cajas con agar Casoy 1 UN
9 Capilares 1 UN
10 Paquete de asas desechables 1 UN
15
Página | 23
5.2 REACTIVOS

NA NA NA NA
5.3 EQUIPOS

1 Microscopio 1 UN
5.4 SOLUCIONES

3 Verde Malaquita 1 UN Por mesón de trabajo

guía.
5.5.2 Reactivación de la Cepa

• Adicionar el contenido de un vial de Chlorella vulgaris en 25mL de caldo CHU 13.
• Incubar durante 8 días a una temperatura de 23°C en aireación constante y flujo de luz de 2000 -
4000 lux.
• Finalizado el tiempo de incubación, adicionar todo el contenido del cultivo en 75mL de caldo CHU
13.
4000 lux.
Nota: Esta etapa es realizada por el monitor de la asignatura.
5.5.3 Caracterización Microscópica

• Con ayuda de un asa tomar un volumen del cultivo y preparar una lámina en fresco.
• Enfocar al microscopio y realizar la descripción microscópica de la morfología de C. vulgaris.
5.5.4 Cultivo bajo condiciones fotótrofas.

• Tomar 10mL del cultivo de C. vulgaris y adicionarlos en 150mL de caldo CHU 13 suplementado
con ampicilina y cicloheximida.
Página | 24
4000 lux.
• Finalizado el tiempo de incubación, realizar la descripción de las características del cultivo a nivel
macroscópico y microscópico y realizar el recuento siguiendo la técnica de recuento en cámara de
Neubauer.
5.5.5 Cultivo bajo condiciones autótrofas

con ampicilina y cicloheximida.
• Incubar durante 8 días a una temperatura de 23°C en aireación constante SIN flujo de luz.
Neubauer.
5.5.6 Cultivo bajo condiciones heterótrofas

con glucosa, ampicilina y cicloheximida.
con glicerol, ampicilina y cicloheximida.
• Cubrir todos los cultivos con papel aluminio para evitar el contacto con la luz.
• Incubar durante 8 días a una temperatura de 23°C en aireación constante.
Neubauer.
5.5.7 Cultivo bajo condiciones mixótrofas

• Tomar 10mL del cultivo de C. vulgaris y adicionarlos en 150mL de caldo vinaza 1%.
• Tomar 10mL del cultivo de C. vulgaris y adicionarlos en 150mL de medio agua residual 1%.
• Incubar durante 8 días a una temperatura de 23°C en aireación constante flujo de luz de 2000 -
4000 lux.
Neubauer.
• Realizar tinción de Gram para evaluar la presencia/ausencia de contaminantes.
• Realizar una siembra por aislamiento en los medios sabouraud con cloranfenicol y casoy. Incubar
durante 48 horas a una temperatura de 30°C para mohos y levaduras y 35°C para bacterias.

• Realice la descripción de los diferentes cultivos y condiciones de incubación evaluados.
• ¿Cuáles son las rutas metabólicas empleadas por las microalgas en los diferentes medios de
cultivo?
• Con respecto a los medios con vinaza y agua residual, ¿Cómo puede influir la aparición de
contaminantes en el cultivo de microalgas?
6 BIBLIOGRAFÍA
• Cheah W, Ling T Loke P, Ching, Chang J. Lee D. Cultivation in wastewaters for energy: A
microalgae platform. Applied Energy 2016; 179, 609 – 625.
• Pérez O, Escalante F, de – Bashan L, Bashan Y. Heterotrophic cultures of microalgae: Metabolism
and potential products. Water Research 2011; 45, 11 – 36.
Página | 25
• Razzak S, Ali A, Mozahar M, deLasa H. Biological CO2 fixation with production of microalgae in
wastewater – A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2017; 76, 379 – 390.
• Safi C, Zebib B, Merah O, Pontalier P, Garcia C. Morphology, composition, production, processing
and applications of Chlorellavulgaris: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2014;
35, 265 – 278
• UTEX Algal Culture Maintenance Guides. Disponible en: https://utex.org/pages/culture-
maintenanceguides
• Welladsen, H, Kent, M, Mangott, A, Li, Y. Shelf-life assessment of microalgae concentrates: Effect
of cold preservation on microalgal nutrition profiles. Aquaculture. 2014; 430, 241 – 247.
Página | 26
PRÁCTICA No. 4
Conservación e Identificación de Microorganismos
OBJETIVOS
• Realizar el control de calidad de diferentes cepas conservadas por el método de congelación
empleando glicerol como crioprotectante.
• Conocer diferentes métodos de conservación y la importancia de la implementación de un
programa de conservación de cepas.
• Realizar la identificación de diferentes microorganismos a partir del perfil bioquímico.
• Aprender del fundamento de las diferentes pruebas bioquímicas y relacionar los sustratos con las
diferentes rutas metabólicas.
5 INTRODUCCIÓN
Las colecciones de cultivos son depósitos importantes de diferentes grupos de microorganismos. En
estas colecciones se distribuyen cepas de identidad conocida, proporcionan información para su
cultivo, y ofrecen diversos servicios a la industria, investigación y educación. Las condiciones de cultivo
óptimas varían mucho entre los diferentes grupos microbianos, sin embargo, la mayoría de las cepas
pueden ser conservadas bajo un conjunto estándar de condiciones de cultivo. Todo este conjunto de
colecciones recibe el nombre de banco de cepas o cepario, y su principal función es asegurar que
todas las cepas se encuentran viables, puras y estables.
Los sistemas de identificación basados en pruebas bioquímicas son bastante útiles en la Microbiología
y son relativamente fáciles de operar. Los sistemas van desde tiras para parejas específicos de
bacterias (por ejemplo, corineformes, bacilo y enterobacterias) hasta matrices de placas grandes que
pueden ser escaneadas automáticamente para detectar cambios debidos a cambios de pH o
reacciones rédox. Para la identificación de Enterobacterias estos sistemas son generalmente buenos
debido a la facilidad de su uso y bajo costo por identificación comparado con la secuenciación de ADN.
El uso de estos sistemas depende de la elección de la "tira" correcta de pocillos de reactivos. Un
problema con la mayoría de los sistemas de pruebas bioquímicas, sin embargo, es que estos sistemas
están orientados al mercado clínico y, como resultado, son limitados en el número de especies
ambientales que pueden identificar.
Los sistemas miniaturizados API® son métodos rápidos que permiten la identificación de
microorganismos a través de la realización de diferentes pruebas bioquímicas. Estos sistemas
consisten en un dispositivo de plástico con varios microtubos que contienen diferentes medios de
cultivo deshidratados o diferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere
montar. Entre algunas de las pruebas bioquímicas que pueden realizarse con estos sistemas están las
pruebas de fermentación de carbohidratos, la determinación de la producción de H 2S, la determinación
de la hidrólisis de la gelatina, entre otras.
6 CONSULTAS PRELIMINARES
• Mencione dos (2) técnicas de conservación de microorganismos y describa su metodología.
• ¿Cuáles tipos de crioprotectantes se emplean diferentes al glicerol? ¿Cómo es su mecanismo de
acción?
• ¿Cuál es la importancia de contar con un cepario en la industria?
• Mencione algunos centros de cultivo y colección de microorganismos.
• ¿Qué información debe contener una cepa que ha sido conservada? Puede verificar en las mismas
páginas de los centros de cultivo y colección de microorganismos.
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• Describa dos (2) técnicas para la identificación de microorganismos diferentes a las bioquímicas.
• ¿Qué ventajas tiene un microorganismo al utilizar las enzimas catalasa y oxidasa?
• ¿En qué consisten las pruebas IMVIC?
7 FUNDAMENTO TEÓRICO
Una extensa investigación en microbiología ha revelado que casi todos los procesos de los
ecosistemas, incluyendo el ciclo biogeoquímico de materiales, la degradación de contaminantes, el
tratamiento de aguas residuales y la producción de oxígeno, están mediados por el metabolismo
microbiano. Los microbios son la columna vertebral de las industrias biotecnológicas modernas y se
utilizan para la generación de bioenergía y biocombustibles entre muchos otros procesos. Son una
fuente natural de terapias novedosas, utilizadas como bioplaguicidas y biofertilizantes, y para mantener
la sostenibilidad del medio ambiente. A pesar de proporcionar valiosos servicios de los ecosistemas,
los microoorganismos también actúan como agentes causales de las enfermedades y afectan la salud
humana y la higiene.
Es por esto que a pesar de que se han implementado nuevas técnicas de cultivo de microorganismos
e identificación, éstos por sí solos no son adecuados sin técnicas de conservación que no alteren la
morfología, la fisiología o la genética de cepas puras. Una preservación cuidadosa es imprescindible
para la investigación futura, la enseñanza y las aplicaciones industriales.
• Métodos de conservación microbiana
Se han utilizado con éxito varios métodos para la conservación de microorganismos: subcultivo
repetido, conservación en perlas de agar, recubrimiento de cultivos en aceite, uso de gel de sílice y
otros soportes estériles, criopreservación y liofilización. Entre ellos, la crioconservación y la liofilización
son altamente utilizadas para colecciones de cultivos en industria.
En la página web de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) se

encuentra disponible un gran volumen de información sobre la práctica y los protocolos de
preservación microbiana (http://www.oecd.org/dataoecd/7/13/38777417. Pdf), así como algunas de los
mayores centros de colección de microorganismos: American Type Culture Collection, Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, y "El acceso común a los recursos biológicos y la
información" (http://www.cabri.org). El acceso a esta información desvelará las lagunas del campo y
creará posibilidades para futuras investigaciones e innovaciones.
• Papel de los crioprotectantes en la preservación a largo plazo
En la crioconservación y la liofilización, las células se someten a temperaturas criogénicas que

promueven la formación de cristales de hielo en el medio de suspensión y dentro del interior de la
célula. El desequilibrio osmótico resultante induce cambios biofísicos y bioquímicos (por ejemplo,
alteración de los organelos y pérdida de la integridad de la membrana) y provoca crio-lesiones y muerte
celular. Los crioprotectantes protegen las células de crio-lesiones durante la preservación. Los
crioprotectantes pueden clasificarse ampliamente como penetrantes (ideales) o no penetrantes.
Actúan protegiendo la célula reduciendo el punto de congelación del agua, promoviendo la formación
de enlaces de hidrógeno y la vitrificación de los disolventes, e impidiendo la formación de cristales de
hielo dentro de las células. El glicerol (10 – 15%) y el dimetil sulfóxido DMSO (5%) se utilizan
frecuentemente en la crioconservación de microorganismos y ambos tienen capacidad de penetración
celular. A temperaturas fisiológicas, el glicerol funciona mejor, pero a temperaturas más bajas no
penetra bien dentro de la célula y por consiguiente proporciona menos protección. El DMSO tiene una
mejor capacidad de penetración que el glicerol, pero su uso es limitado debido a los efectos tóxicos a
Página | 28
concentraciones más altas. Existen otros tipos de compuestos empleados para la crioconservación
aparte de glicerol y DMSO, pero no son de uso común. Estos compuestos también son producidos por
pequeños animales y bacterias en respuesta a temperaturas frías para protegerse contra cryo-
lesiones. Un crioprotector ideal debe cumplir todos los siguientes criterios: ser altamente soluble en
agua, penetrar dentro de la célula, tener una baja toxicidad, ser no reactivo y no precipitar a altas
concentraciones.
• Crioconservación
El término crioconservación se refiere a la conservación de materiales biológicos a temperaturas

criogénicas, generalmente –80ºC (hielo seco) o – 96ºC (nitrógeno líquido). La baja temperatura protege
las proteínas y el ADN de la desnaturalización y retarda el movimiento del agua celular. En
consecuencia, las actividades bioquímicas y fisiológicas de las células se detienen esencialmente y
las células se protegen durante largos períodos de tiempo. La preservación de las células a -20 ° C no
se recomienda para la conservación a largo plazo. La preservación a -80 ° C es adecuada siendo -196
° C la ideal porque las posibilidades de mutaciones del ADN son casi cero a esa temperatura. Durante
la crioconservación, los crioviales se pueden almacenar sumergidos en nitrógeno líquido (-196 ° C) o
en su fase de vapor (-135 a -150 ° C). El almacenamiento en fase de vapor se considera mejor porque
impide la entrada de nitrógeno en fase líquida en los crioviales, protegiendo contra el estallido y la
contaminación viral. Un criovial es un tubo especializado criogénico diseñado para el almacenamiento
de material biológico a bajas temperaturas.
La velocidad de enfriamiento y descongelación es otro punto crucial para la preservación y resucitación

de las células durante la crioconservación. Se ha descrito que una velocidad de enfriamiento
controlada (-1 a -5°C/min) y una rápida descongelación (baño de agua a 37 ° C) son óptimas para la
viabilidad celular. El efecto de la velocidad de enfriamiento sobre la supervivencia de diferentes tipos
de células (levadura, bacterias y células eucariotas) fue estudiado por Dumont et al. (2004). Los
autores informaron una alta recuperación celular a bajas y altas tasas de enfriamiento, mientras que
las tasas de enfriamiento intermedio fueron perjudiciales para la viabilidad celular. También
concluyeron que la respuesta de las células al enfriamiento no sólo depende de la velocidad de
enfriamiento sino también del tamaño de las células, la permeabilidad al agua y la presencia de una
pared celular. Por lo tanto, la temperatura de almacenamiento y una velocidad controlada de
enfriamiento, además de la selección del tipo correcto de crioprotectores, son componentes críticos
para la crioconservación exitosa de microorganismos.
• Liofilización
La liofilización es el método preferido de conservación a largo plazo debido al bajo costo de

mantenimiento y facilidad de transporte de los cultivos liofilizados. La liofilización da resultados
satisfactorios para la conservación de muchas bacterias, levaduras y hongos esporulantes, pero no
preserva adecuadamente los hongos no esporulados (hifas vegetativas), algunas especies de levadura
(Lipomyces, Leucosporidium, Brettanomyces, Dekkera, Bulleera, Sporobolomyces) y ciertas bacterias
(Aquaspirillum serpens, Clostridium botulinum, Helicobacter pylori). La liofilización ejerce presión sobre
las células durante la desecación al vacío y las células elevadas bajo estrés pueden responder mejor
a la liofilización. Por ejemplo, un cultivo en fase estacionaria y una condición de pH bajo sobreviven
mejor durante la liofilización que las células en fase logarítmica cultivadas a pH óptimo. Aunque las
técnicas de liofilización están bien establecidas, la optimización de lyoprotectores y medios de
suspensión sigue siendo necesaria para ciertos microorganismos. Un medio de suspensión ideal para
la liofilización debe contener lyoprotectores y materiales de matriz o excipientes. Se recomienda el uso
de cultivos en fase estacionaria, ampollas de borosilicato, un contenido de humedad final de 1-2% de
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la muestra liofilizada y almacenamiento a 4 ° C en la oscuridad para una mayor viabilidad celular y
mayor estabilidad con la liofilización
Tanto la criopreservación como la liofilización tienen ventajas y desventajas, y la respuesta de

conservación varía según las especies. Incluso diferentes cepas de la misma especie pueden
responder de manera diferente al mismo método de preservación. La viabilidad y longevidad de los
microorganismos bajo conservación depende de algunos factores críticos: (1) composición del medio
de suspensión y rehidratación, (2) tipo de crioprotector utilizado, (3) velocidad de enfriamiento y
descongelación, (4) etapa de crecimiento del cultivo , 5) el tamaño y tipo de células, el contenido de
lípidos, el contenido de agua y la densidad inicial de células
• Seguimiento y manejo de la estabilidad genotípica y fenotípica de cultivos preservados
El objetivo de los centros de colección de cultivos microbianos no es sólo lograr la viabilidad a largo
plazo, sino también mantener la estabilidad genotípica y fenotípica de sus cultivos conservados, ya
que la integridad genotípica y fenotípica es absolutamente esencial para la autenticación de hallazgos
previos. Los investigadores a menudo afirman que la colección de cultivos proporciona una versión
mutante de la cepa de tipo salvaje esperada. Esto indica que las colecciones de cultivos pueden tratar
con mutantes en lugar de con microorganismos silvestres originales. Por lo tanto, una caracterización
exhaustiva de los cultivos en los aspectos morfológicos, anatómicos, fisiológicos, inmunológicos y
moleculares es un requisito antes y después de la preservación. Generalmente, el subcultivo de
cultivos activos induce más mutaciones. Los cultivos preservados mediante liofilización y
crioconservación presentan mayor estabilidad genotípica y fenotípica, pero aún necesitan optimización
para obtener un mejor resultado.
Aún no están claros los mecanismos exactos que conducen a la inducción de cambios genotípicos y
fenotípicos en las células microbianas durante la preservación y el sub-cultivo. Se presume que varios
factores, incluyendo el choque térmico, el estrés oxidativo, la toxicidad de los crioprotectores, las cryo-
lesiones, la formación de hielo intracelular, la presión del vacío en el secado por congelación y en
líquido y la formación de radicales libres pueden inducir diferentes cambios de tipo genotípicos y
fenotípicos. Aparte de las duras condiciones de conservación, las fluctuaciones en la temperatura
durante la congelación y descongelación o incluso la transferencia de cultivos de un congelador a otro,
pueden considerarse como factores que inducen estos cambios en los microorganismos.
Para la autenticación de los cultivos conservados, se recomienda un amplio seguimiento pre y post-
preservación de los rasgos fisiológicos y genotípicos, al menos para las cepas de importancia
ecológica, médica y biotecnológica. Se recomienda el inventario preciso, la validación de la
temperatura y la calidad de almacenamiento, un buen entrenamiento para la manipulación de
muestras, un subcultivo mínimo, la disponibilidad de stocks de distribución suficientes y la preservación
mediante liofilización, secado líquido y crioconservación a temperatura de nitrógeno líquido. Fenotípica
y genotípica de los cultivos durante la preservación.
• Concepto de latencia celular, reanimación celular y estado viable pero no cultivable
La latencia es un mecanismo conocido de supervivencia celular en respuesta a la falta de nutrientes y

al estrés ambiental. Es un mecanismo esencial de evolución, diversidad, sucesión y dinámica
comunitaria en los ecosistemas naturales. La latencia también proporciona un mecanismo para el
mantenimiento de "bancos de semillas" microbianos. Cada tipo de ambiente mantiene una fracción de
su diversidad celular en un estado latente o inactivo. La "gran anomalía del recuento de placas" y la
"no cultivabilidad" pueden explicarse parcialmente por los conceptos de latencia celular y el estado
viable pero no cultivable de las bacterias. Los métodos de conservación a largo plazo tales como la
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crioconservación y la liofilización inducen un estado de latencia dentro de las células y detienen
completamente el metabolismo celular sin un cambio en las características fisiológicas y genéticas de
los microorganismos. Además, la preservación puede crear una condición de estrés dentro de la célula
e inducir un estado viable pero no cultivable en alguna fracción de células preservadas
8 SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA
estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

estériles
Cajas de Petri con Agar
2 5 UN
Chromocult
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Cajas de Petri con Agar Rosa de
3 5 UN
Bengala
7 Frasco Lavador 1 UN Por mesón de trabajo
8 Cultivo de Enterobacterias 1 UN
Cultivo de Bacterias Ácido-
9 1 UN
Lácticas
10 Galería API 20E 1 UN
11 Galería API 50 CHL 1 UN
12 Tirillas prueba de Oxidasa 1 UN
13 Rack de Puntas de 1mL estériles 1 UN
14 Mechero 1 UN
5.2 REACTIVOS

1 Ampolleta API NaCl 0.85 Medium 1 UN
2 Ampolleta API 50 CHL Medium 1 UN
3 TDA 5 mL
4 JAMES 5 mL
5 VP1 5 mL
6 VP2 5 mL
7 Agua Destilada Estéril 50 mL
8 Parafina líquida 10 mL
9 Colorantes de Gram 10 mL
5.3 EQUIPOS

1 Micropipeta 100 - 1000µL 1 UN
2 Microscopio 1 UN
5.4 SOLUCIONES

5.5.1 Conservación de Cepas Aisladas

• Diligenciar el formato de Recepción de Cepas.
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• Almacenar en temperatura de refrigeración (2-8°C) hasta el momento de su conservación.
• Adicionar 5mL de la muestra en 45mL de caldo CASOY estéril o tomar diferentes colonias y
adicionar en 50mL de caldo CASOY.
• Incubar a una temperatura 37°C durante 48 horas.
• Marcar el número de crioviales necesarios con el código asignado.
• Finalizado el tiempo de incubación, mezclar en relación 1:1 el cultivo con la solución de caldo estéril
y glicerol 40% (v/v).
• Realizar coloración de Gram a esta suspensión para verificar la pureza del cultivo. Si se observan
morfologías bacterianas diferentes a las esperadas, se debe replantear todo el procedimiento ya
que se deben conservar cepas puras.
• Adicionar 1mL a cada uno de los crioviales y cerrar correctamente.
• Almacenar a una temperatura de -20° a -196°C.
5.5.2 Reactivación de Cepas
• Tomar el vial y realizar un descongelamiento rápido colocándolo en baño serológico a 37°C. En el
caso que no haya disponibilidad de baños, puede colocarse el criovial en una incubadora bajo estas
mismas condiciones.
• Finalizado el descongelamiento, se puede realizar la siembra en tubo, caja, caldo dependiendo del
análisis a realizar, especificando la hora en que se realiza dicha reactivación.
5.5.3 Control de Calidad de Cepas

• Tomar el contenido de un vial y adicionarlo en 9mL de solución salina estéril 0.85% (p/v).
• Realizar diluciones seriadas en base 10 desde 10 -1 hasta 10-5 en 9mL de solución salina estéril
0.85% (p/v).
• Realizar tinción de Gram a un tubo de dilución para identificar posibles contaminantes.
• Sembrar en superficie todas las diluciones en agar Chromocult y Rosa de Bengala.
• Incubar durante 48 horas a una temperatura de 35°C ± 2°C el cultivo de bacterias y 28°C ± 2°C el
cultivo de levaduras.
• Finalizado el tiempo de incubación, realizar el recuento de las colonias obtenidas.
5.5.4 Identificación Bioquímica de Enterobacterias
5.5.4.1 Prueba de Oxidasa

• Tomar una tirilla de la prueba de oxidasa.
• Colocar la parte superior de la tirilla sobre una colonia aislada en el medio de cultivo.
• Al cabo de aprox. 20 a 60 segundos comparar con la escala colorimétrica. Se considera un
resultado positivo cuanto la tirilla se torna color morado oscuro.
5.5.4.2 Preparación de las Galerías

• Preparar una cámara de incubación (fondo o tapa).
• Marcar con la referencia de las cepas en la lengüeta lateral de la cámara. (No hacerlo sobre la tapa,
ya que ésta puede resultar extraviada durante la manipulación).
• Repartir aproximadamente 10mL de agua destilada o desmineralizada en los pocillos del fondo
para crear una atmósfera húmeda.
5.5.4.2.1 Preparación del Inóculo

• Tomar una ampolla de API NaCl 0.85% Medium (5 ml).
• Sujetar verticalmente el conjunto en una mano (tapón blanco hacia arriba).
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• Presionar a fondo el tapón hasta escuchar que se quiebra el vidrio.
• Retirar el tapón.
• Tomar varias colonias idénticas con ayuda de un asa estéril.
• Realizar una suspensión de turbidez en la ampolla de API NaCl 0.85% Medium. Esta suspensión
debe utilizarse de inmediato.
• Realizar coloración de Gram a su muestra de Enterobacteria.
5.5.4.2.2 Inoculación de las Galerías

• Llenar los tubos y las cúpulas de los ensayos CIT, VP, GEL con la suspensión bacteriana
• Llenar únicamente los tubos (y no las cúpulas) de los demás ensayos.
• Crear una atmósfera anaerobia en los ensayos: ADH, LDC, ODC, H2S, URE, llenado su cúpula de
aceite de parafina.
• Cerrar la cámara de incubación.
• Incubar a una temperatura de 35°C ± 2°C durante 24 horas.
5.5.4.2.3 Lectura y Reporte

• Prueba TDA: agregar una gota del reactivo TDA. Un color marrón-rojizo indica una reacción
positiva.
• Prueba IND: agregar 1 gota del reactivo JAMES. Un color rosado que se difumina en toda la cúpula
indica una reacción positiva.
• Prueba VP: agregar una gota de los reactivos VP 1 y VP 2. Esperar un mínimo de 10 minutos. Un
color rosa o rojo indica una reacción positiva.
• Realizar la lectura de las demás pruebas a partir de la información a continuación:
Pueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
azul oscuro o
CIT utilización del citrato verde
turquesa
sin precipitado
H2S producción de H2S precipitado negro
negro
URE ureasa amarillo rojo o naranja
TDA triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
color rosa o anillo
IND producción de indol amarillo
rosa-rojo
VP producción de acetoína (Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo
GEL gelatinasa sin difusión difusión de pigmento
GLU fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo
MAN fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo
INO fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo
SOR fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo
RHA fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo
SAC fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo
MEL fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo
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AMY fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo
ARA fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo
• En la hoja de resultados, los tests están separados en parejas de tres y se indica para cada uno un
valor de 1, 2 o 4. Como la galería API 20 E comporta 20 ensayos, sumando al interior de cada
pareja los valores que corresponden a reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 7
cifras. (A la reacción de la oxidasa, que constituye el test No. 21 se le asigna el valor 4, cuando
resulte positiva)
• Digitar el código de 7 dígitos en el software de bioMérieux.

• Reportar el nombre del microorganismo obtenido
5.5.5 Identificación Bioquímica de Lactobacilos
5.5.5.1.1 Preparación de las Galerías

Cada galería está constituida por 5 filas conteniendo cada una 10 pocillos numerados.
• Preparar una cámara de incubación (fondo o tapa).
• Marcar con la referencia de las cepas en la lengüeta lateral de la cámara. (No hacerlo sobre la tapa,
ya que ésta puede resultar extraviada durante la manipulación).
• Repartir aproximadamente 10mL de agua destilada o desmineralizada en los pocillos del fondo
para crear una atmósfera húmeda.
• Sacar cada una de las filas de su embalaje, separar en dos las filas 0 – 19 y 20 – 39 y colocarlas
en el fondo de la cámara de incubación.
• Completar la galería con la fila 40-49.
5.5.5.1.2 Preparación del Inóculo

• Tomar una ampolla de API 50 CHL.
• Sujetar verticalmente el conjunto en una mano (tapón blanco hacia arriba)
• Presionar a fondo el tapón y retirarlo.
• Tomar varias colonias idénticas con ayuda de un asa estéril.
• Realizar una suspensión de turbidez en la ampolla de API 50 CHL Medium. Esta suspensión debe
utilizarse de inmediato.
• Realizar coloración de Gram su muestra de Bacterias Ácido-Lácticas.
5.5.5.1.3 Inoculación de las Galerías

Repartir la suspensión bacteriana con la ayuda de una pipeta estéril en los 50 tubos de la galería,
teniendo en cuenta las siguientes precauciones
• Inclinar ligeramente hacia delante la cámara de incubación.
• Evitar la formación de burbujas apoyando la punta de la pipeta en el borde de la cúpula.
• Cuando sólo se inocule el tubo, no rebasar el límite superior del mismo con el fin de conservar una
buena anaerobiosis.
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• Cuando el tubo y la cúpula deban llenarse completamente, evitar la formación de un menisco
cóncavo o convexo.
• Incubar a una temperatura de 35°C ± 2°C durante 48 horas.
5.5.5.1.4 Lectura y Reporte

• Realizar la lectura de los pozos a las 24 y 48 horas de incubación.
• Se considera un resultado positivo (fermentación) cuando el pozo se torna amarillo. Marcar son el
signo (+).
• Se considera un resultado negativo cuando el pozo permanece morado. Marcar son el signo (-).
• Digitar la combinación en el software de bioMérieux.
• Reportar el nombre del microorganismo obtenido

• Complete la información que encuentra en el reporte de resultados (Página 37 y 38).
• Realice un esquema de cómo se realiza la conservación, reactivación y producción de un inóculo
de alguno de los microorganismos usados para la producción de proteínas recombinantes. Incluya
al menos dos (2) artículos científicos.
• Describa dos (2) técnicas para la identificación de microorganismos diferentes a las bioquímicas.
Incluya las referencias bibliográficas de cada una.
6 BIBLIOGRAFÍA
• API Web. Disponible en: https://www.biomerieux.com.co/diagnostico-clinico/apir
• Esteves, A.A, Corrêa, D, Carneiro, A.P.S, Rosa, R.M, Loteri, R, Araújo, W.L. Comparative
evaluation of different preservation methods for cyanobacterial strains. Journal of Applied
Phycology. 2013; 25, 919 – 929.
• Prakash O, Nimonkar Y, Shouche Y. Practice and prospects of microbial preservation. Microbiology
Letters 2012; 339, 1 – 9.
• Spencer, J.F.T, Ragout, A.L. Methods in Biotechnology. Food Microbiology Protocols. Human Press
Inc., Totowa, NJ.
• Tedeschi R, De Paoli P. Collection and preservation of frozen microorganisms. Methods Molecular
Biology 2011; 26, 313 – 326.
Página | 36
PRÁCTICA No. 5
Metabolismo Microbiano
OBJETIVOS
• Reconocer los diferentes procesos metabólicos que llevan a cabo las bacterias usando como
modelo la columna de Winogradsky.
• Identificar como se integran los diferentes productos y subproductos del metabolismo para permitir
el desarrollo de diferentes comunidades microbianas.
• Identificar diferentes morfologías bacterianas y asociarlas con géneros característicos de bacterias
implicadas en el ciclo del azufre.
1. INTRODUCCIÓN
El metabolismo se refiere a todas las reacciones bioquímicas que se producen en una célula u
organismo. El estudio del metabolismo bacteriano se centra en la diversidad química de las
oxidaciones del sustrato y las reacciones de disimilación (reacciones por las que se descomponen las
moléculas del sustrato), que normalmente funcionan en las bacterias para generar energía. También
dentro del alcance del metabolismo bacteriano está el estudio de la captación y utilización de los
compuestos inorgánicos u orgánicos requeridos para el crecimiento y mantenimiento de un estado
estacionario celular (reacciones de asimilación). Estas reacciones exergónicas (energéticas) y
endergónicas (que requieren energía) son catalizadas dentro de la célula bacteriana viva por sistemas
enzimáticos integrados, siendo el resultado final la auto-replicación de la célula. La capacidad de las
células microbianas para vivir, funcionar y replicarse en un medio químico apropiado (tal como un
medio de cultivo) y los cambios químicos que resultan durante esta transformación constituyen el
alcance del metabolismo bacteriano.
• ¿Qué son los ciclos biogeoquímicos?
• Dibuje la columna de Winogradsky y mencione los grupos de microorganismos que se desarrollan
en cada una de las fases.
• Realice una descripción gráfica de las diferentes bacterias que se pueden encontrar en cada una
de las fases de la columna.
• ¿Qué relación hay entre los ciclos de azufre, fósforo y nitrógeno?
• ¿Qué es el biodeterioro y que papel cumplen las bacterias del ciclo del azufre?
Lectura Obligatoria: Giachini AJ, Sulzbach TS, Pinto AL, Armas RD, Cortez DH, Silva EP, Buzanello
EB, Soares ÁG, Soares CRF, Rossi MJ. Microbially-enriched poultry litter-derived biochar for the
treatment of acid mine drainage. Archives of Microbiology 2018; 200, 1227 – 1237.
La célula es un transformador de energía altamente especializado. La energía química generada por
las oxidaciones del substrato se conserva mediante la formación de compuestos de alta energía tales
como adenosina difosfato (ADP) y adenosina trifosfato (ATP) o compuestos que contienen el enlace
tioéster ADP y ATP representan adenosina monofosfato (AMP) más uno y dos de alta energía; la
energía se almacena en estos compuestos como enlaces de fosfato de alta energía. En presencia de
sistemas enzimáticos apropiados, estos compuestos pueden utilizarse como fuentes de energía para
sintetizar los nuevos compuestos orgánicos complejos necesarios para la célula. Todas las células
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vivas deben mantener reacciones bioquímicas en estado estacionario para la formación y el uso de
tales compuestos de alta energía.
Kluyver y Donker reconocieron que los microorganismos, independientemente de las especies, eran
en muchos aspectos químicamente similares a todas las demás células vivas. Por ejemplo, estos
investigadores reconocieron que la transferencia de hidrógeno es una característica común y
fundamental de todos los procesos metabólicos. Las bacterias, como las células de mamíferos y de
plantas, usan ATP o el enlace de fosfato de alta energía (~ P) como fuente de energía química primaria.
Las bacterias también requieren las vitaminas del complejo B como coenzimas funcionales para
muchas reacciones de oxidación-reducción necesarias para el crecimiento y la transformación de
energía. Un organismo como Thiobacillus thiooxidans, que crece en un medio que contiene solo azufre
y sales inorgánicas, sintetiza grandes cantidades de tiamina, riboflavina, ácido nicotínico, ácido
pantoténico, piridoxina y biotina. Por lo tanto, Kluyver propuso la teoría de la unidad de la bioquímica,
que establece que todas las reacciones enzimáticas básicas que soportan y mantienen procesos
vitales dentro de las células de los organismos, tenían más similitudes que diferencias. Este concepto
de unidad bioquímica estimuló a muchos investigadores a usar bacterias como sistemas modelo para
estudiar reacciones bioquímicas eucariotas, vegetales y animales relacionadas que son esencialmente
"idénticas" a nivel molecular.
Desde el punto de vista nutricional o metabólico, existen tres tipos fisiológicos de miccroroganismo:
los heterótrofos (quimioorganotróficos), los autótrofos (quimiolitotróficos) y las bacterias fotosintéticas
(fototróficas)
• Metabolismo Heterótrofo
Los microorganismos heterótrofos, obtienen energía de la oxidación de compuestos orgánicos. Los

carbohidratos (particularmente la glucosa), los lípidos y la proteína son los compuestos más
comúnmente oxidados. La oxidación biológica de estos compuestos orgánicos resulta en la síntesis
de ATP como fuente de energía química. Este proceso también permite la generación de compuestos
orgánicos más sencillos (moléculas precursoras) que necesita las células para las reacciones
biosintéticas o asimiladoras.
Los compuestos intermedios del ciclo de Krebs sirven como moléculas precursoras (bloques de
construcción) para la biosíntesis que requiere energía de compuestos orgánicos complejos. Las
reacciones de degradación que producen simultáneamente energía y generan moléculas precursoras
para la biosíntesis de nuevos constituyentes celulares se denominan anfibólicas.
Todos los microorganismos heterótrofos requieren compuestos orgánicos preformados. Estos

compuestos que contienen carbono y nitrógeno son sustratos de crecimiento, que se usan
aeróbicamente o anaeróbicamente para generar equivalentes reductores (por ejemplo, nicotinamida
adenina dinucleótido reducido, NADH + H +); Estos equivalentes reductores a su vez son fuentes de
energía química para todos los sistemas oxidativos y fermentativos biológicos. Los heterótrofos son
los microrganismos más comúnmente estudiadas; Crecen fácilmente en medios que contienen
carbohidratos, proteínas u otros nutrientes complejos como la sangre. Además, los medios de cultivo
pueden enriquecerse mediante la adición de otros compuestos naturales tales como la leche (para
estudiar las bacterias del ácido láctico) o los hidrocarburos (para estudiar los organismos que oxidan
los hidrocarburos).
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• Respiración
La glucosa es el sustrato más común usado para estudiar el metabolismo heterotrófico. La mayoría de
los organismos aeróbicos oxidan completamente la glucosa mediante la siguiente ecuación de
reacción:
C6 H12 O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2 O + Energía
Esta ecuación expresa el proceso de oxidación celular llamado respiración. La respiración ocurre
dentro de las células vegetales y animales, generando normalmente 38 moléculas de ATP (como
energía) a partir de la oxidación de 1 molécula de glucosa. Esto produce aproximadamente 380.000
calorías (cal) por unidad de glucosa (ATP ~ 10.000 cal / mol).
La oxidación de la glucosa es la reacción disimilatoria más comúnmente estudiada que conduce a la

producción de energía o la síntesis de ATP. La oxidación completa de la glucosa puede implicar tres
vías bioquímicas fundamentales. La primera es la ruta glicolítica o Embden-Meyerhof-Parnas, la
segunda es el ciclo de Krebs (también llamado ciclo de ácido cítrico o ciclo de ácido tricarboxílico) y la
tercera es la fosforilación oxidativa.
La respiración tiene lugar cuando cualquier compuesto orgánico (generalmente hidratos de carbono)
se oxida completamente a CO2 y H2O. En la respiración aeróbica, el O2 molecular es el receptor
terminal de los electrones. Para la respiración anaeróbica, el NO3-, SO42-, CO2 o fumarato pueden
servir como receptores de electrones terminales (en lugar de O2), dependiendo del microorganismo.
El resultado final del proceso respiratorio es la oxidación completa de la molécula del sustrato orgánico
y los productos finales formados son principalmente CO2 y H2O. El amoníaco se forma también si la
proteína (o aminoácido) es el sustrato oxidado.
Metabólicamente, las bacterias son las únicas que a diferencia de las cianobacterias (algas verde-
azuladas) y otras células eucariotas pueden llevar la oxidación de la glucosa por más de una vía. En
las bacterias, la glucólisis representa una de varias vías por las cuales pueden atacar catabólicamente
la glucosa. La vía glicolítica se asocia más comúnmente con el metabolismo anaeróbico o fermentativo
en bacterias y levaduras. En bacterias, también existen otras vías heterofermentativas menores, tales
como la vía de fosfocetolasa.
Además, se encuentran otras dos vías de catabolización de la glucosa en las bacterias: la vía oxidativa
de pentosa fosfato (derivación de hexosa monofosfato) y la vía de Entner-Doudoroff, que se encuentra
casi exclusivamente en bacterias aeróbicas obligada. El género Azotobacter es altamente oxidativo y
la mayoría de las especies de Pseudomonas, por ejemplo, utilizan el camino de Entner-Doudoroff para
catabolismo de glucosa, porque estos organismos carecen de la enzima fosfofructoquinasa y por lo
tanto no pueden sintetizar fructosa 1,6-difosfato, un compuesto intermedio clave en la vía glicolítica.
(La fosfo-fructoquinasa es también sensible al O2 molecular y no funciona en aerobios obligatorios).
Otras bacterias, que carecen de aldolasa (que divide la fructosa-1,6-difosfato en dos trifosfatos),
tampoco pueden tener una vía glicolítica funcional. Aunque el camino de Entner-Doudoroff se asocia
generalmente con las bacterias aerobias obligatorias, está presente en el metabolismo anaerobio
facultativo de Zymomonas mobilis.
• Fermentación
La fermentación es otro ejemplo de metabolismo heterotrófico, que requiere un compuesto orgánico

como aceptor terminal de electrones (o hidrógeno). En las fermentaciones, los productos finales
orgánicos simples se forman a partir de la disimilación anaeróbica de glucosa (o algún otro compuesto).
La energía (ATP) se genera a través de las reacciones de deshidrogenación que se producen cuando
la glucosa se descompone enzimáticamente. Los productos orgánicos formados a partir de este
Página | 39
proceso de oxidación biológico incompleto también sirven como receptores finales de electrones y de
hidrógeno. En la reducción, estos productos finales orgánicos se secretan en el medio como
metabolitos de desecho (normalmente alcohol o ácido). Los compuestos de sustrato orgánico están
incompletamente oxidados por bacterias, pero proporcionan suficiente energía para el crecimiento
microbiano. La glucosa es la hexosa más común usada para estudiar las reacciones de fermentación.
A finales de la década de 1850, Pasteur demostró que la fermentación es un proceso vital asociado al
crecimiento de microorganismos específicos y que cada tipo de fermentación puede definirse por el
producto final orgánico principal formado (ácido láctico, etanol, ácido acético o ácido butírico). Sus
estudios sobre la fermentación con ácido butírico condujeron directamente al descubrimiento de
microorganismos anaerobios. Pasteur concluyó que el oxígeno inhibía a los microorganismos
responsables de la fermentación del ácido butírico debido a que la movilidad bacteriana y la formación
de ácido butírico cesaron cuando se burbujeó aire en la mezcla de fermentación. Pasteur también
introdujo los términos aeróbico y anaeróbico. Sus puntos de vista sobre la fermentación se desprenden
de sus estudios microbiológicos sobre la producción de cerveza.
Para la mayoría de las fermentaciones microbianas, la disimilación de glucosa se produce a través de

la vía glicolític. El compuesto orgánico simple más comúnmente generado es el piruvato, o un
compuesto derivado enzimáticamente de piruvato, tal como acetaldehído, α-acetolactato, acetil-SCoA
o lactyl-SCoA. El acetaldehído puede entonces ser reducido por NADH + H + al etanol, que es
excretado por la célula. El producto final de la fermentación con ácido láctico, que se produce en
estreptococos (por ejemplo, Streptococcus lactis) y muchos lactobacilos (por ejemplo, Lactobacillus
casei, L. pentosus), es un ácido orgánico.
Muchos de los fermentadores de glucosa generalmente producen CO2 y H2 con diferentes

combinaciones de productos finales ácidos (formiato, acetato, lactato y succinato). Otras bacterias
como Enterobacter aerogenes, Aeromonas, Serratia, Erwinia y Bacillus también forman CO2 y H2, así
como otros productos finales neutros (etanol, acetilmetilcarbinol [acetoin] y 2,3-butilenglicol). Muchos
clostridios obligatoriamente anaeróbios (por ejemplo, Clostridium saccharobutyricum, C.
thermosaccharolyticum) fermentan la glucosa con la producción de butirato, acetato, CO 2 y H2,
mientras que otras especies de Clostridum (C. acetobutylicum y C. butyricum) también forman estos
extremos de fermentación Productos más otros (butanol, acetona, isopropanol, formiato y etanol).
• El ciclo de Krebs
También llamado ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de ácido cítrico) funciona oxidativamente en
la respiración y es el proceso metabólico mediante el cual el piruvato o acetil-SCoA se descarboxila
completamente a CO2. En bacterias, esta reacción se produce a través de acetil-SCoA, que es el
primer producto en la descarboxilación oxidativa de piruvato por la enzima piruvato deshidrogenasa.
Si se obtienen 2 moléculas de piruvato a partir de la disimilación de una molécula de glucosa, se

generan en total 30 moléculas de ATP. La descarboxilación de piruvato, isocitrato y α-cetoglutarato
explica todas las moléculas de CO2 generadas durante el proceso respiratorio. La energía química
conservada por el ciclo de Krebs está contenida en los compuestos reducidos generados (NADH + H
+, NADPH + H + y succinato). La energía potencial inherente a estos compuestos reducidos no está
disponible como ATP hasta que se produce el paso final de la respiración (transporte de electrones y
fosforilación oxidativa).
El ciclo de Krebs es por lo tanto otra etapa preparatoria en el proceso respiratorio. Si 1 molécula de
piruvato se oxida completamente a 3 moléculas de CO2, generando 15 moléculas de ATP, la oxidación
de 1 molécula de glucosa producirá hasta 38 moléculas de ATP, siempre que la glucosa sea disimilada
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por el glucólisis y el ciclo de Krebs. Las reacciones de transporte de electrones o fosforilación oxidativa
son bioenergéticamente idénticas a las de las mitocondrias eucarióticas.
• Respiración Anaerobia
Algunas microroganismos exhiben un modo único de respiración llamado respiración anaeróbica.

Estos microorganisos que no crecen de anaerobia a menos que un componente químico específico,
que sirve como aceptor de electrones terminal, se añade al medio. Entre estos aceptores de electrones
están NO3-, SO42-, el compuesto orgánico fumarato, y CO2. Un pareja grande de respiradores
anaeróbicos son los reductores de nitrato. Los reductores de nitrato son predominantemente bacterias
heterotróficas que poseen un sistema o sistemas de transporte de electrones complejos que permiten
que el ion NO3- sirva anaerobiamente como aceptor terminal de electrones
• Autotrofía
Las bacterias que crecen únicamente a expensas de compuestos inorgánicos (iones minerales), sin
utilizar la luz solar como fuente de energía, se llaman autótrofos, quimiotróficos, quimioautótrofos o
quimiolitotróficos. Al igual que los organismos fotosintéticos, todos los autótrofos utilizan CO 2 como
fuente de carbono para el crecimiento. Curiosamente, la fuente de energía para tales organismos es
la oxidación de compuestos inorgánicos específicos. El compuesto inorgánico que se oxida depende
de los microorganismos en cuestión. Muchos autótrofos no crecen en medios que contienen materia
orgánica, incluso agar.
También se encuentran entre los microorganismos autotróficos las bacterias oxidantes de azufre u
oxidantes de compuestos de azufre, que rara vez exhiben un modo de metabolismo estrictamente
autotrófico como las bacterias nitrificantes obligatorias. Los compuestos de azufre representativos
oxidados por tales bacterias son H2S, S2 y S2O3. Entre las bacterias del azufre se encuentran dos
organismos muy interesantes; Thiobacillus ferrooxidans, que obtiene su energía para el crecimiento
autotrófico oxidando el azufre elemental o el hierro ferroso, y T. denitrificans, que obtiene su energía
oxidando S2O3 de forma anaeróbica, utilizando NO3- como el único aceptor terminal de electrones.
Todas las bacterias autotróficas deben asimilar el CO2, que se reduce a la glucosa a partir de la cual
se sintetiza la materia celular orgánica. La energía para este proceso biosintético se deriva de la
oxidación de compuestos inorgánicos discutida en el párrafo anterior. Obsérvese que todas las
bacterias autotróficas y fototróficas poseen esencialmente los mismos constituyentes celulares
orgánicos que se encuentran en las bacterias heterotróficas; Desde el punto de vista nutricional, sin
embargo, el modo autotrófico del metabolismo es único, ocurriendo sólo en bacterias.
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estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

15mL de caldo para Tiobacilos
1 1 mL
acidófilos
15mL de caldo para Tiobacilos
2 1 mL
neutrófilos
3 50Ml de Caldo Api 1 mL
4 Caja de Láminas portaobjetos 1 UN Por mesón de trabajo
5 Caja de Laminillas cubreobjetos 1 UN Por mesón de trabajo
5.2 REACTIVOS

NA NA NA NA NA
5.3 EQUIPOS

1 Microscopio 1 UN
2 Micropipeta 100 – 1000uL 1 UN
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5.4 SOLUCIONES

1 Kit Tinción de Gram 1 UN Por mesón de trabajo
5.5.1 Preparación de la columna

• Cortar con cuidado la parte superior de una botella de plástico.
• Dibujar dos líneas cortas en la botella: una a un cuarto del fondo de la botella, la otra un cuarto del
camino desde la parte superior.
• Adicionar una porción abundante de papel periódico (sin tinta) en la parte inferior de la botella
seguido de cáscaras de huevo y 10g de sulfato de magnesio hasta la primera marca de marcador.
• Adicionar lodo proveniente de una PTAR, lago, río o cualquier otra fuente hasta la segunda marca
de la botella.
• Adicionar agua residual o agua de lago, río o cualquier otra fuente (no use agua potable) hasta la
parte superior de la botella.
• Cubrir la superficie con papel vinipel.
• Incubar durante 15 días a 1 mes con fotoperiodos de 12 horas.
5.5.2 Identificación de Morfologías

• Retire cuidadosamente la parte líquida de la columna.
• Realizar cortes transversales en las diferentes secciones de la columna.
• Preparar láminas en fresco de las diferentes fases.
• Realizar tinción de Gram para diferenciar las diferentes bacterias presentes.
5.5.3 Aislamiento de Bacterias Sultato Reductoras

• Tomar una porción del cultivo de la parte inferior y adicionarla en 25mL de caldo API.
• Homogenizar todo el cultivo.
• Cubrir con parafina liquida toda la superficie del medio de cultivo.
• Incubar durante 5 días a una temperatura de 30°C.
• Finalizado el tiempo de incubación realizar la caracterización macroscópica del cultivo. La aparición
de una coloración negra en el cultivo indica la presente de Bacterias Sultato Reductoras
5.5.4 Aislamiento de Thiobacillus sp acidófilos

• Tomar aproximadamente 1g/1mL de la parte media de la columna y adicionarlas en el medio
Tiobacilos acidófilos.
• Incubar durante 5 días a una temperatura de 30°C en oscuridad.
• Finalizado el tiempo de incubación realizar la caracterización macroscópica del cultivo. La
presencia de turbidez indica la presencia de Tiobacilos acidófilos.
5.5.5 Aislamiento de Thiobacillus sp neutrófilos

• Tomar aproximadamente 1g/1mL de la parte media de la columna y adicionarlas en el medio
Tiobacilos neutrófilos.
• Incubar durante 5 días a una temperatura de 30°C en oscuridad.
• Finalizado el tiempo de incubación realizar la caracterización macroscópica del cultivo. La
presencia de turbidez indica la presencia de Tiobacilos neutrófilos.
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• ¿Cómo influyen la cáscara de huevo, la puntilla y el papel en el desarrollo de los diferentes
microorganismos de la columna?
• Mencione que reacciones están ocurriendo en cada una de las fases de la columna de
Winogradsky. Tenga en cuenta los donadores y aceptores de electrones.
6. BIBLIOGRAFÍA
• Esteban D, Hysa B, Bartow-McKenney C. Temporal and spatial distribution of the microbial
community of Winogradsky columns. Plos One 2015; 10, 1 – 21.
• Hao T, Xiang P, Mackey H, Chi K, Lu H, Chui H, van Loosdrecht M, Chen G. A review of biological
sulfate conversions in wastewater treatment. Water research 2014; 65, 1 – 21
• Muyzer G, Stams J.M. The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria. Nature 2008;
6, 441 – 454.
• Tang K, Baskaran V, Nemati M. Bacteria of the sulphur cycle: An overview of microbiology,
biokinetics and their role in petroleum and mining industries. Biochemical Engineering Journal 2009;
44, 73 – 94.
• Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. Microbiology: an introduction. Harlow: Pearson. (2016).
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PRÁCTICA No. 6
Cinética de Levaduras
OBJETIVOS
• Realizar la producción de biomasa a partir de Saccharomyces cerevisiae
• Observar las diferentes fases de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante un cultivo
discontinuo
• Relacionar la producción de biomasa con el consumo de azúcares.
• Evaluar el comportamiento de la viabilidad y la vitalidad durante el cultivo de Saccharomyces
cerevisiae.
• Realizar la cuantificación de contaminantes durante la producción de biomasa.
1. INTRODUCCIÓN
La biomasa microbiana es una fuente de proteína suplementaria adecuada obtenida de procesos en
los que se cultivan bacterias, levaduras, hongos o algas en grandes cantidades. La biomasa de
levadura se utiliza ampliamente como suplemento de proteína humana o animal. Las cepas
comunmente utilizadas como fuente de proteína incluyen cepas de Saccharomyces cerevisiae y
Candida utilis. Los productos típicos de biomasa microbiana incluyen levadura de panadería y
extractos de levadura en los que las cepas de Saccharomyces cerevisiae son el huésped para la
producción de proteínas heterólogas, así mismo, la fase de producción de biomasa es importante para
dar paso a etapas posteriores como lo es la fermentación alcohólica.
• ¿Qué aplicaciones tiene la producción de biomasa?
• ¿Por qué es importante el porcentaje de viabilidad en la producción de biomasa de levaduras?
• Durante un proceso de producción de biomasa, ¿Qué factores operacionales y ambientales pueden
afectar la viabilidad de las levaduras?
• Mencione algunos procesos de separación y purificación de levaduras.
• Mencione y explique algunos mecanismos que emplean las levaduras para el estrés metabólico
durante su cultivo.
• ¿En qué se diferencian los procesos de producción de biomasa y fermentación alcohólica? Tenga
en cuenta las vías metabólicas.
Lectura Obligatoria: Jinjing W, Huajian D, Feiyun Z, Yongxian L, Chunfeng L, Chengtuo N & Qi Li.
Physiological Changes of Beer Brewer’s Yeast During Serial Beer Fermentation. Journal of the
American Society of Brewing Chemists 2019; 1 – 12.
Los requisitos más importantes en la producción comercial de levadura son el crecimiento rápido y el
alto rendimiento de la biomasa, junto con una buena capacidad de fermentación de la masa. Estas
metas son intrínsecamente y metabólicamente contradictorias porque un alto rendimiento de biomasa
es favorecido por un catabolismo respiratorio, mientras que una alta capacidad de fermentación de
masa significa una alta capacidad para realizar catabolismo fermentativo. Por lo tanto, la capacidad
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leudante de la levadura es un parámetro extremadamente importante en la producción de levadura de
panadería.
Básicamente, el concepto de proceso industrial se basa en la propagación de células a partir de un
cultivo puro en agar a grandes biorreactores que aumentan el volumen en cada etapa de propagación
hasta el volumen final del biorreactor. Sin embargo, además de este concepto simple, la producción
industrial apunta a la conversión eficiente de la materia prima de azúcar en biomasa de levadura. Una
transformación eficiente del azúcar en proteína de levadura requiere que la producción de metabolitos
anaeróbicos como el etanol y acetaldehído se minimice, es decir, que el metabolismo del azúcar se
desvíe a la vía oxidativa para lograr el máximo rendimiento de energía ATP y formación de biomasa.
Además, los productos de fermentación tales como el etanol y en particular, el acetaldehído son
tóxicos. Este problema adquiere especial relevancia durante el cultivo a altas densidades de biomasa.
En general se sabe que las especies de Saccharomyces cerevisiae tienden a metabolizar la glucosa
glicolíticamente bajo el exceso de glucosa incluso en condiciones totalmente aerobias que producen
etanol, un fenómeno conocido como efecto Crabtree. Además, no sólo la glucosa, sino también la
fructosa ha demostrado desencadenar la represión catabolita sobre algunas cepas de Saccharomyces
cerevisiae. Esta represión de catabolitos produce un bajo rendimiento de biomasa en cultivos
discontinuos y afecta negativamente los rendimientos de la biomasa debido al bajo rendimiento de
ATP de la fermentación alcohólica. A pesar de ello, la formación de biomasa puede lograrse mediante
innumerables vías metabólicas y el rendimiento de la biomasa en el sustrato puede alcanzar valores
de hasta un 50% en el crecimiento oxidativo puro.
Para superar estas limitaciones en la producción de biomasa se deben tener en cuenta dos variables
de gran importancia: la tasa de transferencia de oxígeno y la concentración de glucosa en el medio.
En reacciones heterogéneas gas-líquido, por ejemplo, en la fermentación aerobia, la fase líquida
controla los procesos de transferencia de masa debido a la relativa insolubilidad de los gases. Esta
limitación se minimiza mediante el uso de reactores de columna de burbujas debido a su buena
transferencia de oxígeno con una operación de bajo costo en comparación con los reactores de tanque
agitado. La concentración mínima de azúcar en el caldo se puede alcanzar mediante el uso de un
proceso alimentado por lotes. Este concepto de proceso es el actual en escala industrial y proporciona
buenos rendimientos de biomasa cuando se utiliza la estrategia de control de procesos apropiada.
Tradicionalmente, en la producción industrial, la melaza u otra alimentación de materia prima sigue
una estrategia construida sobre la base de datos históricos de fábrica y por lo tanto es peculiar a una
tensión determinada y otras condiciones del proceso. Hoy en día, no sólo por razones económicas,
sino también por la política ambiental, algunas industrias están invirtiendo en nuevas estrategias de
control de procesos para evitar la emisión de contaminantes tóxicos.
Sustratos para la Producción de Levaduras
Las fuentes renovables utilizadas para la producción de biomasa pueden clasificarse en: azúcares,
almidón, biomasa lignocelulósica y algas. Las materias primas a base de azúcar requieren sólo un
proceso de extracción para obtener azúcares fermentables, mientras que los sustratos amiláceos
necesitan someterse a hidrólisis para convertir el almidón en glucosa. Por otro lado, la biomasa
lignocelulósica tiene que ser pretratada antes de la hidrólisis con el fin de alterar las estructuras de
celulosa para la accesibilidad enzimática.
• Azúcares
Los azúcares fermentables presentes en la biomasa, particularmente las materias primas a base
azúcar, son principalmente glucosa, fructosa y sacarosa. Estos azúcares solubles pueden ser
fermentados por levaduras u otros microorganismos fermentadores sin necesidad de ningún
tratamiento adicional. A diferencia de los azúcares solubles, el almidón es un polímero de glucosa que
no puede ser metabolizado por las levaduras y bacterias tradicionales en su etapa polimérica. Por
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consiguiente, el almidón debe convertirse en glucosa antes de someterlo a fermentación, lo que
requiere enzimas amilolíticas.
• Almidón
El almidón es el principal carbohidrato de almacenamiento en las plantas y actúa como reserva de
energía para las plantas superiores, como los cereales, las leguminosas y los tubérculos. Sin embargo,
la biodisponibilidad del almidón durante la hidrólisis enzimática depende de su estructura que puede
variar con respecto a las fuentes botánicas e híbridos de cultivo. El almidón se compone de dos
polímeros de unidades de α-D-glucosa, amilosa y amilopectina. La amilosa está unida por enlaces α-
1 → 4 glicosídicos, mientras que los enlaces α-1 → 4 y α-1 → 6 se encuentran en la amilopectina. La
amilosa es un polímero lineal de alrededor de 1000 unidades de glucosa, mientras que la amilopectina
posee una configuración muy ramificada junto con una rama que se une por enlaces α-1 → 6 en cada
20 enlaces. Las propiedades fisicoquímicas del almidón se asocian a menudo con su proporción de
amilosa y amilopectina, lo que significa significativamente un rendimiento final de etanol final.
• Biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica contiene cantidades variables de celulosa, hemicelulosa y lignina
dependiendo del tipo de biomasa. La celulosa y las hemicelulosas constituyen aproximadamente dos
tercios del peso seco total de la biomasa vegetal. En la biomasa nativa, los polímeros de celulosa y
hemicelulosa permanecen conectados entre sí por los enlaces covalentes y de hidrógeno, ambos
ligados a la lignina, formando así una matriz ligninocelulósica compleja, robusta y recalcitrante a la
despolimerización. En general, la recalcitrancia de la biomasa se asocia con las propiedades de la
biomasa, incluyendo la naturaleza cristalina de la celulosa, la baja superficie disponible, la protección
de la celulosa y la hemicelulosa por la lignina y la naturaleza heterogénea de las partículas de biomasa.
• Celulosa
La celulosa es un polisacárido con una estructura lineal y cristalina que contiene cadenas lineales de
unidades de glucosa unidas entre sí por enlaces β-1 → 4-glucosídico. El enlace de hidrógeno extensivo
dentro de las moléculas de celulosa crea una red cristalina a través de la reticulación de varios grupos
hidroxilo y finalmente produce microfibrillas que hacen que las moléculas de celulosa sean más
resistentes y rígidas. Esta estructura explícita de la celulosa da como resultado su esqueleto apretado
y gran cristalinidad, lo que a su vez provoca la insolubilidad del polímero en agua y la resistencia a la
despolimerización.
• Hemicelulosa
La hemicelulosa es un heteropolímero. Consta de cadenas cortas, lineales y altamente ramificadas de
monómeros diferentes incluyendo hexosas (β-D-glucosa, α-D-galactosa y β-D-manosa) y pentosas (β-
D-xilosa y α-L-arabinosa). Las cadenas de hemicelulosa pueden contener también ácidos de azúcar
(ácidos urónicos): ácido α-D-glucurónico, α-D-galacturónico y α-D-4-O-metilgalacturónico, que
permanecen asociados con celulosa en la pared celular de la planta. A veces pueden encontrarse en
la hemicelulosa otros azúcares en pequeñas cantidades como α-L-ramnosa y α-L-fructosa. La cadena
principal de hemicelulosa se compone principalmente de xilano a través de enlaces β-1, 4 que incluyen
D-xilosa (alrededor del 90%) y L-arabinosa. Las hemicelulosas comúnmente conocidas son xilanos y
glucomananos. Los xilanos son la principal hemicelulosa en maderas duras, desechos forestales,
residuos agrícolas y residuos municipales e industriales, mientras que la madera blanda suele ser rica
en glucomanano.
• Lignina
La lignina es un polímero aromático altamente ramificado presente en la pared celular de la planta, y
está vinculado a los polímeros de celulosa que forman una matriz lignocelulósica. Los monómeros de
un polímero de lignina son tres compuestos fenólicos: cumárico, coniferilo y alcohol sinapílico. Entre
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la biomasa lignocelulósica, las maderas contienen cantidades relativamente más altas de lignina,
donde las maderas blandas varían entre 30% y 60% y las maderas duras varían entre 30 y 55% de
lignina. Las gramíneas y los residuos agrícolas contienen bajas cantidades de lignina, que van del 10%
al 30% y del 3 al 15%, respectivamente.
estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

estériles
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5 Cajas con agar MRS 5 UN
6 Cajas con agar GLA 5 UN
7 Capilares 1 UN
Caja con Celdas para Para todo el salón
8 1 UN
espectrofotómetro
10 Rack de puntas de 1mL 1 UN Estériles
12 Beacker de 500mL 2 UN Para todo el salón
5.2 REACTIVOS

1 Agua destilada 100 mL
5.3 EQUIPOS

2 Espectrofotómetro 1 UN
3 pHmetro Vórtex 1 UN
4 Plancha de calentamiento 2 UN
5.4 SOLUCIONES
1 Azul de Metileno 1% (p/v) 1 UN Por mesón de trabajo
2 DNS 10 mL Para todo el salón
5.5.1 Reactivación de la Cepa

• Adicionar el contenido de un vial de Saccharomyces cerevisiae en 50mL de caldo YGC estéril.
• Incubar durante 12 horas a una temperatura de 30°C ± 2°C en agitación constante a 100rpm.
5.5.2 Producción de Biomasa

• Tomar 25mL de cultivo de S. cerevisiae y adicionarlos en 125mL de caldo mosto.
• Incubar durante 12 horas y tomar muestras cada 2 horas.
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5.5.3 Cuantificación de Biomasa
• Tomar 1mL de cultivo y adicionarlos en 9mL de solución salina estéril 0.85% (p/v). Este
corresponde a la dilución 10-1.
• Realizar diluciones seriadas en base 10 desde 10-1 hasta 10-3 en solución salina estéril 0.85% (p/v).
• Colocar un cubre objetos sobre el sector central de la cámara de Neubauer.
• Con ayuda de una punta de micropipeta tomar 100µL o un capilar poner en contacto con la muestra
y permitir que esta suba por capilaridad.
• Colocar la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos y dejar que el líquido penetre entre
la cámara y el cubreobjetos desde el lateral por capilaridad. No ejercer presión sobre la cámara.
• Una vez identificada la cuadrícula, contar los 25 cuadrantes y reportar el resultado de células
contadas.
• Calcular el valor de biomasa empleando la siguiente fórmula:
El valor obtenido corresponde a la concentración de células/mL presente en la muestra en ese tiempo
de muestreo.
5.5.4 Determinación del Porcentaje Viabilidad

• Tomar 1mL de cada tiempo de muestreo y adicionarlos en 9mL de solución salina estéril 0.85%
(p/v). Este corresponde a la dilución 10-1.
• Realizar diluciones seriadas en base 10 desde 10-1 hasta 10-3 en solución salina estéril 0.85% (p/v).
• Adicionar 12 gotas de azul de metileno 0.1% (p/v)
• Colocar un cubre objetos sobre el sector central de la cámara de Neubauer.
• Con ayuda de una punta de micropipeta o un capilar poner en contacto con la muestra y permitir
que esta suba por capilaridad.
• Colocar la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos y dejar que el líquido penetre entre
la cámara y el cubreobjetos desde el lateral por capilaridad. No ejercer presión sobre la cámara.
• Por cada cuadrante, contar tanto las células incoloras como las células coloreadas y reportar el
valor de cada una de ellas.
• Calcular el porcentaje de viabilidad empleando la siguiente fórmula:

𝒏
(𝟏 × 𝟏𝟎−𝟒 ) ×
𝟐𝟓
El valor obtenido corresponde al porcentaje de viabilidad de las células presentes en la muestra
5.5.5 Recuento de Contaminantes de Proceso
5.5.5.1 Recuento de Bacterias Ácido Lácticas

• Realizar diluciones seriadas en base 10 tomando 1ml de cultivo y adicionándolo en 9 ml de
diluyente. Realizar diluciones desde 10-1 hasta 10-5.
• Sembrar en superficie 0.1mL de cada dilución en agar MRS.
• Incubar las cajas durante 48 h a una temperatura de 35°C ± 2°C.
• Finalizado el tiempo de incubación realizar el recuento de colonias.
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5.5.5.2 Recuento de Levaduras Salvajes
• Sembrar por duplicado y en superficie 0.1mL de cada dilución en agar Lisina
5.5.6 Medición de pH
• Tomar un volumen representativo de la muestra y realizar la medición de pH en el pHmetro.
Verificar la calibración previa a su uso.
5.5.7 Cuantificación de Azúcares
5.5.7.1 Preparación de DNS

• Pesar los siguientes componentes por separado: 1g de ácido 3,5 – dinitrosalicílico, 43.8g de tartrato
de sodio y de potasio, 1.6g de hidróxido de sodio.
• Adicionar 50mL de agua destilada en un vaso de precipitado de 50mL.
• Adicionar 1.6g de hidróxido de sodio y disolver con agitación magnética a temperatura ambiente.
• Adicionar lentamente 43.8g de tartrato de sodio y potasio hasta disolver por completo.
• Envolver el vaso de precipitado con papel aluminio totalmente y agregar lentamente 1g de ácido
3,5 – dinitrosalicílico.
• Completar a 100mL en un balón volumétrico de 100mL
• Agitar durante 12 horas en un frasco ámbar oscuro.
• Rotular el frasco con el nombre del reactivo, fecha de preparación y responsable del reactivo.
Nota: Esta etapa es realizada por el docente de la asignatura.
5.5.7.2 Elaboración de la Curva Patrón para Cuantificación de Azúcares.
• Calentar un baño maria a temperatura de ebullición.
• Preparar 50mL de una solución 2g/L de glucosa anhidra. Usar como solvente agua destilada.
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• A partir de la solución de glucosa, preparar las siguientes soluciones de glucosa en tubos de 13 x
100: 0.2g/L, 0.4g/L, 0.5g/L, 1.0g/L, 1.2g/L, 1.4g/L, 1.6g/L, 1.8g/L y 2g/L. Como concentración 0
(blanco) usar agua destilada.
• Tomar 0.25mL de cada una de las soluciones y adicionarlas en un nuevo tubo de 13 x 100.
• Adicionar 0.25mL del reactivo DNS a cada uno de los tubos.
• Calentar a ebullición durante 5minutos y posteriormente detener la reacción por inmersión de los
tubos en hielo durante 5 minutos.
• Adicionar 2.5mL de agua destilada a cada uno de los tubos de reacción.
• Ajustar el cero de absorbancia del espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm.
• Realizar la lectura de absorbancia de los tubos de reacción.
• Realizar la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de la concentración (absorbancia
vs concentración) y determinar la ecuación de la recta.
5.5.7.3 Cuantificación de Azúcares en Fermentación
• Cubrir un tubo de 16 x 150 con papel aluminio evitando el paso de la luz.
• Tomar 0.25mL de la muestra y 0.25mL del reactivo DNS y adicionarlas en el tubo.
• Calentar en baño maría durante 5minutos y posteriormente detener la reacción por inmersión de
los tubos en hielo durante 5 minutos.
• Adicionar 2.5mL de agua destilada a cada uno de los tubos de reacción.
• En caso de obtener un valor por encima de 1.0 se debe realizar una dilución a la muestra inicial y
repetir el procedimiento.
• Reemplazar el valor obtenido en la ecuación de la recta obtenida previamente.

• Realizar una gráfica integrada de la biomasa, porcentaje de viabilidad, pH y azúcares reductores
durante los diferentes tiempos de muestreo.
• Cuales rutas metabólicas están implicados en la producción de biomasa y cómo se llevó a cabo el
metabolismo del sustrato presente.
• ¿Qué relación existe entre el pH y la producción de biomasa? Tenga en cuenta los metabolitos que
se producen durante el cultivo.
• ¿Qué modificaciones a nivel de membrana y/o metabolitos emplean las levaduras para evitar la
afectación de su membrana?
• ¿Cómo afecta el metabolismo de las levaduras la presencia de bacterias ácido-lácticas y levaduras
salvajes?
6 BIBLIOGRAFÍA
• Durão E, Stupiello M, Andrietta S. Yeast biomass production: a new approach in glucose-limited
feeding strategy. Brazilian Journal of Microbiology 2013; 44, 551 – 558.
• Martínez R Morales P, Gonzalez R, Mas R, Beltran G. Biomass production and alcoholic
fermentation performance of Saccharomyces cerevisiae as a function of nitrogen source. FEMS
2012; 12, 477 – 485.
• Perez R, Gamero E, Gómez R, Garre E, Aranda A, Matallana E. Yeast biomass, an optimised
product with myriad applications in the food industry. Trends in Food Science & Technology 2015;
46, 167 – 175.
• Okafor, N. Modern industrial microbiology and biotechnology. Enfield: Science. (2007)
Página | 52
BALORATORIO MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
PRÁCTICA No. 7
Cinética de Bacterias Ácido Lácticas
OBJETIVOS
• Realizar la producción un inóculo a partir de un cultivo de Bacterias Ácido-Lácticas.
• Observar las diferentes fases de crecimiento de Bacterias Ácido-Lácticas durante un cultivo
discontinuo.
• Relacionar la producción de biomasa con el cambio de pH y la producción de proteínas.
• Realizar la producción de yogurt a partir de un cultivo de Bacterias Ácido-Lácticas.
• Evaluar el potencial probiótico del cultivo de Bacterias Ácido-Lácticas sobre diferentes patógenos.
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias ácido láctica (BAL) (Lactic acid bacteria, LAB) son un grupo de microorganismos no
esporulados, catalasa negativos, Gram positivos, que presentan morfologías cocáceas y bacilares y
son estrictamente fermentativos. Su principal producto final de la fermentación de azúcares es el ácido
láctic. Actualmente, este grupo comprende los siguientes géneros: Carnobacterium, Enterococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella. Se pueden encontrar en diferentes hábitats como el suelo,
el agua, el tracto gastrointestinal animal y humano, así como en alimentos y productos fermentados.
Muchos de estos microroganismos con considerados probióticos, un probiótico es una preparación o

un producto que contiene microorganismos viables en número suficiente que alteran la microflora (por
implantación o colonización) en un compartimento del huésped provocando efectos beneficiosos para
la salud. En general, las características probióticas dependen de múltiples aspectos que generalmente
no son específicos de una sola cepa. Algunos de los efectos probióticos reportados in vitro son la
producción de enzimas, vitaminas y aminoácidos, la capacidad de adherencia, el efecto antagónico
sobre los microorganismos patógenos, la tolerancia a las sales biliares, la producción de bacteriocinas,
la resistencia a los jugos gástricos, la reducción de los niveles de colesterol y estimulación del sistema
inmune entre otros
• Mencione algunos productos cuyo principio activo sean bacterias ácido lácticas.
• ¿Cuáles son las principales aplicaciones de las bacterias ácido lácticas?
• ¿Qué son las bacteriocinas? Mencione el mecanismo de acción y los métodos de cuantificación.
• ¿Qué son los probióticos y qué beneficios inmunológicos confieren?
• ¿Qué propiedades debe presentar un microorganismo para considerarse un probiótico?
• ¿Por qué se pueden considerar los probióticos como conservantes de alimentos?
Lectura Obligatoria: Gómez J.A, Giraldo C, Habeych D, Baena S. Evaluation of biological production
of lactic acid in a synthetic medium and in Aloe vera (L.) Burm. f. processing by-products. Universitas
Scientiarum 2015; 20, 369 – 385.
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo de bacterias Gram positivas unidas por características
morfológicas, metabólicas y fisiológicas que producen ácido láctico como principal producto final
durante la fermentación de carbohidratos. Las BAL están asociadas con la fermentación de alimentos,
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bebidas y con la mucosa animal y humana. Debido a esta larga tradición de uso en seres humanos, la
Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, Food and Drug Administration) han reconocido
que las BAL asociadas con fermentación de alimentos tiene un estatus seguro (GRAS – Generally
recognized as safe).
Las BAL también están asociadas con la síntesis de una amplia gama de compuestos como ácidos
orgánicos, péptidos, agentes antimicrobianos, compuestos aromáticos, exopolisacáridos, vitaminas B
y nutracéuticos. Ciertas cepas de BAL denominadas probióticos muestran propiedades beneficiosas
en la salud humana y animal y son parte de la producción de alimentos funcionales. Las bacterias
también se han vuelto importantes en las aplicaciones biotecnológicas y biomédicas.
Adicionalmente, algunas BAL tienen la capacidad de secretar moléculas edulcorantes bajas en

calorías, que son actualmente fuente de numerosos estudios. La producción de ácido láctico mediada
por las BAL a partir de sustratos renovables y utilizada para la purificación y fabricación ulterior del
ácido poliláctico se ha vuelto más significativa en los últimos años. Se cree que el ácido poliláctico y
las BAL pueden proporcionar los fundamentos futuros para una sociedad basada en biorrefinerías,
mientras que la sustitución de subproductos de petróleo generados a partir de la biomasa será vital
para la sostenibilidad y la sociedad de la industria química en un futuro próximo.
Las aplicaciones de las BAL también incluyen fármacos, inmunoterapéuticos, vacunas vivas y
suministro de ADN, que son seguros para ser utilizados en seres humanos y animales debido a las
características inofensivas de estos microorganismos. Las BAL no son adecuados naturalmente para
maximizar las tasas de producción de algunos compuestos biotecnológicos específicos tales como
ácidos orgánicos, antimicrobianos y otros. Por lo tanto, un enfoque es seleccionar los puntos clave de
la red metabólica de las BAL para futuras manipulaciones genéticas con el fin de obtener una
producción optimizada a expensas de la supervivencia y replicación de los organismos. Este proceso
de optimización metabólica asume el desarrollo sostenible de las tecnologías ómicas (como la
genómica, la transcriptómica, la proteómica, la metabolómica y la fluxomía) y el desarrollo de
herramientas experimentales y matemáticas como plataforma de conocimiento.
Las BAL más ámpliamente estudiadas industrialmente se encuentran ubicados en dos phyla distintos:
Firmicutes y Actinobacteria. Dentro del phylum Firmicutes los géneros más importantes son
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediocuccus, Streptococcus y Weissella,
todos pertenecientes al orden Lactobacillales y con bajo contenido en GC (31 – 49%). Dentro del
phylum Actinobacterium, pertenece al género Bifidobacterium, que tiene un alto contenido de GC (58
– 61%).
Las dos vías principales de la fermentación de azúcares en las BAL de denominan Homo y hetero
fermentación. En la fermentación homoláctica, la glicólisis (Embden-Meyerhorf-Parnas) sólo genera
ácido láctico como producto final bajo condiciones estándar. En la fermentación heteroláctica
heteroláctico, la vía de fosfogluconato / fosfocetolasa genera varios tipos de productos finales además
de lactato, etanol, acetato y CO2. Al variar las condiciones de cultivo se pueden alterar
significativamente la formación del producto en algunas bacterias, estos cambios se atribuyen al
metabolismo alterado del piruvato o al uso de receptores de electrones externos como el oxígeno o
cualquier compuesto orgánico.
En la imagen a continuación se describen los principales procesos metabólicos asociados con las
bacterias ácido lácticas.
Página | 54
Además de asociarse con la industria láctea y la salud humana y animal, las BAL se han utilizado
históricamente en la producción de alimentos lácteos fermentados debido a su capacidad de
acidificación y de cambio de textura y sabor. En relación con el metabolismo, la característica esencial
de BAL es su fermentación eficiente de carbohidratos acoplada a la fosforilación a nivel de sustrato.
Por lo general, el ácido láctico es el principal producto metabólico final junto con otros productos de
fermentación como el ácido acético, el etanol, el dióxido de carbono y el ácido fórmico. Aunque estas
bacterias están asociadas con procesos de fermentación, se sabe que algunas de ellas son capaces
de crecer mejor en condiciones aeróbicas, con un mayor crecimiento y una mayor tasa de
supervivencia, aunque requieran moléculas tipo hemo o menaquinonas para el correcto
funcionamiento del transporte de electrones.
Muchos de estos microorganismos se encuentran en una amplia variedad de ambientes nutritivos; Por
ejemplo, la leche y los productos lácteos, los cereales, la carne y los productos cárnicos pueden
utilizarse en muchos casos como cultivos iniciadores en procesos de fermentación de productos
alimenticios, transfiriendo aroma, textura, acidez, vitaminas y otros. Las BAL también están asociados
con la salud humana y animal porque juegan un papel importante en el equilibrio y los sistemas de
defensa de la microbiota gastrointestinal y genital. Por lo tanto, algunas cepas de BAL se han utilizado
como probióticos, siendo intencionalmente incorporados en alimentos funcionales y productos para un
papel benéfico en las personas que los consumen. La gran diversidad de hábitats en los que se puede
encontrar las BAL justifica su amplia diversidad genética y también el hecho de que existen algunas
funciones y capacidades metabólicas enriquecidas dependiendo de su origen.
Página | 55
Bata de Laboratorio.
Guantes de nitrilo.
Gafas de seguridad.
intercambio con los demás compañeros de Laboratorio.
residuos generados en las prácticas del Laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:
• Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de Laboratorio, los cuales

práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del Laboratorio, quien
le indicará la forma correcta de hacerlo.
5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

estériles
4 Cajas con agar MRS 6 UN
5 Cajas con agar Casoy 2 UN
6 10mL de Suspensión de E. coli 1 UN
10mL de Suspensión de
7 1 UN
Salmonella
8 Tubos de 16 x 150 vacíos 1 UN
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Caja con Celdas para
9 1 UN Para todo el salón
espectrofotómetro
11 Rack de puntas de 1mL 1 UN Estériles
5.2 REACTIVOS

1 Agua destilada 100 mL
2 Bradford 10 mL Para todo el salón
5.3 EQUIPOS

3 pHmetro 1 UN
5.4 SOLUCIONES

5.5.1 Producción de Inóculo de Bacterias Ácido Lácticas

• Preparar 5mL de una suspensión de BAL y adicionarlas en 125mL de caldo leche estéril.
• Incubar durante 12 horas y tomar muestras cada 2 horas.
5.5.2 Recuento de Bacterias Ácido Lácticas

• Sembrar en superficie 0.1mL de cada dilución en agar MRS.
• Homogenizar con ayuda de un rastrillo o asa estéril.
• Finalizado el tiempo de incubación realizar el recuento y descripción de las colonias.
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5.5.3 Caracterización de Morfologías
• Realizar tinción de Gram a su tiempo de muestreo
5.5.4 Medición de Ph
5.5.5 Cuantificación de Proteínas
5.5.5.1 Preparación de Reactivo de Bradford

• Disolver 100 mg de Coomassie Blue G250 en 50mL de etanol al 95%.
• Adicionar 100mL de ácido fosfórico al 85%
• Completar hasta 1L con agua destilada.
• Elaboración de la Curva Patrón para Cuantificación de Proteínas

• Preparar 50mL de una solución 100µg/mL de albúmina de huevo. Usar como solvente agua
destilada.
• A partir de la solución de albúmina, preparar las siguientes soluciones en tubos de 13 x 100: 10
µg/mL, 20 µg/mL, 40 µg/mL, 60µg/mL, 80 µg/mL y 100µg/mL. Como concentración 0 (blanco) usar
agua destilada.
• Tomar 0.1mL de cada una de las soluciones y adicionarlas en un tubo de 13 x 100.
• Adicionar 5mL del reactivo de Bradford a cada uno de los tubos.
• Dejar reaccionar por 2 minutos.
• Realizar la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de la concentración (absorbancia
vs concentración) y determinar la ecuación de la recta.
5.5.5.2 Cuantificación de Proteínas en Fermentación

• Tomar 0.1mL de cada tiempo de muestreo.
• Adicionar 1.9mL del reactivo de Bradford en la celda
• Dejar reaccionar por 2 minutos.
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• En caso de obtener un valor por encima de 1.0 se debe realizar una dilución a la muestra inicial y
repetir el procedimiento.
• Reemplazar el valor obtenido en la ecuación de la recta obtenida previamente.
5.5.6 Pruebas de Antagonismo

• Adicionar 0.1mL del cultivo de los patógenos y 0.1mL del extracto de cada hora de muestreo sobre
agar Casoy.
• Homogenizar la muestra con ayuda de un rastrillo o asa estéril.
• Incubar durante 48 horas a una temperatura de 35°C ± 2°C.
• Finalizado el tiempo de incubación observar si se presentó crecimiento de alguno de los patógenos
en las diferentes horas de muestreo.
5.5.7 Elaboración de Yogurt
5.5.7.1 Cultivo y Fermentación

• Adicionar 3L de leche y 4 cucharadas de azúcar en un recipiente y calentar hasta que la leche
alcance una temperatura de 85ºC aproximadamente. Homogenizar constantemente.
• Finalizado el tiempo de cocción, retire la leche y permita que se atempere hasta alcanzar 45ºC.
• Una vez alcanzada la temperatura, adicionar el contenido del inóculo de las BAL.
• Llevar todo el contenido de la mezcla a un recipiente preferiblemente con cierre hermético para
conservar al máximo la temperatura.
• Dejar actuar el cultivo durante 18 – 24 horas.
5.5.7.2 Preparación de la Fruta

• Seleccionar, lavar y picar de 1,5 a 2Lb de su fruta favorita.
• Llevar a fruta a un sartén, adicionar 1 pocillo de azúcar y calentar durante 5min o hasta obtener
una mezcla homogénea. Si se encuentra muy seco, puede adicionar un pocillo de agua.
• Obtenida la mezcla, retirar y dejar atemperar.
5.5.7.3 Mezcla
• Retirar el yogurt sin sabor del recipiente del numeral 5.5.7.1 y adicionarlo en un nuevo recipiente
para preparar la mezcla.
• Adicionar el contenido de la fruta preparada.
• Homogenizar la mezcla y adicionar azúcar si considera necesario.
• Meter al refrigerador y enfriar a una temperatura entre 2- 8ºC.

• Realizar una gráfica integrada de la biomasa, pH y proteínas.
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• Cuales rutas metabólicas están implicados en la producción de biomasa de las BAL y cómo se llevó
a cabo el metabolismo del sustrato presente. Tenga presente que en la leche no sólo hay lactosa.
• De las bacterias presentes en el cultivo, ¿Cuáles son homofermentativas y cuales
heterofermentativas?
• ¿Qué relación existe entre el pH y la producción de biomasa? Tenga en cuenta los metabolitos que
se producen durante el cultivo de ambos tipos de fermentación.
• ¿Cuál es el pH ideal para el desarrollo de cada una de las BAL presentes en el cultivo?
• ¿Qué tipo de sinergismo se puede presentar entre las diferentes BAL presentes en el cultivo?
• ¿Cómo se ve afectado el desarrollo de los patógenos por los metabolitos presentes en el extracto
del cultivo de las BAL?
6 BIBLIOGRAFÍA
• García Y, Pérez T, Boucourt R, Belcázar J, Nicoli J, Moreira J, Rodríguez Z, Fuertes H, Nuñez O,
Albelo N, Halaihel N. Isolation, characterization and evaluation of probiotic lactic acid bacteria for
potential use in animal production. Research in Veterinary Science 2016; 108, 125 – 132.
• Le C, Coton E, Le Blay G, Chobert JM, Haertlé T, Choiset Y, Van Long N, Meslet L, Mounier Jerome.
Identification and quantification of antifungal compounds produced by lactic acid bacteria and
propionibacteria. International Journal of Food Microbiology 2016; 239, 79 – 85.
• Lamont J, Wilkins O, Bywater M, Smith D. From yogurt to yield: Potential applications of lactic acid
bacteria in plant production. Soil Biology and Biochemistry 2017; 111, 1 – 9.
• Palomar M, Bru E, Maldonado C, Perdigon G. Oral probiotics supplementation can stimulate the
immune system in a stress process. Journal of Nutrition & Intermediary Metabolism 2017; 8, 29 –
40.
• Thi V, Zhao J, Fleet G. The effect of lactic acid bacteria on cocoa bean fermentation. International
Journal of Food Microbiology 2015; 205, 54 – 67.
• Woraprayote W, Maila Y, Sorapukdee S, Swetwiwathana A, Benjakul S, Visessanguan W.
Bacteriocins from lactic acid bacteria and their applications in meat and meat products. Meat
Science 2016; 120, 118 – 132.
• Wu Z, Wu J, Cao P, Jin Y, Pan D, Zeng X, Guo Y. Characterization of probiotic bacteria involved in
fermented milk processing enriched with folic acid. Journal of Dairy Science 2017; 100, 4223 –
4229.
Página | 60
PRÁCTICA No. 8
Co - Cultivos
OBJETIVOS
• Evaluar el porcentaje de degradación de un co – cultivo microbiano a base de bacterias y
hongos sobre un colorante industrial.
• Conocer los diferentes procesos físicos y enzimáticos que llevan a cabo los microorganismos
para realizar la remoción de colorantes.
1. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos viven como comunidades complejas de múltiples especies en entornos
naturales, industriales o artificiales. Los rasgos sociales como la competencia y la cooperación se
observan con frecuencia en las comunidades microbianas, que permiten que diferentes
microorganismos coordinen sus comportamientos para determinar las funciones de toda la
comunidad. Esta forma de interacción se puede realizar a través de metabolitos secretados
endógenamente, que se demuestra por la secreción de compuestos antimicrobianos para
inhibir/promover el crecimiento de especies vecinas. En consecuencia, ciertos microorganismos
dependen de estos metabolitos para sobrevivir.
Uno de los usos de los cocultivo microbianos es en el tratamiento de efluentes de tintes, ya que son
uno de los principales contaminantes liberados al medio ambiente, principalmente por los textiles,
las industrias de colorantes y los laboratorios. Los colorantes tipo azo (principalmente usados en las
pruebas de laboratorio) representan aproximadamente el 70% de todos los colorantes, lo que los
convierte en el grupo de colorantes sintéticos de mayor uso y más comunes liberados en el medio
ambiente. La descarga inadecuada de efluentes coloreados en ecosistemas acuosos conduce a una
reducción en la penetración de la luz solar, lo que a su vez disminuye la actividad fotosintética, la
concentración de oxígeno disuelto y la calidad del agua, a su vez, con serios efectos sobre la flora y
fauna, causando serios problemas ambientales en todo el mundo. Además, los colorantes azoicos
también tienen un impacto adverso en términos de carbono orgánico total (COT), demanda biológica
de oxígeno (DBO) y demanda química de oxígeno (COD).
• ¿Qué manejo se le pueden dar a los residuos domèsticos, industriales y de laboratorios clínicos y
de análisis?
• ¿Qué es la DBO y la DQO?
• ¿Qué métodos diferentes a los enzimáticos puedes usar los hongos para la remoción de colorantes
industriales?
• ¿Qué efectos tóxicos puede tener un colorante sobre el desarrollo de bacterias?
• ¿Qué es la fitorremediación?
• Mencione y describa un proceso microbiológico en el cual se presente un ejemplo de cocultivo y
cometabolismo diferente al tratamiento de efluentes industriales.
Lectura Obligatoria: Kurade M, Waghmode T, Xiong J-Q, Govindwar S, Jeon B. Decolorization of

textile industry effluent using immobilized consortium cells in upflow fixed bed reactor. Journal of
Cleaner Production 2019; 213, 884 – 891.
Página | 61
3.1 Generalidades de los Colorantes
Los colorantes son compuestos orgánicos coloreados naturales o sintéticos que tienen la propiedad
de impartiendo su color a las otras sustancias, tales como fibras textiles. Los tintes sintéticos son
utilizado extensivamente para teñir la materia textil, impresión de papel, análisis de pruebas en
laboratorios, teñido de cuero, fotografía a color y como aditivos en productos derivados del petróleo
debido a su facilidad y rentabilidad en síntesis, firmeza, alta estabilidad a la luz, temperatura,
detergente y variedad de color en comparación con los tintes naturales. Estos diferentes usos
producen efluentes que generalmente son muy resistentes al tratamiento biológico y, por lo tanto, sus
residuos industriales son una de las principales problemas para el medio ambiente. El agua residual
liberada de las industrias textiles es una mezcla compleja de muchas sustancias contaminantes, que
van desde plaguicidas de base agrícola a los metales pesados asociados con el tinte o el proceso de
tinte. Aproximadamente 10,000 diferentes tipos de tintes y pigmentos se utilizan en diferentes
industrias y su producción excede más de 7 × 105 toneladas anuales en todo el mundo.
La mayoría de estos pigmentos se preparan a partir de colorantes azo, antraquinona, triarilmetano y

ftalocianinas. Alrededor del 50% de los colorantes se utilizan en la industria textil y dentro de éstos los
colorantes azoicos representan la mayor proporción de todos los tintes sintéticos en términos de
número y cantidad. Aproximadamente el 70% de todos tintes orgánicos que actualmente están
disponibles en el mercado se fabrican principalmente en China, India, Corea, Taiwán y Argentina. Los
colorantes tipo azo, una de las clases más grandes de colorantes utilizados en la industria textil, se
liberan en los ambientes acuáticos y terrestres a través de los efluentes que emanan de las industrias
textiles y colorantes y son normalmente no se elimina por el sistema de tratamiento de aguas
residuales convencional. La característica estructura química (como ─C═C─, ─N═N─ y ─C≡N─) de
los colorantes azo los hacen recalcitrantes a la descomposición biológica.
3.2 Métodos Físico – Químicos
3.2.1 Métodos Físicos
Método Ventaja Desventaja

Remueve eficientemente varios Algunos de los materiales
colorantes. Como alternativas utilizados, como el carbón
se han usado sílica y activado, tienen costos
recientemente materiales elevados y pérdidas en la
Adsorción celulósicos obtenidos de regeneración. Por otro lado, los
residuos agroindustriales (maíz materiales menos costosos
cebada, etc.). Además de su como las virutas de madera,
eficiencia, es una tecnología requieren más tiempo de
económicamente atractiva. contacto y generan residuos.
Se utiliza para remover Tiene altos costos. Es
colorantes que se encuentran ineficiente para la remoción de
en bajas concentraciones. Es sólidos disueltos, por lo que son
Filtración por membrana
un sistema resistente a necesarios los tratamientos
temperatura y ataques adicionales.
microbianos.
Es un método muy efectivo para Los solventes orgánicos
Intercambio iónico remover colorantes catiónicos y utilizados son caros. Sólo tiene
aniónicos. No hay mucha aplicaciones específicas.
Página | 62
pérdida en la regeneración de
los solventes
3.2.2 Métodos Químicos
Método Ventaja Desventaja

Es un proceso relativamente
nuevo que tiene una eficiente
remoción de colorantes y la Los costos de la electricidad
Electroquímico
degradación de contaminantes son altos.
sin generar subproductos
tóxicos o lodos.
Es uno de los métodos más
usados. Involucra el
rompimiento de los anillos
aromáticos. La oxidación con el
El reactivo de Fenton tiene
reactivo de Fenton es un
como desventaja la formación
método adecuado para el
de lodos. El uso de hipoclorito
Oxidación tratamiento de aguas residuales
de sodio (NaOCl) genera
resistentes a un tratamiento
subproductos tóxicos y
biológico, sin embargo se
carcinógenos.
forman lodos. El hipoclorito de
sodio (NaOCl) al igual que el
ozono, son efectivos en el
rompimiento de enlaces azo.
Se pueden generar
Se puede utilizar para degradar
subproductos como
moléculas orgánicas en CO2 y
halogenuros, metales, ácidos y
agua, ya sea en lote o en un
Fotoquímico aldehídos. Sólo es efectivo si
sistema continuo con cortos
las concentraciones de
tiempos de exposición. No
colorantes son bajas. Presenta
genera lodos.
altos costos.
Se obtienen resultados pobres
Presenta buena eficiencia de
con colorantes ácidos y hay un
remoción, se realiza en un
Coagulación alto costo de disposición por los
periodo corto de tiempo y tiene
volúmenes de lodos que
bajos costos de inversión.
resultan de este método.
3.3 Métodos Biológicos
Los microorganismos tienen una gran capacidad de degradar compuestos orgánicos persistentes,
que se usan en industrias de colorantes. Con estudios anteriores sobre microorganismos, se han
aplicado una serie de estrategias a demostrar o mejorar la capacidad de los organismos para degradar
diversos xenobióticos persistentes y tóxicos. Los hongos y bacterias son los principales
degradadores de materia orgánica, siendo los hongos son más conocidos para este propósito.
3.3.1 Bacterias
Los intentos de identificar las bacterias que pueden degradar el colorante azoico se iniciaron en 1970
con el aislamiento de tres cepa: Bacillus subtilis, Aeromonas hydrophila y Bacillus cereus. La
Página | 63
reducción del colorantes tipo azo generalmente no es específica y la decoloración es más rápida
durante el proceso de degradación bacteriana. Una amplia gama de bacterias aeróbicas y
anaeróbicas como Pseudomonas sp., Bacilus subtilis, Geobacillus sp., Escherichia coli,
Rhabdobacter sp., Enterococcus sp., Staphylococcus sp., Corneybaterium sp., Lactobacillus sp.,
Xenophilus sp., Clostridium sp., Acinetobacter sp., Micrococcus sp., Dermacoccus sp., Rhizobium
sp., Proteus sp., Morganella sp., Aeromonas sp. ., Alcaligenes sp., Klebsiellla sp., Shewanella sp., y
Alishewanella sp. se han reportado ampliamente debido a su buena biodegradación resultante de
los colorantes azoicos.
Los colorantes azoicos son compuestos con deficiencia de electrones que tienen un grupo cromóforo
(−N = N-) junto con muchos otros grupos que retiran electrones. En algunos casos, la generación de
deficiencia de electrones hizo que el compuesto fuera menos susceptible al proceso de degradación.
Sin embargo, las bacterias muestran un potencial eficiente en la degradación del colorante con la
ayuda de un sistema enzimático diverso y muy desarrollado. El paso principal en la decoloración
bacteriana es aeróbico o anaeróbico o por un método secuencial, seguido de la escisión reductiva
del enlace azo. En condiciones anaeróbicas, los colorantes azoicos se degradan a aminas incoloras
que son cancerígenas por naturaleza y se degradan aún más por procesos aeróbicos. Se pueden
usar procesos microaerófilos o aeróbicos secuenciales cuando la amina aromática producida en
condiciones microaerófilas se degrada aún más en condiciones aeróbicas. En caso de
descomposición enzimática de colorantes azoicos industriales, principalmente dos enzimas, a saber:
la azoreductasa y la lacasa parecen tener un gran potencial. En condiciones adversas, las enzimas
peroxidasa y oxidasa participan en otras funciones metabólicas y también pueden degradar el tinte
azoico en cierta medida. Estas enzimas pueden actuar de manera tanto extracelular como
intracelular. Aparte de las bacterias, estas enzimas también se reportan en hongos, plantas u otras
fuentes.
3.3.2 Hongos
Los hongos de podredumbre blanca comprenden un grupo fisiológico de hongos capaces de
biodegradar lignina y el nombre de podredumbre blanca deriva de la apariencia blanca de la madera
atacada por estos hongos, donde la eliminación de lignina da una apariencia blanqueada. Son en
su mayoría basidiomicetos, aunque pocos ascomicetos también son capaces de llevar a cabo
descomposición por podredumbre blanca.
Estos hongos son reguladores clave del ciclo del carbono. Sus complejo enzimático para
degradar/modificar lignina, compuesto por las manganeso peroxidasas (MnP), E.C. 1.11.1.13; lignins
peroxidasas (LiP), E.C. 1.11.1.14 y lacasas (Lac), E.C. 1.10.3.2, están directamente involucradas no
solo en la degradación de lignina en sus sustratos lignocelulósicos naturales sino también en la
degradación de varios compuestos xenobióticos que incluyen los colorantes. Este sistema
enzimático es esencial para la degradación de la lignina, sin embargo, para la lignina la
mineralización a menudo se combinan con otros procesos que involucran enzimas adicionales. Tales
enzimas auxiliares (por sí mismas no pueden degradar la lignina) son las glioxal oxidasa y superóxido
dismutasa para la producción intracelular de H2O2 (un cosustrato de la LiP y MnP) así como glucosa
oxidasa, aril alcohol oxidasa y celobiosa deshidrogenasa.
Página | 64
estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

estériles
2 Cajas con Agar Casoy 7 UN
3 Rack de puntas de 1mL 1 UN
Caja con Celdas Desechables
8 1 UN Para todo el salón
para Espectrofotómetro
9 Cultivo de Penicillium sp 2 UN En caja de Petri
10 Cultivo de Pleurotus sp 2 UN En caja de Petri
11 Cultivo de Pseudomonas sp 250 mL
12 Cultivo de Bacillus subtilis 250 mL
5.2 REACTIVOS
Página | 65

Solución de Residuos de
1 Colorantes de Laboratorio 500 mL Para todo el grupo
5.3 EQUIPOS

2 pHmetro 1 UN
3 Microscopio 1 UN
5.4 SOLUCIONES

5.5.1 Montaje del Sistema

• Adicionar 500mL de la solución de colorantes de laboratorio en un Erlenmeyer de 1000mL
• Adicionar 15g de glucosa
• Adicionar los cultivos de Pseudomonas sp y Bacillus sp directamente al Erlenmeyer
• Con ayuda de una lanceta, adicionar todo el cultivo de Penicillium sp y Pleurotus sp
directamente al Erlenmeyer.
• Incubar a temperatura ambiente y suminisitrar aireación constante con ayuda de una bomba de
pecera durante 10 días.
• Tomar una muestra diaria, tomando como día 0 la fecha en que se inicia el cultivo.
5.5.2 Recuento de Bacterias Totales

• Sembrar en superficie 0.1mL de cada dilución en agar Casoy.
• Homogenizar con ayuda de un rastrillo o asa estéril.
• Finalizado el tiempo de incubación realizar el recuento y descripción de las colonias.
5.5.3 Caracterización de Morfologías

• Realizar tinción de Gram a su tiempo de muestreo
5.5.4 Medición de Ph
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5.5.5 Cuantificación de Unidades de Color (UC)

• Adicionar aproximadamente 1mL del cultivo en la celda
• En caso de obtener un valor por encima de 1.0 se debe realizar una dilución a la muestra inicial
y repetir el procedimiento.
• Calcular las unidades empleando la siguiente fórmula:
• Una vez obtenidas las unidades de color, realizar el cálculo del porcentaje de remoción en cada
uno de los tiempos de muestreo empleando la siguiente fórmula:

• Realizar una gráfica integrada de biomasa, pH, unidades de color y porcentaje de remoción.
• ¿Qué mecanismos emplean los diferentes microorganismos presentes en el cultivo para la
remoción de los colorantes presentes?
• ¿Cuáles son los productos que se obtienen de la remoción de colorantes y a qué rutas metabólicas
ingresan?
• ¿Qué método físico – químico podría acompañar al tratamiento biológico para la remoción de
colorantes?
6. BIBLIOGRAFÍA
• Chan G, Abdul N, Suan L, Ab.Ilah N, Nasiri R, Roslan M. Communal microaerophilic–aerobic
biodegradation of Amaranth by novel NAR-2 bacterial consortium. Bioresource Technology 2012;
105, 48 – 59.
• Chenn B, Lin K, Wang M, Yi C. Revealing interactive toxicity of aromatic amines to azo dye
decolorizer Aeromonas hydrophila. Journal of Hazardous Materials 2009; 166, 187 – 194.
• Khan R, Bhawana P, Fulekar M. Microbial decolorization and degradation of synthetic dyes: a
review. Rev Environ Sci Biotechnol 2013; 12,75–9
• Rawat D, Mishra V, Shyam R. Detoxification of azo dyes in the context of environmental processes.
Chemosphere 2016; 155, 591 – 605.
• Sarkar S, Banejee A, Halder U, Biswas R, Bandopahdahyay R. Degradation of Synthetic Azo Dyes
of Textile Industry: a Sustainable Approach Using Microbial Enzymes. Water Conserv Sci Eng 2017;
1 -11.
Página | 67
PRÁCTICA No. 9
Evaluación de Desinfectantes
OBJETIVOS
• Evaluar el potencial de diferentes desinfectantes sobre un consorcio de microrganismos.
• Describir los mecanismos de acción de acuerdo a los principios activos de los desinfectantes.
• Entender la acción de un detergente y desinfectante y su impacto a nivel industrial.
• Comprender la necesidad de implementar un programa de rotación de desinfectantes.
• Conocer la normatividad actual referente al tema de uso de desinfectantes y sanitización.
1. INTRODUCCIÓN
La aparición y propagación de microorganismos resistentes son amenazas en todos los procesos
industriales y de alguna manera pueden tener un impacto en la salud pública a nivel mundial. Los
desinfectantes son agentes químicos utilizados ampliamente en hospitales y otros entornos de
atención médica, para inhibir o destruir microorganismos y en consecuencia, para prevenir infecciones.
También se utilizan en muchas áreas industriales para los diferentes controles en las etapas de un
proceso. Una amplia variedad de agentes químicos como los alcoholes, glutaraldehído, fenoles, yodo
y compuestos de cloro se han utilizado durante siglos. Aunque la mayoría de ellos demuestran una
actividad antimicrobiana de amplio espectro en altas concentraciones, tienen efectos secundarios
graves para el ser humano y también pueden causar problemas ambientales.
• Mencione algunos productos empleados como detergentes y desinfectantes en industria y su
principio activo.
• Mencione algunos desinfectantes con uso restringido/prohibido por la OMS. ¿A qué se debe su
restricción?
• ¿En qué consiste la rotación de desinfectantes?
• ¿Qué es resistencia antimicrobiana? ¿Cómo la desarrollan los microorganismos? Realice un dibujo
que represente este proceso.
• ¿Qué es el biodeterioro y la biocorrosión? ¿Puede ser controlada empleando detergentes y
desinfectantes?
• ¿Cómo se puede ver afectada la actividad de un detergente y desinfectante?
• ¿Qué son las fichas de seguridad? ¿Qué información contienen?
Los agentes desinfectantes están registrados por la Environmental Protection Agency (EPA) como
"pesticidas antimicrobianos" y son sustancias utilizadas para controlar, prevenir o destruir
microorganismos nocivos en objetos y superficies inanimados. Estos productos antimicrobianos
incluyen sanitizantes, desinfectantes y esterilizantes. Los datos sobre la química del producto, la
eficacia, la toxicidad y otros parámetros deben ser probados y presentados ante la EPA antes de la
comercialización. Los desinfectantes químicos pueden tener diversos efectos contra los
microorganismos.
Dentro de la literatura de los desinfectantes se pueden contemplar los siguientes términos:
• Biocidas/Germicidas: Son agentes químicos que mata a los microorganismos. Estos términos
generales incluyen desinfectantes, antisépticos y antibióticos. Los germicidas y biocidas
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generalmente reaccionan con proteínas, específicamente enzimas esenciales para el crecimiento
de los microorganismos. Las acciones pueden incluir la oxidación, la hidrólisis, la desnaturalización
o la sustitución. Cuando el producto implica una acción de muerte, se utiliza el sufijo -cida (por
ejemplo, biocida, bactericida, virucida, esporicida) mientras que el sufijo -statico (por ejemplo
bacteriostático, virostático) indica que el crecimiento de un microorganismo simplemente se inhibe.
• Sanitizantes: Los sanitizantes no destruyen ni eliminan todas las bacterias o microorganismos,

sino que reducen el número de contaminación microbiana en las superficies inanimadas a niveles
que se consideran seguros desde el punto de vista de la salud pública. Muchos desinfectantes son
una formulación de un detergente y desinfectante.
• Desinfectantes: Un desinfectante describe un producto aplicado directamente sobre un objeto

inanimado. En comparación, con los antisépticos, éstos se aplican a la superficie de organismos
vivos o tejidos para prevenir o detener el crecimiento de microorganismos mediante la inhibición
del microorganismo o matándolos.
• Esterilización: La esterilización se refiere al proceso, ya sea físico (calor extremo) o químico (óxido
de etileno) que destruye o elimina todas las formas de vida, especialmente esporas.
• Detergentes: Los detergentes sirven para dispersar y eliminar material orgánico presente en las
superficies permitiendo que un desinfectante alcance y destruya los microorganismos. Estos
productos también reducen la tensión superficial y aumentan la capacidad de penetración del agua,
Superficies.
Los detergentes se clasifican en tres categorías: catiónico, aniónico y no iónico.

• Los detergentes catiónicos son soluciones de carga positiva, y con la excepción de los compuestos
de amonio cuaternario rara vez se utilizan ingredientes de limpieza.
• Los detergentes aniónicos, o jabones, son sales alcalinas de ácidos grasos de carga negativa. Son
menos ideales para la limpieza porque pueden ser excesivamente espumosos, creando un residuo
que puede permitir que el suelo y los microorganismos se acumulen.
• Los detergentes no iónicos (sin carga) son muy buenos emulsionantes, tienen buena penetración
y dispersión, son eficaces para reducir la tensión superficial y tienen propiedades espumosas
reducidas. Estos productos no suelen reaccionar con iones metálicos, como los que se encuentran
en agua dura. La mayoría de los detergentes comerciales son una combinación de aniónicos y no
iónicos.
Al igual que con los antibióticos y otros fármacos quimioterapéuticos, la resistencia adquirida a los
antisépticos y desinfectantes puede surgir por mutación o la adquisición de material genético en forma
de plásmidos o transposones. Es importante señalar la "resistencia" como un término que a menudo
se puede utilizar de forma poco clara y en muchos casos debe interpretarse con cierta prudencia. Esto
es particularmente cierto con el análisis de la concentración mínima inhibitoria (CMI). A diferencia de
los antibióticos, la "resistencia" o un aumento de la CMI de un biocida, no necesariamente se
correlaciona con el fracaso del uso del producto, sino en la necesidad de incrementar la concentración
de los mismos.
Antes de seleccionar un desinfectante para su uso, hay varios factores que deben ser considerados.
Para un protocolo de desinfección eficaz, se debe considerar el microorganismo que se está dirigiendo,
las características de un desinfectante específico y las cuestiones ambientales. Además, la salud y la
seguridad del personal y el medio ambiente son siempre una consideración importante.
• Consideraciones sobre los microorganismos
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Los microorganismos varían en su grado de susceptibilidad a los desinfectantes. En general, las
bacterias Gram-positivas son más susceptibles a los desinfectantes químicos, mientras que las
micobacterias o las endosporas bacterianas son más resistentes. Los virus hidrofílicos no envueltos
(adenovirus, picornavirus, reovirus, rotavirus) son más resistentes a la desinfección que los virus
lipofílicos envueltos (coronavirus, herpesvirus, ortomixovirus, paramixovirus, retrovirus).
• Consideraciones sobre el desinfectante

Un desinfectante ideal es el que es de amplio espectro, funciona en cualquier ambiente y no es tóxico,
no irritante, no corrosivo y relativamente económico. Desafortunadamente, ningún desinfectante es
ideal. Por lo tanto, una consideración cuidadosa de las características de un desinfectante es esencial
para seleccionar el producto más útil, eficaz y rentable.
a. Concentración desinfectante. El uso de la concentración adecuada de un desinfectante es

importante para lograr los mejores resultados para cada situación. Algunos productos tendrán
diferentes diluciones dependiendo del uso deseado del producto. Aunque algunos desinfectantes
pueden ser más eficaces en concentraciones más altas, estos niveles pueden estar limitados por
el grado de riesgo para el personal, las superficies o el equipo, así como el costo del producto
químico. Sin embargo, la dilución excesiva de un producto puede hacer que el desinfectante sea
ineficaz para el microorganismo diana. La etiqueta del producto indicará la mejor concentración a
utilizar para cada situación.
b. Método de aplicación. Hay una variedad de maneras de aplicar desinfectantes. Las superficies
de objetos o las paredes de un edificio pueden tratarse con una solución desinfectante mediante
barrido, cepillado, rociado o bruma. Los artículos portátiles deben empaparse en un recipiente de
desinfectante. La fumigación puede ser usada en algunas situaciones, pero es ineficiente en
edificios con puertas y ventanas mal ajustadas, o techos dañados.
c. Tiempo de contacto. Los tiempos de contacto apropiados son esenciales. Los desinfectantes
pueden variar en el tiempo de contacto necesario para actuar sobre los microorganismos. Por
ejemplo, el alcohol isopropílico al 70% puede destruir Mycobacterium tuberculosis en 5 minutos,
mientras que el fenol 3% requiere de 2 a 3 horas El tiempo mínimo de contacto necesario se indica
normalmente en la etiqueta del producto. Algunos productos químicos pueden tener actividad
residual mientras que otros pueden evaporarse rápidamente.
d. Estabilidad y almacenamiento. Algunos desinfectantes pierden estabilidad rápidamente después

de ser preparados para uso o cuando se almacenan durante largos períodos de tiempo,
especialmente en presencia de calor o luz. Las etiquetas de los productos desinfectantes describen
la vida útil del producto concentrado. Para maximizar la estabilidad y la vida útil, los productos
deben almacenarse en un lugar oscuro y fresco y preferiblemente en concentraciones de stock. El
uso de un producto anticuado o inactivado puede resultar en el uso de un producto no eficaz y
conducirá a una falsa sensación de seguridad.
e. Precauciones de seguridad. La mayoría de los desinfectantes pueden causar irritación a los ojos,
la piel y/o el tracto respiratorio, por lo tanto, se debe considerar la seguridad de todo el personal.
El muy importante el entrenamiento en procedimientos adecuados de almacenamiento, mezclado
y aplicación. Durante la mezcla o la aplicación de desinfectantes se deben usar equipos de
protección personal (EPP), como guantes, máscaras y protección ocular. Todos los desinfectantes
químicos tienen hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) que enumeran la estabilidad,
los peligros y la protección personal necesaria, así como la información de primeros auxilios. Esta
información debe estar disponible para todo el personal.
Página | 70
estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

75mL de cultivo en suspensión de
cocktail de microorganismos:
1 1 UN
Escherichia coli, Bacillus cereus y
Candida albicans
Cajas con Agar Casoy con Ciclo
2 15 UN
Heximida
Cajas con Agar Sabouraud con
3 15 UN
Cloranfenicol
4 Cajas con Agar Mossel 15 UN
Página | 71
estériles
5.2 REACTIVOS

NA NA NA NA NA
5.3 EQUIPOS

2 Micropipeta de 1000 - 10000 µL 1 UN
3 Rack de puntas de 1mL 3 UN
4 Puntas de 10mL 10 UN
5 Vórtex 1 UN
6 pHmetro 1 UN
5.4 SOLUCIONES

1 15mL de Ácido Peracético 0.5% 1 UN
2 15mL de Ácido Peracético 0.1% 1 UN
15mL de Hipoclorito de Sodio
3 1 UN
2.5%
4 15mL de Hipoclorito de Sodio 1% 1 UN
5 15mL de Amonio Cuaternario 1% 1 UN
15mL de Amonio Cuaternario
6 1 UN
0.1%
7 15mL de Alcohol 70% 1 UN
8 15mL de Alcohol 96% 1 UN
9 15mL de Agua Peptonada 0.1% 1 UN
10 15mL de Fabuloso 1 UN
5.5.1 Recuento Inicial de Suspensión

• Realizar diluciones seriadas en base 10 tomando 1mL de cultivo y adicionándolo en 9 mL de
• Sembrar en superficie 0.1mL de cada dilución en agar casoy, sabourdaud con cloranfenicol y
Mossel.
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• Incubar las cajas para levaduras a una temperatura de 30°C y bacterias 35°C durante 48 horas
para.
5.5.2 Evaluación de Desinfectantes

• Realice la medición de pH de cada una de las soluciones.
• Adicionar 5mL de la suspensión de microorganismos en cada una de los soluciones.
• Tomar 1mL de solución cada 5 minutos hasta completar 30 minutos y sembrar en superficie en
agar Casoy, Sabouraud con Cloranfenicol y Mossel.
• Incubar las cajas para levaduras a una temperatura de 30°C y bacterias 35°C durante 48 horas
para.
• Finalizado el tiempo de incubación, realizar el recuento de los diferentes medios de cultivo.
5.5.3 Cálculo Porcentaje de Efectividad

• De acuerdo con los resultados obtenidos al recuento inicial de la suspensión de microorganismos
y el recuento finalizado el tiempo de tratamiento de cada solución aplique la siguiente fórmula:
𝐑𝐞𝐜𝐮𝐞𝐧𝐭𝐨 𝐈𝐧𝐢𝐜𝐢𝐚𝐥 − 𝐑𝐞𝐜𝐮𝐞𝐧𝐭𝐨 𝐅𝐢𝐧𝐚𝐥

× 𝟏𝟎𝟎
𝐑𝐞𝐜𝐮𝐞𝐧𝐭𝐨 𝐈𝐧𝐢𝐜𝐢𝐚𝐥

• ¿Por qué son considerados patógenos y/o alteradores de alimentos los microorganismos
empleados?
SOLUCIÓN
Recuento Agar Recuento Agar Recuento
Tiempo % Ef % Ef % Ef
Casoy Sabouraud Agar Mossel
% Ef: Porcentaje de Efectividad
• ¿Cuál considera el tratamiento más efectivo?

• ¿Cómo interactúan los diferentes principios activos de cada solución con la estructura celular?
• En caso de presentarse resistencia, ¿Qué mecanismo de resistencia presentan estos
microorganismos para ser tolerantes a este tratamiento?
6 BIBLIOGRAFÍA
• Buckingham K, Goers D, Hamilton M. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests.
Journal of Microbiological Methods 2007; 70, 236 – 244.
• Charlebois A, Jacques M, Boulianne M, Archambault M. Tolerance of Clostridium perfringens
biofilms to disinfectants commonly used in the food industry. Food Microbiology 2017; 62, 32 – 38.
• Feliziani E, Lichter A, Smilanick J, Ippolito A. Disinfecting agents for controlling fruit and vegetable
diseases after harvest. Postharvest Biology and Technology 2016; 122, 53 – 69.
Página | 73
• Gosling R, Mahwinney I, Vaughan K, Davies R, Smith R. Efficacy of disinfectants and detergents
intended for a pig farm environment where Salmonella is present. Veterinary Microbiology 2016;
204, 46 – 53.
• Luciano C, Olson N, Ferreira A, Alfa M. Evaluation of the ability of different detergents and
disinfectants to remove and kill organisms in traditional biofilm. American Journal of Infection
Control 2016; 44, 243 – 249.
• McDonnell G, Russell A. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical
Microbiology Review 1999; 12, 147 – 179.
Página | 74
PRÁCTICA No. 10
Evaluación de Calidad Microbiológica de Aguas, Ambientes y Superficies
OBJETIVOS
• Evaluar la calidad microbiológica de diferentes tipos de aguas mediante el método de filtración por
membrana.
• Evaluar la calidad microbiológica de ambientes mediante la técnica de sedimentación en caja.
• Evaluar la calidad microbiológica de superficies mediante la técnica hisopado tradicional.
• Conocer la normatividad legal vigente que aplica para el control de los parámetros a evaluar.
1. INTRODUCCIÓN
Al decidir el emplazamiento de los establecimientos de producción, es necesario tener presentes las
posibles fuentes de contaminación, así como la eficacia de cualesquiera medidas razonables que
hayan de adoptarse para proteger los diferentes procesos. Los establecimientos no deberán ubicarse
en un lugar donde, tras considerar tales medidas protectoras, sea evidente que seguirá existiendo una
amenaza para la inocuidad. En particular, los establecimientos deberán ubicarse normalmente
alejados de: zonas cuyo medio ambiente esté contaminado y actividades industriales que constituyan
una amenaza grave, zonas expuestas a inundaciones a menos que estén protegidas de manera
suficiente; zonas expuestas a infestaciones de plagas; zonas de las que no puedan retirarse de manera
eficaz los desechos, tanto sólidos como líquidos.
• ¿Qué es un programa de manejo de Control de Plagas?
• ¿Qué es un programa de manejo integrado de residuos?
• ¿Qué son los gráficos de control? ¿Cuál es su utilidad en la evaluación de calidad microbiológica?
• ¿En qué consiste la técnica de muestreo por luminometría?
Lectura Obligatoria: Rodhouse L, Carbonero F. Overview of craft brewing specificities and potentially
associated microbiota. Critical reviews in food science and nutrition 2019; 59, 462 – 773.
Las Buenas Prácticas de Manufactura son los principios básicos y prácticos generales de higiene en
la manipulación, preparación, elaboración, envasado, almacenamiento, transporte y distribución de
productos para consumo humano, con el objeto de garantizar que los productos en cada una de las
operaciones mencionadas cumplan con las condiciones sanitarias adecuadas, de modo que se
disminuyan los riesgos inherentes a la producción. Consultar las siguientes resoluciones:
• Resolución 2674 de 2013
a. Normas de seguridad:
Página | 75
b. Equipos de protección personal:
c. Manejo de residuos químicos:
estudiante debe:

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MATERIALES

Cajas con Agar Sabouraud con
1 4 UN
Cloranfenicol
Cajas de Petri con Agar UN
2 4
MacConkey
3 Cajas de Petri con Agar Cetrimide 1 UN
Cajas de Petri con Agar Baird UN
4 3
Parker
5 Cajas de Petri con Agar Casoy 4 UN
6 Tubos con 5mL de Caldo Casoy 3 UN
7 Hisopos Estériles 5 UN
8 Láminas Portaobjetos 10 UN
9 Laminillas Cubreobjetos 10 UN
10 Pinzas estériles 1 UN
11 Filtros de Membrana 5 UN
5.2 REACTIVOS
Página | 76

NA NA NA NA NA
5.3 EQUIPOS

Equipo de Filtración de
1 1 UN
Membrana
2 Microscopio 1 UN
5.4 SOLUCIONES

1 Azul de Lactofenol 1 UN Por mesón de trabajo
5.5.1 Filtración por Membrana para Análisis de Aguas

• Colocar un filtro de membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas de acero previamente
flameadas con alcohol.
• Situar un embudo sobre el soporte hasta que esté fijo.
• Verter 100mL de la muestra de agua problema en el embudo y encender el vacío hasta que el
líquido se haya filtrado.
• Romper el vacío y extraer el embudo.
• Con las pinzas flameadas extraer el filtro del soporte.
• Colocar el filtro en los siguientes medios de cultivo: agar Casoy, agar Sabouraud con cloranfenicol,
agar Chromocult y Cetrimide, con la cuadricula hacia arriba, procurando que no se formen burbujas
entre la membrana y el medio de cultivo.
• Incubar las cajas para mohos y levaduras a una temperatura de 23°C durante 5 días y 35°C durante
48 horas para bacterias.
• Realizar coloración de Gram y coloración con azul de lactofenol a las colonias obtenidas en cada
medio.
5.5.2 Muestreo de Ambientes

• Seleccionar 3 puntos de muestreo. Identificar el sitio, estado en el que se encontraba el sitio y si
había personal en el momento del muestreo.
• Marcar 1 caja de agar Sabouraud con cloranfenicol y agar Casoy con el nombre del sitio de
muestreo.
• Ubicar un juego de cajas en cada uno de los sitios de muestreo, abrir las cajas y dejar expuestas
al ambiente durante 15 minutos.
Página | 77
• Realizar coloración de Gram y coloración con azul de lactofenol a 3 colonias características de
baterías, mohos y levaduras.
5.5.3 Muestreo de Superficies
• Seleccionar 3 superfecies: Identificar con el nombre, estado en el que se encontraba y actividades

que se estén ejecutando.
• Colocar la plantilla (5cm x 5cm) sobre la superficie a muestrear.
• Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en 5mL de caldo casoy.
• Con el hisopo inclinado, frotar 4 veces la superficie delimitada por la plantilla, cada una en dirección
opuesta a la anterior.
• Adicionar el hisopo al tubo con caldo casoy.
• Realizar una siembra masiva en los siguientes medios de cultivo: agar Plate Count, agar Sabouraud
con cloranfenicol, agar Baird Parker y agar Macconkey.
• Realizar coloración de Gram y coloración con azul de lactofenol a 3 colonias características de
baterías, mohos y levaduras

• Para el análisis de aguas complete la siguiente tabla:
Recuento de
Recuento de Recuento de Mohos Recuento de
Tipo de Muestra coliformes totales y
Bacterias Mesófilas y Levaduras Pseudomonas
E. coli
• Para el análisis de ambientes complete la siguiente tabla:
Punto de Muestreo Recuento de Bacterias Mesófilas Recuento de Mohos y Levaduras
• Para el análisis de superficies complete la siguiente tabla:
Recuento de Recuento de
Recuento de Recuento de Mohos
Sitio de Muestreo coliformes totales y Staphylococcus
Bacterias Mesófilas y Levaduras
E. coli aureus
• Los resultados obtenidos para los ambientes y superfices, ¿Cumplen con los parámetros legales?
Página | 78
• ¿Qué medidas puede implementar para el control de los microorganismos obtenidos?
• ¿Qué factores influyen en la aparición de estos microorganismos?
• ¿Qué impacto tienen los microorganismos encontrados en una planta de producción?
6 BIBLIOGRAFÍA
• Decreto 1594 de 1984. Usos del agua y residuos líquidos.
• EPA Method 1604: Total coliforms and Escherichia coli in water by membrane filtration. 2002.
• Norma Técnica Colombiana NTC – 4092. Reglas generales para el análisis microbiológico.
• Resolución 2674 de 2013. Establecer los requisitos sanitarios que deben cumplir las personas
naturales y/o jurídicas que ejercen actividades de fabricación, procesamiento, preparación, envase,
almacenamiento, transporte, distribución y comercialización de alimentos y materias primas de
alimentos y los requisitos para la notificación, permiso o registro sanitario de los alimentos, según
el riesgo en salud pública, con el fin de proteger la vida y la salud de las personas.
• Resolución 2115 de 2007. Por medio de la cual se señalan características, instrumentos básicos
y frecuencias del sistema de control y vigilancia para la calidad del agua para consumo humano.
• TEXTOS BÁSICOS SOBRE HIGIENE DE LOS ALIMENTOS SEGUNDA EDICIÓN. Códex
Alimentarius. http://www.fao.org/ag/agn/CDfruits_es/others/docs/CAC-RCP1-1969.PDF
Página | 79

Manual de Laboratorio

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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

• Mencione algunos productos que se obtienen a partir de bacterias.

3.1 Morfología Bacteriana

Los Procariotas -eubacteria y archaea- difieren de los eucariotas en numerosas características

5. Compartimentación interna. En eucariotas, las enzimas para la respiración celular se envasan en

7. Diversidad metabólica. Sólo un tipo de fotosíntesis se produce en eucariotas e implica la liberación

3.3 Superficie Bacteriana

3.4 Estructura Interna

1. Membranas internas. Muchas bacterias poseen regiones invaginadas de la membrana plasmática

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

b. Equipos de protección personal:

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

c. Manejo de residuos químicos:

• Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Tabla 2. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

5.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.5.1 Desinfección del Área de Trabajo

5.5.2 Siembra y Recuento en Placa

5.5.2.1 Preparación de Diluciones

5.5.2.2 Siembra en superficie

5.5.3 Siembra por Aislamiento/Agotamiento

5.5.3.1 Siembra para Aislamiento de Coliformes

5.5.3.3 Siembra para Aislamiento de bacterias productoras enzimas

5.5.4 Métodos de Tinción

5.5.4.1 Tinción de Gram

5.5.4.2 Tinción de Esporas

5.6.1 Siembra y Recuento en Superficie

150 × 10000 × 10 = 15000000

• En microbiología, se reporta en notación científica con dos cifras significativas, luego:

15000000 = 15 × 106 𝐔𝐅𝐂/𝐦𝐋

5.6.2 Siembras por Aislamiento

Agar Almidón Agar Leche

Tenga en cuenta las siguientes características de los medios de cultivo:

Medio de Cultivo: McConkey Medio de Cultivo: Chromocult

La presencia de coliformes en este medio se La presencia de coliformes en este medio se

La presencia de Pseudomonas en este medio se caracteriza por la aparición de colonias amarillas,

Medio de Cultivo: Almidón Medio de Cultivo: Leche

La presencia de bacterias amilolíticas La presencia de bacterias proteolíticas y/o ácido

Muestra Lámina en Fresco Tinción de Gram Tinción de Esporas

Las diferencias significativas entre hongos y plantas son las siguientes:

3.1 Estructura Fúngica

3.2 Reproducción de Hongos

El citoplasma en hifas fúngicas fluye normalmente a través de septos perforados o se mueve

4. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

4.1 Normas de seguridad:

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

4.2 Equipos de protección personal:

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

4.3 Manejo de residuos químicos:

• Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Tabla 3. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

5.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.5.1 Desinfección del Área de Trabajo