DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

BIOLOGIA MOLECULAR

PARALELO “C”

INFORME DE PRACTICA
“EXTRACCION DE ADN SANGUINEO”
DOCENTE: Mgtr. KATTY OJEDA GUTIERREZ
ESTUDIANTE: CARLOS CUENCA

LOJA – ECUADOR
2022
OBJETIVOS:

 Determinar como la extracción de muestra sanguínea repercute a lo largo de la

práctica por medio del sistema vacutainer

 Analizar el procedimiento de extracción de ADN y comprender que sucede en las

células después de todo el proceso realizado en el laboratorio.

INTRODUCCIÓN

Las cadenas de ácido desoxirribonucleico o también conocidas simplemente como

ADN, son todo el material genético que contiene toda la información hereditaria en los

humanos y casi todos los demás organismos, así como de algunos virus.

Para el estudio del DNA su extracción es de vital importancia ya que por medio

de esta se obtienen moléculas aisladas con alto grado de pureza y su uso en investigación

científica, en medicina o para la ciencia forense es muy valioso. La mayor parte de los

métodos que existen para extraer el ADN consisten en lograr primero la lisis o ruptura de

la célula, para luego separar las moléculas de ADN del resto de los constituyentes de la

célula.

A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en cuenta

varios factores:

 La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN.

 El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN.

 La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído.

 El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento esperado.

 Uso que se le va a dar al ADN extraído.

(Fujifilm, 2014, parr. 4)

 Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN de

muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales, tejidos

vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. (Ríos et al., 2016, pag.59)

Existen distintos tipos de técnicas de extracción de ADN, entre las que se pueden

enumerar: incubación del lisado para su uso, lisis por ruptura mecánica y extracción con

disolventes orgánicos, método de salting-out, método PK-SDS, método de extracción de

ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un único microtubo de

centrifugado, extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio,

intercambio aniónico para la extracción de ADN del lisado celular, uso de matrices

celulósicas para la extracción del ADN de muestras biológicas y uso de resinas de

intercambio iónico. (Osorio y Quenàn, 2012)

Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos

El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol,

siendo las proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico,

por lo que de esta forma se logra la separación de los ácidos nucleicos. Este método se

puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos

rendimientos de moléculas relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que

controlar el pH de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que

aseguran una buena separación. Las desventajas de este método son el uso de disolventes

orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden quedar como trazas en la muestra

de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR, que es largo, en

ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y requiere de varios trasvases que

aumentan la posibilidad de contaminación de la muestra. (Fujifilm, 2014)

MATERIALES
 Torniquete Guantes quirúrgicos

Jeringa y campana Muestra de ADN

Guardian Algodón

Alcohol Gradilla
 Vortex Marcador permanente

Centrifugadora Kit de extracción

METODOLOGÍA

Extracción muestra de sangre

1. La persona a la cual se le vaya extraer la muestra sanguínea debe estar relajada y

sentarse cómodamente con la espalda erguida. Esta misma persona debe usar

prendas de mangas cortas en los brazos para facilitar la extracción.

2. Por parte del personal que vaya extraer la muestra debe transmitir calma y

seguridad para que el paciente este tranquilo a lo largo del procedimiento de

extracción. Recordar el uso de guantes y todas las medidas de seguridad tanto para

el paciente como para la misma persona que está haciendo la extracción

 3. Lo mas factible es que cuando se vaya a tomar la muestra sanguínea el personal

encargado lo haga del lado que más destreza tenga para evitarse complicaciones.

4. Una vez definido lo antes mencionado, se procede a solicitar al paciente que

extienda el brazo para poder colocar el torniquete en el brazo lo suficientemente

ajustado. Luego de ello se limpia la zona de extracción con una mota de algodón

bañada en alcohol antiséptico.

5. En este caso la extracción se realiza por medio del método de vacutainer, el cual

consiste en un sistema cerrado para extraer sangre al vacío, lo que garantiza

máxima seguridad de principio a fin. En este método se ajusta la jeringa portátil

en la campana, inmediatamente se ingresa por medio de la aguja en la vena

expuesta por el torniquete y simultáneamente colocamos el tubo dentro del tapón

de plástico blando mediante una leve presión. Luego de haber insertado el tubo se

debe quitar la presión del compresor de la vena para dejar que la sangre fluya

naturalmente hacia el tubo recolector.

6. Después de que se haya recolectado la muestra suficiente retiramos la jeringa con

mucho cuidado del punto de punción, y seguidamente colocamos una mota de

algodón en el mismo sitio. Se le debe pedir al paciente que lleve su antebrazo

hacia el brazo para que haya una pequeña compresión y de esta manera se detenga

la salida de sangre.

7. Colocar los tubos recolectores con la identificación adecuada en las gradillas

correspondientes, desechar todos los utensilios que hayan sido manejados en la

práctica en los sitios correctos, por ejemplo, las jeringas y todo objeto

cortopunzante va en el guardián que casi siempre tiene coloración roja o

anaranjada.

Extracción de ADN
1. Agregar 900ul de solución de lisis en cada tubo de ensayo

2. Agregar a la solución de lisis 300ul de sangre, luego de esta acción de debe invertir

con regularidad los tubos manualmente por alrededor de 10min

3. Se procede a centrifugar las muestras a 13000 – 16000 rpm por 20 segundos.

Recordar que en la centrifugadora se colocan los tubos con el mismo peso de lado

y lado para que no haya ningún desbalance y se dañe la experimentación.

4. Luego de ello se sacan los tubos de la centrifugadora y se procede a retirar el

sobrenadante de los tubos. Al final de esta operación deberán quedar 10 – 20 ul

de Pellet.

5. Agregar nuevamente 900ul de solución de lisis, y en esta ocasión como la vez

anterior se espera 10min, pero se dejan quietos los tubos.

6. Pasado este tiempo, se los vuelve a colocar a la centrifugadora a la misma rapidez

y por el mismo tiempo.

7. Quitar nuevamente el sobrenadante hasta que quede de 10 – 20 ul de Pellet.

8. Después de ello se agregan 300ul de lisis nucleica a los tubos de experimentación,

mezclarlo varias veces y luego incorporarlo al vortex para una agitación más

efectiva y rápida gracias a su movimiento vibratorio por aproximadamente 10

segundos.

9. Se lo retira del agitador y se le agrega 100ul de precipitación de proteínas, se lo

debe volver a colocar dentro del vortex.

10. Inmediatamente volver a centrifugar los tubos por 3 minutos.

11. Hace unos pasos previos se empezó a observar una bolita que tenía una coloración

rojiza pardo a amarillento lacre, es esta última centrifugación esta bolita cambio

de color pasando de las tonalidades antes mencionadas a una marrón oscura.

 12. Después de haber sacado los tubos de la centrifugadora nuevamente se retira el

sobrenadante, pero no para ser deshecho como lo que se ha venido realizando

anteriormente, simultáneamente se puede proceder a colocar 300ul de isopropanol

en 3 tubos nuevos, este sobrenadante se lo coloca en los tres tubos con

isopropanol.

13. A estos tubos de nuevo hay que colocarlos en la centrifugadora aproximadamente

por 1min.

14. Terminado la centrifugación se retira de los tubos 600 – 620 ul de sobrenadante,

seguidamente se coloca dentro de los tubos desde 100ul hasta 300ul de etanol,

esto es para limpiar la muestra de ADN. En esta práctica se utilizó 300ul de etanol.

15. Centrifugar por última vez con la misma velocidad que ha sido utilizada a lo largo

de la práctica y que fue indicada al principio del procedimiento por alrededor de

1min.

16. Descartar todo el etanol de los tubos porque el ADN quedo pegado a las paredes

de los recipientes, inmediatamente se les da vuelta a los tubos para que precipiten

adecuadamente, esperar 10min mientras se realiza esto.

17. Finalmente colocar dentro de los tubos 100ul de ADN Rehidratante.

RESULTADOS:

Al final de la práctica se obtuvo tres microtubos que contenían el ADN impregnado en

las paredes del mismo. Para posteriormente, realizar su análisis mediante los

procedimientos de electroforesis y PCR.

DISCUSIÓN

De todo lo expuesto anteriormente, una de las primeras conclusiones a la que se puede

llegar es la buena extracción de sangre que se realizó la clase pasada, ya que la cantidad
de la misma alcanzo notablemente para la práctica entera. Recordemos también que la

extracción por medio del sistema vacutainer permitió tener una muestra limpia para la

extracción de ADN ya que su sistema utiliza un mecanismo cerrado para extraer sangre

al vacío, lo que garantiza la máxima seguridad de principio a fin. Esto obviamente

garantiza que las pruebas siguientes como la del PCR y secuencia ion se cumplan con

normalidad y éxito. En esta práctica la técnica que se utilizo para la extracción de ADN

fue con disolventes orgánicos, en este caso con alcohol isopropílico, siendo las proteínas

y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta

forma se logra la separación de los ácidos nucleicos. La principal desventaja de este

método radica en que indiferentemente del disolvente orgánico que se haya utilizado este

puede actuar como interferente en técnicas como el PCR, que en ocasiones puede dar

rendimientos poco reproducibles y requiere de varios trasvases que aumentan la

posibilidad de contaminación de la muestra.

CONCLUSIONES

 El sistema vacutainer es uno de los mejores mecanismos para la extracción

sanguínea que ayuda a garantizar la calidad de la muestra desde el momento de la

extracción hasta su posterior análisis, asegurando la máxima confiabilidad en los

resultados del laboratorio. Es un sistema cerrado (o de vacío) en el que la sangre

pasa directamente de la vena del paciente al tubo. Garantiza la esterilidad e

integridad de la muestra, dado que la misma no entra en ningún momento en

contacto con el medio ambiente.

 Durante la realización de la práctica observamos cómo se dio la ruptura de la

membrana celular, separación del ADN, esto por medio de la aplicación de

diferentes soluciones como lisis, solución salina, y alcohol isopropílico para

finalmente obtener ADN resuspendido.

RECOMENDACIONES

 Se recomienda realizar un lavado de manos antes de realizar la extracción de las

muestras de sangre.

 Utilizar todos los materiales de bioseguridad como bata, guantes, zapatones y

gorro.

 Al momento de realizar la extracción de sangre es recomendable permanecer en

calma.

ANEXOS:
BIBLIOGRAFÍA

 Fujifilm Wako Chemicals U.S.A. Corporation. (2014, 30 de enero). 10 métodos

de extracción de ADN. https://www.wakolatinamerica.com/blog-

reactivos/noticias-wako/post/10-metodos-de-extraccion-de-adn/

 Osorio, J., y Quenàn, Y. (2012). Modificación de una técnica para extracción de

ADN de glóbulos blancos humanos. Artículo del Laboratorio de Bioquímica

Clínica y Patología Molecular de la Universidad de Caldas, 11(2). 43-51.

www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-

95502012000200003

 Ríos, E., Calleros, E., Gonzales, A., Rubio, J., Martínez, O., Hernández, S. y

Pérez, R. (2016). Análisis comparativo de diferentes métodos de extracción de

DNA y su eficiencia de genotipificación en población mexicana. Acta

Universitaria del Departamento de Medicina Genómica de la UNAM, 26(4), 58-

61. www.scielo.org.mx/pdf/au/v26n4/2007-9621-au-26-04-00056.pdf