CAPITULO 2

Estudio de la estructura
microbiana: microscopía
y preparación de

muestras ■■

Clostridium botuünum
es una bacteria con
forma bacilar que forma
endosporas y libera la
toxina botulínica, la
causa de la intoxicación
alimentaria denominada
botulismo. En esta
imagen, obtenida
mediante contraste de
 fases, la endospora
aparece como un objeto
oval, brillante,
localizado en el extremo
del bacilo; algunas
endosporas se han
liberado de las células
que las formaron.
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r Colorantes y tinción simple 28
e
Tinción diferencial 29
2.1 Lentes y desviación de la luz

Conceptos
s Tinción de estructuras específicas 30
c
e 2.4 Microscopía electrónica 32 Microscopio
n electrónico de transmisión 32
ci
a Preparación de la muestra 32
2
Microscopio electrónico de barrido 35
6
2.
2.5 Nuevas técnicas en microscopía 36
3
Microscopía confocal 36 Microscopía con
P
sonda de barrido 38
r
e 1. Los microscopios ópticos emplean lentes de vidrio para desviar y enfocar
p los rayos de luz, produciendo imágenes aumentadas de objetos pequeños.
a La resolución de un microscopio óptico se determina por la apertura
r numérica de su sistema de lentes y la longitud de onda de la luz empleada;
a la resolución máxima es de aproximadamente 0.2 u.m.
ci 2. Los tipos más comunes de microscopios ópticos son los de campo claro,'
ó campo oscuro, contraste de fases y de fluorescencia. Cada uno de ellos
ofrece una imagen distintiva y pueden emplearse para observar aspectos
n
diferentes de la morfología microbiana.
y
ti 3. Como la mayoría de los microorganismos son incoloros y, por ello, difíciles
de observar con el microscopio de campo claro, se suelen fijar y teñir antes
n
de su observación. Se puede emplear una tinción simple o diferencial para
ci aumentar el contraste. Algunas estructuras bacterianas específicas, como
ó cápsulas, endosporas y flagelos pueden también teñirse selectivamente.
n 4. El microscopio electrónico de transmisión alcanza una gran resolución
d (aproximadamente, 0.5 nm), al utilizar haces de electrones de longitud de
e onda muy corta, en lugar de luz visible. Aunque los microorganismos
la pueden prepararse para su observación de otras formas, se suelen estudiar
s cortes finos de muestras incluidas en polímeros y tratadas con metales
m pesados para mejorar el contraste.
u 5. Se pueden apreciar características externas con gran detalle por medio del
e microscopio electrónico de barrido, que genera una imagen al escanear la
superficie de las muestras con un haz fino de electrones, en lugar de
st
proyectar electrones a través de las mismas.
6. Nuevos métodos de microscopía están mejorando nuestra capacidad para
observar microorganismos y moléculas. Dos ejemplos de estos nuevos sistemas
son la microscopía confocal de barrido por láser y la microscopía con sonda de
barrido.
I Existen más animales en la suciedad de los dientes de una boca
humana que. hombres en todo un reino.
Antony van Leeuwenhoek.
L a Microbiología se ocupa generalmente de
organismos tan pequeños que no los puede ver
claramente el ojo humano a simple vista.
Debido a la naturaleza de
esta disciplina, el microscopio tiene una
importancia crucial; la mayor parte de los
conocimientos sobre los microorganismos se han
descubierto con microscopios. Por ello, es
fundamental comprender cómo funciona un
microscopio y la forma de preparar las muestras
para su examen.
Este capítulo comienza con una descripción
detallada del microscopio estándar de campo claro
y continúa con otros tipos de microscopios ópticos.
Seguidamente, se exponen las técnicas de
preparación y tinción de las muestras para su
examen con el microscopio óptico. A continuación,
se describen los microscopios de transmisión y de
barrido con haz de electrones, muy utilizados
actualmente en investigación. El capítulo finaliza
con una breve introducción a dos nuevas formas de
microsocopía: la microscopía con sonda de barrido,
y la microscopía confocal.
2.1 Lentes y desviación, de la luz
Para comprender cómo funciona un microscopio
óptico, es preciso entender la forma en que las
lentes desvían y enfocan la luz para formar
imágenes. Cuando un rayo de luz pasa
Figura 2.1 Desviación de la luz por un prisma. Las líneas normales
(líneas perpendiculares a la superficie del prisma) se indican con
puntos discontinuos. Al entrar la luz en el vidrio, se desvía hacia la
primera normal (el ángulo 92 es inferior al 8,). Cuando la luz deja el
vidrio y vuelve al aire, se desvía de la segunda normal (04es superior
a 63). Como consecuencia, el prisma desvía la luz que pasa a su
través.
de un medio a otro, se produce una refracción,
es decir, el rayo se desvía en la interfase. El
índice de refracción es una medida de la
intensidad con que una sustancia disminuye la
velocidad de la luz, de tal forma que la dirección
y la magnitud de la desviación se determinan por
los índices de refracción de los dos medios que
forman la interfase. Cuando la luz pasa del aire al
vidrio, un medio con un índice de refracción
superior, disminuye su velocidad y se desvía
hacia la normal, línea perpendicular a la
superficie (Figura 2.1). A medida que la luz deja
el vidrio para volver al aire, un medio con un
índice de refracción inferior, acelera su velocidad
y se desvía de la normal. En consecuencia, un
prisma desvía la luz porque ésta incide sobre la
superficie del vidrio en ángulo, y el vidrio tiene
un índice de refracción diferente al del aire.
Las lentes actúan como un conjunto de
prismas que funcionan como una unidad.
Cuando la fuente de luz está alejada, de forma
que rayos paralelos de luz inciden sobre la lente,
una lente convexa enfocará estos rayos en un
punto específico, el punto focal (F, en la Figura
2.2). La distancia entre el centro de la lente y el
punto focal se denomina distancia focal (f, en la
Figura 2.2).
Figura 2.2 Función de una lente. Una lente funciona como un conjunto
de prismas. Los rayos de luz de una fuente distante se enfocan en un
punto focal F. El punto focal queda a una distancia/, distancia focal, del
centro de la lente.

2
0
El ojo humano no puede enfocar objetos a una
distancia inferior a 25 cm, aproximadamente
(Tabla 2.1). Esta limitación se puede superar
utilizando una lente convexa como lupa de
aumento simple (o microscopio) y manteniéndola
cerca de un objeto. Una lupa de vidrio ofrece una
imagen clara a una distancia mucho más próxima y
el objeto parece mayor. La potencia de una lente
está relacionada con la distancia focal; una lente
con una distancia focal corta aumentará un objeto
más que otra con una distancia focal más larga.
1. Defina refracción, índice de refracción, punto focal y
distancia focal.
2. Describa la trayectoria de un rayo de luz a través de un
prisma o lente.
3. ¿Cómo está relacionada la potencia de una lente con la
distancia focal?
2.2 Microscopio óptico
Los microbiólogos utilizan diversos microscopios
ópticos en su trabajo; de campo claro, de campo
7
oscuro, de contraste de fases y de fluorescencia
son los tipos de microscopios más empleados. Los
microscopios modernos son todos compuestos. Es
decir, la imagen aumentada que forma la lente del
objetivo es ampliada por una o más lentes
adicionales.
Microscopio de campo claro
El microscopio ordinario se denomina microscopio
de campo claro porque forma una imagen oscura
frente a un fondo claro. Este microscopio está
formado por un cuerpo o soporte de metal
compacto, compuesto por una base y un brazo,
donde se fija el resto de las partes (Figura 2.3). En
la base hay una fuente de luz —espejo o
iluminador eléctrico—. En el brazo hay dos
dispositivos giratorios para enfocar, de ajuste fino
(micrométrico) y ajuste grueso (macrométrico),
que pueden mover la platina o el portaobjetivos
para enfocar la imagen.
La platina está situada hacia la mitad del brazo,
donde se colocan los portaobjetos, sujetados con
pinzas sencillas o con pinzas sobre la platina
mecánica. Una platina mecánica permite al
especialista mover un portaobjetos lentamente
durante su observación, utilizando los dispositivos
de con-
 8

Figura 2.3 Microscopio de campo claro. Partes de un microscopio de campo claro moderno. El microscopio descrito es algo más sofisticado que los de
un laboratorio de estudiantes. Por ejemplo, es binocular (tiene dos oculares) y tiene una platina mecánica, un condensador inferior ajustable y un
iluminador incorporado.

2.2 Microscopio óptico

trol de la platina. El condensador se monta dentro o por

debajo de la platina, y enfoca un cono de luz sobre el
portaobjetos. Su posición es a menudo fija en
microscopios sencillos, pero puede ajustarse
verticalmente en modelos más modernos.

La parte curvada superior del brazo soporta el

conjunto del cuerpo del microscopio, al que se ajustan
un portaobjetivos y uno o más oculares. Los
microscopios más modernos tienen un ocular para cada ojo y se denominan binocu-
lares. El cuerpo contiene una serie de espejos y prismas de

manera que la parte que contiene el ocular puede
inclinarse para conseguir una mejor observación
(Figura 2.4). El portaobjetivos sostiene de tres a cinco
objetivos con lentes de diferente poder de aumento,
que pueden girarse para colocar cualquiera de los
objetivos en posición de observación. Idealmente, un
microscopio debe ser parafocal —es decir, que
mantenga la imagen enfocada aunque se cambie de
objetivo.
La trayectoria de la luz a través de un
microscopio de campo claro se muestra en la Figura
2.4. La lente del objetivo forma una imagen real
aumentada en el microscopio, y la lente del ocular
magnifica aún más esta primera imagen. Cuando se
mira por un microscopio, la imagen de la muestra
aumentada, denominada imagen virtual, parece
que se encuentra justo detrás de la platina, a
aproximadamente 25 cm. El aumento total se
calcula multiplicando los aumentos del objetivo y
del ocular. Por ejemplo, si se utiliza un objetivo de
45x con un ocular de lOx, el aumento total de la
muestra será de 450x.
Figura 2.4 Trayectoria de la luz en un microscopio óptico. Se
muestran la trayectoria de la luz en un microscopio de campo claro
moderno y la localización de la imagen virtual. (Véase también la
Figura 2.23.)
9
Figura 2.5 Apertura numérica en microscopía. La apertura angular 6
es la mitad del ángulo del cono de luz que atraviesa una lente desde
una muestra, y la apertura numérica es n sen 9. A la derecha de la
ilustración, la lente tiene una mayor apertura, tanto angular como
numérica; su resolución es superior y la distancia de trabajo inferior.
Resolución de un microscopio
La parte más importante de un microscopio es el
objetivo que debe crear una imagen aumentada,
pero además clara. Por ello, la resolución es muy
importante. La resolución es la capacidad de una
lente para separar o distinguir entre objetos
pequeños que están muy próximos. La mayor parte
de la teoría óptica que fundamenta el diseño de un
microscopio fue desarrollada por el físico alemán
Ernst Abbé en la década de 1870. La distancia
mínima (d) requerida para visualizar dos objetos
como entidades separadas está determinada por la
ecuación de Abbé, en la que lambda (A) equivale a
la longitud de onda de la luz empleada para
iluminar la muestra, y n sen 9, la apertura numérica
(AN).
Al disminuir d, aumenta la resolución y el detalle
con el que se distingue una muestra.
La ecuación anterior indica que la longitud de
onda de la luz empleada es un factor primordial en
la resolución. La longitud de onda debe ser inferior
 10

a la distancia entre dos objetos, de lo contrario tener una apertura numérica superior a 1.0. La
no se verán con claridad. En consecuencia, la única forma de incrementarla por encima de 1.0 y
mayor resolución se obtiene con luz de conseguir, con ello, una resolución mayor, es
longitud de onda menor, la que se corresponde aumentando el índice de refracción con aceite de
con el extremo azul del espectro visible (en la inmersión, un líquido incoloro con el mismo índice
gama de 450 a 500 nm). Espectro de refracción del vidrio (Tabla 2.2). Si se sustituye
electromagnético de radiación (p. 137). el aire por aceite de inmersión, muchos rayos de
luz que no pueden pasar por el objetivo debido a
La apertura numérica (n sen 8) resulta más
la reflexión y refracción en las superficies de su
difícil de comprender. Theta se define como la
lente, podrán hacerlo (Figura 2.6). Con ello, se
mitad del ángulo del cono de la luz que entra
consigue aumentar la apertura numérica y la
en un objetivo (Figura 2.5). La luz que incide
resolución.
sobre un microorganismo después de atravesar
un condensador tiene forma cónica. Cuando La resolución de un microscopio depende de la
este cono tiene un ángulo estrecho, formará un apertura numérica del condensador y del objetivo.
vértice muy agudo que no se extenderá mucho Esto queda demostrado por la ecuación que
más allá después de alejarse del portaobjetos, define la resolución total del microscopio.
por lo que no separará adecuadamente las
imágenes de objetos muy próximos entre sí. En
este caso, la resolución es baja. Por el
contrario, si el cono de luz tiene un ángulo muy
22
La mayoría de los microscopios tienen un
condensador con una apertura numérica teórica
abierto, en este caso sí que se proyectará a
entre 1.2 y 1.4. Sin embargo, la apertura numérica
más distancia después de atravesar la muestra,
del condensador no será muy superior a 0.9, salvo
permitiendo así que incluso los objetos muy
que se ponga aceite en la parte superior del
próximos aparezcan claramente separados y
condensador hasta alcanzar el portaobjetos.
puedan identificarse como independientes. El
Durante una observación sistemática con el
ángulo del cono de luz que puede penetrar una
microscopio, no se suele poner aceite en el
lente depende del índice de refracción (n) del
condensador, quedando limitada la resolución
medio en que se encuentra la lente del
total, incluso con el objetivo de inmersión en
Tabla 2.2 Propiedades de los objetivos de un microscopio óptico

Objetivo

Propiedad De rastreo o lupa Bajo aumento Gran aumento De inmersión en aceite

objetivo. El índice de refracción del aire es de aceite.

1.0. Como sen 9 no puede ser superior a 1 (el
Los límites establecidos para la resolución de
máximo de 8 es 90° y el seno de 90° es 1.0),
un microscopio óptico pueden calcularse mediante
ninguna lente que funcione en el aire puede
Aumento Apertura numérica x4 0.10 40 xlO 0.25 16 x40-45 0.550.65 x 90-100
la
Distancia focal aproximada (/) mm 17-20 mm 4- 4 mm 1.25-1.4 ecuación
Distancia de trabajo Poder de mm 2.3 8 mm 0.9 0.5-0.7 mm 1.82.0 mm de Abbé.
resolución aproximado con luz de um pm 0.35 um 0.1 mm
450 nm (azul) 0.18 um El poder

de resolución máximo teórico de un
microscopio con un objetivo de inmersión en
aceite (apertura numérica de 1.25) y con luz
azul-verdosa es de aproximadamente 0.2 |j,m.
Figura 2.6 Objetivo de inmersión en aceite. Marcha de rayos
atravesando un objetivo de inmersión en el aire, y con aceite de
inmersión.
Es decir, en el mejor de los casos, un
microscopio de campo claro puede distinguir
como independientes dos puntos separados por
aproximadamente 0.2 |Am (el tamaño de una
bacteria muy pequeña).
11
Normalmente, un microscopio está equipado
con tres a cuatro objetivos, con un poder de
aumentos entre x4 y x 100 (Tabla 2.2). La distancia
de trabajo de un objetivo es la distancia entre la
superficie frontal de la lente y la superficie del
cubreobjetos (si se emplea) o de la muestra, cuando
ésta está bien enfocada. Los objetivos con una
apertura numérica y un poder de resolución
elevados tienen distancias de trabajo cortas.
El ojo humano puede detectar una mota de 0.2
mm de diámetro, en consecuencia, teniendo en
cuenta que el microscopio óptico puede distinguir
objetos con un mínimo de 0.2 u.m (objetivo de
inmersión, 1.25 de apertura numérica), será fácil
recordar que el límite eficaz de aumento es de
alrededor 1000 veces la apertura numérica de la
lente del objetivo. La mayoría de los microscopios
estándares poseen oculares de x 10 y un límite
superior de casi x 1000 con aceite de inmersión. Se
puede emplear un ocular de x 15 con objetivos
buenos para alcanzar un aumento de x 1500.
Cualquier aumento superior a éste no ofrece una
observación más detallada. Se puede construir un
microscopio óptico
2.2 Microscopio óptico

Figura 2.7 Microscopía de campo oscuro. La forma más sencilla de transformar un microscopio en uno de campo oscuro es colocar (a) un
diafragma de campo oscuro debajo de (b) un sistema de lentes-condensador (Abbé). Este condensador produce un cono hueco de luz de forma
que sólo entra en el objetivo la luz que procede de la muestra.
para producir un aumento final de xlO 000, pero
sería simplemente como aumentar un borrón.
Solamente el microscopio electrónico ofrece una
resolución suficiente para que los aumentos sean
eficaces.
Una iluminación adecuada de la muestra es
también muy importante para determinar la
resolución. Un microscopio equipado simplemente
con un espejo cóncavo entre la fuente de luz y la
muestra, iluminaría el portaobjetos con un cono de
luz demasiado estrecho y tendría una apertura
numérica pequeña. La resolución puede mejorarse
con un condensador bajo la platina y una lente
grande receptora de luz que proyecte un cono
ancho de luz a través del portaobjetos y que pase
por la lente del objetivo, aumentando con ello la
apertura numérica.
Microscopio de campo oscuro
12
reados pueden observarse simplemente cambiando
la forma en que se iluminan. Se enfoca un cono
hueco de luz sobre la muestra, de manera que no
penetren en el objetivo rayos no reflejados y no
refractados. Solamente la luz que haya sido
reflejada o refractada por la muestra puede formar
una imagen (Figura 2.7). De esta forma, el campo
que rodea la muestra aparecerá negro, mientras
que el objeto quedará iluminado intensamente
(Figura 2.8a,b); como el fondo es oscuro, se
denomina microscopio de campo oscuro. Muchas
estructuras internas pueden verse en
microorganismos eucariotas grandes (Figura 2.8b).
Incluso, este tipo de microscopio se emplea para
identificar bacterias como Treponema pallidum,
que presenta un diámetro tan pequeño que
difícilmente puede visualizarse mediante un
microsocopio de camplo claro (Figura 2.8(7).

Las células vivas no pigmentadas no son claramente
visibles con un microscopio de campo claro porque
hay poca diferencia entre las células y el agua. Por
ello, los microorganismos a menudo se fijan y tiñen
antes de su observación para aumentar el contraste
y crear variaciones de color entre las estructuras
celulares. Las células y organismo vivos no colo-
24
13
Microscopio de contraste de fases
Otra alternativa al microscopio de campo oscuro
para la observación de células vivas no teñidas es el
microscopio de contraste de fases, que convierte
diferencias pequeñas en el índice de refracción y la
densidad celular, en variaciones en intensidad de
luz fácilmente detectables (Figura 2.8c-e).
 14

Figura 2.8 Ejemplos de microscopía de campo oscuro y de contraste de

fases, (a) Treponema pallidum, espiroqueta que causa la sífilis; microscopía
de campo oscuro (x500). (b) Volvox y Spirogyra; microscopía de campo
oscuro (xl75). Obsérvense las colonias hijas denlro de la colonia madura de
Volvox (centro) y los cloroplastos espirales de Spirogyra (izquierda y
derecha), (c) Spirillum vohitans, bacteria muy grande con haces de flagelos;
microscopía de contraste fases (x210). (d) Clostridium botulinum, bacteria
responsable del botulismo, con endosporas ovales subterminales;
microscopía de contraste de fases (x600). (e) Paramecium teñido para
mostrar un macronúcleo central grande con un micronúcleo esférico
pequeño en un lado; microscopía de contraste de fases (xlOO).

El condensador de un microscopio de contraste

de fases tiene un diafragma anular, disco opaco
con un anillo transparente fino, que produce un
cono hueco de luz (Figura 2.9). Al atravesar este
cono de luz una célula, algunos rayos se desvían
debido a variaciones en la densidad y el índice de
refracción de la muestra, retrasándose en casi 'A de
longitud de onda. La luz difractada se enfoca para
formar una imagen del objeto. Los rayos de luz no
difractados inciden sobre un anillo de fase en una
placa cambiadora de la fase, disco óptico especial
situado en el objetivo, mientras que los rayos
difractados (porque pasaron por la muestra) no son
retenidos por el anillo, atravesando la placa. Si el
anillo de fase se construye de tal forma que la luz
no difractada pase a través
2.2 Microscopio óptico
del mismo avanzando 'A de su longitud de onda, las
ondas difractadas y no difractadas tendrán una
diferencia de fase de [h de la longitud de onda y se
anularán entre sí cuando se junten, formándose
una imagen (Figura 2.10). El fondo, formado por
luz no difractada, es claro, mientras que el objeto
no teñido aparece oscuro y bien definido. Este tipo
de microscopía se denomina microscopía de
contraste de fase oscura. A menudo, se emplean
filtros de color para mejorar la imagen (Figura
2.8c,<f).
La microscopía de contraste de fases es
especialmente útil para detectar componentes
bacterianos como endosporas y cuerpos de
inclusión que contienen poli-(3-hidroxibutirato,
polimetafosfato, azufre u otras sustancias (véase el
Capítulo 3).
 15

Figura 2.9 Microscopía de contraste de fases. Óptica de un microscopio de contraste de fase oscura.
 16

26 Capítulo 2 Estudio de la estructura microbiana: microscopía y preparación de muestras

Figura 2.10 Producción de contraste en un microscopio de fases. Comportamiento de los rayos de luz difractados y no difractados, en un
microscopio de contraste de fase oscura. Como los rayos de luz tienden a anularse entre sí, la imagen de la muestra será oscura sobre un fondo
más

claro. otra. Una de ellas pasa a través de la muestra,

Estas sustancias son claramente visibles (Figura
2.8d) porque poseen índices de refracción
notablemente diferentes al del agua. Los
microscopios de contraste de fases se emplean
también frecuentemente para estudiar las células
eucariotas.
Microscopio de contraste de interferencia
mientras que la otra sirve de referencia y pasa por
una zona clara. Tras atravesar la muestra, las dos
ondas se combinan e interfieren entre sí formando
una imagen. El espécimen, que no estaba
previamente teñido, aparece vivamente coloreado
en una imagen tridimensiomal (Figura 2.11).
Estructuras como las paredes celulares,
endosporas, granulos, vacuolas y el núcleo de
eucariotas aparecen claramente visibles.

diferencial Microscopio de fluorescencia

El microscopio de contraste de interferencia
diferencial (CID) es similar al de contraste de fases
en cuanto a que crea una imagen sobre la base de
la detección de diferencias en los índices de
refracción y el espesor de la muestra. Mediante
unos prismas se generan dos ondas de luz
polarizada plana en ángulo recto una respecto de la
Los microscopios descritos hasta ahora producen
una imagen a partir de la luz que pasa a través de
un espécimen. Un objeto puede verse también
porque emite realmente luz; ésta es la base del
microscopio de fluorescencia. Cuando algunas
moléculas absorben energía radiante, quedan
excitadas y posteriormente liberan la energía
 17

atrapada en forma de luz, se denomina luz

fluorescente. Cualquier luz emitida por una
molécula excitada tendrá una longitud de onda
superior (de energía inferior) a la radiación original
absorbida. La luz fluorescente es emitida muy
rápidamente por una molécula excitada, ya que
ésta tiende a recuperar un estado más estable
liberando la energía atrapada.

El microscopio de fluorescencia (Figura 2.12)

expone un espécimen a luz ultravioleta, violeta o
azul, y forma una imagen del objeto con la luz
fluorescente emitida. Una lámpara de arco de vapor
de mercurio u otra fuente produce un rayo intenso;
la transferencia de calor debe limitarse con un filtro
especial de infrarrojos. La luz resultante pasa a
través de un filtro de excitación que transmite sólo
la longitud de onda deseada. Un condensador de
campo oscuro crea un

Figura 2.11 Microscopía de contraste de interferencia

diferencial. Micrografía del protozoo Amoeba proteus. La imagen
tridimensional muestra un gran detalle; está coloreada
artificialmente (x!60).

Figura 2.1.2 Microscopía de fluorescencia. Principios de funcionamiento de un microscopio de fluorescencia.
fondo negro frente al cual los objetos fluorescentes
brillan. Normalmente, las muestras se tiñen con
moléculas coloreadas, denominadas fluorocromos,
que brillan intensamente bajo la exposición de la
luz de una longitud de onda específica, pero
algunos microorganismos ya contienen dichas
moléculas, por lo que son autofluorescentes. El
microscopio forma una imagen de los
microorganismos marcados a partir de la luz que
18
2.2 Microscopio óptico
emiten cuando brillan (Figura 2.13). Un filtro de
barrera colocado después de la lente del objetivo
elimina cualquier luz ultravioleta parásita sobrante,
que podría dañar los ojos del observador, o la azul y
la violeta, que podrían reducir el contraste de la
imagen.
El microscopio de fluorescencia se ha
convertido en un instrumento esencial en
 19

microbiología médica y ecología microbiana. Así, se qué medida está relacionada la resolución con la
longitud de onda de la luz, el índice de refracción y la
pueden identificar bacterias patógenas (p. ej.,
apertura numérica? ¿Cuáles son las funciones del
Mycobacterium tuberculosis, causa de la condensador y del aceite de inmersión? Describa
tuberculosis) después de marcarlas brevemente cómo funcionan los microscopios de
específicamente con anticuerpos fluorescentes, campo oscuro, de contraste de fases y de
conjugados con fluorocromos, mediante métodos fluorescencia, y la clase de imagen que forman cada
uno de ellos. Dé un uso específico para cada tipo.
de inmunofluorescencia. En investigaciones
ecológicas, la microscopía de fluorescencia se
ción las estructuras internas y externas de las
emplea para observar microorganismos teñidos
células de los microorganismos. Inactiva enzimas
con fluorocromos como naranja de acridina y DAPI
que podrían alterar la morfología celular y endurece
(diamino-2-fenilindol, para marcar específicamente
las estructuras celulares, de manera que no
el DNA), o con sondas marcadas con un
cambian durante la tinción ni la observación.
fluorocromo. Los organismos teñidos de naranja o
Normalmente, durante la fijación se mata al
verde flúores-
microorganismo y se fija firmemente al
28 Capítulo 2 Estudio de la estructura microbiana: microscopía y preparación de muestras

Figura 2.13 Ejemplos de microscopía de fluorescencia, (a) Escherichia coli marcada con anticuerpos fluorescentes (x 600). El material verde se
corresponde con impurezas de la muestra, (b) Paramecium tetraurelia en fase de conjugación; fluorescencia por naranja de acridina (x 125). (c)
Protozoo flagelado Crithidia luciliae marcado con anticuerpos fluorescentes para mostrar el cinetoplasto (x 1000). (d) Mezcla de Micrococcus luteus y
Bacillus cereus (bacilos). Las bacterias vivas emiten fluorescencia verde; las muertas, roja.
cente pueden detectarse en medio de otras portaobjetos.
partículas. Incluso es posible distinguir bacterias
Fundamentalmente, existen dos clases de
vivas de muertas por el color de la fluorescencia,
fijación diferentes. 1) Los bacteriólogos fijan con
después de tratarlas con una mezcla especial de
calor frotis bacterianos calentando suavemente a la
fluorocromos (Figura 2.13d). En consecuencia, se
llama una película de bacterias secada previamente
pueden observar y contar directamente los
al aire. Este método conserva adecuadamente la
microorganismos en un nicho ecológico
morfología general, pero no las estructuras internas
relativamente no modificado.
de la célula. 2) Sin embargo, para proteger la
Inmunofluorescencia y microbiología diagnóstica
subestructura fina y la morfología de
(pp. 842, 897-898).
microorganismos delicados de mayor tamaño hay
que utilizar la fijación química. .Los fijadores
Enumere las partes de un microscopio óptico y sus químicos penetran en las células y reaccionan con
funciones. componentes celulares, normalmente proteínas y
Defina los conceptos de resolución, apertura lípidos, para inactivarlos y convertirlos en insolubles
numérica, distancia de trabajo y fluorocromo. ¿En
e inmóviles. Las mezclas comunes de fijación
 20

contienen sustancias como etanol, ácido acético,

cloruro mercúrico, formaldehído y glutaraldehído.

2.3 Preparación y tinción de las muestras

Aunque los microorganismos vivos se pueden
examinar directamente con un microscopio óptico,
a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar
la resolución, acentuar las características
morfológicas y conservarlos para su estudio en el
futuro.

Fijación
Las células teñidas que se observan con un
microscopio deben parecerse lo más posible a las
células vivas. La fijación es el proceso por el cual se
conservan y fijan en su posi-

Colorantes y tinción simple

Los numerosos tipos de colorantes empleados para
teñir microorganismos poseen dos características
en común. 1) Todos poseen grupos cromóforos,
grupos con dobles enlaces conjugados que dan el
color al colorante. 2) Pueden unirse a las células
mediante enlaces iónicos, covalentes o hidrófobo.
Por ejemplo, un colorante cargado positivamente
se une a estructuras cargadas negativamente de la
célula.

Los colorantes ionizables se pueden dividir en

dos clases generales, tomando como base la
naturaleza de su grupo cargado.

1. Los colorantes básicos —azul de metileno,

fucsina básica, cristal violeta, safranina, verde
malaquita—
 2.3 Preparación y tinción de las muestras 29

son catiónicos o tienen grupos cargados positiva-

mente (normalmente, alguna forma de

nitrógeno pentavalente) y se comercializan
generalmente como sales de cloruro. Los
colorantes básicos se unen a moléculas
cargadas negativamente, como ácidos nucleicos
y muchas proteínas. Como las superficies de las
células bacterianas están cargadas
negativamente, estos colorantes se emplean a
menudo en bacteriología.

2. Los colorantes ácidos —eosina, rosa de bengala

y fucsina acida— son amónicos o poseen grupos
cargados negativamente, como carboxilos (-
COOH) e hidroxilos fenólicos (-OH). Los
colorantes ácidos, debido a su carga negativa, se
unen a estructuras celulares cargadas
positivamente.

El pH puede modificar eficazmente la tinción, pues

la naturaleza y el grado de la carga de los
componentes celulares cambian con el mismo. Por
ello, los colorantes amónicos tiñen mejor en
condiciones acidas, en que las proteínas y muchas
otras moléculas poseen una carga positiva; los
colorantes básicos son más eficaces a valores de pH
más elevados.

Aunque las interacciones iónicas constituyen

probablemente la forma más común de fijación de los
colorantes, éstos se unen también por medio de
enlaces covalentes, o bien, su acción se debe a sus
características de solubilidad. Por ejemplo, el DNA se
puede teñir con el método de Feulgen, en el que el
reactivo de Schiff se une covalentemente a los
azúcares de desoxirribosa después de un tratamiento
con ácido clorhídrico. El Sudán III (negro Sudán) tiñe
selectivamente los lípidos porque es liposoluble, pero
no se disuelve en las partes acuosas de las células.
Los microorganismos se pueden teñir
satisfactoriamente mediante tinción simple, esto es,
utilizando sólo un colorante. El valor de esta clase de
tinción radica en su simplicidad y facilidad de empleo.
El frotis, previamente fijado, se cubre con un colorante
durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de
colorante con agua y se seca el portaobjetos. Los
colorantes básicos como cristal violeta, azul de
metileno y carbolfucsina se emplean con frecuencia
para determinar el tamaño, la forma y la organización
de las bacterias.

Tinción diferencial
Los métodos de tinción diferencial clasifican a las
bacterias en grupos diferentes según sus propiedades
de tinción. La tinción de Gram, desarrollada por el
médico danés Christian Gram en 1884, es el método de
tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se
trata de un método de tinción diferencial porque
divide a las bacterias en dos clases —Gram negativas y
Gram positivas. Bacterias Gram positivas y Gram
negativas (pp. 57-64, 476-477).

En el primer paso de esta tinción (Figura 2.14), el

frotis se tiñe con el colorante básico cristal violeta
(violeta de gen-

Figura 2.14 Método de tinción de Gram. Observe la

importancia de la decoloración con etanol-acetona que elimina
el cristal violeta de las células Gram negativas, pero no de las
Gram positivas. Las primeras adquieren un color de rosa a rojo
tras la última tinción con safranina.

ciana), el colorante primario. A continuación, se

trata con una solución yodada que actúa como
mordiente. Esto es, el yodo aumenta la
interacción entre la célula y el colorante, de
forma que aquélla se tiñe más intensamente.
Luego se decolora el frotis lavándolo con etanol
o acetona. Este paso produce el aspecto
diferencial de la tinción de Gram; las bacterias
Gram positivas retienen el cristal violeta,
mientras que las Gram negativas lo pierden y
aparecen incoloras. Finalmente, el frotis se tiñe
de nuevo (tinción de contraste) con un colorante
básico de diferente color al cristal violeta. La
safranina es el colorante de contraste más
común y tiñe las bacterias Gram negativas de
rosa o rojo, dejando a las Gram positivas de
color violeta (Figura 2.15). Estructura de la
pared celular y mecanismo de la tinción de Gram
(p. 64).
30 Capítulo 2 Estudio de la estructura microbiana: microscopía y preparación de muestras

Figura 2.15 Ejemplos de tinción de Gram. (a) Clostridium perfringens Gram positivo (x 800). Algunos bacilos se han teñido de rosa en lugar de
morado, como ocurre a menudo cuando envejecen las células Gram positivas, (b) Staphylococcus aureus. Tinción de Gram, visto con un microscopio
de campo claro (x 1000). Los cocos Gram positivos se asocian en racimos semejantes a los de uvas, (c) Escherichia coli, tinción de Gram (x500). (d)
Neisseria gonorrhoeae. Los diplococos se encuentran a menudo dentro de leucocitos (x 1000).

La tinción de ácido-alcochol resistencia es resistencia. Las bacterias no ácido-alcochol

otro método importante de tinción diferencial.
Unas pocas especies, particularmente las del
género Mycobacterium {véase el Capítulo 24) no
se unen fácilmente a colorantes simples y hay que
teñirlas con un tratamiento más fuerte:
calentando una mezcla de fucsina básica y fenol
(método de Ziehl-Neelsen). Una vez que la fucsina
básica ha penetrado en la célula con la ayuda del
calor y el fenol, las células ácido-alcochol
resistentes no se decoloran fácilmente con una
solución acidoalcohólica, permaneciendo de color
rojo. Esto se debe al elevado contenido en lípidos
de las paredes de estas células; en particular, los
ácidos micólicos —un grupo de lípidos hidroxílicos
de cadena ramificada— parecen ser los
responsables de la propiedad de ácido-alcochol
resistentes se decoloran con la solución
acidoalcohólica, por lo que se tiñen de azul con
azul de metileno (tinción de contraste). Este
método se emplea para identificar
Mycobacterium tuberculosis y M. leprae (Fjgura
2.16), agentes patógenos responsables de la
tuberculosis y la lepra, respectivamente.
Tinción de estructuras específicas
Se han desarrollado numerosos métodos de tinción a
lo largo de los años para estudiar estructuras
bacterianas específicas con el microscopio óptico.
Uno de los más sencillos es la tinción negativa,
técnica que revela la presencia de cápsulas difusas
alrededor de muchas bacterias. Se mezclan las
bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se
extienden en una capa fina sobre un portaobjetos.
Después de secarlo al aire, las bacterias aparecen
como cuerpos más claros en medio de un fondo azul
oscuro, porque la tinta y las partículas de colorante
no pueden penetrar ni la célula bacteriana ni su
cápsula. La extensión de la región de luz está
determinada por el tamaño de la cápsula y por la
propia célula. Apenas se produce modificación de la
forma bacteriana y la célula se puede teñir
posteriormente para conseguir incluso una mejor
visibilidad (Figura 2.17). Cápsulas y «slime» (pp. 65-
66).

Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium

{véase el Capítulo 23) forman una estructura de
supervivencia en condiciones ambientales
desfavorables, excepcional-

Figura 2.16 Tinción de ácido-alcochol resistencia. Mycobacterium leprae.
Tinción de ácido-alcochol resistencia (x38O). Obsérvense las masas de
bacterias rojas dentro de las células huésped.
mente resistente durante períodos largos de
tiempo. Esta estructura se denomina endospora
pues se desarrolla dentro de la célula. La morfología
y la localización de las endosporas varían con la
especie y son a menudo de un gran valor para la
identificación bacteriana; pueden ser esféricas a
elípticas, con un diámetro menor o superior al de la
bacteria madre. Se pueden observar con el
microscopio de contraste de fases o mediante
tinción negativa. Las endosporas no se tiñen bien
con la mayoría de los colorantes, pero una vez
teñidas, resisten intensamente la decoloración. Esta
propiedad es la base de la mayoría de los métodos
de tinción de endosporas (Figura 2.18). Con el
método de Schaeffer-Fulton, las endosporas se
tiñen primero calentando las bacterias con verde
malaquita, luego se lava la preparación con agua
para eliminar el resto de colorante y se contratiñe
con safranina. Esta técnica revela endosporas
verdes en células de color rosa a rojo. Estructura
de las endosporas bacterianas (pp. 72-75).
Los flagelos bacterianos son estructuras de
locomoción en forma de hilo, tan delgados (10 a 30 nm
de diáme-
2.3 Preparación y tinción de las muestras 31
Figura 2.18 Tinción de endosporas. Bacillus cereus teñidos con el
método de Schaeffer-Fulton. Obsérvense las esporas centrales,
elípticas, de azul a verde, dentro de células rosadas (x 1000).
tro, aproximadamente) que sólo se pueden
observar directamente con el microscopio
electrónico. Para observarlos con el óptico, se
aumenta su grosor cubriéndolos con mordientes,
como ácido tánico y alumbre de potasio, y
tiñéndolos con pararosanilina (método de Leifson)
o fucsina básica (método de Gray). Los métodos de
tinción de flagelos ofrecen una información
taxonómica importante acerca de su presencia y el
modelo de su distribución (Figura 2.19; véase
también la Figura 3.31). El flagelo bacteriano (pp. 66-
70).
1. Defina los conceptos de fijación, colorante, cromóforo,
colorante básico, colorante ácido, tinción simple, tinción
diferencial, mordiente, tinción negativa y tinción de ácido-
alcochol resistencia.
2. Describa el método de tinción de Gram y cómo funciona.
3. ¿De qué manera se pueden visualizar las cápsulas,
endosporas y flagelos?

Figura 2.17 Tinción negativa. Klebsiella pneumonías teñidas
negativamente con tinta china para revelar las cápsulas (x900).
Figura 2.19 Ejemplo de tinción de flagelos. Spirillum volutans
con mechones bipolares de flagelos (x400). (Véase también la
Figura 3.31.)
32 Capítulo 2 Estudio de la estructura microbiana: microscopía y preparación de muestras
2.4 Microscopía electrónica
Durante siglos, el microscopio óptico ha sido el
instrumento más importante para estudiar
microorganismos. En la actualidad, el
microscopio electrónico ha transformado la
microbiología y ha aumentado enormemente
nuestros conocimientos. La naturaleza del
microscopio electrónico y la preparación de las
muestras para su observación se describen
brevemente a continuación.
Microscopio electrónico de transmisión
El mejor microscopio óptico tiene un límite de
resolución de aproximadamente 0.2 u.m. Como
las bacterias tienen aproximadamente un
diámetro de 1 ujn, sólo se pueden ver con el
microscopio óptico la forma general y las
características morfológicas principales. La
estructura interna detallada de microorganismos
de mayor tamaño tampoco se puede estudiar
adecuadamente con este tipo de microscopio.
Estas limitaciones tienen su origen en la
naturaleza de las ondas de luz visible, no en la
incapacidad del propio microscopio óptico, como
ya se explicó con anterioridad.
Recordemos que la resolución de un
microscopio óptico aumenta al disminuir la
longitud de onda de la luz empleada para
iluminar. Los haces de electrones actúan como
una fuente de radiación y pueden enfocarse al
igual que la luz en un microscopio óptico. Si los
electrones iluminan el espécimen, la resolución
del microscopio aumenta considerablemente
porque la longitud de onda de la radiación es de
aproximadamente 0.005 nm, aproximadamente
100 000 veces menor que la luz visible. El
microscopio electrónico de transmisión tiene una
resolución práctica de aproximadamente 1000
veces superior a la del microscopio óptico;
incluso, con muchos microscopios electrónicos se
pueden distinguir puntos separados por 5 Á (0.5
nm), y el aumento eficaz es superior a 100 000 x
(Figura 2.20). El valor de este microscopio queda
demostrado comparando las fotografías de la
Figura 2.21; la morfología microbiana puede
estudiarse ahora con un mayor detalle.
Un microscopio electrónico de transmisión
moderno (MET) es complejo y sofisticado (Figura
2.22), pero los principios básicos de su
funcionamiento pueden comprenderse
fácilmente. Un filamento de tungsteno calentado
en un generador de electrones libera un haz de
electrones que se enfoca a continuación sobre la
muestra mediante el condensador (Figura 2.23).
Como los electrones no pueden atravesar una
lente de vidrio, se emplean electroimanes con
forma de «donut», denominados lentes
magnéticas, para enfocar el haz. La columna que
contiene las lentes y la muestra deben estar en
condiciones de vacío para obtener una imagen
clara porque los electrones se desvían al chocar
con las moléculas de aire. La muestra dispersa
los electrones que pasan a su través, y este haz
se enfoca con lentes magnéticas para formar una
imagen aumentada y visible sobre una pantalla
 fluorescente. Aquella zona de la muestra que sea observarse, y los métodos para su preparación. Como
más densa, los electrones se absorben y dispersan con bastante
facilidad por la materia sólida, solamente se pueden
observar cortes extremadamente finos de muestras
microbianas. La muestra debe tener un grosor de 20 a
100 nm, un diámetro de alrededor '/so a Vio del de
una bacteria típica, y, al mismo tiempo, debe ser
capaz de mantener su estructura

Figura 2.20 Límites de la resolución de un microscopio. Las

dimensiones están indicadas en escala logarítmica (cada división
principal representa un cambio de tamaño de 10 veces). A la
derecha de la escala se indican los tamaños aproximados de
células, bacterias, virus, moléculas y átomos.

dispersará más electrones (densa a los electrones) y,

por ello, aparecerá más oscura en la imagen, pues
inciden menos electrones en ese área de la pantalla.
Por el contrario, las zonas electrotransparentes
aparecen más claras. La pantalla puede desplazarse y
capturar la imagen sobre película fotográfica.

Preparación de la muestra

La Tabla 2.3 compara algunas de las características

más importantes de los microscopios óptico y
electrónico. Las propiedades distintivas del MET
limitan la naturaleza de las muestras que pueden
 2.4 Microscopía electrónica 33 Figura
2.22

Figura 2.21 Microscopía óptica y electrónica. Comparación entre la resolución de un microscopio óptico y uno electrónico, (a) Rhodospiríllum rubrum
visto con un microscopio óptico de contraste de fases (x600). (b) Corte fino de R. rubrum visto con un microscopio electrónico de transmisión (x 100
000). (c) Micrografía del virus influenza humano (x282 000). Las partículas víricas tienen un diámetro aproximado de 100 nm,
mucho más pequeñas que las células bacterianas. Microscopio electrónico de transmisión. La pistola de electrones se
encuentra en la parte superior de la columna central y las lentes
magnéticas, dentro de ella. La imagen en la pantalla fluorescente se
puede observar a través de un amplificador situado sobre la ventana
cuando se bombardee con los electrones en alto de observación. La cámara se encuentra en el compartimiento de
debajo de la pantalla.
vacío. Un corte tan fino no puede realizarse salvo
que la muestra tenga algún tipo de soporte, taraldehído o tetróxido de osmio para estabilizar la
como el que ofrece un plástico. Después de fijar estructura celular, se deshidrata con disolventes
la muestra con sustancias químicas como glu- orgánicos (p. ej., acetona o etanol). Es fundamental
conseguir una deshidratación completa porque la
mayoría de los plásticos empleados en la inclusión no
son hidrosolubles. A continuación, se incluye la
muestra en un plástico epoxi líquido, no polimerizado,
hasta que queda totalmente impregnado y el plástico
se endurece para formar un bloque sólido. Los cortes
se realizan de este bloque con una cuchilla de
diamante o vidrio, utilizando un instrumento especial
denominado ultramicrotomo.

Al igual que en microscopía óptica, también en el

caso de utilizar MET la muestra debe ser teñida para
verla con claridad. Por tanto, hay que tener en cuenta
la capacidad de dispersar los electrones por parte de
la muestra, y ésta viene determinada por la densidad
(número atómico) de los átomos de la muestra. Las
moléculas biológicas están compuestas de átomos de
número atómico bajo (H, C, N y O) y la dispersión
electrónica es bastante constante a lo largo de la
célula no teñida. Por ello, las muestras se preparan
para su observación sumergiendo los cortes finos en
soluciones de sales de metales pesados como citrato
de plomo y acetato de uranilo. Los iones de plomo y
uranio se unen a las estructuras celulares y las hacen
más electrodensas (opacas), aumentado el contraste.
Los átomos de osmio pesado, del fijador tetróxido de
osmio, también se utilizan para «teñir» las células y
aumentar su contraste. Finalmente, los cortes teñidos
se montan sobre rejillas finas de cobre y se observan.
Aunque el método anterior de inclusión en
plásticos y realización de cortes finos se emplea
normalmente para revelar la estructura interna de las
células, hay otros medios para preparar
microorganismos y objetos pequeños para su
observación.
34 Capítulo 2 Estudio de la estructura microbiana: microscopía y preparación de muestras
Figura 2.23 Funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión. Resumen del funcionamiento de un MET, y comparación entre éste y uno
óptico.
Una técnica muy eficaz es la tinción negativa. Se
extiende la muestra formando una película fina
con ácido fosfotúngstico o acetato de uranilo. De
modo análogo a la tinción negativa para
microscopía óptica, los metales pesados no
penetran la muestra, sino que crean un fondo
oscuro, mientras que la muestra aparece brillante
en las fotografías. La tinción negativa es una
forma excelente de estudiar la estructura de virus,
vesículas de gas bacterianas, y otros materiales
similares. Un microorganismo se puede observar
también después de sombrearlo con metal. Se
cubre con una película fina de platino u otro metal
pesado por evaporación en un ángulo de 45°
respecto de la horizontal, de manera que el metal
incide sobre el microorganismo sólo desde un
lado. El área cubierta con metal dispersa
electrones y aparece brillante en las fotografías,
mientras que el lado sin cubrir y la región
Tabla 2.3 Características de los microscopios y electrónico de transmisión
óptico
Características Microscopio óptico Microscopio electrónico

Aumento práctico más elevado Entre 1000 y 1500 Más de 100 000

Resolución máxima" 0.2 um 0.5 nm

Fuente de radiación Luz visible Aire Haz de electrones
Medio de desplazamiento Vidrio Alto vacío
Tipo de lente Absorción de luz diferencial Electroimán
Fuente de contraste Se ajusta la lente mecánicamente Dispersión de electrones
Mecanismo de enfoque Cambio del objetivo u ocular Se ajusta la corriente a la lente
Método de modificación de los aumentos Portaobjetos de vidrio magnética
Montaje de la muestra Se ajusta la corriente a la lente
magnética
Rejilla de metal (normalmente de
cobre)
sombreada creada por el objeto aparece oscura técnica es particularmente eficaz para estudiar la
(Figura 2.24). La muestra aparece como si la luz morfología de virus, flagelos bacterianos y
brillase sobre ésta proyectando una sombra. Esta plásmidos {véase el Capítulo 13).

El límite de resolución del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm.

2.4 Microscopía electrónica 35

El método de criofractura permite visualizar mediante el

MET la presencia y forma de organulos en el interior de
microorganismos. Para ello, las células se congelan rápidamente
en nitrógeno líquido y luego se calientan hasta -100 °C en una
cámara de vacío. A continuación, se fracturan las células
congeladas con una cuchilla previamente enfriada con nitrógeno
líquido (-196 °C); estas células son muy quebradizas y se rompen
a lo largo de líneas muy débiles, normalmente, por la mitad de
las membranas internas (Figura 2.25). Se deja la muestra en
condiciones de alto vacío durante un minuto o más, de forma
que parte del hielo sublime y se descubra más detalle
estructural (a menudo, se omite este paso). Finalmente, las
superficies expuestas se sombrean y cubren con capas de
platino y carbono para formar una réplica de la superficie.
Después de eliminar químicamente la muestra original, la
réplica puede observarse con el MET, que ofrece una vista
tridimensional detallada de la estructura intracelular (Figura
2.26). Una ventaja de esta técnica es la minimización del riesgo

(b)

Figura 2.24 Sombreado de una muestra para su observación Los microscopios descritos anteriormente crean
mediante MET. Algunos ejemplos observados con MET después de
una imagen a partir de la radiación que ha pasado a
sombrearlos con uranio, (a) Proteus mirabilis (x42 750). Obsérvense los
flagelos y las fimbriae. (b) Colifago T4 (x72 000). través de la muestra. Recientemente, se ha
empleado el microscopio electrónico
de formación de artefactos, ya que en lugar de someterlas a una fijación química y deshidratación,
las células se congelan rápidamente.
 Microscopio electrónico de barrido

Figura 2.25 Técnica de

criofractura. En los pasos (a) y (b),
se fractura una célula eucariota
congelada con una cuchilla fría. La
fractura por sublimación se
describe en (c). El sombreado con
platino y carbono, y la formación
de la réplica, se muestran en (d) y
(e). Consúltese el texto para más
información.
 en la pantalla de televisión, que puede verse y
fotografiarse.

El número de electrones secundarios que

alcanzan el detector depende de la naturaleza de
la superficie de la muestra. Cuando el haz de
electrones incide sobre un área elevada, entra en
el detector un número grande de electrones; por
el contrario, pocos electrones podrán escapar de
una depresión o «valle» llegando al detector. En
consecuencia, las áreas elevadas aparecen más
claras en la pantalla y las depresiones, más
oscuras. Se produce una imagen tridimensional
realista de la superficie de un microorganismo con
una gran profundidad de campo (Figura 2.28).
También se puede examinar la localización real de
los microorganismos in situ, en nichos ecológicos,
como la piel humana y la pared intestinal.

1. ¿Por qué el microscopio electrónico de transmisión

Figura 2.26 Ejemplo de criofractura. Preparación por criofractura de
la bacteria Thiobacülus kabobis. Obsérvense las diferencias
estructurales entre la superficie externa, S; la membrana externa de la
pared celular, ME; membrana citoplasmática, MC; y el citoplasma, C.
Barra = 0.1 um.
sión por éste de centelleos de luz que un
fotomultiplicador transforma en una corriente
eléctrica y la amplifica. La señal se envía a un tubo
de rayos catódicos y se produce una imagen como
tiene una resolución superior al óptico? Describa en
términos generales las funciones del MET.
2. Describa la preparación de las muestras para su
observación con el MET. ¿Cómo se tiñen normalmente
los cortes para aumentar el contraste? ¿Qué son la
tinción negativa, el sombreado y la criofractura?
3. ¿Cómo funciona el microscopio electrónico de barrido y
en qué medida es diferente su función de la del MET?
¿Qué aspectos morfológicos se estudian con el MEB?

La preparación de muestras es sencilla y en

algunos casos, se puede examinar directamente
de barrido (MEB) para estudiar superficies de
material secado al aire. Sin embargo, con mayor
microorganismos con mayor detalle;
frecuencia, los microorganismos deben primero
normalmente, tienen una resolución de 7 nm o
fijarse, deshidratarse y secarse para conservar la
inferior. El MEB se diferencia de otros
estructura de superficie y evitar el colapso de las
microscopios electrónicos en que produce una
células cuando se expongan a alto vacío en el
imagen a partir de electrones emitidos por la
MEB. Antes de la observación, se montan las
superficie de un objeto, en lugar de a partir de
muestras secas y se cubren con una capa fina de
electrones transmitidos.
metal para evitar la formación de carga eléctrica
 superficial, formándose una imagen de mayor
calidad.
El MEB realiza un escáner con un estrecho haz
de electrones en forma de prisma, de adelante
hacia atrás sobre la muestra (Figura 2.27). Cuando
el haz incide sobre una zona concreta de la
muestra, los átomos de la superficie emiten una
nube tenue de electrones denominados
electrones secundarios, que son atrapados por un
detector especial. Los electrones secundarios que
entran en el detector inciden sobre un
centelleador, causando la emi-
2.5 Nuevas técnicas en microscopía
Microscopía confocal
Un microscopio óptico convencional utiliza una
combinación de diferentes longitudes de onda como
fuente luminosa capaz de iluminar una amplia zona
de la muestra, estas condiciones le confieren una
relativamente gran profundidad de campo. Incluso
no estando enfocada, aparecerán visibles imágenes
de las bacterias en cualquier profundidad de la
muestra, incluyendo células por encima y por
debajo del plano enfocado (Figura 2.29). Sin
embargo, la imagen completa será borrosa, confusa
y demasiado abarrotada.
La solución a este problema es el microscopio
confocal de barrido por láser (MCBL) o microscopio
confocal. Las muestras normalmente se marcan con
fluorocromos. Un haz de láser se hace incidir —
enfocar— sobre un punto de la muestra (Figura
2.30). La luz procedente del punto iluminado es
enfocada por la lente de un objetivo en un plano por
encima de éste. Gracias a una apertura situada por
encima del objetivo quedan bloqueados los rayos
que provienen de
Figura 2.27 Microscopio electrónico de transmisión.
aquellas áreas de la muestra que estaban por 2.5 Nuevas técnicas en microscopía 37
encima y por debajo del plano enfocado. Si el láser
realiza un barrido sobre un plano de la muestra, se
denomina «barrido de haz»; pero si lo que se mueve
para enfocar ese plano es el estativo, se denomina
«barrido de estativo». Finalmente, un detector mide
la iluminación de cada punto para producir una
imagen de la sección. Cuando muchas secciones son
escanedas, un ordenador puede digitalizar las
imágenes y combinarlas para formar una imagen
tridimensional. Incluso esta imagen puede ser
medida y analizada cuantitativamente.

Figura 2.28 Micrografías de bacterias mediante microscopía electrónica de barrido, (a) Staphylococcus aureus (x32 000). (b) Cristispira, espiroqueta
en el estilo cristalino de la ostra Ostrea virginica. Las fibrillas axiales o flagelos periplásmicos son visibles alrededor del cilindro protoplásmico (x 6000).
Figura 2.29 Microscopía confocal de barrido por láser: profundidad de campo y nitidez de la imagen, (a) Obsevación mediante un microscopio
óptico convencional, (b) Imagen mediante microscopía confocal de barrido por láser.
El microscopio confocal mejora la obtención de
imágenes mediante dos mecanismos diferentes: 1)
la iluminación alternativa de zonas muy puntuales
reduce las interferencias de la luz dispersada por el
resto de la muestra; 2) el efecto bloqueante sobre
estos mismos rayos parásitos realizado por la
apertura situada por encima del objetivo. De esta
forma, la imagen presenta un excelente contraste y
gran resolución, pudiendo observarse planos de 1
|xm o incluso de menor diámetro en gruesas
preparaciones. Debe emplearse un software
especial para crear imágenes tridimensionales de
alta resolución de estructuras celulares y de
muestras complejas como los biofilms (Figura
2.31).
Microscopía con sonda de barrido
Aunque los microscopios ópticos y electrónicos se
han sofisticado mucho y han alcanzado un estado
avanzado de desarrollo, todavía se construyen
nuevos microscopios de poder mayor. Una nueva
clase de microscopios, denominados microscopios
con sonda de barrido, ofrecen una medida de las
características de superficie al mover una sonda
fina sobre la superficie de un objeto. El
microscopio elec- trónico de efecto túnel,
inventado en 1980, es un ejemplo excelente de
microscopio con sonda de barrido. Puede alcanzar
aumentos de 100 millones y permite a los
científicos ver átomos en la superficie de un sólido.
Los electrones que rodean los átomos de superficie
se proyectan desde el borde de la superficie a una
corta distancia. Este microscopio tiene una sonda
parecida a una aguja con una punta tan fina que a
menudo sólo contiene un átomo. La sonda se
acerca a la superficie de la muestra hasta que su
nube de electrones justamente choca con la de los
átomos de la superficie. Si se aplica un pequeño
voltaje entre la punta y la muestra, los electrones
 fluyen a través de un estrecho canal o túnel
formado en las nubes de electrones. Esta corriente
de túnel, como así se denomina, es
extremadamente sensible a la distancia y
disminuye hasta casi mil veces si la sonda se mueve
hacia fuera de la superficie a una distancia
equivalente al diámetro de un átomo.
La disposición de los átomos en la superficie de
una muestra se determina moviendo la punta de la
sonda de adelante hacia atrás sobre la superficie,
mientras se mantiene a una altura constante
ajustando la distancia de la sonda para mantener
una corriente de túnel estable. Al mover la punta
de arriba abajo, siguiendo el contorno de la

2.5 Nuevas técnicas en microscopía 39

Figura 2.30 Diagrama de rayos de un microscopio confocal de barrido por láser. Las líneas amarillas representan la luz láser utilizada para la
iluminación. Las líneas rojas simbolizan la luz que surge del plano enfocado, y las líneas azules representan la luz procedente de aquellas zonas de la
muestra por encima y por debajo del plano enfocado. Consúltese el texto para obtener más información.
Figura 2.31 Imágenes confocales a varias profundidades de un biofilm. (a) a 20 u.m de profundidad, (b) 40 um. Cada una de estas imágenes
confocales —que combinan imágenes fluorescentes y de reflexión— tienen una profundidad de campo de 2 um. Se pueden observar algunas bolas de
látex fluorescentes, en rojo, empleadas como trazadoras.

punta, justo lo necesario para mantener una

superficie, se registra y analiza su movimiento en
un ordenador para crear una imagen
tridimensional precisa de los átomos de la
superficie. El mapa de la superficie puede
mostrarse en la pantalla de un ordenador o
trazarse en papel. La resolución es tan elevada
que pueden observarse átomos individuales con
facilidad. Los inventores de este microscopio,
Gerd Binning y Heinrich Rohrer, compartieron el
premio Nobel de Física en 1986 por este trabajo,
junto con Ernst Ruska, diseñador del primer
microscopio electrónico de transmisión.
distancia constante, lo suficiente como para no
dañar la superficie. El movimiento vertical de la
punta se controla normalmente midiendo la
desviación de un rayo láser que incide sobre la
palanca que soporta la sonda. Al contrario que el
microscopio de barrido de efecto túnel, el de
fuerza atómica puede emplearse para estudiar
superficies que no conducen bien la electricidad.
Este microscopio se ha utilizado para investigar las
interacciones entre las proteínas chaperonas de E.
coli GroES y GroEL, hacer el mapa genético de
plásmidos localizando enzimas de restricción
unidas a lugares específicos, y conocer el com-

El microscopio de barrido de efecto túnel

tendrá seguramente un gran impacto en biología.
Recientemente, se ha utilizado para ver
directamente DNA (Figura 2.32). Como este
microscopio puede examinar objetos cuando se
sumergen en agua, puede ser especialmente útil
para estudiar moléculas biológicas.

Más recientemente, se ha desarrollado otra

clase de microscopio por sonda de barrido. El
microscopio de fuerza atómica mueve una fina
sonda sobre la superficie de una muestra mientras
que mantiene constante la distancia entre la
punta de la sonda y la superficie. Puede hacer esto
si se ejerce una fuerza muy pequeña sobre la
Figura 2.32 Ejemplo de microscopía electrónica de efecto túnel.
Una doble hélice de DNA, mostrando aproximadamente tres vueltas
(color falseado; X2Ü0Ü 000).

1. ¿Cómo funciona un microscopio confocal y por qué revela

mejores imágenes de muestras gruesas que un
microscopio estándar?
2. Describa brevemente el microscopio por sonda de
barrido y su versión más conocida, el microscopio de
barrido de efecto túnel, y el de fuerza atómica. ¿Para qué
se utilizan estos microscopios?
 portamiento de células vivas.

1. Un rayo de luz que pasa de aire a vidrio, o viceversa, se desvía según un proceso denominado refracción. Las lentes enfocan los rayos de
luz en un punto focal y amplían las imágenes (Figura 2.2).
2. En un microscopio compuesto como el de campo claro, la imagen primaria se forma por una lente del objetivo, y se amplía por la lente del
ocular para crear una imagen virtual (Figura 2.3).
3. Un condensador situado debajo de la platina enfoca un cono de luz sobre la muestra.
4. La resolución de un microscopio aumenta al disminuir la longitud de onda de la radiación empleada para iluminar la muestra. La resolución
máxima de un microscopio óptico es de aproximadamente 0.2 (J.m.
5. Un microscopio de campo oscuro utiliza solamente la luz refractada para formar una
Resumen
imagen (Figura 2.7), brillando los objetos sobre un fondo negro.

6. Un microscopio de contraste de fases convierte variaciones en el índice de refracción y en la densidad de las células en cambios de intensidad
de luz, haciendo visibles células incoloras no teñidas (Figura 2.9).
7. El microscopio de interferencia diferencial utiliza dos haces de luz para crear mayor contraste e imágenes tridimensionales de muestras vivas.
8. Un microscopio de fluorescencia ilumina una muestra marcada con un fluorocromo y crea una imagen a partir de la fluorescencia emitida
(Figura 2.12).
9. Normalmente, las muestras deben fijarse y teñirse antes de observarlas con un microscopio de campo claro.

10. La mayoría de los colorantes son básicos, cargados positivamente, o ácidos, cargados negativamente, y se unen a partes ionizadas de las
células.
11. En la tinción simple, se emplea un único colorante para teñir los microorganismos.
12. Los métodos de tinción diferencial, como las tinciones de Gram y de ácido-alcohol resistencia, emplean diferentes colorantes para distinguir
entre grupos microbianos, al teñirlos de forma diferente.
13. Algunas técnicas de tinción son específicas para observar estructuras particulares como cápsulas, flagelos y endosporas bacterianas.
14. El microscopio electrónico de transmisión utiliza lentes magnéticas para formar una imagen a partir de electrones que han atravesado un
corte muy fino de una muestra (Figura 2.23). La resolución es grande porque la longitud de onda de los electrones es muy corta.
 Cultivos en los laboratorios de
Microbiología
Tienen una enorme importancia en la clínica, de hecho, un hospital que no tiene
un laboratorio de microbiología solo por eso no es un buen hospital, significa un
riesgo para los pacientes, manejar bien el laboratorio de microbiología requiere
de muchos años de experiencia, pero se fundamentan en principios muy
sencillos. Que tiene que ver con la interpretación de los cultivos de las cajas en
el laboratorio de microbiología.
Tenemos en los laboratorios de microbiología, medios de cultivo donde vamos a
sembrar las cosas. Los primeros medios de cultivo fueron cosas como estas que
eran caldos de animales, como en este caso caldo de cerebro y corazón de
carnero se desgrasan y eso es un caldo, si algo se pone aquí y desarrolla la
bacteria vamos a ver que se enturbia el caldo. Hay algunos caldos mas
modernos como estos que son para hemocultivo en los hospitales, el problema
de estos caldos es que no nos permite decir cuál es la morfología de la bacteria
o de la colonia que crece ahí. Vamos a poner algunos ejemplos.
Estos son ya agares son caldos a los que se le ha puesto una gelatina para que
solidifiquen y que cuando crezca una bacteria nos diga cuál es su morfología
aquí en cada bacteria que callo desarrollo una colonia por eso las bacterias en
términos técnicos se conocen como unidades formadoras de colonias, esta es
una colonia plana, grande a diferencia a esta que es una colonia redonda y bien
definida es un estafilococos, para esos son los medios agar para permitirnos no
solo ver las características de las colonias de las bacterias si no para también
contarlas, tenemos distintos tipos de agares. Por ejemplo, este es un
agar agar; que no tiene mas que el caldo de cultivo y la gelatina o el agar para
que solidifique.
Este es un medio mas enriquecido donde se le pone sangre para que crezcan
con mas facilidad algunas bacterias.
Este es un medio todavía más enriquecido llamado chocolate que tiene además
suplementos nutricios y vitaminas para bacterias que exigen más.
Esto es por el contrario un cultivo que iría en sentido opuesto, no solo no es
enriquecido si no es selectivo este es un medio que se conoce como el medio de
MacConkey. En el que solo crece los bacilos gran negativos

Principio Fundamentales
No todo crece en los cultivos, cuando hablamos que unas cosas crecen en los
cultivos y otras no.
No crecen
➢ Virus
➢ Rickettsias
➢ Mycoplasma
También algunos parásitos las amibas no crecen en cultivo las yaryas no crecen
en cultivo.
Otros crecen, pero muy lento
➢ Hongos
➢ Micobacterias
Que pueden tardarse días, semanas hasta incluso meses en crecer, pero
generalmente andan entre la primera y tercera semana, ese es el caso de las
micobacterias este es un cultivo de micobacterias, este es un agar de
micobacterias lo que se conoce como un agar de lowenstein Jensen, este de
aquí no creció nada y aquí vemos una micobacteria que puede ser una
micobacteria tuberculosa que ha tardado en crecer dos o tres semanas.
Cuando hablamos de los cultivos nos estamos refiriendo en general, a los
cultivos habituales, hablamos de los que crecen lento, de los que no crecen.
Pero quiero que nos dediquemos hablar de las bacterias de Rápido crecimiento
bacterias que crecen en un ambiente aeróbica.
Y aquí dividirlos generalmente en.
➢ Los Gram Positivos: Son por ejemplo lo que vemos en una tinción azul,
que generalmente los vemos como cocos en cadena como los
estreptococos, o en racimos como los estafilococos o bacilos gram
positivos son generalmente azules en la coloración de gram.
➢ Gram Negativos: Por otros lados los bacilos gram negativos o bacterias
gram negativas pueden ser cocos, los vemos color rosa o rojito en la
tinción de gram o pueden ser bacilos en la tinción de gram, En los gram
negativos generalmente tenemos los habituales (los que no necesitan el
agar chocolate para crecer) pueden crecer en medios no selectivosincluso
en medios selectivos para bacilos gram negativos ahí tenemos porejemplo
las
• Enterobacterias (la más carecteristicas de estas es la Escherichia
coli)
• Pseudomonas que se han vuelto resistentes a los antibióticos.
• Como los Acinetobacter que recientemente han tomado por asalto
los hospitales y a veces son intratables
Por otro lado, tenemos los de difícil crecimiento que solamente crecen en agares
de chocolate que requieren además de una atmosfera capnófilica que logarmos
reduciendo el medio la atmosfera prácticamente encendiendo una vela para que
haya mas CO2 y que imite la atmosfera de la tierra hace algunos hace poco
millones de años

• Haemophilus
• Brucellas

• Franscicella tularensis
Vamos a dar algunos ejemplos no es difícil conocer sus principios básicos
Gram Positiva +, típicamente un estafilococo aureus, crece en el agar
Sangre, si crece en el agar sangre más fácilmente va a crecer en el agarchocolate,
pero no va a crecer en el MacConkey que es un medio para bacilos gram
negativos.
Quien tiene mucha experiencia en el laboratorio puede decir, esto es una
colonia típica de estafilococos dorado, es redondita tiene un color dorado,
que puede ser un stapha áureo aunque todavía hay que identificarla y
conocer su patrón de sensibilidad a los antibióticos, dicho de paso también
los estafilococos se han vuelto muy resistentes.
Gram Negativa -, E. Coli que es la mas famosa de todas, ya sabemos
que va a crecer en el medio selectivo de bacilos negativos MacConkey,
típicamente va a crecer en el chocolate y en agar sangre pues son medios
no solo dos son exigentes si no medios enriquecidos.
En este caso estamos viendo una flora microbiana.
Bacilos de difícil crecimiento Haemophilus crece en el chocolate, no
se desarrolla en el MacConkey y obviamente el agar sangre sin desarrollo
Otro ejemplo es que crezca en el agar sangre, que no crezca en el agar
chocolate y que crezca en al agar MacConkey muchos pudieran decir que
es una Gram Negativa, pero podemos decir fácilmente que esto es un
error, porque no puede decir que creció en el MacConkey pero no en el
chocolate al revés si puede ser en el caso de Haemophilus.
Otro ejemplo puede ser que crezca en el agar sangre, no crezca en el
chocolate y tampoco crezca en el MacConkey, porque si creció en el agar
sangre debía crecer en el chocolate y podría no haber crecido en el
MacConkey.
Bueno son principios fundamentales de los que parte la interpretación en
los laboratorios de microbiología, esto es extraordinariamente importante,
en los laboratorios de microbiología muchas veces se define la vida del
paciente, este es el caso de los hemocultivos de Sangre. Si un paciente
tiene por ejemplo un catéter central, se contamino ese catéter central y
esta soltando bacterias al torrente sanguíneo del paciente el paciente se
puede morir entra en lo que conocemos como Cercis, pero clínicamente
no puedo decir que está contaminado el catéter, pero lo puedo sospechar
la única manera que puedo saberlo con precisión seria tomarle sangre del
paciente, sembrarlo en un cultivo como este, primero cultivo liquido este
una vez que este se enturbie pasarlo a estas cajas, identificarlos para
poder avisarle al clínico que esta creciendo el hemocultivo, el clínico
tomara la decisión mas probablemente de quitar el catéter.
Pero nuestra obligación en el laboratorio seria identificar las bacterias
darle un reporte de la identificación, pero además decir que antibióticos
pueden funcionarle al paciente.
CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS

Uno de los más destacados en el tema de los cultivos era el Dr. Robert koch de
hecho para poder aislar la bacteria que produce la tuberculosis lógicamente primero
se tuvo que haber desarrollado un medio de cultivo en el campo de la virología el
poder cultivar un microorganismo es fundamental el caso de los virus cuando están
produciendo enfermedades poder cultivarlos para poder producir sus vacunas.

La nutrición como todos

sabemos todos
necesitamos una serie
de sustancias nutritivas
que nos van a permitir el
crecimiento de los seres
vivos igual sucede con
los microorganismos, en
el caso de que ya no
haya crecimiento, pues
el mantenimiento de un
individuo. para esto
vamos a necesitar
nutrientes de los cuales
vamos a obtener la
energía que se requiere.

En el caso de los microorganismos vemos acá un medio de cultivo donde están creciendo
bacterias, las bacterias en medio solido crecen formando colonias obviamente una colonia se
forma por la unión de millones de bacterias.

En esta lamina más o menos se

puede apreciar que se
representa una colonia y cada
colonia diferente representa una
colonia diferente una colonia
como esta, que tiene un color
más o menos rosado un tamaño
particular y luego vemos otra un
poco más pequeña con un color
un diferente.
En el caso de los hongos que es
lo que vemos a la derecha
vemos que el crecimiento de
ellos es diferente, todos hemos
visto los hongos. si las bacterias
crecen formando colonias,
los hongos tienen un crecimiento particular, como algodonoso aquí estamos
hablando de un hongo filamentoso.
Para que un microorganismo pueda crecer requiere de dos cosas:
Requiere de un medio de cultivo que le provea todos los nutrientes necesarios pero
no solamente eso, ademas necesitan de unas condiciones ambientales propias
como temperatura de acuerdo a la temperatura los microorganismos
particularmente se clasifican en:
✓ generales
✓ cicrofilas
✓ mesofilas
✓ termofilas.

Si la bacteria es termolfila y el ambiente que nosotros tenemos es cicrofilo logicamnete no va

a
crecer o no va a crecer por que
habalmos tambien del
crecimiento optimo. Otra
condicion fisica es la
disponibilidad de oxigeno es decir
si las bacterias van a crecer en un
medio anaerobio en ausencia
total de oxigeno libre y en un
microaerofilico donde se
requieren pequeñas cantidades
de este oxigeno o si son
anaerobias reclutativas que
pueden crecer tanto en presencia
como en ausencia de oxigeno. Si
nosotros tenemos n medio para una bacteria pero imaginemos que la bacteria sea
anaerobica que solamente puede crecer en ausencia de oxigeno y nosotros
preparamos el medio la inoculamos pero en un ambiente aerobioco aunque tenga
un medio enrriquecido la condicion no le favorece y no crece de ahí pues esto las
condiciones son fundamentales para que los microorganismos puedan crecer.
Aquí vemos los fines de como
aprovisiona energía un
microorganismo se pueden
subdividir:
organismos litrotofas según
como es la fuente de energía
para este microorganismo así
va a ser el grupo al que
pertenece en el caso de las
 litrotofas que son
microorganismo que
únicamente requieren
sustancias de tipo inorgánico
sustancias simples para poder
crecer como el nitrito, nitrato
como el hierro apenas un
orgánico que parece insipiente
o
como que no promueve crecimiento de nada ya esto es suficiente para que muchas bacterias
del
grupo de las litrotoficas puedan crecer a diferencia de las organotroficas requieren
de compuestos orgánicos como el carbono carburo carbohidratos los grupos que
forman parte de las moléculas biológicas los lípidos etc. para poder desarrollarse,
desde un punto de vista bio sintético también hay una clasificación es decir un
organismo es autotrófico (capaz de producir su propia energía) como en el caso
de las plantas que so autotróficas por que únicamente con presencia de la luz solar
a través del proceso de la fotosíntesis pueden captar energía en el caso de nosotros
pertenecemos al segundo grupo dependemos totalmente de otros organismos.

Respecto a los elementos entonces

vemos dos grupos de elementos:
macro elementos que son las
moléculas grandes como el carbono,
pero también, aunque sea en muy
pequeñas cantidades se requieren de
los elementos traza o micro
elementos como el manganeso
cobalto zinc cobre y molibdeno que
son fundamentales para el
crecimiento de los microorganismos.

Aquí vemos las fuentes de carbono y

energía, todos los organismos
independientemente que sean las
plantas los animales igual las baterías
los microorganismos requieren energía
para poder crecer si un organismo su
fuente de energía es radiante decimos
que son: fotótrofos o fotolitotrofos
que obtienen su energía a través de la
luz, pero si esos organismos son un
poco más complejos requieren la
oxidación de compuestos de carbono
que corresponden a los heterotróficos
a los quimiorganotrofos según la
demanda. por ejemplo, si un
organismo su fuente de energía es la
luz y su fuente de
carbono es el co2 que es un compuesto inorgánico estamos hablando de un
organismo fotolitrotofico, la fuente de carbono la fuente de energía la luz y la
fuente de carbono el co2 porque es un compuesto inorgánico, si ya requiere
compuestos orgánicos para la obtención de carbono estamos hablando de un
organismo quimioterotrofico, distinto más complejo y más sofisticado su fuente
de energía.
en esta lista vemos los macro elementos que los requieren obviamente los
microorganismos al igual que lo requieren otros seres vivos más desarrollados.

Cuando un organismos su fuente es

inorgánica el co2 esa es una de las
cualidades de las bacterias por ejemplo
una de las grandes propiedades como
organismos productores, recordemos que
hay diferentes clasificaciones de los
organismos dependiendo si son
productores si son consumidores o son
descomponedores en el caso de las
bacterias y los hongos como sabemos
están dentro de los grupos de
microorganismos que son
descomponedores de toda la materia
orgánica que hay en nuestro ambiente
que es
generada por nosotros y por otros animales lógicamente es descompuesta
principalmente con la participación de los hongos y de las bacterias y es importante
porque además estos microorganismos permiten una conversión de sustancias
inorgánicas que muchas veces no pueden ser utilizadas por otros seres vivos las
incorporan al suelo las convierten en algo orgánico que puede ser asimilado y que
va a servir como fuente de energía para otro organismo. Una de las cosas más
elementales de los microorganismos captar algo inorgánico. Captar co2 que es un
contaminante incorporarlo en una sustancia que pueda ser utilizada por otro
organismo.
 Así como existen los hongos o bacterias
que son poco exigentes otros requieren
factores de crecimiento y vitaminas
como la tiamina biotina y es el ejemplo
que tenemos de este género que se
llama Brucella. También Haemophilus
es otra bacteria que es muy exigente.

Aquí se empieza a hablar un poco de los

medios de cultivo, un medio de cultivo es
aquel que le aporta los requerimientos
nutricionales para crecer. Hay diferentes
tipos de medios de cultivos de acuerdo a
lo que nosotros queremos que crezca no
existe un medio universal ni un medio
que promueve el desarrollo a todos los
microorganismos.
Los medios de cultivos pueden ser:
a) solidos
b) líquidos
En los sólidos las bacterias crecen formando colonias y en los medios líquidos el crecimiento
lo
detectaos porque vemos turbidez si un
medio cuando no se ha inoculado, no se
ha sembrado bacterias; digamos que es
claro cuando ponemos a crecer las
bacterias en este medio que es liquido
vamos a captar el crecimiento por que
este se vuelve turbio.
Aquí podemos un ver un medio de cultivo, en
primera instancia, es decir; vamos a ver otra
clasificación, en términos generales los
medios pueden ser de tres tipos:
✓ naturales
✓ sintéticos
✓ semisinteticos

Los naturales son los que crecen en frutas,

pan, carne etc… permiten el crecimiento del
microorganismo, significa que no conocemos
su composición química a diferencia del
segundo grupo estamos hablando de un medio
que su composición química está definida
sabemos que cantidad de cada uno de los
ingredientes
conforman parte de ese medio de cultivo. El tercero el sintético es una mezcla de
la anterior por que lleva algunas sustancias químicas que no se conocen, pero
existen otras que está bien definidas.

Hay diferentes tipos de medios de cultivo puede ser:

✓ Puro cuando solamente crece un solo microorganismo, pero posee pureza
genética esto quiere decir que tiene las características idénticas al
microorganismo que le dio nombre a esa especie.
✓ Axenico cuando solamente crece un tipo de microorganismo, pero no
posee pureza genética ya no es idéntica a la bacteria que le dio origen.
✓ Mixtos cuando en el crecen dos o más bacterias que pueden ser distintas
inclusive pueden crecer bacterias y también hongos.
 Esta es otra clasificación
los medios de cultivos
pueden ser:
✓ Comunes
✓ enriquecidos

Si nosotros incorporamos
tejidos o nutrientes
especiales al medio que
puedan promover el
crecimiento de bacterias
exigentes estamos
hablando de medios
enriquecidos.
Un ejemplo de un medio enriquecido es Gelosa sangre, pero también es un medio
común por que permite el crecimiento de todo tipo de microorganismos es decir
crecen bacterias Gram positivas,
Gram negativas.

Este es un medio selectivo el

McCONKEY tiene una serie
de elementos que inhiben el
desarrollo de ciertos
organismos y a la par
favorece el de otros en este
inhibe el crecimiento de las
baterías Gram positivas, pero
en el crecen muy bien las
bacterias Gram negativas.

Aquí tenemos el
agar sangre es un
medio selectivo,
pero también es un
medio diferencial
porque cuando
crecen las colonias
algunas son
hemolíticas
 hemo(sangre)
lítica(ruptura) quiere
decir que esas bacterias rompen la sangre.
Un medio de cultivo como este igual que la gelosa tenemos bacterias y se
presentaran dos tipos de colonias unas que producen hemolisis y otras no producen
hemolisis, por lo tanto, este es un
medio también diferencial por que podríamos clasificar desde
ese punto de vista a las bacterias en otra subdivisión que serían:
✓ Bacterias hemolíticas
✓ Bacterias no hemolíticas

Este es un medio de prueba es el caso de Mueller Hinton si

nosotros queremos probar un antibiótico, lo amarillo
corresponde al crecimiento de una bacteria lo blanco son
discos impregnadas con antibiótico y aquí lo que vemos es que
alrededor de ese antibiótico no hay crecimiento esto se conoce
como halo división que es la zona alrededor del antibiótico
donde no hay crecimiento bacteriano.
En cambio vemos otras
como este que hay
crecimiento en todo
alrededor del disco
impregnado del
antibiótico entonces
según en el halo división
si son grandes podemos
decir que estas bacterias
son sensibles o que son
resistentes si el halo
división es muy
pequeño, pero donde la
bacteria crece muy cerca
del disco decimos que
son altamente
resistentes.

Este es un medio para

contar bacterias algunas
veces se necesita
determinar la cuenta de
bacterias particularmente
en el caso de los alimentos
si necesitamos saber
cuántas bacterias
coniformes están presentes
en algunos alimentos se
toleran ciertas cantidades
de coniformes totales casi
nunca fecales.
Entonces a través de esta
técnica que se conoce
pour plate podemos hacer
una siembra y poder
contar las bacterias.