Microbiología Alimentos Manual

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ÁREA ACADÉMICA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL E
INGENIERÍA EN ALIMENTOS
PROGRAMA EDUCATIVO DE
INGENIERÍA EN ALIMENTOS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
4º SEMESTRE
PROGRAMA EDUCATIVO DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
DIRECTORIO:
ADOLFO PONTIGO LOYOLA

RECTOR
AGUSTÍN SOSA CASTELÁN

SECRETARIO GENERAL
GONZALO VILLEGAS DE LA CONCHA

COORDINADOR DE LA DIVISIÓN ACADÉMICA
YOAN BELTRÁN MARTÍNEZ

DIRECTOR GENERAL DE SERVICIOS ACADÉMICOS
ÓSCAR RODOLFO SUÁREZ CASTILLO

DIRECTOR DE LABORATORIOS Y TALLERES
ARMANDO PELÁEZ ACERO

DIRECTOR DEL INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
JESÚS MELITÓN FRANCO FERNÁNDEZ

SECRETARIO DEL INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
RAFAEL GERMAN CAMPOS MONTIEL

JEFE DEL ÁREA ACADÉMICA DE ING. AGROINDUSTRIAL E ING. EN ALIMENTOS
HEIDI MARÍA PALMA RODRÍGUEZ

COORDINADOR DEL PROGRAMA EDUCATIVO DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS
FECHA DE APROBACIÓN DEL MANUAL DE PRÁCTICAS POR LA ACADEMIA RESPECTIVA:

ENERO, 2022. ACADEMIA DISCIPLINAR DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ALIMENTARIA
NOMBRE DE QUIENES PARTICIPARON EN LA ELABORACIÓN:

NOMBRE FIRMA
DRA. MARTHA GAYOSSO CANALES
VO. BO. DEL PRESIDENTE Y SECRETARIO DE LA ACADEMIA:

NOMBRE FIRMA
DRA. THANIA ALEJANDRA URRUTIA HERNÁNDEZ
MTRA. RAQUEL HERNÁNDEZ GONZÁLEZ
VO. BO. DEL COORDINADOR DEL PROGRAMA EDUCATIVO:

NOMBRE FIRMA
DRA. HEIDI MA. PALMA RODRÍGUEZ
FECHA DE LA ÚLTIMA REVISIÓN Y/O ACTUALIZACIÓN:

ENERO, 2022
REVISADO POR:
DIRECCIÓN DE LABORATORIOS Y TALLERES
INDICE
A.- ENCUADRE DEL MANUAL DE PRÁCTICAS 5

1.- Introducción 5
2.- Competencias 5
3.- Programa del Sistema de Prácticas y Actividades Extramuros 5
B.- REGLAMENTO, NORMAS DE SEGURIDAD Y LINEAMIENTOS 6
1.- Reglamento de Laboratorios 6
2.- Medidas de Seguridad en los Laboratorios, Talleres, Clínicas y Actividades Extramuros
10
3.- Lineamientos de Seguridad para Trabajar en Laboratorios, Clínicas, Talleres y
Actividades Extramuros 11
C.-NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA 16
1.- Cuadro de Normas y Referencias de Seguridad de la Práctica 16
2.- Política Ambiental 17
2a.- Cuadro de Disposición de Residuos 17
D.- CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA EN PARTICULAR 19
Práctica No. 1: Destrucción Térmica de Microorganismos 19
Práctica No. 2: Evaluación de la Higiene y Sanidad en el Procesamiento de Alimentos 26
A.- ENCUADRE DEL MANUAL DE PRÁCTICAS

1.- Introducción
Con este manual de prácticas se pretende que el alumno adquiera los conocimientos y
habilidades para realizar análisis microbiológicos de muestras de alimentos. Con la
finalidad de facilitar la comprensión y el desarrollo del tema involucrado, cada práctica
contiene una breve introducción sobre la naturaleza de los procedimientos y materiales a
utilizar y una serie de cuestiones que involucran la revisión de material adicional. La
mayoría de los experimentos se harán en grupos pequeños de tres a cinco personas.
Independientemente del trabajo en equipo, todos los estudiantes son particularmente
responsables de recolectar el total de datos obtenidos y de hacer su reporte individual.
Este manual es una traducción parcial de Food Microbiology Laboratory de Lynne
McLandsborough. Editado por CRC Press. U.S.A. (2005), con inserciones de otras
fuentes.
2.- Competencias
Genéricas:
Busca y analiza información, propone y argumenta ideas.
Específicas:
Determina los microorganismos que pueden encontrarse en un alimento con base en las
características del alimento.
Decide el tipo de análisis microbiológico que debe realizar a un alimento en particular
basándose de la regulación
Prepara muestras de alimentos para someterlas a los análisis microbiológicos
correspondientes.
Capacidad para elegir el tipo de muestreo e interpretar resultados de un análisis
microbiológico así como de hacer un reporte de resultados
3.- Programa del Sistema de Prácticas y Actividades Extramuros

NÚM. PROGRAMACIÓN
DE
UNIDAD NOMBRE ÁMBITO DE LA
PROGRAMÁ SESIONES DE LA DE
PRÁCT PRÁCTICA
TICA PRÁCTICA DESARROLLO
ICA (SEMANA)
Destrucción térmica de
1 1 2 Laboratorio 2
microorganismos
Evaluación de la higiene y
2 2 11 Laboratorio 4
sanidad en el
5
procesamiento de
alimentos
B.- REGLAMENTO, NORMAS DE SEGURIDAD Y LINEAMIENTOS

1.- Reglamento de Laboratorios
CAPÍTULO III
De los usuarios
Artículo 18. Se consideran corno usuarios de los laboratorios:
I.Los alumnos de la Universidad que, conforme a los planes y programas de estudio de los
diferentes niveles educativos, requieran de este apoyo.
II.El personal académico de la Universidad que requiera apoyo de los laboratorios.
III.Los estudiantes o pasantes que se encuentren realizando tesis o prácticas profesionales,
prestatarios de servicio social o colaborando en actividades académicas.
IV.Los profesores visitantes que requieran de la utilización o Servicios de los laboratorios de
acuerdo a convenios establecidos.
V.Las personas que, por causa académica justificada, autorice el Director de la Unidad
Académica.
Artículo 19. Los usuarios alumnos de la Universidad deberán acreditar esta calidad así
como el derecho a cursar la asignatura con la que se relaciona la práctica y/ó proyecto a
realizar, de acuerdo a los programas educativos vigentes.
Artículo 20. Tratándose de prácticas de asignatura de los planes y programas de estudio

vigentes en que deba asistir el grupo, éste quedará a cargo del profesor titular del mismo,
quien lo controlará y asesorará. En caso de que el profesor no asista, la práctica no podrá
realizarse.
Artículo 21. Los usuarios académicos de la Universidad deberán acreditar esta calidad ante
el Responsable de Laboratorios, así como tener aprobados los proyectos de investigación.
Artículo 22. Los usuarios estudiantes a que se refiere la fracción III del artículo 18 de este
reglamento podrán hacer uso del laboratorio, clínica o taller de que se trate, con la
acreditación respectiva y cuando cuenten con la asesoría del director de tesis o del
investigador responsable del proyecto en el que participan, previo registro ante el Jefe de
Laboratorios, del protocolo de investigación aprobado y con el visto bueno del Director de
la Unidad Académica.
6
Artículo 23. Los profesores visitantes nacionales o extranjeros deberán acreditar su

pertenencia a la institución que representan, así como los programas y convenios con los
que se relaciona la actividad por realizar y tener aprobados los proyectos de investigación.
CAPÍTULO IV
De la operación y uso
Artículo 24. Los laboratorios permanecerán abiertos en el horario definido por cada Unidad
Académica. Cualquier uso fuera del horario de operación, deberá ser autorizado por el
director de la Unidad Académica.
Artículo 25. Durante el tiempo de operación de los laboratorios, solamente tendrán acceso
para su uso, en los horarios previamente establecidos:
I.El personal adscrito a los mismos.

II.Los usuarios a quienes se refiere el artículo 18 de este reglamento.
Artículo 27. Tras la adquisición o pérdida de algún equipo o mobiliario de laboratorio, el Jefe
de Laboratorio tiene la obligación de notificar inmediatamente su alta o baja dentro del
inventario. En caso de pérdida, se procederá a levantar un acta informativa y se seguirá el
procedimiento legal que corresponda.
Artículo 28. Cada laboratorio deberá contar con un archivo general, manuales de prácticas
y de operación, una bitácora actualizada de servicios prestados, prácticas o proyectos
realizados, otra bitácora por cada equipo que así lo requiera, y una copia del inventario
interno actualizado, que serán resguardados por el Responsable del Laboratorio.
Artículo 29. Las llaves de las puertas de acceso al laboratorio y de las demás áreas físicas
del mismo, estarán en poder del Responsable, y se contará con un duplicado en la dirección
de la Unidad Académica.
Artículo 30. Las mesas de trabajo de cualquier laboratorio, clínica y taller, serán usadas
mientras dure la práctica, por lo que no se podrá dejar material en ellas por mayor tiempo
del autorizado. En el caso de tratarse de procesos continuos que no se puedan interrumpir,
se comunicará al Responsable.
Artículo 31. Los espacios físicos destinados a cubículos u oficinas dentro de los
laboratorios, así como el mobiliario, equipo y materiales para el mismo fin, sólo podrán ser
utilizados por el personal adscrito al laboratorio.
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Artículo 32. Durante su estancia en los laboratorios, toda persona se abstendrá de fumar,
de consumir alimentos, del uso de teléfono celular y radiolocalizador. La no observancia a
esta disposición causará la suspensión del derecho al uso de los laboratorios.
Artículo 33. Los equipos, herramientas, reactivos y materiales del laboratorio, que se
empleen durante una práctica o prestación de servicios, quedarán bajo la responsabilidad
directa del usuario que los solicitó. El solo hecho de hacer el vale correspondiente no da
derecho al usuario a sustraerlo de la Unidad, ni a conservarlo en uso exclusivo más del
tiempo autorizado; salvo autorización especial y por escrito del director de la Unidad
Académica.
Artículo 34. Todo material y equipo solicitados deberán ser devueltos al Responsable del
Laboratorio, quien tiene la obligación de revisar que estén completos y en buen estado. En
caso contrario, registrará este hecho en la bitácora del laboratorio, o del equipo específico,
notificando inmediatamente al Jefe de Laboratorios, quien hará un convenio con el o los
alumnos para fincar la responsabilidad y acordar la modalidad de la reparación de la pérdida
o daño, lo cual será informado a la dirección de la Unidad Académica.
Artículo 35. Toda pérdida o daño al equipo o del material causados por el usuario serán
repuestos o reparados por él mismo, en especie o pagos, a través de depósito bancario o
directo en la Coordinación de Administración y Finanzas, en un lapso no mayor de quince
días hábiles, contados a partir de la fecha del incidente. De no cumplir lo anterior, se le
suspenderá el permiso para utilizar los laboratorios, clínicas o talleres y se sujetará a lo
dispuesto por la legislación universitaria.
Artículo 36. La persona que haga mal uso del equipo, materiales o instalaciones, o que
presente un comportamiento indisciplinado, será amonestada o se le suspenderá temporal
o definitivamente el permiso de uso de los laboratorios, clínica o taller, según la gravedad
o frecuencia con que dicha acción se realice, y de acuerdo a lo establecido en el reglamento
interno de la Unidad Académica correspondiente.
Artículo 37. Es obligación del Responsable del Laboratorio, supervisar el cumplimiento de

las reglas de seguridad, contar con carteles, cuadros u otros señalamientos. Será su
responsabilidad revisar y actualizarlos periódicamente.
Artículo 38. Todo usuario alumno que no utilice o que haga mal uso de los materiales de
protección diseñados para trabajar en el área o que ponga en peligro a otros usuarios a
través de su comportamiento inadecuado, se hará acreedor a las siguientes sanciones:
8
I. Será amonestado verbalmente. De no corregir de inmediato su actitud, le será

suspendida la autorización para seguir trabajando ese día.
II. En caso de reincidir, será suspendido por el resto del semestre.
Artículo 39. El director de la Unidad Académica aplicará las sanciones referidas en el

artículo 38, según la gravedad de la falta.
Artículo 40. Respecto a los usuarios académicos de la Universidad y a los profesores

visitantes que infrinjan las normas de seguridad y disposiciones de este reglamento, la
Dirección de la Unidad Académica comunicará a la Secretaría General las faltas cometidas
para que, en su caso, se apliquen las sanciones que procedan.
Artículo 41. Ningún equipo, accesorio, material, reactivo o mobiliario podrá ser sustraído de
los laboratorios, sin la autorización de la dirección de la Unidad Académica, debiendo el
Jefe de laboratorios, vigilar y registrar, de acuerdo a los procedimientos establecidos por la
Dirección de Recursos Materiales cualquier mudanza autorizada, fuera o dentro de la
unidad académica.
Artículo 43. El manejo de reactivos y materiales dentro de los laboratorios deberá sujetarse
a las normas nacionales e internacionales que en materia de seguridad e higiene estén
establecidas.
Artículo 44. Toda información técnica perteneciente a los equipos y accesorios de un

Laboratorio es parte integral del mismo, y deberá estar disponible para su consulta en el
lugar al que pertenecen.
Artículo 45. Cada equipo mayor deberá contar con una bitácora de operación propia, la cual
será un libro de pasta dura, con hojas foliadas y resistentes, y se ubicará permanentemente
junto al equipo correspondiente; cada vez que sea utilizado un equipo, el usuario deberá
registrar en ella:
I. Nombre y firma;
II. Fecha;
III. Proyecto, práctica o servicio al que corresponde el uso;
IV. Hora de inicio del uso del equipo;
V. Hora de terminación del uso del equipo;
VI. Número de muestras y material usados;
VII. Unidad académica o dependencia externa de adscripción; y
VIII. Observaciones generales.
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CAPÍTULO V
De los servicios
Artículo 47. Se consideran servicios prestados por los laboratorios: a toda actividad en
apoyo a la docencia e investigación, así como asesoría, capacitación, análisis, fabricación
y preparación de muestras, evaluación técnica de procedimientos experimentales, de
control, medición o calibración que se prestan a la comunidad universitaria o a los sectores
externos a la misma.
Artículo 48. Los servicios de los laboratorios serán de dos tipos: internos y externos.
Articulo 49. Los servicios internos serán gratuitos, y son aquellos servicios prestados a
usuarios internos que tengan por objeto cumplir con alguna de las funciones sustantivas de
la Universidad, siempre y cuando no represente un gasto no autorizado previamente.
Artículo 50. Tratándose de los servicios a los usuarios a que se refiere la fracción III del
artículo 18 del presente reglamento, los laboratorios, clínicas y talleres, les proporcionarán
aquellos que son de carácter general; en tanto que el costo de reactivos o materiales
específicos relacionados con las tesis de titulación, los cubrirá la Universidad, siempre y
cuando se tenga la autorización previa del presupuesto respectivo.
2.- Medidas de Seguridad en los Laboratorios, Talleres, Clínicas y Actividades

Extramuros
1. Las sustancias que se manejan comúnmente en el laboratorio y/ó taller son altamente
contaminantes. Como UNIVERSITARIOS tenemos gran compromiso con el cuidado del
medio ambiente y en consecuencia debemos desecharlas adecuadamente conforme a las
indicaciones que te indique tu catedrático. “NO DESECHES TUS SOLUCIONES,
RESIDUOS O PRODUCTOS DIRECTAMENTE EN LA TARJA”, utiliza los contenedores
correspondientes al tipo de sustancia en particular.
2. El usuario tendrá cuidado de no contaminar los reactivos o sustancias que utilice, o tomar
alguna directamente con la mano. Existen reactivos y/ó sustancias de los cuales se
preparan soluciones diluidas, que son altamente corrosivos. En este sentido, el contacto
con ellos deber ser reducido al mínimo con las manos, la nariz o la boca. Usar en todos los
casos una perilla o propipeta o bien el material apropiado para auxiliarte al tomar la cantidad
deseada de reactivo.
3. El usuario, por ningún motivo pipeteará las soluciones con la boca, así como tampoco
“PIPETEARA” directamente del frasco que contiene al reactivo o sustancia a utilizar. Para
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ello, toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO DEVUELVAS EL

RESTANTE al frasco de origen, consulta con el catedrático que hacer con este restante y
sigue sus instrucciones. Así evitarás accidentes que van desde ligeros hasta muy graves,
y a la vez, que los reactivos se contaminen y que los resultados de tu práctica (y la de los
demás) se vean afectados.
4. Si el usuario necesita preparar una solución con reactivo(s) que desprende gases (como
los ácidos o el amoniaco) deberá HACERLO EN LA CAMPANA, PREVIA ACTIVACIÓN DE
LOS EXTRACTORES, y NO en las mesas de laboratorio.
5. En caso de que alguna sustancia corrosiva te llegue a caer en la piel o en los ojos, LAVA
INMEDIATAMENTE la parte afectada al chorro del agua al menos durante 5 minutos y
AVISA AL CATEDRÁTICO, para lo conducente. Si el derrame fue en una área considerable
de la piel o si el derrame fue en la ropa, usa las regaderas que están ubicadas en el
laboratorio y/ó taller.
6. Cuando peses en la balanza cualquier producto químico deberás utilizar un pesafiltro o

un recipiente adecuado, NUNCA en un trozo de papel. Además, procura no tirar el producto
alrededor de la balanza ya que puedes dañarla. Si esto sucede límpialo inmediatamente
con una brocha y/o con un trozo de tela limpio.
3.- Lineamientos de Seguridad para Trabajar en Laboratorios, Clínicas, Talleres y

Actividades Extramuros
I. Todos los usuarios deberán respetar la Normatividad Universitaria vigente.
II. Los usuarios sólo podrán trabajar y permanecer en el laboratorio y/ó taller, bajo la
supervisión directa del catedrático. En ningún caso el auxiliar o responsable de laboratorio,
podrá suplir al catedrático ó investigador en su función.
III. Para asistir a sesiones de laboratorio y/ó taller, es requisito indispensable que los
usuarios se presenten con manual de prácticas, guía de trabajo y/ó de investigación, con
los materiales específicos por adquisición personal, necesarios para el trabajo a realizar en
los laboratorios y/ó talleres y portar adecuadamente su equipo de seguridad según aplique,
a indicación del catedrático:
• Laboratorios y/ó talleres: bata reglamentaria blanca o de color y de manga larga, y en caso
de talleres de ingeniería pelo recogido, sin adornos, uñas cortas y sin portar alhajas.
Asimismo deberá portar, zapato y/ó bota antiderrapantes, portar en cada visita a obra y en
la realización de trabajo en campo el casco de seguridad tipo jockey y el chaleco de
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seguridad de malla con franja reflejante. Si el catedrático considera alguna otra, favor de
indicarla previamente a los alumnos para que estén en posibilidad de cumplirla
estrictamente.
IV. En todo momento deberás conducirte en el laboratorio y/ó taller, con respeto y
responsabilidad hacia el catedrático y a los demás, tomando en cuenta que la seguridad de
tus compañeros y que la preservación de este espacio depende de todos y cada uno de los
usuarios.
V. El laboratorio y/o taller NO proporcionará manuales de prácticas a los usuarios, ya que

éstos serán suministrados por el catedrático de la asignatura correspondiente.
VI. La entrada al laboratorio y/ó taller será a la hora exacta de acuerdo a lo Programado.
VII. El usuario solicitará el equipo, utensilios, herramienta, material y reactivos descritos

correctamente, de acuerdo a las especificaciones del manual de prácticas, mediante el vale
de préstamo debidamente requisitado. Formato DLA-009 y su identificación oficial de la
U.A.E.H.
VIII. El usuario deberá revisar el mobiliario, equipo, herramienta y material que se les
proporcione, verificando que esté limpio, ordenado, completo y funcionando, éste quedará
a responsabilidad del usuario(s), durante el tiempo que dure la práctica y después de su
uso, deberá ser entregado en las mismas condiciones en las que le fue proporcionado.
IX. El usuario que solicite y reciba el material, herramienta y/ó equipo deberá ser quien a la
vez, haga la entrega del mismo, al final de la práctica.
X. Si el usuario no conoce el funcionamiento del equipo o máquina alguna, puede provocar

que ésta sea averiada o bien provocar algún accidente al tratar de utilizarla, para evitar lo
anterior, por favor ¡solicite asesoría a su catedrático!
XI. Al devolver el mobiliario, equipo y material, el usuario deberá solicitar el vale de

laboratorio Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H.
XII. Cuando el material quede bajo la responsabilidad del usuario, el vale de laboratorio
Formato DLA-009 y su identificación oficial de la U.A.E.H., será retenido por el auxiliar o
responsable hasta la devolución del material.
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XIII. El usuario de laboratorio o taller, debe conocer la ubicación y el uso de los extintores,
las puertas de emergencia y la circulación correcta del lugar así como las rutas de
evacuación, para que en emergencia, proceda correctamente.
XIV. Todo frasco, bolsa, caja o contenedor, deberán ser etiquetados. Por lo tanto cualquier
sustancia con recipiente no etiquetado será desechada, conforme a lo que indica el “Manual
de Procedimientos. Departamento Control del Medio Ambiente” DLA-MO-7.2-01.6.
XV. En caso de pérdida, ruptura o desperfecto del equipo o material de laboratorio, el

usuario solicitará al auxiliar el vale de adeudo Formato DLA-010 y anotará en éste el nombre
y número de cuenta de todos los integrantes del equipo y será respaldado con la
identificación oficial de la U.A.E.H., debidamente requisitada en este vale. El adeudo se
repondrá en un plazo no mayor a 15 días hábiles. En este procedimiento se retendrá
únicamente el vale de adeudo.
XVI. Si el material adeudado no es repuesto en el plazo fijado, el o los usuarios

responsables, no podrán continuar con la realización de las prácticas correspondientes.
Control de adeudo Formato DLA-011.
XVII. En caso de no cumplir con la reposición del material en el plazo establecido, el

usuario(s), será(n) dado(s) de alta, en la aplicación del Sistema Institucional de Control de
Adeudos en Laboratorios, Clínicas y Talleres, implementado en la Dirección de Laboratorios
y Talleres de la U.A.E.H.
XVIII. La acreditación de cada una de las prácticas que se realicen, estará sujeta a la
evaluación que aplique el catedrático y a lo estipulado por la Dirección de Administración
Escolar.
XIX. El usuario que realice práctica de recuperación deberá cumplir con todo lo estipulado
en el presente.
XX. Los usuarios que por indisciplina o negligencia pongan en peligro su integridad, la de
sus compañeros, la del mobiliario, material, utensilios o la de las instalaciones, serán
sujetos a la sanción correspondiente prevista en el Reglamento de Laboratorios Artículo 36
y 38.
XXI. Por la naturaleza de las cosas que existen en el laboratorio debes mantenerte alerta y
sin distracciones y además NO corras, NO ingieras alimentos, NO se permite el uso de
equipos de sonido personales y NO SE PERMITEN VISITAS DURANTE TU ESTANCIA
EN NINGÙN LABORATORIO, CLÍNICA O TALLER.
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XXII. El usuario que incurra en alguna falta académica será sancionado de acuerdo a la
Normatividad Universitaria vigente.
XXIII. Queda estrictamente prohibido realizar cualquier tipo de actividad ajena al desarrollo
de las tareas propias del laboratorio, clínica y/o taller.
XXIV. Todo usuario deberá entrar y salir por los accesos autorizados, en orden y cuidando
su integridad y la de sus compañeros. (Manual de Higiene, Seguridad y Ecología, Capitulo
1).
XXV. Los usuarios deben reportar cualquier anomalía o maltrato por parte del catedrático y
del personal de laboratorio, al jefe de los mismos o en su caso a la Dirección de la Escuela
o Instituto.
XXVI. Al concluir la práctica, deben dejar limpia el área de trabajo, así como el mobiliario,
material y equipos utilizados. NO TIRES PAPELES Y/O BASURA A LAS TARJAS, MESAS
Y/O EQUIPOS.
XXVII. Al concluir la licenciatura, maestría o doctorado y realices el trámite de titulación

solicitarás la constancia de “no adeudo de material, herramienta y/o equipo de laboratorios,
clínicas y talleres”, para obtenerla harás una donación en especie (material que se usa en
los, clínicas, laboratorios y talleres) de acuerdo al Formato DLA-043, la cantidad de la
donación será entre tres y cuatro salarios mínimos vigente en el estado de Hidalgo para
ello es necesario entregar la nota y escribir en el formato el material donado, posteriormente
el documento que se extienda se entregará a la Dirección de Laboratorios y Talleres donde
se elabora y entrega la constancia de no adeudo
XXVIII.- Las situaciones no previstas en este lineamiento serán resueltos por la Dirección
correspondiente y la Dirección de Laboratorios de acuerdo a la legislación universitaria
aplicable.
XXIX.- En los laboratorios se toma en cuenta la regla de cortesía la cual marca que por
ningún motivo o circunstancia las personas que se encuentren dentro de las instalaciones
del laboratorio, clínica y/o taller deberán de nombrarse con apodos, malas palabras o
faltarse al respeto de cualquier connotación sexual, racial o social. En caso contrario la
Dirección correspondiente y la Dirección de Laboratorios aplicarán lo conducente de
acuerdo a la legislación universitaria aplicable.
14
C.-NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA

1.- Cuadro de Normas y Referencias de Seguridad de la Práctica
Para el llenado, consulte el “Manual de Higiene, Seguridad y Ecología”
TIPO DE RIESGO COMO EVITARLO COMO PROCEDER EN CASO DE UN

ACCIDENTE…
Quemaduras químicas Debe ponerse atención Lave inmediatamente con agua

al trabajo que se realiza, corriente la superficie quemada. Deje
no sólo para evitar que corra bastante agua.
quemaduras, sino Aplique hielo o compresa helada.
también muchos otros Aplique la corriente de agua sobre el
accidentes. área quemada mientras remueve la
Evitar transportar ropa.
sustancias en el Cualquier material que se ponga
laboratorio, a menos que sobre la herida debe estar
sea necesario. sumamente limpio.
Caminar en el Si la quemadura extensa, mantenga
laboratorio, no correr. a la víctima acostada y que la cabeza
Lavar inmediatamente esté más baja que los hombros.
con agua los frascos que (Levante ligeramente las piernas si
presentan escurrimiento es posible)
de reactivos. Si el paciente está consciente y
Tapar correctamente los puede pasar líquidos, debe tomar
recipientes donde se bebidas sin alcohol.
guardan sustancias Todas las quemaduras, excepto las
químicas y desechar los muy pequeñas, deben ser vistas por
rotos, estrellados o sin el médico.
tapa. Quemaduras por substancias
La mejor protección se químicas en áreas especiales como
logra mediante el uso de en los ojos, pueden necesitar un
gafas, caretas, etc. y que tratamiento especial.
a su vez permiten El personal que trabaja en tales
perfecta visibilidad para áreas debe conocer este tratamiento.
trabajar. No ponga grasas, aceite,
Limpiar inmediatamente bicarbonato de sodio u otras
el lugar de trabajo substancias sobre las quemaduras.
cuando una sustancia se
ha derramado a caído.
15
Al efectuar reacciones Aplique hielo o compresas heladas

Quemaduras pequeñas exotérmicas o de
sobre la parte afectada.
calentamiento, pueden
por calor generarse explosiones, No trate de reventar las ampollas.
estas se pueden evitar si Puede sumergir la parte quemada
se utilizan pequeñas dentro de un recipiente con agua fría
cantidades de reactivos y
con hielo.
se mezclan lentamente,
y si el sistema debe Todas las quemaduras, excepto las
calentarse hacerlo con muy pequeñas, deben ser
moderación. examinadas por un médico o
Poner atención si una enfermera.
sustancia ha de
calentarse, ya que
pueden proyectarse
cuando se hace sin el
control adecuado.
Cuando se maneja
material metálico o de
vidrio calientes, deben
utilizarse guantes de
asbesto pinzas, paño,
etc.
2.- Política Ambiental

Política Ambiental
Es compromiso de todos los integrantes de la comunidad universitaria cumplir con

los requisitos legales de la normatividad vigente aplicable en materia ambiental, así
como con los requisitos e iniciativas que la Universidad Autónoma del Estado de
Hidalgo emita para mitigar el impacto ambiental generado por las actividades
universitarias; lo anterior con base en la sustentabilidad para impulsar a la institución
hacia el desarrollo sostenible, mediante el fomento del equilibrio entre el respeto al
medio ambiente y el desarrollo universitario.
2a.- Cuadro de Disposición de Residuos

“Manual de Procedimientos del Departamento de Control del Medio Ambiente. Plan de
Manejo de los Residuos C R E T I (Corrosivos, Reactivos, Explosivos, Tóxicos e
Inflamables) y el “Manual de Procedimientos del Departamento de Control del Medio
Ambiente. Plan de Manejo de los Residuos R P B I” (Residuos Peligrosos Biológicos e
Infecciosos)
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TIPO DE RESIDUOS CLASIFICACIÓN TIPO DE CONTENEDOR
Inflamable Líquido Garrafón o Tambo

Corrosivo ácido Garrafón o Tambo
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D.- CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA EN PARTICULAR
1. Identificación
NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Destrucción Térmica de Microorganismos
No. DE PRÁCTICA: 1 No. DE SESIONES: 2
No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO: 5
2. Introducción
El calor es el método más usado para la inactivación de microorganismos en la producción

de alimentos. La exposición microbiana al calor depende de dos parámetros: la temperatura
y el tiempo de exposición. En el laboratorio exploramos la destrucción térmica de bacterias.
Para monitorear la destrucción celular, generalmente se usa un número inicialmente alto de
células (mucho más alto del que se podría encontrar en un alimento) que permita detectar la
reducción por encima un número log de reducciones. Por ejemplo, si tú inicias con 5X104
UFC/mL (4 Log), sólo podrás detectar una reducción de 2 a 3 log (recuerda 1X101 UFC/mL
está por debajo del intervalo contable), pero si inicias con 5X108 UFC/mL, tendrás la
oportunidad de monitorear una reducción hasta de 6 a 7 log.
En este laboratorio llevaremos a cabo la destrucción térmica en tubos de ensaye en un baño
de agua, este sistema requiere un equipo estándar que puede encontrarse en la mayoría de
los laboratorios. Sin embargo, no es un sistema ideal para obtener información de
destrucción térmica exacta. Idealmente el sistema debe tener un tiempo de ascenso muy
rápido (tiempo para conseguir la temperatura interna de procesamiento), y todo el recipiente
de procesamiento debe mantenerse a la misma temperatura. Por esta razón la suspensión
bacteriana debe procesarse en tubos capilares sellados o viales que se sumergen
completamente en un baño de agua o de aceite. Las curvas de sobrevivencia son de carácter
logarítmico, hay una relación lineal entre el número logarítmico de sobrevivientes y el tiempo.
La información generada en la destrucción térmica generalmente es de forma sigmoidal,
significa que hay un hombro inicial antes de la caída exponencial en el número de células o
hay una cola al final de la curva. Las causas exactas detrás de los hombros y colas no son
obvias, pero al parecer están relacionadas a la heterogeneidad dentro de los cultivos. Se ha
mostrado que las curvas de muerte térmica pueden relacionarse matemáticamente a las
18
propiedades estadísticas de la distribución subyacente de las resistencias al calor dentro de

un cultivo. Además, el concepto de “valores D” está bajo dura crítica, debido a que en este
concepto se asume la destrucción de primer orden e ignora los valores de los hombros y las
colas, Sin embargo los valores D y Z son aún usados por la FDA para asegurar el proceso
térmico adecuado.
3. Objetivo General
Evaluar la efectividad del procesamiento térmico como método de destrucción microbiana a

través del monitoreo de las curvas de destrucción térmica
4. Objetivos Específicos
Familiarizarse con las pruebas de procesamiento térmico

Usar la información para generar curvas de sobrevivencia y calcular los valores D
Detectar potenciales fuentes de error en el laboratorio.
5. Reactivos/Insumos, Materiales/Utensilios y Equipos/Instrumentos

a) Reactivos/Insumos
C ANTIDAD U NIDAD D ESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
25 g. Caldo soya tríptica (TSB)
b) Materiales/Utensilios
CANTIDAD UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
4 Pieza Frascos de cultivo o matraces de 200 mL
Erlenmeyer
3 Pieza Pipetas graduadas de 1 mL
6 Pieza Tubos de ensaye con tapa de de 12 mL
baquelita
66 Pieza Cajas Petri desechables
8 Pieza Pipetas graduadas 0.1 mL
1 Pieza Perilla
c) Equipos/Instrumentos
C ANTIDAD U NIDAD D ESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
1 Equipo Balanza analítica
1 Equipo Estufa de incubación
1 Equipo Campana de flujo laminar
1 Equipo Autoclave
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6. Desarrollo de la Actividad Práctica
Se usará lo siguiente para generar las curvas de destrucción térmica:

Cultivos bacterianos; células en fase estacionaria crecidas a 37oC con agitación (250
rpm).
Medio: Caldo de soya tríptica (TSB), pH 7.
Temperatura de procesamiento: 54, 58 o 62oC
Diluciones: blancos de dilución de 99 mL
Método de inoculación: Placa vertida en agar soya tríptica (TSA) con 1 a 0.1 mL de
volúmenes de inoculación.
Se generarán tres curvas diferentes de sobrevivencia para un solo organismo, nivel de
inóculo y condición de crecimiento.
Sesión 1
Información para determinar valores D
Procedimiento
A cada grupo se le asignará una de las tres temperaturas (54, 58 y 62oC). Las diluciones
de estudio del cuadro 1 y el esquema de dilución (Fig. 1). En cada punto del tiempo
necesita preparar sólo las diluciones dadas en el cuadro 1. La organización es clave para
el tiempo de experimentación. Por lo tanto es importante etiquetar todas las cajas Petri y
todos los blancos de dilución, antes de empezar a trabajar con cualquier cultivo. Anote en
el fondo de la caja su nombre, temperatura de procesamiento, tiempo y diluciones que se
inocularon.
Transferir 11 mL de bacterias crecidas durante la noche a 99 mL de medio (TSB pH 7), y
mezclar bien. (Nota: el crecimiento nocturno tiene aprox. 3X109 UFC/mL, así tendrá un
nivel bacteriano inicial de aprox. 3X108 UFC/mL en el caldo).
Use un marcador permanente para etiquetar los seis tubos de ensaye de los blancos
estériles con su nombre de grupo y tiempo (10, 20, 30, 40, 50 y 60 min).
Añadir 5 mL del caldo inoculado a cada uno de los seis tubos. Estos serán sus muestras
10o para cada tiempo.
Coloque los tubos marcados 10, 20, 30, 40, 50 y 60 min en el baño de agua. Inicie su
contador de tiempo.
Siembre su muestra T=0 de su botella original de TSB inoculado. Siembre las diluciones
finales 10-5 hasta 10-7 por duplicado usando placa vertida.
A T=10, quite su tubo 10 min del baño de agua y colóquelo en un baño de hielo o hielo
agua a enfriar. Mezcle bien y diluya en placa vertida por duplicado de acuerdo al cuadro
1.
Para los subsecuentes tiempos repita el paso 7.
20
Incube las placas invertidas a 37oC por 48 h.
Cuadro 1. Diluciones para ser inoculadas a cada temperatura de procesamiento

Tiempo de Dilución final inoculada
muestreo 540C 580C 620C
(min)
0 10-5, 10-6, 10-7 10-5, 10-6, 10-7 10-5, 10-6, 10-7
10 10-5, 10-6, 10-7 10-2, 10-3, 10-4, 10- 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
5
, 10-6
20 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 10-1, 10-2, 10-3, 10- 100,10-1, 10-2, 10-3, 10-4
4
, 10-5
30 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 100,10-1, 10-2, 10-3, 100,10-1, 10-2, 10-3
10-4
40 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 100,10-1, 10-2, 10-3 100,10-1, 10-2, 10-3
10-6
50 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 100,10-1, 10-2, 10-3 100,10-1, 10-2
60 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 100,10-1, 10-2, 10-3 100,10-1, 10-2
Sesión 2
Resultados y análisis de información
Registrar la información de la muestra en la sección de resultados.
Graficar la información usando papel para graficar o un programa para graficar como
Excel. La información puede ser graficada en una gráfica semi log con el número de
células sobrevivientes (UFC/mL) en el eje logarítmico y tiempo en el eje x. Esto es
conocido como curva de destrucción térmica (CDT). Opcionalmente, el número de
células (UFC/mL) puede convertirse al log del número de células (log UFC/mL) y puede
ser graficado contra el tiempo.
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Volumen (mL)
Dilución
Dilución total
Dilución inoculada
Figura 1. Esquema de dilución para CDT de bacterias. Las diluciones para punto de
tiempo están dadas en el cuadro 1.
Calcular el valor D de la pendiente. El valor D está definido como la cantidad de tiempo

necesario para reducir la población bacteriana en 1 log (reducción del 90%) o el
recíproco de la pendiente de la curva de destrucción térmica. El cálculo de los valores D
asume una destrucción de primer orden. Cada grupo debe registrar sus valores D para
su temperatura y dar una copia de sus pendientes de las CDT para ser distribuidas en la
clase. Usar los valores D para calcular los valores z para cada medio.
4. Graficar los valores D vs temperatura de calentamiento en una segunda hoja de papel
semi-log, esto se conoce como la curva de tiempo de muerte térmica (CTMT). El valor z
es el cambio en la temperatura requerida para la curva de destrucción térmica para
cruzar un ciclo log o el recíproco de la pendiente de la CDT.
Resultados
Muestra
Tiempo (min) Dilución inoculada y cuenta Sobrevivencia calculada
UFC/mL
0
22
10
20
30
40
50
60
Valores calculados de D y de z
Temperatura
540C 580C 620C
valor D
valor z
7. Cuestionario
1. ¿Qué tipo de errores experimentales pueden estar asociados con este tipo de
experimentos? ¿Qué podrías hacer de manera diferente para eliminar esos errores?
2. ¿Por qué un tubo sellado que esta completamente sumergido en el baño de agua
daría resultados más exactos que un tubo de ensaye?
3. ¿Fueron tus curvas de destrucción térmica líneas rectas? Asumiendo que la no
linealidad de tus curvas no se debió a un error experimental, qué podría haber causado
esta variación?
4. Si tu quieres repetir este experimento y ver los niveles de células dañadas, cómo
harías el experimento? ¿Necesitarías ajustar las diluciones que inoculas? ¿Porqué o
porqué no?
5. Usando los valores D de la curva de destrucción térmica, ¿cuánto tiempo tendrías
que calentar tu TSA para asegurar una destrucción 3D?, y una destrucción 5 D? ¿qué pasa
sí el pH de tu medio fuera 4? ¿esperarías ver diferencias? ¿por qué? ¿por qué no?
6. Mucha gente crítica el concepto 12D porque es una pura extrapolación. ¿Por qué
sería imposible confirmar experimentalmente la letalidad de 12D?
8. Bibliografía
McLandsborough, L. 2005. FoodMicrobiologyLaboratory. CRC Press. U.S.A.
9. Formato y Especificación del Reporte de Práctica

a) Introducción
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b) Objetivo
c) Desarrollo de la actividad práctica
d) Resultados
e) Discusión
f) Cuestionario
g) Bibliografía
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1. Identificación
Evaluación de la Higiene y Sanidad en el

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
Procesamiento de Alimentos
No. DE PRÁCTICA: 2 No. DE SESIONES: 11
No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO:
2. Introducción
Cada año ocurren miles de casos de infecciones, intoxicaciones o toxiinfecciones,

transmitidas por los alimentos, estos problemas de salud también causan pérdidas
económicas, esto sucede debido a que hay volúmenes considerables de productos
alimenticios que llegan al consumidor contaminados a causa de un manejo deficiente. El
saneamiento de los alimentos significa eliminar o controlar en forma efectiva los
microorganismos presentes en ellos y en todo aquello con lo que entren en contacto. La
presencia numerosa de bacterias indica que algo no se hizo bien al prepararlos, que se
manipularon deficientemente1.Sin embargo, el manejo de la higiene no solo depende de la
legislación al respecto o del equipo utilizado; el papel que desempeñan quienes preparan y
sirven alimentos es determinante. La inocuidad de los alimentos, es producto de muchas
acciones directas e indirectas, dentro de las cuales los aspectos relativos al manejo higiénico,
así como el monitoreo a través del muestreo y análisis tanto de superficies vivas e inertes
como del ambiente, son de suma importancia.
La tendencia actual en la industria de los alimentos, es implementar planes y programas de

análisis de riesgos y puntos críticos de control (siglas en inglés HACCP), y es requisito
entrenar a los manipulares de alimentos en buenas prácticas de limpieza e higiene, e instruir
un sistema de monitoreo para asegurarse de que se están siguiendo las instrucciones para
reducir el riesgo de contaminación.El HACCP es un enfoque moderno que pretende eliminar
de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su consumo. Por lo tanto es de suma
importancia el conocer metodologías analíticas adecuadas para efectuar (o bien solicitar a
laboratorios de apoyo) el análisis de superficies inertes, vivas y medio ambiente y, con base
en los resultados analíticos, conocer las condiciones de operación reales que prevalecen2.
25
Analizar muestras de agua y alimentospara cada patógeno es demasiado caro y se requiere

mucho tiempo, por ello el análisis microbiano utiliza “organismos indicadores”. Los
organismos indicadores generalmente están presentes en mayor cantidad que los patógenos
y son más fáciles de detectar. Además, los organismos indicadores deben tener
características de crecimiento y sobrevivencia que sean similares a las de los patógenos.
Los organismos más comúnmente usados como indicadores son los coliformes, los cuales
comprenden un grupo más o menos definido de organismos Gram negativos que son
miembros de la familia Enterobacteriaceae, la mayoría de los cuales se encuentran en los
intestinos de animales de sangre caliente. Debido a que muchos de los patógenos
transmitidos por los alimentos son también miembros de la familia Enterobacteriaceae y se
desechan a través del tracto intestinal, la presencia de altas cantidades de coliformes puede
ser usada para predecir patógenos intestinales. Altos niveles de coliformes también pueden
indicar la ausencia de sanidad.
Los géneros incluidos en el término coliforme abarca al menos cuatro: Escherichia,

Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter. La definición de coliformes es una definición de
laboratorio basada en la tinción de Gram y reacciones metabólicas, éstas bacterias son:
Gram negativos, no formadores de esporas, aeróbicos o bacilos anaeróbicos facultativos que
fermentan lactosa, forman ácido y gas en las primeras 48 horas a 35oC.1 E. colies un miembro
del grupo coliforme. Cuando se enumeran coliformes, E. coli está entre la población mixta
detectada. Sin embargo, algunos medios selectivos o diferenciales pueden ser usados para
evaluar niveles independientes de E. coli desde una población mixta de coliformes. Las
cuentas de E. coli son más específicas que las cuentas de coliformes en las que hay sólo
una especie detectada. También, debido a que una pequeña población de serotipos de E.
coli pueden ser patógenos, algunos investigadores creen que la presencia de ésta
bacteriapuede tener una correlación más exacta a la presencia de patógenos que los
coliformes.
Medios bacteriológicos usados en estos análisis

1. Caldo triptosalauril sulfato (LST) con MUG: este medio contiene triptosa (fuente de
nitrógeno), lactosa (carbohidrato), búfer de fosfatos, sal (NaCl), lauril sulfato y MUG.
Agente selectivo: lauril sulfato de sodio, el cual inhibe el crecimiento de bacterias Gram
positivas y formadoras de esporas.
Agentes diferenciales: (a) producción de gas a partir de lactosa (tubo Durham) y (b)
subproducto fluorescente debido al rompimiento del MUG por E. coli, la cual produce la
enzima β-D-glucuronidasa.
2. Caldo bilis verde brillante (BGB): Este medio contiene peptona (fuente de nitrógeno),
lactosa (carbohidrato), bilis de buey y verde brillante.
26
Agentes selectivos: verde brillante y bilis de buey, ambos inhiben el crecimiento de

organismos Gram +.
Agentes diferenciales: (a) producción de gas (tubo de Durham) y producción de ácido, el
verde brillante se torna amarillo alrededor de pH 46.
3. 3M PetrifilmE. coli/coliforme. Este medio es una modificación del agar bilis rojo violeta
(VRBA*) y la mayoría probablemente contiene extracto de levadura, peptona, sales biliares,
lactosa, cloruro de sodio, rojo neutro y cristal violeta.
Agentes selectivos: sales biliares y cristal violeta, inhiben el crecimiento de organismos Gram
+.
Agentes diferenciales: (a) los organismos positivos a lactosa tiene colonias rojo púrpura.
(b) los organismos negativos a lactosa dan colonias de claro a rosa. El sustrato de β-D-
glucuronidasa cambia de incoloro a un precipitado azul cuando se fragmenta.
Salmonella es un miembro de la familia Enterobacteriaceaey siempre es considerado un

patógeno cuando es aislado de productos alimenticios o de humanos. La enfermedad
causada por Salmonella es llamada genéricamente salmonelosis y puede incluir desde
diarrea hasta septicemia. La infección salmonelosis que provoca diarrea bacteriana es
generalmente transmitida por los alimentos, comúnmente llega a los humanos a través de
huevos contaminados o productos avícolas mal cocinados. Las aves albergan muchas
especies de Salmonella en sus tractos gastrointestinales, lo cual puede resultar en
contaminación, sí no son manejadas adecuadamente. S. typhi, la causa de la fiebre tifoidea,
difiere de la mayoría de Salmonellaspp. en que su reservorio es humano más que animal. El
organismo es diseminado de persona a persona vía la ruta oral-fecal.
La taxonomía del género Salmonella es compleja y está basada en sus propiedades
bioquímicas y serológicas. En esta práctica no tendremos tiempo para clasificar a Salmonella
serológicamente. Salmonella entérica, la cual se divide en cinco subespecies, contiene a la
mayoría de los patógenos humanos y comprende más de 2000 serotipos, basados en sus
propiedades serológicas. Los únicos componentes del serotipo son los antígenos de la
proteína flagelar (H), antígenos de los polisacáridos de la pared celular (O) y el antígeno del
polisacárido capsular (Vi).
Los métodos para el aislamiento e identificación de Salmonella, como se resumen en el
Manual Bacteriológico Analítico (MBA) publicado por la Administración de Drogas y
Alimentos (FDA) de E.U.A., consta de cinco pasos: pre-enriquecimiento, enriquecimiento
selectivo, cultivo selectivo, pruebas metabólicas y serología3. Estas se resumen en la Fig. 1.
Nosotros haremos los primeros cuatro pasos de este proceso usando diferentes muestras y
diferentes técnicas de preparación la muestra. En los pasos de las pruebas metabólicas, hay
más de 20 pruebas posibles diferentes, pero nosotros realizaremos una pequeña serie de
pruebas metabólicas que incluyen las pruebas de agar hierro triple azúcar, agar hierro lisina
27
y el IMViC. La serie IMViC consta de las pruebas indol, rojo metilo, Voges–Proskauer y
citrato.
Medios bacteriológicos usados en esta práctica

Para mayor información consultar el Manual Bacteriológico Analítico (MBA) publicado por la
Administración de Drogas y Alimentos.
Enriquecimiento no selectivo
1. Caldo soya tríptica (TSB): Este es un medio nutriente de propósitos generales usado
para cultivar microorganismos muy exigentes y no exigentes. El medio es un hidrolizado de
caseína-frijol de soya.
2. Caldo lactosa (LB): Este medio es a menudo usado como un caldo de pre-
enriquecimiento para bacterias coliformes y otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Caldos de enriquecimiento selectivo
3. Caldo cistina selenito (SC): Este es un caldo de enriquecimiento selectivo,
recomendado para usarse en la detección e identificación de Salmonella en productos
lácteos y otros alimentos. El selenito de sodio es usado como el agente selectivo contra
coliformes. La cistina es añadida para facilitar el crecimiento de Salmonella.
4. Caldo tetrationato (TT): Este es un caldo de enriquecimiento selectivo para detectar
Salmonella en alimentos. Este medio contiene peptona proteosa (un hidrolizado de tejidos
animales), sales biliares, tiosulfato de sodio y carbonato de calcio. Durante la preparación
del medio, una solución de yodo es añadida. El yodo reacciona con el tiosulfato, llevando a
la formación de TT. El TT inhibe el crecimiento de las bacterias coliformes y permite el
crecimiento de Salmonella. Las sales biliares reducen el crecimiento de organismos Gram-
positivos. Este medio también tiene carbonato de calcio como búfer y los nutrientes
generales son suministrados por la peptona proteasa.
28
Clase 4 Elegir dos colonias características de Salmonella* de cada placa e inocular un trozo
de cada colonia en TSI y LIA. *HE: colonia azul-verdoso con o sin centro negro. XLD: colonias
rosas con o sin centros negros. BS: colonias cafés, grises o negras, algunas veces con brillo
metálico. Clase 5 Observar los cultivo de TSI y LIA. Inocular trozos de TSI+ en caldo triptona,
caldo MRVP y agar citrato Simmons.Clase 6 Realizar las pruebas de indol, rojo de metilo y
VogesProskauer.
Figura 1. Diagrama de flujo del aislamiento tradicional de Salmonellaspp. de
alimentos
Medios selectivos/diferenciales
5. Agar sulfito bismuto (BS): este es un medio selectivo para el aislamiento de
Salmonella typhiy otras Salmonellaspp. BS y verde brillante son usados como agentes
selectivos contra el crecimiento de bacterias Gram positivas, mientras que permiten crecer a
Salmonella. El bifosfato de sodio es añadido para amortiguar el medio; la dextrosa es la
fuente de energía y el extracto de carne y la peptona suministran nutrientes generales. El
sulfito ferroso es adicionado para la producción de sulfuro de hidrógeno. Las colonias de
Salmonella son generalmente negras o gris verdoso, con o sin brillo metálico.
6. Agar desoxicolato xilosa (XLD): Este es un medio de inoculación selectivo diferencial
diseñado para el aislamiento directo de Shigella y Providencia de bancos de muestras. El
desoxicolato de sodio es usado para inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas, y
esto inhibe el amontonamiento de Proteus. Salmonella es diferenciada de otras bacterias
usando tres reacciones: fermentación de xilosa, descarboxilación de lisina, producción de
29
condiciones alcalinas (colonia roja). Este ambiente alcalino permite la producción de sulfuro
de hidrógeno, provocando los centros negros en las colonias de Salmonella mientras que
otras colonias de organismos entéricos permanecen amarillo ácido o rojo sin el centro negro.
7. Agar entérico Hektoen (HE): este es un medio diferencial y selectivo usado para aislar
y diferenciar géneros de Salmonella y Shigella de otros organismos entéricos Gram-
negativos. Este medio tiene elevados contenidos de carbohidrato y peptona para
contrarrestar los efectos inhibitorios de las sales biliares e indicadores. Esta combinación
solo inhibe ligeramente el crecimiento de Salmonella y Shigella, mientras que inhibe otros
organismos entéricos. Los organismos fermentadores lactosa positivos son diferenciados de
las colonias lactosa negativos debido a la presencia de dos indicadores, azul de bromotimol
y fucsina ácida. Finalmente la combinación de tiosulfato y citrato de amonio provocan que
las colonias productoras de sulfuro de hidrógeno se vuelvan negras. Las colonias lactosa
positivas aparecen como colonias de amarillo a anaranjado. Las bacterias que producen
sulfuro de hidrógeno aparecen como colonias con centros negros.
Pruebas metabólicas.
8. Agar hierro triple azúcar (TSI): Este medio es recomendado para la identificación de
bacillus estéricos Gram-negativos basándose en la fermentación de glucosa, lactosa y
sacarosa, además de la producción de sulfuro de hidrógeno. La demostración de las
propiedades fermentativas del organismo depende de las proporciones de los carbohidratos
(10 partes de lactosa: 10 partes de sacarosa: 1 parte de glucosa), así como de sus
concentraciones relativas a la concentración de peptona. El rojo fenol sirve como un
indicador ácido, y el sulfato ferroso es añadido para la formación de sulfuro de hidrógeno.
Después de la esterilización, el medio es solidificado de forma tal que se forme una
inclinación en la parte superior. Cuando la glucosa es fermentada todo el medio se vuelve
amarillo (ácido) en 8 a 12 h. El fondo permanecerá ácido después de 18 a 24 h debido a la
presencia de ácidos orgánicos resultantes de las condiciones anaeróbicas. Sin embargo, la
superficie volverá al color alcalino (rojo) debido a la oxidación de peptonas bajo condiciones
aerobias, con la formación de dióxido de carbono, agua y aminas. Cuando la lactosa o
sacarosa son fermentadas además de la glucosa, mayores cantidades de productos ácidos
neutralizan los productos alcalinos en la superficie, provocando que la superficie permanezca
amarilla. La formación de dióxido de carbono e hidrógeno es evidente por las grietas o
burbujas en el agar. La producción de sulfuro de hidrógeno requiere un ambiente ácido y se
manifiesta por un oscurecimiento del fondo. La reacción se observa entre las 18 a 24h de
incubación, debido a los parámetros de la formulación del medio no será notoria después
de ese tiempo.
Superficie y fondo alcalino (A/A)= no fermentador
Superficie alcalina y fondo ácido (A/AC)= fermentación de glucosa únicamente
Superficie y fondo ácidos (AC/AC)= fermentador de glucosa, sacarosa o lactosa
30
A/AC/gas + H2S = fermentación de glucosa con producción de gas y producción de H2S

9. Agar hierro lisina (LIA): Este medio esta diseñado para determinar si una bacteria
descarboxila o desamina lisina y forma sulfuro de hidrógeno. En un ambiente ácido, si un
organismo produce una coenzima fosfato piridoxal y una enzima descarboxilasa, los
aminoácidos son descarboxilados a la amina correspondiente. El medio contiene peptonas,
glucosa, citrato de amonio férrico y tiosulfato de sodio, además de lisina y esto se hace en
agar inclinado. Cuando la glucosa es fermentada, el fondo se torna de color amarillo. Sí la
lisina es descarboxilada, es producido un compuesto llamado cadaverina, típica de
Salmonella. La cadaverina neutraliza los ácidos orgánicos formados de la fermentación de
la glucosa y el medio se vuelve color púrpura. El género principal de la familia
Enterobacteriaceae puede llevar a cabo una desaminación oxidativa de lisina produciendo
un compuesto que en presencia de citrato de amonio férrico y una coezima
(flavinmononucleótido) forma un bode de color rojo.
Superficie alcalina y fondo ácido (A/AC)= fermentación de glucosa
Superficie alcalina y fondo alcalino (A/A)= descarboxilación de lisina o sin fermentación
Superficie roja y fondo ácido (R/AC)= desaminación de lisina y fermentación de glucosa
10. Caldo triptona: Este medio es un hidrolizado pancreático de caseína y es usado en
esta práctica debido a su alto contenido de triptófano y la diferenciación de cultivos se da por
la producción o no de indol.
11. Caldo rojo de metilo VogesProskauer (MR-VP): Este es medio simple compuesto de
glucosa, peptona y algunas sales. Este es usado para discriminar entre organismos que usan
una ruta metabólica ácido mixta (ácidos fuertes), detectada por la prueba del rojo de metilo,
o una ruta butilen glicol generando acetoína, detectada en el ensayo de Voges-Proskauer.
12. Agar citrato Simmons: Este medio es usado para determinar si un organismo puede
usar citrato de sodio como única fuente de carbono, lo cual puede significar que es un medio
diferencial. Si el citrato de sodio es utilizado, se generan productos alcalinos, incluyendo
NaOH. El indicador usado es el azul de bromotimol, el cual es azul a pH alcalino.
Otro patógeno, S. aureus se encuentra en la piel y el área nasofaríngea de los animales y

humanos. Con frecuencia llega a los alimentos a través de los manipuladores de alimentos,
de la piel de los animales o de superficies sucias de preparación de alimentos. S. aureus no
puede crecer a temperaturas de refrigeración y es un pobre competidor de la microflora de
los alimentos. Usualmente crece cuando hay un abuso en la temperatura. El abuso en la
temperatura ocurre cuando el alimento se mantiene en la zona de riesgo, 4.4 a 60oC durante
prolongados periodos de tiempo. La temperatura óptima para el crecimiento de S. aureus es
de 18 a 40oC. Debido a que esta bacteria crece escasamente en presencia de otra microflora
de los alimentos, estos organismos tiende a crecer mejor en alimentos procesados o
cocinados. Además, S. aureus puede crecer a aw más bajas comparadas a la mayoría de las
otras bacterias (por debajo de aw 0.85); puede crecer bajo una reducida aw o en los alimentos
31
salados que inhibirían el crecimiento de la mayoría de los patógenos tanto como la

temperatura permita el crecimiento. Metabólicamente, S.aureus puede utilizar manitol, lo cual
no sucede con otras especies estafilococales, tales como S. epidermidis. La producción de
la enzima coagulasa por la mayoría de las cepas de S. aureus puede usarse para diferenciar
esta especie de otras.
Algunas cepas de S. aureus tiene la capacidad de producir enterotóxinas estafilocales (ES)

mientras crece en los alimentos. Los síntomas principales de una intoxicación ES son vómito
y diarrea (sin fiebre) después de 4 a 12 h del consumo. Los alimentos comunmente asociados
con contaminación estafilococales son los alimentos de salchichonería, especialmente
jamón; ensaladas de salchichonería (jamón, pollo, papas) y bollos de crema; todos los
alimentos en la preparación involucran la manipulación humana. Además puede haber un
abuso de temperatura, tanto antes como después de la venta al consumidor. Grandes
cantidades de S. aureus enterotoxicogénicas (mayores a 106 UFC/g) son necesarias para
producir suficiente enterotóxina estafilococal para causar este tipo intoxicación alimentaria.
Aunque es deseable no tenerla en los alimentos, pequeñas cantidades están presentes a
menudo (menos de 103 UFC/g). Debido a que grandes cantidades son requeridas para
producir cantidades detectables de ES, el conteo se hace en productos alimenticios como
una medida indicadora del abuso de temperatura y el potencial de S. aureus para causar
enfermedades4.
Es importante recordar que ES es más estable y resiste mayor temperatura que las células
de S. aureus. Por lo que bajos niveles de S. aureus no siempre garantizan que el producto
tenga ES. Posiblemente había altos niveles de crecimiento de S. aureus a un tiempo dado,
y el subsecuente procesamiento eliminó las células viables, pero no eliminó la actividad
biológica de las enterotóxinas. Por esta razón, la detección directa de ES usando pruebas
inmunológicas o la detección de otros metabolitos (termonucleasa estafilococal
termoestable) pueden ser usados como un indicador de que altos niveles de S. aureus
estaban presentes en el alimento5.
Medios usados en esta práctica

Medio Baird Parker: este es el medio selectivo/diferencial preferido para la detección de S.
aureus2. Este medio contiene triptona y extracto de carne como nutrientes básicos, con
glicina y piruvato de sodio para mejorar el crecimiento. Los agentes selectivos son cloruro de
litio y telurito de potasio, los cuales inhiben la mayoría de los organismos Gram negativos y
lentos para inhibir el crecimiento de la mayoría de los otros organismos Gram positivos. La
yema de huevo se agrega para la detección de lecitinasa producida por la gran mayoría de
cepas de S. aureus. Los típicos estafilocos coagulasa positivos tienen la capacidad de reducir
32
el telurito de potasio produciendo colonias negras y producen lecitinasa, la cual causa una
aclaramiento visible alrededor de las colonias.
Agar sal manitol. Este es un medio selectivo alternativo para estafilococus. Este medio
contiene peptona,extracto de carne, manitol, NaCl, agar y rojo fenol. La alta concentración
de sal (7.5%) inhibel el crecimiento de la mayoría de los otros organismos y el manitol es el
único carbohidrato fermentable. En este medio S. aureus aparece como una colonia amarilla,
mientras que S. epidermidis no patogénica manitol negativa aparecerá como una colonia
roja.
Caldo infusión cerebro corazón. Este medio se hace de infusiones de cerebros de ternera,
corazón de res, peptona, glucosa y NaCl. Este medio es altamente nutritivo y es usado para
producir un alto crecimiento de organismos exigentes.
Plasma coagulasa con ácido etilendiaminotetracético (EDTA). Este es comprado en forma
liofilizada. El EDTA es agregado como un antigulante. El plasma reconstituido es usado para
determinar si una especie estafilococal tiene la capacidad para producir la enzima coagulasa,
que causará coagulación del plasma de conejo.
3. Objetivo General
Evaluar la calidad microbiológica de alimentos y expendios de alimentos, llevando a cabo

análisis microbiológicos de superficies inertes, vivas y medio ambiente.
4. Objetivos Específicos
Aprender a aislar e identificar Salmonellaspp en alimentos, además de usar el

enriquecimiento selectivo para aislar patógenos.
Aprender a realizar el aislamiento y conteo de Staphylococcusaureus de alimentos.
5. Reactivos/Insumos, Materiales/Utensilios y Equipos/Instrumentos

a) Reactivos/Insumos
CANTIDAD UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
12 g g. Caldo triptonalauril sulfato +
MUG
25 g g. Caldo soya tríptica (TSB)
20 g g. Caldo lactosa (LB)
18 g g. Caldo cistina selenito (SC)
25 g g. Caldo tetrationato (TT)
18 g g. Agar sulfito bismuto (BS)
33
22 g g. Agar desoxicolato xilosa (XLD)

17 g g. Agar entérico Hektoen (HE)
23 g g. Agar hierro triple azúcar (TSI)
25 g g. Agar hierro lisina (LIA)
12 g g. Caldo triptona
15 g g. Caldo rojo de metilo Voges-
Proskauer (MR-VP)
18 g g. Agar citrato Simmons
2 ml mL. Reactivo de Kovac
2 ml mL. Naftol
1g g. KOH
2 ml mL. Rojo de metilo
12 g g. Caldo bilis verde brillante Solución
15 g g. Agar sal manitol
17 g g. Agar Baird-Parker
5 ml mL. Plasma de coagulasa con
EDTA
2 g. Peptona
3 Pieza Plantillas de aluminio de 12 cm
de lado
3 Pieza Esponjas de poliuretano o de de dimensiones Bolsas
celulosa apropiadas a la Whirlpack
superficie que se va a con
muestrear esponja
(comercial
es
estériles).
b) Materiales/Utensilios
CANTIDAD UNIDAD D ESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
1 Pieza Vasos de precipitados de 500ml
1 Pieza Pizeta de 500 ml
20 Pieza Tubos de ensaye de 10X70 mm
15 Pieza Tubos de ensaye de 120X 20 mm
1 Pieza Pipeta de 10 ml
15 Pieza Campanas de Durham
1 Pieza Micropipeta de 1 ml
15 Pieza Cajas Petri
2 Pieza Asas de platino
5 Pieza Frasco para cultivo de 250 ml
34
1 Pieza Varilla de vidrio

1 Pieza Espátula
1 Pieza Vidrio de reloj
2 Pieza Pinzas de disección Estériles
3 Pieza Puntas para micropipeta De 1 ml
3 Pieza Hisopos de mango de madera 12 cm de largo
3 Pieza Plantillas de aluminio de 12 cm
de lado
3 Pieza Bolsas de plástico estériles de la dimensión
necesaria.
3 Pieza Pliegos de papel manila para envolver los
materiales para
esterilizar
c) Equipos/Instrumentos
CANTIDAD UNIDAD D ESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
1 Equipo Balanza analítica
1 Equipo Estufa de incubación
1 Equipo Campana de flujo laminar
6. Desarrollo de la Actividad Práctica
SELECCIÓN DEL MÉTODO DE MUESTREO
La selección de método de muestreo debe estar en función de las características de la

superficie a muestrear Se seleccionan aquellas áreas que están o tendrán contacto directo
con los alimentos que no serán sometidos a un proceso térmico u otro que disminuya la carga
microbiana6.
MÉTODO DE SUPERFICIES A MUESTREAR

MUESTREO
Método del hisopo Se utiliza para superficies inertes regulares e irregulares, tales
como tabla de picar, bandejas, mesas de trabajo, utensilios,
cuchillas de equipos, cortadora de embutidos, cortadora de pan de
molde, fajas transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos, paredes
y otros
Método de la Este método se utiliza preferentemente para superficies de mayor
esponja área.
Método del Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeños
35
enjuague o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas,

bolsas de plástico, etc.
Sesión 1
ANÁLISIS DE SUPERFICIES INERTES

Método del hisopo
Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en
frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril, humedecido con la
solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área determinada para finalmente
suspenderla en el diluyente.
Muestreo de superficies
Colocar la plantilla o bien delimitar un área aproximada de 5x5 cm ó 10x10 cm sobre la
superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo asépticamente. Si la superficie está seca,
humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar contra la pared del frasco o tubo con
un movimiento de rotación para quitar el exceso de líquido, en caso contrario no es necesario
hacer esto. Con el hisopo inclinado, frotar la superficie delimitada por la plantilla en 3 sentidos
diferentes (horizontal, vertical y oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte
que estuvo en contacto con los dedos. Este método también puede utilizarse para buscar
patógenos, substituyendo la solución diluyente por el caldo de cultivo adecuado.
Muestreo de utensilios de comedor

Utilizar tubos con l0 ml, tomar un hisopo, mojarlo en la solución diluyente y eliminar el exceso
de líquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el hisopo frotando la
superficie que tiene contacto con el alimento o con la boca. Regresar el hisopo al tubo y romper
la parte que estuvo en contacto con los dedos. Una vez tomada la muestra, se procede a hacer
el recuento, por el método más adecuado, generalmente cuenta en placa, con los medios de
cultivo recomendados para este tipo de análisis.
Método de la esponja
Esta técnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en áreas
grandes. Se utilizan esponjas estériles de espuma de poliuretano generalmente de 13 x 7.5 x
4 cm (o de dimensiones requeridas) y bolsas de plástico transparentes estériles de las
dimensiones necesarias. Consiste en pasar la esponja sobre toda la superficie del equipo o
utensilio que se va a muestrear pudiendo estimar el contenido microbiano de toda la superficie
y no únicamente de dimensiones limitadas. La bolsa de plástico se invierte a modo de guante
sobre la mano del muestreado, haciendo que la parte interna pase a ser la externa y con la
36
mano así protegida, se toma una esponja retirándola de la envoltura de papel manila.
Se humedece la esponja con un poco de la solución diluyente estéril y se frota completamente

toda la superficie que se va a muestrear. Terminando el muestreo, se vuelve la bolsa a su
posición original quedando la esponja en su interior y se adiciona el resto del volumen de la
solución diluyente a la bolsa que plástico que contiene la esponja y se homogeniza
exprimiendo repetidamente la esponja. Esta suspensión será considerada como la muestra
directa y a partir de ella se harán las diluciones necesarias. Las superficies y utensilios a
muestrear pueden ser de forma y tamaño muy diverso, tales como, mesas, tablas de picar
(tratando de llegar a las hendiduras y esquinas), utensilios de comedor (tomar muestra de la
superficie del utensilio con excepción del mango, prestando atención a la parte interna como
es el caso de los tenedores entre diente y diente), vasos, platos (tomar la superficie expuesta
a los alimentos, incluyendo el borde que está en contacto con los labios del usuario), manos
(la palma de la mano y parte interna y externa de cada uno de los dedos), etc.
Método de enjuague total
Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son cucharas,
tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas y
bolsas de plástico, etc. Dependiendo de la muestra el método consiste en realizar un enjuague
(botellas, frascos, similares) o inmersión (manos, objetos pequeños) en una solución
diluyentes
Procedimiento
Para manos
1. Vaciar el diluyente del frasco (100 ml) en una bolsa de polipropileno estéril.
2. Introducir las manos a muestrear hasta la altura de la muñeca
3. Solicitar al manipular que realice un frotado de los dedos y particularmente alrededor de
las uñas y la palma de la mano, adicionalmente el muestreador deberá realizar la misma
operación a través de las paredes de la bolsa, durante 1 min aprox.
4. Luego de retirar las manos se regresa el líquido al frasco o se deja en la bolsa con la
protección adecuada.
Para recipientes (frascos, jarras u otros)

1. Vaciar en el recipiente a muestrear una parte de la solución estéril (frasco con 100 ml) y
agitar vigorosamente.
2. Regresar la solución a su frasco original.
3. Cerrar herméticamente el frasco para su traslado.
Para objetos pequeños (piezas de equipo, otros)

1. Se introduce individualmente cada objeto en el frasco obolsa con la solución estéril y
37
agitar vigorosamente.
2. Luego con una pinza estéril, retirar el objeto pequeño del frasco o bolsa.
3. Si se muestrea más de un objeto pequeño de igual naturaleza, se debe considerar esto
en el cálculo de los resultados.
Selección de pruebas
Superficies inertes Superficies vivas
Indicadores de higiene Coliformes totales Coliformes totales
Mesófilos aerobios Mesófilos aerobios
Patógenos Salmonellasp Staphylococcusaureus,
Salmonellasp
Límites permisibles
Microorganismo Superficie inerte Superficie inerte Superficie viva
regular irregular
Coliformes < 1 UFC/cm2 < 200 UFC/ utensilio <10 UFC/ manos
Mesofílicos aerobios < 400 UFC/cm2 < 400 UFC/utensilio < 3000
UFC/manos
Salmonella spp Ausencia/100 cm 2
Ausencia/utensilio Ausencia/manos
Staphylococcus NA NA <100 UFC/
aureus manos
Fuente: Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Prácticas de Higiene y Sanidad en la
preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.
Sesión 2
Monitoreo del medio ambiente
Procedimiento
Técnica de sedimentación en placa. Las placas con los medios de cultivo para monitoreo de
los 3 grupos de microorganismos indicadores, se exponen al medio ambiente seleccionado,
retirando la tapa de cada placa y colocando ésta boca abajo. Se sugiere colocar las placas
con los medios de cultivo lo más cercanas entre sí, para que la calidad del medio ambiente
monitoreado sea homogénea. Después de 15 minutos de exposición, las placas se tapan e
incuban a 35 + 2 oC/48 + 2 h. (bacterias) o 26 + 2 oC/ 3-5 días (hongos y levaduras). Considerar
que el volumen de aire monitoreado tras exponer durante 15 minutos las placas con los medios
de cultivo, equivale a 1 m3.
Efectuar el cómputo por placa de medio de cultivo utilizado para cada grupo microbiano.
Reportar el cómputo de cada grupo microbiano en UFC/m3. Opcional: después de registrar
características de desarrollo y morfología colonial, hacer un frotis (ver al mismo tiempo,
consistencia de colonia, color, bordes, elevación, tamaño). Teñir con Gram y cuando sea
necesario con otro colorante. Observar al microscopio.
38
NOTA: El medio de cultivo de donde se aislan principalmente los microorganismos

ambientales, es agar cuenta estándar tripticaseína. Se utiliza agar Sabouraud o agar papa
dextrosa, para la investigación específica de hongos y levaduras, VRBA, para la investigación
del grupo coliforme y agares selectivos y/o diferenciales para patógenos.
Límite permisible en medio ambiente

Prueba Límite permitido
Mesofílicos aerobios ≤ 15 UFC/m3
Coliformes totales ausencia
Hongos y levaduras ≤ 15 UFC/m3
Fuente: Standard Methodsfortheexamination of DairyProducts
Coliformes
Inoculación sobre 3M PetrifilmColiformes
Procedimiento
1. Usar la serie de diluciones de 10-1 hasta 10-5.
2. Marcar cada 3M Petrifilm con la dilución inoculada. Debido a que 1 ml de cada dilución
de la serie será usada, la dilución final sería la misma que la dilución del tubo (v. gr. 1 ml x 10-
2
es igual a la dilución final 10-2).
3. Colocar el 3M Petrifilm sobre la mesa e inocular una dilución a la vez.
4. Levantar la tapa de la película y añadir 1 ml de la dilución al medio deshidratado.
5. Cerrar la película para evitar las burbujas de aire.
6. Usar una plantilla plástica (aplastar desde el borde) para presionar suavemente la
muestra para llenar el área (cuidar de no presionar demasiado fuerte para que la muestra no
escurra fuera del área del medio).
7. Incubar las placas a 35oC por 24 h (como sugiere el fabricante).
Resultados del 3M Petrifilm para coliformes

1. Los coliformes fermentarán lactosa (colonias rojas) y producirán gas (burbujas
atrapadas). Las colonias asociadas con espuma blanca no son contadas como coliformes.
Contar las colonias rojas y usar los resultados para calcular las UFC de coliformes/ml.
Identificación de Salmonella
Métodos
Nota: en esta práctica, se podrá aislar un severo patógeno humano. Por lo tanto cada paso
deberá ser tratado como si el patógeno estuviera presente. Como precaución, deberás usar
protección para ojos y guantes durante toda la práctica.
Sesión 3
39
Procedimiento
Procedimiento general para la preparación de muestras
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para
trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de pre-
enriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar
si es necesario durante un min. En caso superficies o utensilios, seguir el procedimiento de
toma de muestra. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril
de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la
tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es
necesario, a un pH 6.8 ± 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente
enroscando suavemente la tapa.
Incubar 24 ± 2 h a 35oC1. Para la preparación de muestras según el producto seguir las
especificaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM–114–SSA1–19947.
Sesión 4
Enriquecimiento selectivo
Nota: en esta práctica, podrás aislar un severo patógeno humano. Como precaución, deberás
usar protección para ojos y guantes durante toda la práctica después de la homogenización
inicial del producto en el caldo enriquecido.
Procedimiento
Suavemente mezclar los caldos enriquecidos y asépticamente transferir volúmenes de 1 ml a
dos tubos de 10 ml caldo SC y TT. Tendrás un total de cuatro tubos de enriquecimiento
selectivo (dos de cada medio) de cada pre-enriquecimiento. Incubar a 37oC por 24 h.
Sesión 5
Inoculación selectiva
Procedimiento
1. Cuidadosamente mezclar los enriquecidos selectivos usando un mezclador de vórtice.
Sí los tubos tienen cierres de Morton (se ve similar a una campana al revés), ser cuidadoso
no mezclar vigorosamente, para que la muestra no se derrame del tubo.
2. Usar una asa de inoculación para estriar en agar BS, agar XLD, y agar HE. Los tres
medios deber inoculados de cada tubo de enriquecimiento selectivo.
3. Incubar a 35oC por 24 h.
Nota: Hasta este momento, tendrías 12 placas generadas de una sola muestra de alimento. A
partir de aquí te organizarás para registrar tus posibles cultivos de Salmonella. Se proporciona
el cuadro 1 para registrar los resultados. Tú deberás desarrollar un esquema de identificación
y mantener una clave en tu bitácora.
40
Sesión 6
Observación de las placas e inoculación de los medios para el ensayo metabólico
1. Examinar las placas para detectar las colonias de Salmonella sospechosas. Se

proporcionarán ejemplos de colonias positivas, para la comparación.
a) HE: Las colonias típicas son de verde-azul a azul, con o sin centros negros. A menudo
las colonias de Salmonella casi completamente negras y brillosas.
b) BS: Las colonias típicas de Salmonellapueden aparecer cafés, grises o negras y
pueden algunas veces tener un brillo metálico. El medio de los alrededores empezará café y
se volverá negro, después del tiempo de incubación. Algunas cepas producen colonias verdes
con poco o ningún oscurecimiento a su alrededor.
c) XLS: Las colonias típicas serán rosas, con o sin centros negros. A menudo las colonias
de Salmonella casi completamente negras y brillosas.
2. Seleccionar dos colonias sospechosas de cada agar selectivo, registrar la morfología.
Inocular cada colonia en agar TSI y LIA. Como control negativo, incubar un tubo de medio sin
inocular. Esto ayudará a determinar si ocurre algún cambio. No desechar las placas.
Envolverlas en plástico y guardarlas en case de análisis futuros.
3. Inocular agar TSI inclinado, para esto tocar suavemente una colonia sospechosa con una
aguja de inoculación estéril luego hacer movimientos en zigzag y hacer clavar la aguja en el
fondo del agar.
4. Inocular en LIA clavando dos veces la aguja en el fondo del agar y luego hacer estriado
como se indicó para TSI.
5. Incubar os cultivos TSI y LIA a 37oC por 24 h.
Sesión 7 Pruebas metabólicas posteriores

Cuando las pruebas bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes,realizar
las pruebas que se describen a continuación:
1. Examinar los cultivos en TSI. Un cultivo de Salmonella típico produce un color alcalino
(rojo) y ácido en el fondo (amarillo), con o sin producción de H2S (ennegrecimiento del agar).
Registrar los resultados en el cuadro 1.
2. Examinar los cultivos en LIA, los cultivos de Salmonella típicos dan una reacción
alcalina (púrpura) en el fondo del tubo. Ser cuidadoso para considerar únicamente como
negativo un distintivo color amarillo en el fondo del tubo, reacción ácida, porque algunos
cultivos de Salmonella pueden producir una ligera decoloración en el fondo. La mayoría de los
cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. Registrar los resultados en el cuadro 1.
3. Con los tubos TSI positivos inocular los tubos de caldo triptona. Esto se hace usando
un asa de inoculación estéril. Incubar a 35oC por 24 h. Este tubo deber usado para llevar a
acabo la prueba del indol.
41
4. Inocular los tubos de caldo MR-VP con los cultivos positivos de TSI. Usar el mismo
procedimiento que para el punto 3 y este cultivo en tubo después será usado para las pruebas
rojo de metilo y VogesProskauer. Incubará 35oCpor 48 h.
5. Finalmente inocular agar inclinado citrato Simmons con colonias positivas de TSI
estriando el agar inclinado y clavando la aguja de inoculación en el fondo. Incubar a 35oCpor
46 h.
Sesión 8 Resultados de la prueba metabólica

Realizar las siguientes pruebas y registrar los resultados en el cuadro 1:
1. Prueba del indol: Añadir de tres a cinco gotas de reactivo de Kovac a los tubos de caldo
triptona, usando pipetas Pasteur. La mayoría de los cultivos de Salmonella dan una prueba
negativa (sin color rojo en la superficie del caldo).
2. Prueba de Voges- Proskauer (VP): transferir 1 ml de cultivo del caldo MR-VP a un tubo
de ensaye estéril, agregar 0.6 ml de naftol y agitar bien. Agregar 0.2 ml de solución de KOH al
40% y agitar. Leer los resultados después de 4 h, el desarrollo de un color rosa a rojo rubí en
el caldo indica una prueba positiva. Los cultivos de Salmonella son típicamente VP negativos.
3. Prueba de rojo de metilo: transferir 5 ml de caldo MR-VP a un tubo estéril, y añadir 5 a
6 gotas de indicador rojo de metilo. Observar los resultados. Una prueba positiva es
confirmada por un color rojo en el tubo. Los cultivos de Salmonella son típicamente rojo de
metilo positivos.
4. Examen del agar citrato Simmons: un resultado positivo está indicado por un cambio
de color de verde a azul. La mayoría de los cultivos de Salmonella son citrato positivos. Los
resultados negativos son evidentes por el poco o nulo crecimiento y no hay cambio de color.
Detección de Staphylococcusaureus
Sesión 9 Preparación de la muestra
1. Usar una espátula estéril, pesar 10 g de muestra y colocarlo en una bolsa de stomacher
estéril.
2. Agregar 90 ml de solución salina estéril. Esta es la primera dilución 1/10.
3. Homogenizar en un agitador peristáltico (como el stomacher) por 2 min.
4. Para el caso de superficies vivas seguir las indicaciones de muestreo correspondientes
5. Preparar duplicados de placas estriadas en agar sal manitol o medio Baird-Parker
usando el esquema de dilución mostrado en la figura 1.
6. Incubar las placas por 24 h a 37oC.
42
Figura 1. Esquema de dilución sugerido para esta práctica.
Sesión 10. Resultados

1. Observar las placas. Contar las colonias amarillas en el agar sal manitol o las colonias
negras en el medio Baird Parker, calcular las presuntas UFC S. aureus/g.
2. Para la confirmación, tomar dos colonias representativas de las presuntas S. aureus.
Usar un asa flameada y transferir cada colonia a 2 ml de caldo infusión cerebro corazón (1
colonia/tubo de caldo). Incubar a 37oC durante 24 a 28 h.
Sesión 11. Prueba dela coagulasa para corfirmación de S. aureus

Procedimiento
1. Añadir 0.2 ml del cultivo de 24 a 28 h a 0.5 ml de plasma de coagulasa con EDTA en
tubos de 10x75 mm.
2. Incubar en un baño de agua a 37oC y examinar periodicamente para observar la
formación del coágulo. S. aureus deberá coagular el plasma en 4 h.
3. Cuando las colonias representativas son coagulasa positivas, la cuenta es confirmada
para S. aureus.
Posteriores pruebas de caracterización podrían incluir la utilización anaeróbica de glucosa y
manitol (S. aureus son usualmente positivas para ambas pruebas), sensibilidad a lisostafina y
producción de termonucleasa.
REPORTE DE LA PRÁCTICA:
Resultados
Cuenta de coliformes en 3M Petrifilm
43
Dilución en placa UFC/placa UFC/placa Promedio UCF/placa

10 0
10-1
10-2
10-3
UFC de coliformes/ml =
Cuenta de presuntos coliformes VRBA

10 -2
10-3
10-4
10-5
Presuntos UFC de Coliformes/placa =
Registro de resultados para Salmonella

Enriquecimiento Medios de Código TSI LIA Indol MR VP Citrato Identificación
selectivo inoculación de tu final
selectiva cepa
Cistina-selenito BS
(SC-1) XLS
HE
Cistina-selenito BS
(SC-2) XLS
HE
Caldo BS
tetrationato XLS
(TT1) HE
Caldo BS
tetrationato XLS
(TT2) HE
Reacciones bioquímicas de géneros selectos de Enterobacteriaceaea

Organismo TSIb LIAc H2Sd Gasd Indole MRf VPg Citratoh
(superficie/ (superficie/
fondo) fondo)
Citrobacter Ac/Ac A/Ac +/- + +/- + - +
44
E. coli Ac/Ac A/A - + + + - -

Edwardsiella A/Ac A/A +/- + + + - -
Enterobacter Ac/Ac A/Ac - + - - + +
Klebsiella Ac/Ac A/A - + - - + +
Morganella A/Ac R/Ac - + + + - -
Proteus Ac/Ac R/Ac +/- + +/- + - +/-
Providencia A/Ac R/Ac - - + + - +
Salmonella A/Ac A/A + + - + - +
Serratia Ac/Ac A/Ac - + - - + -
Shigella A/Ac A/Ac - - +/- + - -
a
claves básicas: + la mayoría de estos organismos en este género tienen esta característica;
- La mayoría de organismos en este género carecen de esta característica; está característica
varía por especies dentro de este género.
b
A= alcalino (rojo); Ac= ácido (amarillo o negro, ácido +H2S).
c
A= alcalino (púrpura indica que no hay fermentación o descarboxilación de lisina); Ac= ácido
(amarillo); R= reacción de desaminación (color cereza).
d
El sulfuro de hidrógeno (color negro) es producido del sulfato ferroso generado en un
ambiente ácido. El gas (CO2 e H2) está demostrado por las roturas o separaciones en el agar.
Ambas reacciones pueden ser observadas en TSI y LIA.
e
+= color rojo observado en la superficie del caldo cuando el reactivo de Kovac es adicionado
al caldo de cultivo de triptona; - = a un anillo incoloro.
f
Rojo de metilo. + = Un producto de reacción de color rojo en el tubo con indicador rojo de
metilo muestra un metabolismo ácido mixto en caldo de cultivo MR-VP; -= no hay cambio de
color.
g
Voges-Proskauer. += un color rosa a rojo rubí en el tubo al adicionar naftol y KOH que indica
la producción de acetoína; - = no hay cambio de color.
h
+ = cambio de color de verde a azul; - = no hay cambio de color (verde).
Fuente: Adaptado de Holt, et al., 1994. Bergey´s Manual of determinativebacteriology. 9th ed.
Williams and Wilkins, Baltimore.
Resultados para S. aureus

10 -2
10-3
10-4
10-5
UFC/g=
Registrar los resultados de la prueba de coagulasa:

45
Superficies.
Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las colonias
por ml, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre cm2de la superficie.
Los resultados se expresan como UFC/cm2.
Utensilios de comedor.
Hacer el cálculo del número de colonias por ml, multiplicar el volumen total de la solución
diluyente de muestreo. Informar UFC/utensilio.
Cálculo y expresión de resultados
Contar las colonias y calcular el número de UFC/mL multiplicar por el volumen del diluyente y
reportar por unidad de superficie (cm2) o por utensilio.
7. Cuestionario
1. ¿Por qué tu cuenta de coliformes es considerada presuntiva? ¿qué otros

parámetros experimentales necesitas probar para confirmar la presencia de coliformes
2. ¿Cuál fue la concentración mínima de coliformes que pudimos detectar con el 3M
Petrifilm? Usar nuestras diluciones y considerar una cuenta mínima de 25 coliformes/placa.
¿cuál fue la máxima concentración de coliformes que pudimos detectar con las diluciones
utilizadas, considerando un máximo de 250 coliformes/placa?
3. Justifique el paso de pre-enriquecimiento, más que simplemente colocar tu muestra
directamente en el caldo de enriquecimiento selectivo, sabiendo que el medio de pre-
enriquecimiento es un medio nutritivo que permite el crecimiento de una amplia variedad
de organismos.
4. ¿Cuál sería la ventaja de hacer aún más pruebas bioquímicas qué las que hizo?
5. Discuta cómo lo largo del proceso de identificación de Salmonella podría impactar
las prácticas de distribución de los producto alimenticios?
6. ¿Por qué es importante establecer las pruebas bioquímicas con una sola colonia
bien aislada de la placa de agar selectivo?
7. ¿Tuvo dificultad para interpretar los resultados de las diferentes pruebas?, ¿podrían
impactar los niveles de experiencia de los laboratoristas en la confiabilidad de las pruebas
de control de calidad? Explicar.
8. ¿Cuáles son algunas nuevas tecnologías que podrían acortar o eliminar este largo
proceso? ¿En qué parte del proceso podrían ser implementadas estás?
9. ¿Por qué es usada la inoculación selectiva o diferencial directa para la prueba de
S. aureus más que el aislamiento por enriquecimiento selectivo?
46
10. Hay un reporte de un brote de enfermedad transmitida por los alimentos debido al
consumo de queso cheddar. Las victimas tienen los síntomas clásicos de una intoxicación
alimentaria estafilococal. Los síntomas incluyen vómito y diarrea sin fiebre después de 4 h
del consumo. Los síntomas únicamente se manifiestan por un periodo corto (8 a 12 h).
Como un buen microbiólogo de alimentos, inocula el producto y encuentra que no hay S.
aureus detectable. ¿Cómo podría confirmar o eliminar a la toxina estafilococal cómo causa
del brote?
11. ¿Cómo podría confirmar la presencia o ausencia de toxina estafilococal en un
alimento?
8. Bibliografía
1. Garbutt, J. 1997. Essentials of food microbiology. Arnold, London. England.

2. ICMSF (International Commision on Microbiological Specifications for Food). 2002.
Microorganisms in food 7 Microbiological testing in food safety management.
Springer. U.S.A.
3. Andrews, W.H., June, G.A., Sherrod, P.S., Hammack, T.S. y Amaguana, R.M.
1995. Salmonella, en Bacteriologicalanalytical manual. 8th ed. FDA, ed. AOAC,
Gaithersburg, MD.
4. Jay, J.M. 2000. Modern foodmicrobiology. 6th ed. Chapman and Hall, London:
New York.
5. Bennet, R.W. y Lancette, G. A. 1998. Staphylococcusaureus, in
BacteriologicalAnalytical Manual. 8th ed. FDA, Ed. AOAC, Gaithersburg, MD.
6. www.digesa.minsa.gob.pe/norma_consulta/microbiologico.pdf. Últimoacceso 28 de
noviembre de 2012.
11. Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la
determinación de salmonella en alimentos.
9. Formato y Especificación del Reporte de Práctica

a) Introducción
b) Objetivo
c) Desarrollo de la actividad práctica
d) Resultados
e) Discusión
f) Cuestionario
g) Bibliografía
47

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INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ADOLFO PONTIGO LOYOLA

AGUSTÍN SOSA CASTELÁN

GONZALO VILLEGAS DE LA CONCHA

YOAN BELTRÁN MARTÍNEZ

ÓSCAR RODOLFO SUÁREZ CASTILLO

ARMANDO PELÁEZ ACERO

JESÚS MELITÓN FRANCO FERNÁNDEZ

RAFAEL GERMAN CAMPOS MONTIEL

HEIDI MARÍA PALMA RODRÍGUEZ

FECHA DE APROBACIÓN DEL MANUAL DE PRÁCTICAS POR LA ACADEMIA RESPECTIVA:

NOMBRE DE QUIENES PARTICIPARON EN LA ELABORACIÓN:

VO. BO. DEL PRESIDENTE Y SECRETARIO DE LA ACADEMIA:

VO. BO. DEL COORDINADOR DEL PROGRAMA EDUCATIVO:

FECHA DE LA ÚLTIMA REVISIÓN Y/O ACTUALIZACIÓN:

A.- ENCUADRE DEL MANUAL DE PRÁCTICAS 5

A.- ENCUADRE DEL MANUAL DE PRÁCTICAS

3.- Programa del Sistema de Prácticas y Actividades Extramuros

B.- REGLAMENTO, NORMAS DE SEGURIDAD Y LINEAMIENTOS

Artículo 18. Se consideran corno usuarios de los laboratorios:

Artículo 20. Tratándose de prácticas de asignatura de los planes y programas de estudio

Artículo 23. Los profesores visitantes nacionales o extranjeros deberán acreditar su

I.El personal adscrito a los mismos.

Artículo 37. Es obligación del Responsable del Laboratorio, supervisar el cumplimiento de

I. Será amonestado verbalmente. De no corregir de inmediato su actitud, le será

Artículo 39. El director de la Unidad Académica aplicará las sanciones referidas en el

Artículo 40. Respecto a los usuarios académicos de la Universidad y a los profesores

Artículo 44. Toda información técnica perteneciente a los equipos y accesorios de un

2.- Medidas de Seguridad en los Laboratorios, Talleres, Clínicas y Actividades

ello, toma sólo la cantidad necesaria en un vaso de precipitados y NO DEVUELVAS EL

6. Cuando peses en la balanza cualquier producto químico deberás utilizar un pesafiltro o

3.- Lineamientos de Seguridad para Trabajar en Laboratorios, Clínicas, Talleres y

V. El laboratorio y/o taller NO proporcionará manuales de prácticas a los usuarios, ya que

VII. El usuario solicitará el equipo, utensilios, herramienta, material y reactivos descritos

X. Si el usuario no conoce el funcionamiento del equipo o máquina alguna, puede provocar

XI. Al devolver el mobiliario, equipo y material, el usuario deberá solicitar el vale de

XV. En caso de pérdida, ruptura o desperfecto del equipo o material de laboratorio, el

XVI. Si el material adeudado no es repuesto en el plazo fijado, el o los usuarios

XVII. En caso de no cumplir con la reposición del material en el plazo establecido, el

XXVII. Al concluir la licenciatura, maestría o doctorado y realices el trámite de titulación

C.-NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA

TIPO DE RIESGO COMO EVITARLO COMO PROCEDER EN CASO DE UN

Quemaduras químicas Debe ponerse atención Lave inmediatamente con agua

Al efectuar reacciones Aplique hielo o compresas heladas

2.- Política Ambiental

Es compromiso de todos los integrantes de la comunidad universitaria cumplir con

2a.- Cuadro de Disposición de Residuos

TIPO DE RESIDUOS CLASIFICACIÓN TIPO DE CONTENEDOR

Inflamable Líquido Garrafón o Tambo

D.- CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA EN PARTICULAR

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Destrucción Térmica de Microorganismos

No. DE PRÁCTICA: 1 No. DE SESIONES: 2

No. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO: 5

El calor es el método más usado para la inactivación de microorganismos en la producción

propiedades estadísticas de la distribución subyacente de las resistencias al calor dentro de

Evaluar la efectividad del procesamiento térmico como método de destrucción microbiana a

Familiarizarse con las pruebas de procesamiento térmico

5. Reactivos/Insumos, Materiales/Utensilios y Equipos/Instrumentos

6. Desarrollo de la Actividad Práctica

Se usará lo siguiente para generar las curvas de destrucción térmica:

Incube las placas invertidas a 37oC por 48 h.

Cuadro 1. Diluciones para ser inoculadas a cada temperatura de procesamiento