Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales

Departamento de Química Industrial y Aplicada

Microbiología General y de los Alimentos

Taller Nº 1: EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Objetivos
✓ Conocer las normas básicas de bio-seguridad en el laboratorio de
microbiología.
✓ Destacar la importancia de los conceptos “bioseguridad” y “esterilidad”
✓ Conocer la metodología de trabajo (técnica aséptica).
✓ Reconocer la aplicación del equipamiento y materiales.

Marco Teórico
Microscopía

La microscopía es la ciencia de los usos y aplicaciones interpretativas de los

microscopios. Los microscopios son instrumentos ópticos de observación que, por un
sistema de lentes ubicados entre el ojo del observador y el objeto a examinar,
permiten ampliar la imagen de dicho objeto.
Las lentes tienen un gran poder de resolución, esta propiedad está dada por la
longitud de onda de la luz y la apertura numérica del objetivo.
Los objetivos principales de la microscopía son la formación de una imagen
magnificada con la menor cantidad de defectos ópticos y el logro del contraste. El
contraste se basa en la absorción diferencial de la luz entre la muestra estudiada y su
medio. Todos los métodos de microscopía dependen de la capacidad de la muestra
para absorber, refractar o reflejar la luz, produciendo así contrastes entre los detalles
de la muestra y su fondo.
Los microscopios pueden ser simples (una sola lente) o compuestos (varias lentes).

Microscopio simple:
Un microscopio simple se compone de una sola lente de aumento de gran campo que
produce una imagen vertical. Este tipo de microscopio puede adaptarse a un
micrómetro rejilla u otros retículos con una base apropiada e iluminadores adecuados.
Su uso está limitado por su baja apertura numérica y su resolución es de unos 10
micrómetros (µ). Las lentes simples son útiles para la disección, la medición y el
examen de las reacciones de aglutinación. Un microscopio simple muy usado es el
contador de colonias de bacterias.

Microscopio compuesto:
Los microscopios compuestos constan por lo menos de dos sistemas de lentes. El
microscopio compuesto estándar o común comprende una lente objetivo de múltiples
compartimentos con breves longitudes focales, que forman una diminuta imagen real
invertida en el plano focal de otra lente, el ocular (o proyector cuando se añade una
cámara al microscopio), que magnifica la imagen para que el observador pueda

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resolverla. Tienen una parte mecánica y una parte óptica (figura 1).

• Parte mecánica:
Todo microscopio consta de una base o pie y de un brazo unido al pie por medio de un
tornillo que permite el desplazamiento del brazo en distintos ángulos de acuerdo a las
necesidades o comodidad del operador. En el brazo hay dos tornillos que pueden estar
separados o dispuestos en forma concéntrica. Uno de ellos es el macrométrico que
permite desplazamientos rápidos del tubo principal y el otro es el micrométrico que
permite desplazamientos lentos o de enfoque perfecto. El tubo principal está unido al
brazo por medio de una cremallera que es donde van a actuar los dos tornillos
anteriores (figura 1 partes en verde y gris).
En la parte superior del tubo principal se ubica un tubo concéntrico que se puede
desplazar dentro del principal y donde va colocado el ocular. En el otro extremo del
tubo principal encontramos el revólver porta objetivos. Este revólver puede tener de
tres a cuatro objetivos de distinta potencia. De acuerdo a la lente que se necesite
utilizar se lo gira colocando al objetivo en su sitio. El sentir un pequeño "click" nos
indica la posición exacta.
El tubo porta lentes puede tener un dispositivo ocular que tiene en su interior un
sistema de prismas que desvía la luz incidente en dos direcciones paralelas de
manera que se puedan usar a la vez dos oculares; es lo que se conoce como
microscopio binocular. Por otro mecanismo se puede desplazar la distancia entre un
ocular y el otro de acuerdo a las necesidades de la ubicación de los ojos del
observador.
Debajo del objetivo e implantado en el brazo se encuentra la platina, con un orificio en
la parte central que permite el paso de los rayos luminosos procedente de la fuente de
iluminación. La platina puede ser redonda, cuadrada, fija o móvil, siendo las móviles
las más comunes La platina móvil tiene dos tornillos que permiten el desplazamiento
en sentido horizontal o vertical (figura 1 parte L).

• Parte óptica:
El ocular está formado por un tubo con dos lentes una superior próxima al ojo del
observador y otra en el extremo del tubo. Entre ambas hay un diafragma fijo. Las
lentes son plano convexas teniendo la parte plana hacia el ojo observador. Están
graduadas en la parte superior con número y letras y de la combinación con el objetivo
resulta el aumento del microscopio. La ampliación focal se expresa con un “X” puesto
después del número (figura 1 parte A). Por ej. 5x, 10x, 15x.

Los objetivos son lentes que se encuentran próximas al objeto a observar, puede
decirse que es la parte más noble del microscopio. Están formados por un pequeño
tubo metálico que tiene en su interior un sistema de lentes. La ampliación focal se
expresa con un “X” puesto después del número. Por ej. 10x, 45x, 100x. Según la forma
de usar los objetivos se los clasifica en objetivos secos o de inmersión.
Objetivos Secos son los que se utilizan directamente colocándolos sobre el objeto a
examinar sin interponer ninguna sustancia. Son utilizados para la observación de
hongos, levaduras, parásitos, etc.

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Objetivos de Inmersión son los que, entre la lente frontal y el objeto a observar se
coloca un líquido que impida la desviación de los rayos luminosos que concurren en la
formación de la imagen. Ya que cuando un rayo pasa de un medio a otro de distinta
densidad se produce un fenómeno óptico que se conoce como refracción. Si el rayo
pasa en sentido perpendicular al otro medio, no sufre ninguna desviación, es decir,
corre igual que la normal, pero si ese rayo tiene una cierta inclinación, sufre una
desviación. Esto es lo que ocurre con los rayos que salen del portaobjeto (vidrio,
medio más denso), donde gran parte de ellos se desvían al pasar al aire (medio
menos denso). Los que llegan perpendicularmente al portaobjeto irán al interior de la
lente, no así gran número de los que llegan inclinados, los que se perderán restando
iluminación y nitidez a la imagen.
Si se coloca entre el portaobjeto y la lente una sustancia que forme un todo
homogéneo, se conseguirá un máximo de iluminación y cuanto más próxima sea la
densidad de esta sustancia a los medios sólidos en juego, será menor el número de
rayos desviados. Por supuesto que algunos rayos se desviarán pero siempre serán en
menor número. A dicha sustancia se la conoce como sustancia de inmersión. Si la
sustancia interpuesta es agua se obtiene una inmersión escasa, si se utiliza aceite de
cedro (líquido viscoso que no seca y es refractariamente estable) se obtiene una
inmersión homogénea pues su índice de refracción es de 1,51 y el índice de refracción
de la lente frontal es de 1,515. Así, con el aceite de cedro se logra una mejor imagen
por una mayor iluminación, y no hay alteraciones producidas por las diferencias de
espesor del portaobjetos que perjudican la claridad de la imagen (figura 1 parte B).

El condensador es un sistema de lentes destinados a concentrar los rayos luminosos

en el plano de la preparación (pueden ser de construcción muy variada). El diafragma
iris es un sistema óptico que regula la entrada de la luz.

Los componentes de un microscopio se pueden dividir en cuatro sistemas (Tabla 1):

Tabla 1: Sistemas de componentes de un microscopio

Sistema de soportes Sistema de aumentos
Pie Ocular
Brazo
Revolver porta objetivos Objetivos
Platina (fija o móvil)
Sistemas de iluminación Sistemas de ajuste
Fuente luminosa Macrométrico
Micrométrico
Condensador Tornillos del condensador
Elevador del diafragma
Diafragma Tornillos de la platina mecánica

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L
I
H

J
H

Figura 1. Partes del Microscopio.

Descripción: A) ocular, B) objetivo, C) portaobjeto, D) lentes de la iluminación, E) sujeción del
objeto, F) espejo o fuente de la iluminación, G) pie del microscopio, H) tornillos macrométrico y
micrométrico (acercamiento o alejamiento de la muestra), I) brazo del microscopio, J) tornillo de
movimiento de la platina (L), K) revólver de los objetivos y L) platina. En el esquema de la
izquierda: en verde sistemas de soporte, en amarillo sistema de iluminación, en celeste sistema
de aumentos (óptica) y en gris sistemas de ajuste. Fuente: Wikipedia De User:Tomia - Trabajo
propio, CC BY 2.5, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=3382974

Otros Microscopios Compuestos:

• Microscopio estereoscópico.
• Microscopio de contraste de fases.
• Microscopios de interferencia.
• Microscopio compuesto biológico.
• Microscopio de campo oscuro.
• Microscopio de fluorescencia.
• Microscopio electrónico

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Esterilización
La fisiología de los microorganismos depende de su metabolismo y de los factores
ambientales que los rodean, ya sean favorables o desfavorables. La técnica de
esterilización tiende a establecer un ambiente desfavorable para el desarrollo
fisiológico de los microorganismos viables y virus; causando su muerte o eliminación
total.
Se entiende por esterilización la destrucción de todo tipo de microorganismos
(saprófitos y patógenos) e inactivación de virus, mediante la utilización de agentes
físicos y/o químicos. Es la destrucción de todas las formas de vida macro o
microscópica, patógena o saprófita, vegetativa o de resistencia. Esta definición
excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los
microorganismos o atenuación de la actividad de cualquier tipo.

El material una vez esterilizado, continúa en esas condiciones indefinidamente si se

encuentra en un compartimento cerrado, sellado y libre del contacto con
microorganismos del ambiente exterior.

Los métodos de control de crecimiento se pueden clasificar según:

1) El medio:
• Físicos
• Químicos

2) El efecto que produce:

• Bacteriostático: Impide la multiplicación microbiana (es un proceso reversible,
al cesar la causa el microorganismo continúa su desarrollo).
• Bactericida: El efecto es mortal e irreversible.

Generalmente, el alcance de uno o de otro depende de la intensidad con que se

aplique el agente. Paralelamente, se puede hablar de fungicida, fungistático, viricida
y viristático.

3) El mecanismo de acción y la estructura bacteriana sobre la que actúan:

• Membrana citoplasmática y la pared celular.
• Proteínas y las enzimas.
• Núcleo.

4) El espectro de actividad:
• Amplio: Actúan sobre un gran número de microorganismos.
• Intermedio: Actúan sobre un número limitado de microorganismos.
• Reducido: Actúan sobre un pequeño número de microorganismos.

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✓ Métodos Físicos

Los principales métodos físicos utilizados en los procesos de esterilización se

resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Resumen de métodos físicos de esterilización.

1. TEMPERATURA
1.1 Calor húmedo: 1.1.a. Vapor de agua a presión
1.1.b. Tyndalización

1.2. Calor seco: 1.2.a. Flameado

1.2.b. Incineración
1.2.c. Aire caliente
2. RADIACIONES
2.1. Infrarrojas (calor)
2.2. Ultravioletas
2.3. Ionizantes

3. AGENTES MECÁNICOS
3.1. Ultrasonido
3.2. Filtración

1. TEMPERATURA

Los sistemas enzimáticos de las bacterias tienen una temperatura ideal de

funcionamiento en la que se desarrollan mejor, lo que se conoce como temperatura
óptima. Por encima y debajo de esta temperatura los microorganismos siguen
viviendo dentro de amplios márgenes (generalmente éste es de 40 °C). Estos límites
superior e inferior se llaman temperatura máxima y mínima de desarrollo y son
extremadamente variables de un microorganismo a otro. Si la temperatura es
superior o inferior a las temperaturas máximas y/o mínimas de crecimiento, se crea
un ambiente desfavorable para el microorganismo.

El método más extendido para controlar el crecimiento microbiano es por

calentamiento.

A medida que la temperatura se eleva por encima de la temperatura máxima de

crecimiento, se producen efectos letales (Brook, 1998). La efectividad del calor como

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método de esterilización depende de: temperatura, tiempo de exposición, de la

naturaleza del calor y sensibilidad del microorganismo. El calor provoca
desnaturalización e inactivación de proteínas, colapsamiento de la membrana
citoplásmica y a veces lisis térmica de la bacteria.
Hay una pérdida de viabilidad, es decir que los microorganismos dejan de ser
capaces de crecer y dividirse, aún cuando sean transferidos a un medio idóneo. La
muerte por calor es una función exponencial de primer orden (ecuación 1):

Ecuación 1

La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la
muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o
estructura esencial (como por eje,mplo: el ADN cromosómico o por creación de un
daño irreparable en la membrana).
¿Cómo se puede caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una
suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados:
✓ Tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que
mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una
determinada temperatura;

✓ Tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al

10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura
(también llamado valor D);

✓ Punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas

las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de
referencia empleado es de 10 min).

Al medir el efecto del calor se tiene que tener en cuenta la posibilidad de la presencia
de bacterias esporógenas, además de considerar el resto de vida no formadora de
esporas. Las esporógenas se destruyen a temperaturas mayores a los 100 °C y en
general las formas no esporuladas patogénicas se destruyen entre los 50 y 70 °C.

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Tabla 3: Ejemplos de punto térmico mortal

Punto térmico mortal Especies

55 oC Escherichia coli

60 oC Mycobacterium tuberculosis

120 oC Endosporas de especies muy resistentes de

Bacillus.

El efecto destructivo del calor sobre los microorganismos está en íntima relación con
el grado de humedad del ambiente, por lo que hay que distinguir entre la acción de
calor húmedo y la del calor seco.

1.1. Calor húmedo

Produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben
principalmente a dos razones:
• La molécula de agua es muy reactiva y muchas estructuras biológicas son
producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas
podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos.
Además, las estructuras secundarias y terciarias se estabilizan mediante
uniones puente hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y
rotas por el agua a altas temperaturas.

• El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más

elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor más
rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la
condensación.

Esta combinación hace que el calor húmedo tenga un efecto desfavorable mayor y
más rápido sobre los microorganismos.

1.1.a. Vapor a presión:

Es uno de los métodos más seguros y utilizados para esterilizar los materiales,
medios cultivos y materiales que se usan en microbiología. Se lleva a cabo en un
autoclave, donde el vapor de agua y a presión tiene un poder de penetración
superior a los métodos anteriores, por lo que permite tener la seguridad de una
correcta esterilidad. Este método permite a la eliminación de todo tipo de
microorganismos (incluido las esporas) en corto tiempo, es económico, no deja
residuos tóxicos y tiene un reducido deterioro del material expuesto.

El autoclave consiste en un recipiente de cobre u otro material adecuado, con una

tapa que ajusta perfectamente mediante diversos mecanismos, como por ejemplo un
sistema de tornillos llamados mariposas. La autoclave debe estar provisto de un
manómetro (marca la presión del interior de la autoclave), una válvula de seguridad,
un termómetro (marca la temperatura interior) y de una espita (válvula de purgado)
que permite la salida del aire y del vapor de agua.
Este dispositivo está cubierto por fuera con otra carcasa metálica y posee una fuente

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de calor. Las autoclaves pueden ser horizontales o verticales y de tamaño muy

variado de acuerdo a la necesidad. En el interior del autoclave se coloca una rejilla a
una determinada altura, hasta donde se llena con agua y sobre la cual se coloca el
recipiente interno con el material a esterilizar (figura 2).

Funcionamiento del autoclave: Se abre la tapa, se coloca el agua en su interior

hasta la altura de la rejilla, se coloca el recipiente interno y sobre el mismo se
deposita el material a esterilizar. Se cierra la tapa, se ajustan los tornillos o el
mecanismo de cierre, se abre la espita y se conecta la fuente de calor. El vapor de
agua a presión es el que efectúa la esterilización y por ello el autoclave no debe
contener aire en su interior. Esto se logra manteniendo la espita abierta hasta que se
observa la proyección de una corriente continua de vapor de agua. Esa es la señal de
que todo el aire ha sido expulsado y se cierra la espita. La presencia de aire en el
autoclave disminuye marcadamente la temperatura al producirse una falsa presión y
no se alcanzará la esterilización en el tiempo previsto (es distinta la temperatura de
una mezcla vapor-aire que la temperatura del vapor solo). El proceso por el cual se
elimina el aire de la autoclave por medio de la espita para lograr una presión y
temperatura adecuadas se denomina purgado. Una vez realizado el purgado, se
cierra la espita y se controla el aumento de presión y temperatura. Cuando se llega a
la temperatura y presión adecuadas se regula la fuente de calor para mantener
constantes estos parámetros y comenzar a controlar el tiempo de esterilización.
Generalmente se trabaja a 120 °C a 1 atm (1 kg/cm2 o 15 psi o 0,98 bar) durante 15 a
20 minutos. Luego de realizada la esterilización, se desconecta la fuente de calor, se
deja enfriar el equipo, se destapa y retira el material esterilizado.

Se puede esterilizar por este método: Material de vidrio (placas, tubos, vasos de
licuadoras, pipetas, Erlenmeyer, etc.), medios de cultivos, agua, materiales de acero
inoxidable, filtros, papeles, etc. Las principales desventajas de este método son el
efecto corrosivo sobre algunos metales y el no poder esterilizar algunos materiales en
los que no puede ingresar agua como los polvos.

Tabla 4: Relación Presión-Temperatura

Temperatura (°C)
Presión
(atm) Descarga Descarga de 2/3 Descarga de ½ Sin descarga
completa del aire del aire del aire del aire

1/3 109 100 90 72

2/3 115 109 100 90
1 121 115 109 100
4/3 126 121 115 109
5/3 130 126 121 115
2 133 130 126 121

El buen funcionamiento de la autoclave requiere el uso de indicadores que

comprueben que en el interior del recipiente se han dado las condiciones deseadas
de temperatura y presión. Se suelen utilizar productos químicos que cambian de color
según los niveles alcanzados, bacterias esporuladas o algunas aleaciones. Las cintas
testigo para esterilización poseen un indicador químico de alta fidelidad que cambia

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de color luego de ser expuesto al proceso de esterilización. Este producto es ideal

para cerrar paquetes de diferentes tipos e identificar el material procesado. La
formulación especial del adhesivo otorga mayor adherencia sobre una gran cantidad
de superficies y está disponible para esterilización por óxido de etileno, calor húmedo,
calor seco, etc. Los integradores químicos son otros dispositivos utilizados como
indicadores internos de paquetes, contenedores y recipientes y confirman que se
hayan cumplido todas las condiciones para garantizar una exposición suficiente al
proceso de esterilización. En general consisten en pequeñas tiras con un capilar
transparente en donde se observa una franja negra luego de un adecuado proceso
de esterilización. Son específicas para cada proceso por lo que existen tiras para la
esterilización con peróxido de hidrógeno, vapor a presión, calor seco y óxido de
etileno (figura 3).

Manómetro Válvula de seguridad

Válvula de purgado

Tubo de escape
de aire
Recipiente interno

Mariposas

Resistencia
Parrilla de soporte
(nivel max de agua) Control de
temperatura

Figura 2. Autoclave

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Indicadores químicos Indicadores biológicos

Figura 3. Indicadores de esterilización

Descripción: los indicadores químicos son productos químicos que se funden (indicador 3M de
la izquierda) luego de ser sometidos al tratamiento térmico. La tira superior no ha sido
utilizada y la tira inferior ha sido colocada en el autoclave y muestra un correcto
funcionamiento. En caso de que la línea negra no llegue al sector verde de la tira (accept) el
proceso de esterilización es dudoso y requiere revisión del equipo. A la derecha indicadores
biológicos, son viales con medios de cultivo y esporas de Geobacillus stearothermophilus, que
una vez realizado el proceso de esterilización se incuban por 24 h, si el medio se mantiene
igual significa que las esporas fueron destruidas. Si luego de la incubación, el color del medio
vira al amarillo significa que hubo actividad metabólica y el proceso de esterilización fue
ineficiente.

1.1.b. Tyndalización
Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por Tyndall, que permite
esterilizar a menor temperatura aquellas sustancias que se alteran a elevadas
temperaturas. Consiste en someter el producto 3 (tres) días sucesivos a un
calentamiento entre 56 -100 °C (65 °C), durante media hora con intervalos de
veinticuatro horas. La discontinuidad del calor y el reposo permite a las bacterias
formar nuevas células vegetativas a partir de sus esporas, hasta que por último en el
tercer calentamiento teóricamente no deberían quedar formas esporuladas. Se puede
usar Baño María o el autoclave abierto.

Ej.: Un material que tiene 10 (diez) formas vegetativas y 10 (diez) esporas, se realiza
el primer periodo de esterilización, mueren las 10 (diez) formas vegetativas, se incuba
a 37 °C, germinan 5 (cinco) esporas, se realiza el segundo período de esterilización,
mueren las 5 (cinco) esporas que germinaron, se incuba a 37 °C, germinan las otras
5 (cinco) esporas, y así con el tercer periodo son totalmente destruidas.

El calor seco produce una desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles
elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos
se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que
están en contacto con estos. Los sistemas de aplicación de calor seco para la

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destrucción de los microorganismos son tres:

1.2.a. Flameado
Es una práctica muy usada en el laboratorio para la esterilización del ansa y de la
espátula de Drigalski (antes y después de realizar la inoculación), de agujas, de
bocas de recipientes, etc. Para esta práctica se utiliza el mechero de Bunsen u otros.
El mechero es indispensable para mantener un área estéril en donde se está
trabajando.

1.2.b. Incineración
Es un procedimiento ideal para todos aquellos productos contaminados en que no
importa su destrucción (por ej. material descartable). Se utiliza combustión directa.

1.2.c. Aire caliente

Es necesario disponer de estufas u hornos de esterilización, donde el aire calentado
circula por el espacio existente entre la doble o triple pared, transmitiendo calor hacia
los objetos que se encuentran en su interior. El tiempo requerido para esterilizar es
de 1 hora a 160 C o 40 minutos a 170 C.
El aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua. La acción destructiva
del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material
está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas
se estabilizan mediante uniones puente hidrógeno intramoleculares que son más
difíciles de romper por el calor seco. Por ello es que se necesita mayor temperatura y
mayor tiempo que en otros procedimientos. Su aplicación está indicada para material
de vidrio (pipetas, placas de Petri, tubos, matraces), porcelanas, niquelados y
material donde no debe penetrar agua como aceites, vaselinas, talcos, glicerol, etc.
En general no se debe sobrepasar los 180 C porque el material puede quemarse. Si
se utiliza papel, la temperatura no debe superar los 160 ºC, para que evitar que se
carbonice.

Es importante señalar que el material a esterilizar debe estar perfectamente

acondicionado y preferentemente, envuelto en papel blanco o de aluminio, así al
retirarlo del horno, conservará la esterilidad hasta el momento de su uso. Los demás
métodos físicos (radiación y mecánicos) junto con los métodos químicos se describen
más adelante.

Actividad Experimental
✓ Observar el video “Preparación del material disponible en el laboratorio”
disponible en el LEV.

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