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BJP Revista británica de

Farmacología
DOI:10.1111/bph.12889
www.brjpharmacol.org

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN Correspondencia

Zhe-Sheng Chen, Departamento de
Ciencias Farmacéuticas, St.

Caracterización in vitro, John's University, Queens, Nueva York 11439,

EE. UU. Correo electrónico: chenz@stjohns.edu;

in vivo y ex vivo de Li-Wu Fu, State Key Laboratory of Oncology

in South China, Cancer Center, Sun Yat-Sen
University, Guangzhou 510060, China.

ibrutinib: un potente Correo electrónico: fulw@mail.sysu.edu.cn

inhibidor de la función de -------------------------------------------------- --------------

*Dirección actual: Departamento de Psicología,

Facultad de Artes y Ciencias de Harpur,

eflujo del transportador MRP1

Universidad de Binghamton – Universidad
Estatal de Nueva York, Binghamton, NY
13902, EE. UU.

Hui Zhang1,2,†, Atish Patel1,†, Shao-Lin Ma2, Xiao Jie Li3 , Yun-Kai Zhang1 , -------------------------------------------------- --------------

† Hui Zhang y Atish Patel contribuyeron

Pei-Qi Yang1,*, Rishil J Kathawala1 , Yi-Jun Wang1 , Nagaraju Anreddy1 ,
igualmente a este documento.
Li-Wu Fu2 y Zhe-Sheng Chen1 -------------------------------------------------- --------------

1 Recibió
Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Farmacia y Ciencias de la Salud, Laboratorio de Oncología Clave
29 de marzo de 2014
2
Universidad, Queens, Nueva York, EE. UU., del Estado de St. John en el sur de China, Colaborativo
Revisado
Centro de Innovación para la Medicina del Cáncer, Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, 8 de agosto de 2014
China, y 3
Departamento de Laboratorio Clínico, Tercer Hospital Afiliado de Sun Yat-Sen Aceptado
Hospital Universitario-Lingnan, Guangzhou China 13 de agosto de 2014

ANTECEDENTES Y PROPÓSITO El
transportador, la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MRP1, ABCC1), desempeña un papel fundamental en el desarrollo de la
resistencia a múltiples fármacos (MDR). Ibrutinib es un inhibidor de la tirosina quinasa de Bruton. Aquí investigamos el efecto de reversión de
ibrutinib en la MDR mediada por MRP1.

ENFOQUE EXPERIMENTAL La
citotoxicidad se determinó mediante ensayo MTT. La expresión de proteína fue detectada por Western blot. Se realizaron RT-PCR y Q-PCR para
detectar la expresión del ARNm de MRP1. La acumulación intracelular y el flujo de salida de sustratos para MRP1 se midieron mediante contador de
centelleo y citometría de flujo. Se establecieron xenoinjertos de células HEK293/MRP1 en ratones desnudos para estudiar los efectos de ibrutinib in vivo.

RESULTADOS
CLAVE Ibrutinib mejoró significativamente la citotoxicidad de los sustratos de MRP1 en células HEK293/MRP1 y HL60/Adr que sobreexpresan
MRP1. Además, ibrutinib aumentó la acumulación de sustratos en estas células que sobreexpresan MRP1 al inhibir la función de salida del fármaco
de MRP1. Sin embargo, la expresión de mRNA y proteína de MRP1 permaneció inalterada después del tratamiento con ibrutinib en células que
sobreexpresan MRP1. In vivo, ibrutinib mejoró la eficacia de la vincristina para inhibir el crecimiento de xenoinjertos tumorales HEK293/MRP1 en
ratones desnudos. Es importante destacar que el ibrutinib también aumenta la citotoxicidad de la vincristina en cultivos primarios de blastos de leucemia,
derivados de pacientes.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES Nuestros

resultados indicaron que ibrutinib aumentó significativamente la eficacia de los agentes quimioterapéuticos que eran sustratos de MRP1, en
células que sobreexpresan MRP1, in vitro, in vivo y ex vivo. Estos hallazgos conducirán a más estudios sobre los efectos de una combinación de
ibrutinib con agentes quimioterapéuticos en pacientes con cáncer que sobreexpresan MRP1.

abreviaturas
ABC, casete de unión a ATP; BTK, tirosina quinasa de Bruton; MDR, resistencia a múltiples fármacos; MRP1, proteína de resistencia a múltiples
fármacos 1

© 2014 La Sociedad Farmacológica Británica Revista británica de farmacología (2014) •• ••–•• 1

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H Zhang et al.
BJP
Tablas de Enlaces
OBJETIVOS
Transportersa
MRP1 (ABCC1)
Enzimasb
BTK, tirosina quinasa de Bruton
Estas tablas enumeran los objetivos y ligandos de proteínas clave en este artículo que están vinculados a las entradas correspondientes en http://www.guidetopharmacology.org ,
el portal común para datos de la Guía de FARMACOLOGÍA IUPHAR/BPS (Pawson et al., 2014) y están archivados permanentemente en la Guía Concisa de FARMACOLOGÍA
2013/14 (a,bAlexander et al., 2013a,b).
Introducción
La resistencia a múltiples fármacos (MDR), un fenómeno caracterizado por la
resistencia a fármacos no relacionados estructural y mecánicamente, es un
obstáculo importante para el éxito de la quimioterapia contra el cáncer. Aunque
el fenotipo MDR está mediado a través de varios mecanismos, la sobreexpresión
de los transportadores de casetes de unión de ATP (ABC) de membrana en el
cáncer se considera un determinante principal de dicha resistencia a los
fármacos (Danks et al., 1988; Giaccone et al., 1992). Los transportadores ABC
actúan como el sistema de defensa de las células cancerosas contra los
fármacos anticancerosos a través de un mecanismo de salida activo, lo que
conduce a una acumulación intracelular reducida de fármacos sustrato, lo que
los vuelve ineficaces (Sodani et al., 2012a). De estos transportadores ABC, la
glicoproteína MDR1/P (ABCB1), la proteína resistente al cáncer de mama
(ABCG2, MXR) y la proteína 1 resistente a múltiples fármacos (MRP1, ABCC1)
son componentes clave en el desarrollo del fenotipo MDR (Cole y Deeley,
1998; Ambudkar et al., 1999; Gottesman et al., 2002).
MRP1, el primer miembro identificado de la subfamilia C de transportadores
ABC, fue clonado a partir de células de carcinoma de pulmón de células
pequeñas humanas seleccionadas con antraciclina, H69AR, en 1992 por Cole et al.
(1992). MRP1 se expresa en varios tejidos humanos normales, incluidos los
pulmones, el bazo, los testículos, los riñones, la placenta, la tiroides, la vejiga
y las glándulas suprarrenales (Flens et al., 1996). Como transportador de
ubicación basolateral, MRP1 participa en el transporte de GSH, conjugados de
GSH y aniones orgánicos junto con compuestos orgánicos básicos y neutros
(Muller et al., 1994; Ishikawa et al., 1997). Además, MRP1 es un importante
transportador de leucotrieno C4 endógeno, un modulador importante de la
respuesta inflamatoria (Jedlitschky et al., 1994; Wijnholds et al., 1997; 1998;
2000). Con su amplio perfil de expresión, MRP1 es capaz de proteger tejidos y
eliminar sustratos tóxicos, manteniendo así la homeostasis (Cole et al., 1992).
La sobreexpresión de MRP1 en tumores se ha asociado claramente con la
resistencia clínica a los medicamentos en la leucemia y los tumores sólidos,
como los neuroblastomas infantiles, los cánceres de pulmón y de esófago (Cole
et al., 1992; Burger et al., 1994; Nooter et al., 1995; Norris et al., 1996). La
expresión de MRP1 se detectó en 48 niños (86 %) y 48 adultos (98 %) con
leucemia linfoblástica aguda (LLA) (Plasschaert et al., 2005). Informes
anteriores mostraron que la alta expresión de MRP1 se asoció con el fenotipo
MDR y el mal pronóstico tanto en pacientes con leucemia mieloide aguda
(LMA) como con LLA (Plasschaert et al., 2005; Mahjoubi et al., 2008). MRP1
transporta una amplia gama de
2 Revista británica de farmacología (2014) •• ••–••
LIGANDOS
5-FU MK571 (verlukast)
cisplatino paclitaxel
doxorrubicina vincristina
Ibrutinib
importantes agentes quimioterapéuticos como vincristina, vin blastina,
epipodofilotoxinas, doxorrubicina y algunos oxianiones de metales pesados
que confieren MDR (Haimeur et al., 2004). Por lo tanto, se han realizado
esfuerzos constantes para bloquear el transporte de dichos sustratos de MRP1,
con la ayuda de agentes moduladores, pero con un éxito limitado. Desde el
descubrimiento de MRP1, se han identificado varios moduladores de MRP1,
que incluyen indometacina (Duffy et al., 1998), probenecid (Gollapudi et al.,
1997), los antagonistas del receptor de leucotrienos MK571 (Burns et al., 1995)
y ONO -1078 (Nagayama et al., 1998; Nakano et al., 1998), pero ninguno ha
tenido éxito en la práctica clínica. En consecuencia, es necesario desarrollar e
identificar fármacos que puedan inhibir con éxito la actividad de MRP1 sin
producir efectos adversos graves.
Estudios anteriores informaron que los inhibidores de la tirosina quinasa
(TK), como imatinib y AG1393, han demostrado interactuar con MRP1 humana
e inhibir la actividad de transporte, lo que indica que los inhibidores de TK
también pueden ser inhibidores prometedores de MRP1 (Hegedus et al., 2002).
La tirosina quinasa de Bruton (BTK) es una enzima citoplasmática que juega
un papel clave en el desarrollo, proliferación, diferenciación, apoptosis y
migración celular de los linfocitos B (Akinleye et al., 2013). Algunos estudios
preclínicos y clínicos han demostrado que ibru tinib (PCI-32765), un nuevo
inhibidor potente de BTK, indujo respuestas impresionantes en tumores
malignos de células B. Recientemente, la FDA aprobó ibruti nib para el
tratamiento del linfoma de células del manto refractario y la leucemia linfocítica
crónica (Novero et al., 2014).
En este estudio, investigamos el efecto de ibrutinib en la mejora de la
eficacia de los agentes quimioterapéuticos en células que sobreexpresan
MRP1 in vitro, in vivo y ex vivo. Estos hallazgos demuestran la resensibilización
de las células leucémicas y las células resistentes a los fármacos que
sobreexpresan MRP1 a los efectos quimioterapéuticos de los fármacos
citotóxicos que son sustratos de MRP1.
Métodos
Líneas celulares y cultivo celular.
La línea celular de leucemia humana HL60 y la doxorrubicina
La línea celular HL60/Adr que sobreexpresa MRP1 seleccionada se obtuvo de
la Dra. Susan E. Bates (NCI, NIH, Bethesda, MD)
(Tang et al., 2004); la línea celular HEK HEK293/pcDNA3.1 y
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Ibrutinib revierte la multirresistencia mediada por MRP1
La línea celular transfectada con MRP1 HEK293/MRP1 se adquirió del
Dr. Suresh V. Ambudkar (NCI, NIH, Bethesda, MD) (Muller et al., 2002).
Todas las células se cultivaron en medio DMEM o RPMI 1640
suplementado con FBS al 10 % a 37 °C en una atmósfera humidificada
de CO2 al 5 %.
Ensayo de citotoxicidad La
sensibilidad celular a los fármacos se analizó mediante el ensayo
colorimétrico MTT como se describió anteriormente (Shi et al., 2007;
Kathawala et al., 2014). Las células se recogieron y sembraron en
placas de 96 pocillos. Para probar los efectos de ibrutinib, las células
se preincubaron con o sin ibrutinib durante 1 h y luego se agregaron
diferentes concentraciones de agentes quimioterapéuticos en los
pocillos designados. Se usó MK571 (50 ÿM), un inhibidor conocido de
MRP1, como control positivo. Después de 68 h de incubación, se
agregaron 20 ÿL de solución de MTT (4 mg·mLÿ1 ) a cada pocillo y se
incubaron adicionalmente durante 4 h. Luego se descartó el medio, se
agregaron 100 ÿL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales
de formazán. Luego se determinó la absorbancia a 570 nm mediante
un lector de microplacas OPSYS de DYNEX Technologies, Inc.
(Chantilly, VA, EE. UU.). Las concentraciones requeridas para inhibir el
crecimiento en un 50% (IC50) se calcularon a partir de las curvas de
supervivencia celular.
3 5% disuelta en tampón TBST (10 mmol·L-1 Tris-HCL, 150 mmol·L-1
H]-vinblastina y doxorrubicina
[ensayo de acumulación La
acumulación intracelular de [ 3H]-vinblastina en células que
sobreexpresan MRP1 se determinó como se ha descrito anteriormente
(Cole et al., 1994). Las células se tripsinizaron y cuatro alícuotas (5 ×
106 células) se suspendieron en el medio y se preincubaron con o sin
ibrutinib (1 o 5 ÿM) o MK571 (50 ÿM) durante 1 hora a 37 °C.
Posteriormente, estas células se trataron con un sustrato radiactivo
[ 3H]-vinblastina y se incubaron durante otras 2 ha 37°C. Posteriormente,
las células suspendidas se sedimentaron a 4 °C y se lavaron dos veces
con 10 ml de PBS enfriado con hielo. Las células se lisaron en SDS al
1 % y la radiactividad asociada a las células se determinó usando un
contador de centelleo líquido; los resultados obtenidos se expresaron
como pmol de vinblastina por 106 células.
Cada muestra se colocó en fluido de centelleo y la radiactividad se
midió usando un analizador de centelleo líquido Packard TRI-CARB
1900CA de Packard Instrument Company Inc.
(Downers Grove, IL, EE. UU.) (Sodani et al., 2012b). La acumulación
intracelular de doxorrubicina en células HL60/Adr que expresan en
exceso MRP1 y sus células HL60 parentales se examinó mediante
citometría de flujo como se describió anteriormente (Zheng et al., 2009).
Brevemente, las células se recolectaron y 1 × 106 células de cada línea
celular HL60 y HL60/Adr se suspendieron en medio y se preincubaron
con o sin ibrutinib o MK571 durante 2 h a
37°C. Más tarde, se añadieron 10 ÿM de doxorrubicina a las células y
se incubaron durante otras 2 horas a 37 °C. Las células fueron entonces
lavado con PBS helado dos veces antes de leerlo usando un citómetro
de flujo y un mínimo de 20 000 eventos.
3
Ensayo de eflujo de H]-vinblastina y doxorrubicina
[ Para medir el flujo de salida del fármaco, las células se preincubaron
con ibrutinib 5 ÿM o MK571 50 ÿM durante 1 h como se describe en el
experimento de acumulación. A continuación, se añadió [3 H]-vinblastina
a las muestras y se incubaron durante un período de 2 h, después de
lo cual las células se lavaron con PBS helado y luego se complementaron
con medio fresco con o sin ibrutinib (5 ÿM)
BJP
o MK571 (50 µM) a 37°C. Después de 0, 30, 60 y 120 min, se retiraron
alícuotas iguales de suspensión celular y se lavaron inmediatamente
dos veces con PBS helado. A continuación, las células se recogieron y
lisaron para la detección de radiactividad. Cada muestra se colocó en
líquido de centelleo y se midió la radiactividad como se describió
anteriormente (Patel et al., 2013). La salida de doxorubicina en células
HL60/Adr que expresan en exceso MRP1 y sus células HL60 parentales
se examinó mediante citometría de flujo como se describió anteriormente
(Tang et al., 2014).
Análisis de transferencia Western
Se realizó un análisis de transferencia Western para detectar los niveles
de expresión de la proteína MRP1 después del tratamiento con ibrutinib
5 ÿM durante 0, 24, 48 y 72 h. Las células se recogieron y se lisaron
con tampón de lisis (pH 7,4, que contenía Triton X-100 al 1 % y SDS al
0,2 %) (Yan et al., 2011). Los lisados celulares se mantuvieron en hielo
durante 20 min seguidos de centrifugación a 8573 × g durante 15 min
a 4 °C. El sobrenadante se separó y almacenó a -80 °C hasta que se
requirió para el experimento. Se usó el kit de ensayo BCA de Thermo
Fischer Scientific Inc. (Rockford, IL, EE. UU.) para cuantificar la
concentración de proteína en cada muestra. Se resolvieron cantidades
iguales de proteína (80 µg) de varios tratamientos mediante SDS-PAGE
y se transfirieron a membranas de PVDF mediante electroforesis. A
continuación, las membranas se bloquearon con leche desnatada al
NaCl y 0,1% Tween20 pH 8,0) durante 2 ha temperatura ambiente. Las
membranas se incubaron durante la noche con el anticuerpo monoclonal
primario contra MRP1 (a una dilución de 1:200) o ÿ-actina (a una
dilución de 1:1000) a 4 °C y luego se incubaron con el anticuerpo
secundario conjugado con HRP ( dilución 1:1000) durante 2 h a
temperatura ambiente. Después de lavar las membranas tres veces
con TBST, el complejo proteína-anticuerpo se detectó mediante un
sistema de detección de quimioluminiscencia mejorado (Amersham,
NJ, EE. UU.). La expresión de ÿ-actina se utilizó como control de carga
(Sodani et al., 2012b).
RT-PCR y Q-PCR El ARNm
total se aisló mediante el kit de extracción de ARN Trizol Reagent
adquirido en Molecular Research Center (Cincinnati, OH, EE. UU.). La
Q-PCR se realizó con un sistema en tiempo real Bio-Rad CFX96
(Hercules, CA, EE. UU.). Los cebadores de PCR utilizados en este
estudio se resumen en la Tabla de información complementaria S1.
El gen que codifica GAPDH se usó como control. Los productos de
amplificación se analizaron en geles de agarosa al 1%. La cuantificación
relativa de ABCC1 se realizó mediante el método 2-ÿÿCt (Livak y
Schmittgen, 2001). Todos los experimentos fueron repetidos tres veces.
Animales
Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales
cumplieron con la Ley de Bienestar Animal y otros estatutos federales
y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de
Animales de la Universidad de St. John. Todos los estudios que
involucran animales se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE
para informar experimentos con animales (Kilkenny et al., 2010;
McGrath et al., 2010). Se utilizaron un total de 28 animales en los
experimentos descritos aquí.
Se compraron ratones machos desnudos NCR (nu/nu) atímicos, de
5 a 6 semanas de edad y con un peso de 19 a 25 g, de Taconic Farms.
Revista británica de farmacología (2014) •• ••–•• 3
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(NCRNU-M, homocigoto, color albino) y se utilizaron para desarrollar
el modelo de xenoinjerto tumoral que sobreexpresa MRP1. Todos los
ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad,
con libre acceso a alimentos y agua esterilizados, y se mantuvieron
en las instalaciones para animales de la Universidad de St. John.
Modelo de xenoinjerto de ratón desnudo Se
desarrollaron xenoinjertos tumorales de células HEK293/MRP1 que
sobreexpresan MRP1 en ratones desnudos a partir de estudios
anteriores realizados en nuestras instalaciones (Tiwari et al., 2013;
Kathawala et al., 2014). Se inyectaron sc células HEK293/MRP1 (1 ×
107 ) debajo de las axilas de los ratones. Los ratones se distribuyeron
aleatoriamente en cuatro grupos cuando los xenoinjertos alcanzaron
un diámetro medio de 5 mm (n = 7) y se trataron con uno de los
siguientes regímenes: todos los tratamientos se administraron en
días alternos durante 7 días (i) vehículo (agua esterilizada en
autoclave); (ii) ibrutinib (30 mg kg-1 , po); (iii) vincristina (0,4 mg·kgÿ1 ,
ip); y (iv) ibrutinib (30 mg·kgÿ1 , po, administrado 1 h antes de dar
vincristina) + vin cristina (0,4 mg·kgÿ1 , ip).
La concentración de vincristina se eligió según Huang et al.
(2008). Peso corporal, dimensiones del tumor,
Figura 1
Citotoxicidad de ibrutinib en células resistentes a los medicamentos y sus células parentales sensibles a los medicamentos. (A) La estructura química de ibrutinib;
(B) Western blot que muestra la expresión de MRP1 en células HEK293/MRP1 y HL60/Adr; (C) curvas de concentración-respuesta de células HL60 y HL60/Adr
tratadas con ibrutinib solo; (D) Curvas de concentración-respuesta de células HEK293/pcDNA3.1 y HEK293/MRP1 tratadas con ibrutinib.
4 Diario Británico de Farmacología (2014) •• ••–••
el comportamiento de alimentación y la actividad locomotora de cada
ratón se registraron cada dos días. El último día del experimento, se
sacrificaron los ratones y se diseccionaron, pesaron y midieron los
xenoinjertos como se describió anteriormente (Mi et al., 2010). Los
pesos corporales de los animales y los dos diámetros perpendiculares
(A y B) se registraron cada dos días, y el volumen del tumor (V) se
estimó de acuerdo con la siguiente fórmula:
3
ÿ AB
V= )
6+
2(
Muestras de pacientes
Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Ética de la
Universidad Sun Yat-Sen. Se obtuvo sangre de médula ósea (4 ml)
de 10 pacientes con LMA o LLA diagnosticada, según la clasificación
FAB (Mihic-Probst et al. 2007) después del consentimiento informado.
Las características de los pacientes se resumen en la Tabla de
información de apoyo S2. Los blastos de leucemia se aislaron
utilizando una centrífuga de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque
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Ibrutinib revierte la multirresistencia mediada por MRP1
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gación y cultivada en medio RPMI-1640 que contiene 20% Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE. UU.). DMEM
FBS. Se realizó Western blot para detectar la expresión de MRP1 de las y RPMI-1640 eran productos de Gibco BRL (Grand Island,
muestras de pacientes. NY, EE. UU.), vinblastina, doxorrubicina, paclitaxel, 5-FU, cisplatino, MK571,
penicilina/estreptomicina, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol 2-il)-2,5-

Análisis de los datos difeniltetrazolio (MTT), DMSO y

Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. microsoft
Office Excel 2010 (Microsoft Corp., Redmond, WA, EE. UU.) y
el software estadístico SPSS16.0 (IBM, Armonk, NY, EE. UU.)
fueron utilizados en el procesamiento de datos. ImageJ (NIH, Bethesda, MD,
USA) se utilizó para analizar la relación de escala de grises de Western blot.
La significación estadística se determinó utilizando el Student's
prueba t. La significación se determinó en P < 0,05 o P < 0,01.
Materiales
3
[ H]-sulfato de vinblastina (25 Ci·mmolÿ1 ) se adquirió de
American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO, EE. UU.). Ibru tinib se
obtuvo de ChemieTek (Indianapolis, IN, EE. UU.).
PCI 29732 se adquirió de Medchem Express (Shanghai,
Porcelana). La vincristina se adquirió de los laboratorios LC.
(Woburn, MA, EE. UU.). Anticuerpos monoclonales anti-MRP1
(sc-18835) y anti-ÿ-actina (sc-8432) se adquirieron de
otros productos químicos se compraron a Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MO, EE. UU.).
Resultados
Efecto citotóxico de ibrutinib en
Células que sobreexpresan MRP1 y sus
células sensibles a los padres
Antes de investigar la citotoxicidad de ibrutinib, realizamos
Western blot para determinar la expresión de la proteína MRP1 en
las células utilizadas en nuestros experimentos. Se encontraron altos niveles de MRP1
expresado en células HEK293/MRP1 y HL60/Adr (Figura 1B).
La citotoxicidad de ibrutinib se evaluó en MRP1-
células que sobreexpresan y células sensibles a los padres por ensayo MTT.
Los valores IC50 de ibrutinib en estos dos conjuntos de células fueron

tabla 1
El efecto de ibrutinib en la reversión de la MDR mediada por MRP1 en células HEK293/pcDNA3.1 y HEK293/MRP1

IC50 ± SD (nM) (resistencia al pliegue)

Compuestos HEK293/pcDNA3.1 HEK293/MRP1

vincristina 2,37 ± 0,67 (1,00) 21,7 ± 3,22 (9,16)

+Ibrutinib 1 ÿM 2,19 ± 0,40 (0,92) 8,39 ± 1,01 (3,54)**
+Ibrutinib 5 ÿM 1,84 ± 0,35 (0,78) 2,51 ± 0,55 (1,06)**
+ MK571 50 µM 2,07 ± 0,32 (0,87) 4,21 ± 0,43 (1,78)**
Vinblastina 1,05 ± 0,20 (1,00) 6,92 ± 1,02 (6,59)
+Ibrutinib 1 ÿM 0,90 ± 0,11 (0,86) 3,45 ± 0,66 (3,29)**
+Ibrutinib 5 ÿM 0,80 ± 0,23 (0,76) 1,55 ± 0,21 (1,47)**
+ MK571 50 µM 0,9 ± 1,93 (0,3) 0,83 2,39 ± 0,49 (2,28)**
doxorrubicina (0,9) 2,26 (1,00) 115 ± 7,93 (5,39)
+Ibrutinib 1 ÿM 20,7 ± 3,11 (0,97) 67,1 ± 8,40 (3,14)**
+Ibrutinib 5 ÿM 22,9 ± 1,76 (1,07) 27,8 ± 2,01 (1,30)**
+ MK571 50 µM 21,9 ± 2,05 (1,03) 58,8 ± 5,29 (2,76)**
cisplatino 1502 ± 120 (1,00) 1932 ± 200 (1,29)
+Ibrutinib 1 ÿM 1405 ± 200 (0,94) 1912 ± 125 (1,27)
+Ibrutinib 5 ÿM 1258 ± 179,50 (0,84) 1761 ± 220 (1,17)
+ MK571 50 µM 1402 ± 210,38 (0,93) 1848 ± 176 (1,23)
paclitaxel 7,03 ± 2,01 (1,00) 6,33 ± 1,41 (0,90)
+Ibrutinib 5 ÿM 6,11 ± 1,02 (0,87) 5,50 ± 1,34 (0,78)
+ MK571 50 µM 5,84 ± 1,15 (0,83) 4,99 ± 1,44 (0,71)
5-FU 14 418. ± 21265 (1,00) 20 185 ± 3463 (1,40)
+Ibrutinib 5 ÿM 15 270 ± 3016 (1,06) 22 658 ± 4334 (1,57)
+ MK571 50 µM 16 369 ± 2264 (1,14) 23 049 ± 5746 (1,60)

La supervivencia celular se determinó mediante ensayos MTT. Los datos que se muestran son medias ± DE de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado.
La resistencia de MDR (valores dados entre paréntesis) se calculó dividiendo los valores IC50 del sustrato en células HEK293/MRP1 en el
presencia o ausencia de inhibidor, o células HEK293/pcDNA3.1 con inhibidores, por la IC50 de células HEK293/pcDNA3.1 sin inhibidor.
*P < 0,05, **P < 0,01 significativamente diferente de los valores obtenidos en ausencia de inhibidor.

Revista británica de farmacología (2014) •• ••–•• 5

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>10 ÿM, y más del 85% de las células sobrevivieron en el
concentración de ibrutinib 5 ÿM (Figura 1C y D). Establecido
en base a estos resultados, ibrutinib a una concentración de 5 ÿM fue
elegido como la concentración máxima para la combinación
tratamiento con medicamentos contra el cáncer, conocido como MRP1
sustratos
El efecto de ibrutinib en la reversión
MDR mediada por MRP1 en
Células que sobreexpresan MRP1
La citotoxicidad de los sustratos de MRP1 como vincristina, vinblastina,
doxorrubicina o sustratos que no son de MRP1, como cisplatino, paclitaxel y
5-FU, se evaluó en presencia o
ausencia de ibrutinib en HEK293/pcDNA3.1 y HEK293/
células MRP1. Como se muestra en la Tabla 1, la sobreexpresión de MRP1
Las células HEK293/MRP1 exhibieron resistencia a los sustratos de MRP1
como vincristina, vinblastina y doxorrubicina, en comparación
con células HEK293/pcDNA3.1. Ibrutinib a 1 o 5 ÿM sensibilizó
significativamente las células HEK293/MRP1 a los sustratos de MRP1
pero no al cisplatino, paclitaxel o 5-FU. El efecto sensibilizante
de ibrutinib fue más potente que la de MK571, un conocido
inhibidor de MRP1 (Tabla 1). De manera similar, ibrutinib significativamente
potenció la citotoxicidad de los fármacos sustrato de MRP1 en
otra línea celular que sobreexpresa MRP1, leucemia HL60/Adr
células. Sin embargo, ibrutinib no alteró la citotoxicidad de
estos fármacos en células HL60 (Tabla 2). Por lo tanto, nuestros resultados
sugirió que ibrutinib sensibilizó a las células que sobreexpresan MRP1
a fármacos antineoplásicos que son sustratos de MRP1.
El efecto de ibrutinib en intracelular
acumulación de [3 H]-vinblastina y
doxorrubicina en células que sobreexpresan MRP1
Para dilucidar el mecanismo que subyace a la reversión de la droga
resistencia, medimos el efecto de ibrutinib sobre la acumulación de [3 H]-
vinblastina en las células. el intracelular
los niveles de [3 H]-vinblastina se midieron en presencia o
ausencia de ibrutinib en HEK293/pcDNA3.1 y HEK293/
células MRP1. Los niveles de acumulación intracelular de
[3 H]-vinblastina en células HEK293/MRP1 fueron significativamente
más bajas que las de las células HEK293/pcDNA3.1, después de la incubación
con [3 H]-vinblastina durante 2 h (Figura 2A). Sin embargo, los niveles de
acumulación intracelular de [3 H]-vinblastina en HEK293/
Las células MRP1 aumentaron significativamente después del tratamiento con
ibrutinib. Además, el aumento del efecto producido por ibru tinib a 5 ÿM fue
comparable al de MK571 a 50 ÿM.
Sin embargo, ni ibrutinib ni MK571 aumentaron la
acumulación intracelular de [3 H]-vinblastina en HEK293/
Células pcDNA3.1 (Figura 2A). Estos resultados sugirieron que es probable
que ibru tinib afecte la función de salida de MRP1
transportador De manera similar, el análisis de citometría de flujo mostró que
ibrutinib aumentó la acumulación intracelular de doxoru
bicina en células HL60/Adr pero no en las células HL60 parentales
(Información de apoyo Fig. S1A).

Tabla 2
El efecto de ibrutinib en la reversión de la MDR mediada por MRP1 en células HL60 y HL60/Adr

IC50 ± SD (nM) (resistencia al pliegue)

Compuestos HL60 HL60/ADR

vincristina 12,6 ± 2,33 (1,00) 13,2 2021 ± 191(161)

+Ibrutinib 1 ÿM ± 1,51 (1,05) 9,12 ± 900 ± 120 (72)**

+Ibrutinib 5 ÿM 2,82 (0,72) 10,5 ± 1,90 138 ± 11,3 (11,0)**

+ MK571 50 µM (0,83) 59,2 ± 14,90 190 ± 20,4 (15,1)**

doxorrubicina (1,00) 3890 ± 340 (65,8)

+Ibrutinib 1 ÿM 52,3 ± 8,11 (0,88) 1671 ± 210 (28,2)**

+Ibrutinib 5 ÿM 48,1 ± 5,27 (0,81) 624 ± 100 (10,6)**

+ MK571 50 µM 49,8 ± 4,56 (0,84) 705 ± 70,4 (11,9)**

cisplatino 1804 ± 201 (1,00) 2101 ± 321 (1,16)

+Ibrutinib 5 ÿM 1726 ± 229 (0,96) 2255 ± 219 (1,25)

+ MK571 50 µM 1623 ± 219 (0,90) 2076 ± 302 (1,15)

paclitaxel 7,71 ± 1,02 (1,00) 6,65 ± 1,20 (0,86)

+Ibrutinib 5 ÿM 8,16 ± 1,45 (1,05) 6,74 ± 0,89 (0,87)

+ MK571 50 µM 7,28 ± 2,10 (0,94) 7,90 ± 1,48 (1,02)

5-FU 35 999 ± 4005 (1,00) 38 037 ± 4185 (1,06)

+Ibrutinib 5 ÿM 31 653 ± 5392 (0,88) 39 627 ± 5205 (1,10)

+ MK571 50 µM 39 9757 ± 6198 (1,11) 41 696 ± 5531 (1,16)

La supervivencia celular se determinó mediante ensayos MTT. Los datos que se muestran son medias ± DE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. El pliegue
La resistencia de MDR (valores entre paréntesis) se calculó dividiendo los valores IC50 del sustrato en células HL60/Adr en ausencia o
presencia de inhibidor, o los valores IC50 de sustrato en células HL60 con inhibidor, por IC50 de células HL60 sin inhibidor. *P < 0,05, **P < 0,01
significativamente diferente de los valores obtenidos en ausencia de inhibidor.

6 Revista británica de farmacología (2014) •• ••–••

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Ibrutinib revierte la multirresistencia mediada por MRP1
El efecto de ibrutinib sobre la salida de
[ 3H]-vinblastina en células que sobreexpresan MRP1
Para determinar si el aumento en la acumulación intracelular de
[3 H]-vinblastina se debió a la inhibición de la salida de MRP1,
medimos la salida de [3 H]-vinblastina en presencia o ausencia
de ibrutinib en diferentes momentos (0, 30, 60 y 120 min) en
células HEK293/pcDNA3.1 y HEK293/MRP1. En ausencia de
ibrutinib, hubo una salida rápida de [3 H]-vinblastina de las células
HEK293/MRP1, lo que resultó en una disminución de la
acumulación de [3 H]-vinblastina, en comparación con las células
HEK293/pcDNA3.1. Sin embargo, en presencia de ibrutinib, el
transportador MRP1 se bloqueó, lo que provocó una disminución
del flujo de salida de [3 H]-vinblastina en diferentes momentos
(Figura 2B). Los niveles intracelulares de [3 H]-vinblastina a los 0
min del punto de tiempo de salida se establecieron en 100 % y,
durante 120 min, hubo una reducción relacionada con el tiempo
3
en la [3 H] intracelular.
H]-vinblastina en células HEK293/MRP1 en ausencia de
Figura 2
Ibrutinib aumentó la acumulación intracelular de [3 H]-vinblastina al
inhibir la función de salida de MRP1. (A) La acumulación de [3 H]-
vinblastina se midió en células HEK293/pcDNA3.1 y células HEK293/
MRP1 con o sin ibrutinib; MK571 se usó como un inhibidor conocido
de MRP1. Los datos mostrados son medias (con DE) de determinaciones
por triplicado. * P < 0,05 ** P,<control.
0,01, significativamente diferente
(B) Se midieron los efectosdel
de
ibrutinib sobre la salida de [ 3H]-vinblastina de las células HEK293/
pcDNA3.1 y HEK293/MRP1. Se encontró una disminución dependiente
del tiempo de [3 H]-vinblastina intracelular (0, 30, 60 y 120 min). Los
datos mostrados son medias ± DE de tres determinaciones
independientes, por triplicado. * P < 0,05, significativamente diferente
del control.
BJP
ibrutinib. Cuando las células HEK293/MRP1 se incubaron con
ibrutinib, los niveles de [ 3H]-vinblastina intracelular aumentaron
en todos los puntos temporales. Nuestros resultados también
mostraron que ibrutinib inhibió significativamente la salida de
doxorrubicina en las células HL60/Adr (Información de apoyo, Fig.
S1B). Estos datos indicaron que ibrutinib inhibe la función de
salida del transportador MRP1 y aumenta significativamente la
acumulación de sustratos.
El efecto de ibrutinib en los niveles de expresión de
mRNA y proteína de MRP1
El efecto de sensibilización de ibrutinib podría lograrse
antagonizando la función de MRP1 o disminuyendo los niveles de
expresión de MRP1. Realizamos RT-PCR, Q-PCR y Western blot
para analizar el efecto de ibrutinib en los niveles de expresión de
mRNA y proteína de MRP1. Como se muestra en la Figura 3, los
niveles de expresión de ARNm o proteína de MRP1 no se
alteraron significativamente en las células HEK293/MRP1 después
del tratamiento con ibrutinib durante 24, 48 y 72 h. Las
proporciones de MRP1/ÿ-actina fueron proporcionales a los
niveles de proteína MRP1 (Figura 3). El resultado sugirió que el
efecto de sensibilización de ibrutinib no fue causado por una disminución en la
El efecto de ibrutinib sobre la reversión de la
MDR mediada por MRP1 en el modelo de xenoinjerto de
ratón desnudo Se utilizó un modelo de MDR in vivo,
xenoinjertos de células HEK293/MRP1 en ratones atímicos, para
estimar la eficacia de ibrutinib para revertir la resistencia a la
vincristina mediada por MRP1. no hubo
diferencia significativa en el tamaño del tumor entre los grupos
tratados con solución salina e ibrutinib. El grupo tratado con
vincristina (0,4 mg kg-1 , ip) mostró reducciones leves de la tasa
de crecimiento de los tumores, en comparación con el grupo de
control, tratado con solución salina (Figura 4A y B). Sin embargo,
el grupo tratado con ibrutinib (30 mg kg-1 , po) en combinación
con vincristina (0,4 mg kg-1 , ip) mostró una mayor inhibición del
crecimiento tumoral que en los animales tratados con solución
salina, vincristina o ibrutinib solos (Figura 4A y B). Los pesos
medios de los tumores extraídos de los ratones al final del
experimento (Figura 4C) mostraron inhibición por vincristina sola
y una inhibición significativamente mayor después del tratamiento
combinado (ibrutinib + vincristina). Además, no hubo diferencias
significativas en el peso corporal ni en los cambios fenotípicos
entre los grupos de tratamiento después del curso de la terapia
(Figura 4D). Nuestros resultados sugirieron que ibrutinib en
combinación con vincristina no aumentó la toxicidad in vivo , pero
mejoró la eficacia antitumoral de vincristina en este modelo de
xenoinjerto de células HEK293/MRP1.
El efecto de ibrutinib sobre la citotoxicidad de la vincristina en
células blásticas leucémicas derivadas de pacientes que
sobreexpresan MRP1 MRP1 se expresa tanto en pacientes con
LMA como con LLA (Mahjoubi et al., 2008). Por lo tanto, probamos
la expresión de MRP1 y analizamos la citotoxicidad de la
vincristina, con o sin tratamiento con ibrutinib, en células blásticas
leucémicas derivadas de pacientes. Nuestros resultados
demostraron que 3 de 9 muestras de pacientes mostraron una
expresión detectable de MRP1 (Figura 5A). El tratamiento de
cultivos de estas células blásticas de leucemia con ibrutinib 5 ÿM
los sensibilizó a los efectos de la vincristina, en estos
Revista británica de farmacología (2014) •• ••–•• 7
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H Zhang et al.
BJP

Figura 3
Ibrutinib no alteró los niveles de expresión de MRP1 en células MDR. (A) El efecto de ibrutinib en los niveles de proteína de MRP1 se probó después de que las células
HEK293/MRP1 se trataron con 5 ÿM de ibrutinib durante 0, 24, 48 y 72 h y se realizaron transferencias Western. (B) ImageJ se utilizó para analizar las proporciones en
escala de grises de MRP1/ÿ-actina. Las proporciones de escala de grises fueron proporcionales a los niveles de proteína MRP1. (C) Se realizó RT-PCR para confirmar
los niveles de ARNm en células HEK293/MRP1. (D) Q-PCR se realizó además para probar los niveles de ARNm en células HEK293/MRP1. Las diferencias no fueron
estadísticamente significativas (P > 0,05).

tres muestras (Figura 5B-D). Nuestros hallazgos sugirieron que la
combinación con ibrutinib y vincristina podría tener un valor clínico
significativo, aunque se necesitan más estudios clínicos.
discusiones y conclusiones
La quinasa BTK es un componente citoplasmático esencial de la vía
de señalización del receptor de células B, que se ha convertido en
un objetivo atractivo para la quimioterapia contra el cáncer (Akinleye
et al., 2013). Ibrutinib, un nuevo inhibidor dirigido a BTK, ha mostrado
actividades significativas en una variedad de trastornos neoplásicos
de células B en modelos preclínicos y ensayos clínicos (Sharma, 2013).
La US FDA aprobó el ibrutinib para el tratamiento de pacientes con
linfoma de células del manto o leucemia linfocítica crónica (Dolgin,
2013). Además, se están realizando varios ensayos clínicos para
evaluar el efecto sinérgico de ibru tinib administrado en combinación
con rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona
en pacientes recién diagnosticados con subtipo de células B no del
centro germinal de células B grandes difusas. linfoma (http://
clinicaltrials.gov ).
Existe buena evidencia de que los inhibidores de TK tienen una
interacción importante con los transportadores ABC, como ABCB1,
ABCG2 y MRP1. Varios inhibidores de TK como lapatinib,
gefitinib y erlotinib también son inhibidores de ABCB1 y ABCG2
(Elkind et al., 2005; Shi et al., 2007; Dai et al., 2008).
Sin embargo, hasta la fecha se sabe poco sobre la interacción entre
los inhibidores de TK y MRP1 y, hasta el momento, ninguno de los
compuestos ha sido aprobado para uso clínico. Debido a que ibrutinib
demostró una inhibición notable de la vía de la señal BTK y una
perspectiva prometedora en el tratamiento combinado con
medicamentos contra el cáncer tradicionales, fue de gran interés
investigar el efecto de ibrutinib en la MDR mediada por MRP1.
Como se informó anteriormente, las líneas celulares que
sobreexpresan MRP1, HEK293/MRP1 y HL60/Adr, mostraron una
alta resistencia a vincristina, vinblastina, etopósido y doxorrubicina
(Wu et al., 2005). En la presente investigación, demostramos que
ibruti nib, en concentraciones que mostraban poca o ninguna
toxicidad, potenciaba significativamente la citotoxicidad de sustratos
conocidos de MRP1 en células que sobreexpresan MRP1. Este
efecto fue mucho más potente que MK571, un conocido inhibidor del
flujo de salida del fármaco MRP1. Sin embargo, las mismas
concentraciones de ibrutinib no sensibilizaron las células parentales
HEK293/pcDNA3.1 o HL60 a los agentes anticancerígenos. Además,
ibrutinib no afectó las potencias de los sustratos que no son MRP1,
como cisplatino, paclitaxel y 5-FU. Otro inhibidor de BTK, PCI 29732,
también mostró la reversión de los efectos de MRP1, pero este efecto
fue mucho más modesto (información de apoyo, figura S2 y tabla
S3). Además, hemos investigado los efectos de ibru tinib en cultivos
primarios de blastos leucémicos derivados de pacientes.

8 Revista británica de farmacología (2014) •• ••–••

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Ibrutinib revierte la multirresistencia mediada por MRP1
BJP

Figura 4
Ibrutinib mejoró el efecto de la vincristina en el crecimiento de un modelo de xenoinjerto de células HEK293/MRP1 que sobreexpresa MRP1 en ratones desnudos atímicos.
(A) Las imágenes de tejidos tumorales HEK293/MRP1 extirpados de diferentes ratones se muestran el día 20 después de la implantación (n = 7). (B) Se muestran
los cambios en el volumen del tumor con el tiempo en el modelo de xenoinjerto MRP1. (C) Pesos medios (con DE) de los tumores HEK293/MRP1 extirpados de los
ratones tratados con vehículo, ibrutinib, vincristina o una combinación de ibrutinib y vincristina (n = 7 de cada grupo). *P < 0,05 frente al grupo de vehículo; #P < 0,05
frente al grupo de paclitaxel. (D) Porcentaje promedio de cambio de peso corporal después de los tratamientos.

células. Nuestros resultados indicaron que MRP1 se sobreexpresaba
en dichas células y que ibrutinib sensibilizaba a los blastocitos de
leucemia a la citotoxicidad de la vincristina en muestras que
sobreexpresaban MRP1. Estos resultados indicaron que ibrutinib
sensibilizó significativamente las células que sobreexpresan MRP1
a los agentes quimioterapéuticos que también eran sustratos de MRP1.
Para investigar los mecanismos potenciales por los cuales
ibrutinib sensibilizaba las células MDR a los fármacos antineoplásicos,
examinamos el efecto de ibrutinib en la acumulación de sustratos
en las células que sobreexpresan MRP1. Los resultados mostraron
que ibrutinib aumentó la acumulación intracelular de sustratos en
estas células. Los estudios de eflujo confirmaron
que este efecto se logró antagonizando la función de eflujo del
transportador MRP1. En un análisis más detallado de los mecanismos
involucrados, realizamos RT-PCR, Q-PCR y Western blot para
determinar los niveles de expresión de mRNA y proteína de MRP1
respectivamente. Los resultados indicaron que ibruti nib no alteró la
expresión de mRNA o proteína del
Transportador MRP1, que eliminó la posibilidad de regulación a la
baja de los niveles de proteína de MRP1 por ibrutinib.
Estudios farmacocinéticos previos informaron que ibrutinib, a
una dosis de 14,2 mg·kgÿ1 , podría producir
plasmática una concentración
máxima de 1,07 ÿM
(Honigberg et al., 2010). Por lo tanto, la dosis de 30 mg·kgÿ1
utilizada en nuestros experimentos in vivo puede producir una
concentración plasmática que podría alcanzar el rango de
concentración que utilizamos para los estudios celulares. Por lo
tanto, asumimos que las concentraciones de ibrutinib utilizadas en
los experimentos de reversión in vitro se lograron en los tejidos
tumorales después del tratamiento terapéutico. Con el fin de
determinar si los efectos in vitro de ibrutinib se pueden traducir al
entorno in vivo , examinamos el efecto de ibrutinib sobre la actividad antitumoral
lidad de vincristina en el modelo usando xenoinjertos HEK293/MRP1
que sobreexpresan MRP1. De acuerdo con hallazgos anteriores,
nuestros resultados actuales mostraron que la vincristina sola redujo
levemente los volúmenes tumorales. Sin embargo, la combinación
de ibrutinib con vincristina resultó en una mejora significativa

Revista británica de farmacología (2014) •• ••–•• 9

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H Zhang et al.
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Figura 5
Ibrutinib aumentó la citotoxicidad de vincristina en cultivos primarios derivados de pacientes de células blásticas leucémicas con sobreexpresión de MRP1. Se
recogieron muestras de médula ósea de nueve pacientes recién diagnosticados. (A) La expresión de MRP1 en cultivos primarios de blastos de leucemia se
determinó mediante transferencia Western. Las muestras de tres pacientes mostraron niveles más altos de MRP1. (B, C, D) Mejora por ibrutinib de la citotoxicidad
de vincristina en cultivos primarios de blastos de leucemia con sobreexpresión de MRP1 de los tres pacientes con niveles altos de MRP1. Los datos que se
muestran son medias ± DE para determinaciones independientes por triplicado.

actividad antitumoral de la vincristina en este modelo de xenoinjerto Agradecimientos

tumoral HEK293/MRP1 (Figura 4A y B). Además, no hubo cambios
sustanciales en el peso corporal de los ratones tratados con la
combinación de fármacos en comparación con los que recibieron el
tratamiento farmacológico individual solo (Figura 4D). Por lo tanto,
pudimos demostrar que ibrutinib potenció significativamente el
efecto antitumoral de la vincristina en xenoinjertos de células
HEK293/MRP1 que sobreexpresan MRP1.
En conclusión, proporcionamos la primera evidencia in vitro, in
vivo y ex vivo de que ibrutinib podría mejorar significativamente la
eficacia de los agentes quimioterapéuticos en células MDR que
sobreexpresan MRP1, un efecto logrado al antagonizar la función
de salida del transportador MRP1. Aunque la combinación es eficaz,
cabe señalar que los efectos citotóxicos de la doxorrubicina
provocan, según se informa, alteraciones en la función cardíaca y
la localización de MRP1 en el corazón protege al corazón de dichos
agentes. Por lo tanto, cuando se combina con agentes moduladores
de MRP1 como ibrutinib, la función cardíaca debe controlarse
cuidadosamente. La combinación de ibrutinib con sustratos de
MRP1 podría tener un valor clínico significativo y se justifica una
mayor investigación clínica.
Agradecemos al Dr. Suresh Ambudkar por las células HEK293/
MRP1 (NCI, NIH, Bethesda); Drs. SE Bates y RW Robey (NCI, NIH,
Bethesda) para células HL60 y HL60/Adr; estamos agradecidos con
ChemieTek (Indianapolis, IN, EE. UU.) por proporcionar una muestra
gratuita de ibrutinib para nuestro estudio del proyecto. Este trabajo
fue apoyado por la Beca Semilla de Investigación de la Universidad
de St. John (No. 579-1110-7002) para Z.-SC y el principal proyecto
de ciencia y tecnología del Programa 863 de China (No.
2012AA02A303) para L.-WF, National Fundación de Ciencias
Naturales de China (No. 81072669 y No. 81061160507) para L.-WF
Contribuciones de autor
HZ, AP, S.-LM, XJL, P.-QY e Y.-KZ realizaron investigaciones y
analizaron los datos. HZ y AP escribieron el manuscrito. RJK, Y.-
JW y NA colaboraron en la revisión del manuscrito. Z.-SC y L.-WF
diseñaron la investigación y revisaron el manuscrito.

10 Revista británica de farmacología (2014) •• ••–••

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Ibrutinib revierte la multirresistencia mediada por MRP1
Conflicto de intereses
No hay conflictos de intereses potenciales que revelar.
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Información de soporte
Se puede encontrar información de apoyo adicional en la versión en
línea de este artículo en el sitio web del editor:
http://dx.doi.org/10.1111/bph.12889
Figura S1 Ibrutinib aumentó la acumulación intracelular de doxorrubicina
(DOX) al inhibir la función de salida de MRP1. (A) La acumulación de
DOX se midió en células HL60 y células HL60/Adr con o sin ibrutinib;
Se utilizó MK571 como inhibidor positivo de MRP1. Las columnas son
la media de determinaciones por triplicado; las barras representan SD.
(B)
Se midieron los efectos de ibrutinib sobre la salida de DOX de las
células HL60 y HL60/Adr. Se encontró una disminución dependiente
del tiempo de DOX intracelular (0, 30, 60 y 120 min). Los datos
mostrados fueron medias ± DE para determinaciones independientes
por triplicado. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.
Figura S2 Citotoxicidad de PCI 29732 en células resistentes a fármacos
y sus células parentales sensibles. Curvas de concentración-respuesta
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Ibrutinib revierte la multirresistencia mediada por MRP1
BJP
de células HL60 y HL60/Adr tratadas con PCI 29732 solo. Tabla S1 Resumen de cebadores de PCR.
Los datos mostrados fueron medias ± DE para determinaciones independientes Tabla S2 Características de los pacientes.
por triplicado. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Tabla S3 El efecto de PCI 29732 en la reversión de MDR mediada por MRP1
en células HL60 y HL60/Adr.

Revista británica de farmacología (2014) •• ••–•• 13