Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biológicas

FISICA GENERAL

Proyecto de Investigación
Director: Dr. José Antonio Heredia Rojas.
Co-Director: Abraham Octavio Rodríguez de la Fuente.

EQUIPO: 5
GRUPO: D
INTEGRANTES:
ANA CAROLINA SÁNCHEZ BRISEÑO 2010118
HECTOR ALEJANDRO ALEMAN FLORES 1866609
JANNIS VALERIA ZAMORA TORRES 2127596
ELISA CATALINA RANGEL ALMANZA 1953801
AARON ADAIR CURA ALANIS 1963652
ALI SEBASTIAN SALAZAR MONCADA 1959961
 Efecto de la radiación ultravioleta B en la producción de polifenoles
en la microalga marina Chlorella sp.

INTRODUCCIÓN

Las microalgas son organismos unicelulares que forman parte del fitoplancton
marino. Se encuentran flotando tanto en aguas saladas como dulces, cerca de la
superficie del agua donde hay abundancia de luz solar. Son el primer eslabón de la
cadena trófica en el medio acuático y desempeñan un papel vital en la estabilidad del
ecosistema marino, son una fuente importante de compuestos antioxidantes (fenoles y
polifenoles), generados como mecanismos de defensa frente a factores de estrés
(radiación UV, temperatura, herbívora).

Un cambio o la exposición a los rayos ultravioleta puede llegar a afectar

dramáticamente al fitoplancton marino. Dada la importancia que revisten las microalgas
en los ecosistemas acuáticos en la producción primaria y tramas tróficas, resulta
importante conocer la capacidad de respuesta de estos organismos a la radiación UV-B.

La radiación solar en el rango UV-B (280-315 nm) tiene un alcance a

profundidades significativas, dependiendo de la presencia de compuestos luz-
absorbentes como materia orgánica disuelta, organismos fotosintéticos y materia
inorgánica, produciendo un efecto ecológico en muchos ecosistemas de agua dulce y
marinos.

Se han tenido estudios donde se observa los efectos del estrés producidos por la
radiación UV en microalgas influyen en la inhibición de la fotosíntesis, daño al ADN,
proteínas y lípidos; generación de especies reactivas de oxígeno e inhibición en la
asimilación de nutrientes.

Se han realizado diversos estudios en macro y microalgas para evaluar la

resistencia y el efecto a la exposición de radiación UV. Por esta razón es importante
conocer en esta investigación el cómo evaluar la estrategia de adaptación al efecto de la
radiación ultravioleta B en la microalga marina Chlorella sp. a través de la producción de
polifenoles.

Hay evidencias de que organismos como las microalgas pueden presentar

respuestas adaptativas a la exposición de radiación UV, aumentando los niveles de
polifenoles a modo de mecanismo de defensa, este mecanismo de foto protección tiene
gran utilidad para la producción de antioxidantes naturales. Por lo tanto el objetivo de
este proyecto de investigación será evaluar la estrategia de adaptación al efecto de la
radiación ultravioleta B en la microalga marina Chlorella sp. A través de la producción de
polifenoles.

ANTECEDENTES

Estrés oxidativo: producción y acción de los radicales libres.

Un radical libre es aquella figura química que tiene en su estructura uno o más
electrones no apareados. Es altamente reactiva y clave para formar otros radicales libres
en cadena. (Nuñez, 2011). Por la vida media que es de microsegundos, ocurre una
rápida propagación con moléculas aledañas y mayor daño potencial. De hecho un radical
libre puede afectar 1 millón de moléculas durante la reacción en cadena. (Zamora, 2007).

Los radicales libres se liberan durante el metabolismo humano, y también se

producen por contaminantes ambientales, (atmosféricos, acuáticos, de suelos),
radiaciones (ultravioleta, gamma, hertziana), entre otros. Se pueden relacionar con el
consumo o uso de tóxicos como el alcohol, tabaco y drogas o debido a una alimentación
no adecuada, exposición a fertilizantes o pesticidas. Se incluye además el metabolismo
de algunos químicos, elevado estrés físico o psíquico. (Llancari, et al.). , estilo de vida y
situaciones patológicas, pueden generar exceso y acumulación de radicales, resultando
en el establecimiento de estrés oxidativo.
 El estrés oxidativo es un desequilibrio entre la generación y la eliminación
de especies reactivas, las que tienen como característica común el tener un electrón
incompleto en su último orbital. Este desequilibrio ocasiona que la célula sea
abrumada por radicales con gran capacidad oxidante. El estrés oxidativo se ha
relacionado con el envejecimiento y enfermedades crónicas, promoviendo un alto índice
de mortalidad en los últimos años. (Sánchez-Valle et al., 2013). La consecuencia del
estrés oxidativo puede involucrar daño a lípidos, proteínas y ADN, con el desarrollo de
patologías y el envejecimiento subsecuente. (Finkel & Holbrook, 2000)

Los polifenoles y sus propiedades antioxidantes.

Existen dos vías fundamentales para proteger al organismo de los radicales libres;
enzimáticos y no enzimáticos (endógenos y exógenos) y su interacción puede ser
intracelular o extracelular, la vía endógena requiere apoyo externo y por ello se
recomiendan los antioxidantes exógenos cuyo papel es relevante dado que son los que
pueden formar parte de la dieta diaria. (Coronado et al., 2015).

Entre los antioxidantes hay varias familias de principios activos como los
polifenoles y los fitoestrógenos. Entre los primeros se encuentran los flavonoides y los
taninos (polifenoles). (Drago et. al, 2006).

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas, con

diversas funciones fisiológicas. Variadas estructuras químicas caracterizan a este grupo
de moléculas. Su amplia distribución, así como su capacidad de captar especies
reactivas de oxígeno y nitrógeno asociadas con el padecimiento de enfermedades, perfila
a los extractos naturales ricos en compuestos fenólicos como ingredientes que pueden
ser utilizados para el desarrollo de nuevos productos en la industria farmacéutica, de
alimentos y cosméticos. (Ávilés et al., 2017). Estos metabolitos tienen la capacidad de
neutralizar radicales libres, debido a la habilidad de donar los átomos de hidrógeno de
los grupos hidroxilos presente en su estructura de anillos aromáticos, la capacidad de
atrapar radicales libres, funciones como agentes quelantes y la inducción de enzimas
antioxidantes. (Vauzor, 2010)
 En los últimos años se ha demostrado que una dieta rica en polifenoles vegetales
puede mejorar la salud y disminuir la incidencia de enfermedades cardiovasculares.
(Schroeter et al., 2006 ; Perez-Vizcaino et al., 2009).

Compuestos fenoles en algas.

La síntesis de determinados metabolitos secundarios en las algas marinas puede

ser explicada como un mecanismo de defensa contra circunstancias adversas del medio
ambiente entre los que se pueden citar la temperatura, luz solar, pH, estrés oxidativo y
presencia de peces herbívoros. En los mares tropicales las algas están expuestas a una
alta incidencia de luz solar lo que puede conducir a la formación de radicales libres, de
manera que la ausencia de daños oxidativos de sus componentes estructurales y
fisiológicos evidencian que estos organismos presentan un eficiente sistema de defensas
antioxidantes. (Gómez-Gutiérrez, 2011).

Especies de los géneros Bryothamnion y Halimeda se demostraron propiedades

antioxidantes en sistemas libres de células, en modelos experimentales in vitro y en
modelos animales. (Fallarero, 2006 ; Silva et al. 2012). Encontraron cantidades
apreciables de compuestos polifenolicos en especies del genero Halimeda. (Yoshie,
2002). Bryothamnion triquetrum y Halimeda opuntia poseen propiedades antioxidantes
debidas al menos en parte a su contenido de polifenoles, con mayor cantidad de
compuestos polifenólicos en el alga B. triquetrum. (Díaz-Gutierrez et al., 2015)

Se evaluó la actividad antioxidante de diferentes especies de algas y en H. opuntia

encontraron actividad atrapadora de radicales hidroxilos (·OH), explicando las
propiedades antioxidantes por la presencia de florotaninos y terpenoides. (Vauzuor,
2010).
Efectos en la capacidad de absorción de radiación ultravioleta B vistas
en algunas especies de algas.

Muchos organismos producen diferentes sustancias capaces de absorber luz

ultravioleta (Cockell & Knowland, 1999). Dentro de estos compuestos se encuentran los
denominados "pantalla" como las MAAs (Mycosporinelike aminoacids) producidas por
muchas algas y algunas cianobacterias (Bjorn, 2007).

Estudios en plantas vasculares han demostrado que la RUV-B (280-315 nm)

estimula las vías de producción de algunos metabolitos incluyendo polifenoles y
flavonoles. Estos compuestos absorbentes de rayos ultravioleta son principalmente
fenilpanoides tales como ésteres de cinamoilo con ácidos cinámicos. Antocinaínas, que
también se acumulan bajo UVb mejorado en muchas especies de plantas (Tevini, 1993).
La protección de estos organismos a la luz UV incluye sustancias que absorben estas
radiaciones. (Dunlap et al., 1998). Reducen al máximo los daños en las funciones
fisiológicas normales de sus tejidos. Existen trabajos que evidencian la presencia de
compuestos fotoprotectores de radiación UV en algas (Hoyer et al., 2001).

Existen evidencias que organismos como las microalgas pueden presentar

respuestas adaptativas a la exposición de radiación UV, aumentando los niveles de
polifenoles a modo de fotoprotección (Estévez et al., 2001). Se evidencian la presencia
de compuestos fotoprotectores de radiación UV en algas (García-Pichel et al., 1992;
Gómez et al., 1998). Se observó que la excreción de compuestos fenólicos funciona
como un mecanismo de protección que proporciona un filtro de radiación en las
inmediaciones de los talos de Cystoseira tamariscifolia. (López et al., 2014). Arthospira
(Spirulina) platensis y Nostoc spaheroides responden al estrés UVR es a través de
cambios morfológicos mediante compuestos de protección UV. (Helbling et al. 2006).
 HIPÓTESIS
La exposición frente a la RUV-B provoca una respuesta de las microalgas, generando
mayores niveles de sustancias fotoprotectoras.

OBJETIVO.
Evaluar la estrategia de adaptación al efecto de la radiación ultravioleta B (280-315 nm)
en la microalga marina Chlorella sp. mediante la producción de polifenoles.

MATERIALES Y MÉTODOS.

-Obtención de cultivo e irradiación.

En todos los cultivos, la biomasa inicial será de 4.150.000 células mL-1 proveniente
de un cultivo madre de Chlorella sp. A partir de éste se iniciará un cultivo stock de 50 mL
utilizando agua destilada y medio nutritivo, compuesto por cinco soluciones stock, las
cuales deben contener: micronutrientes, macronutrientes, Fe-EDTA, elementos traza y
NaH-CO3 (agregado sólo en el tiempo inicial), bajo luz PAR (Photosynthetically Active
Radiation) con una exposición a luz continua de intensidad l90 ± 10 μιτω! m-2 s-1 de 24
h luz y temperatura ambiente (18-20°C). Los cultivos serán mantenidos bajo las mismas
condiciones que el cultivo stock. La exposición a luz continua se mantuvo con la sola
excepción del período de irradiación. (Copia et al., 2012).

A partir del cultivo stock de Chlorella sp. se iniciarán cuatro nuevos cultivos, uno
denominado "control" (C) (realizado por triplicado para cada uno de los cultivos) y tres
"experimentales" (R1, R2 y R3), siendo estos últimos los que serán expuestos a
diferentes dosis de radiación UV-B. Por cada tratamiento se consideraron tres réplicas.
En las etapas 1 a 3, la irradiación se realizarán a partir del 5° día, durante tres días
consecutivos por períodos de 10, 20 y 30 min respectivamente, correspondiente a dosis
de 2820, 5640 y 8460 J m-2 respectivamente con agitación manual cada 1 min. En la
cuarta etapa los cultivos (R1, R2 y R3) serán irradiados igualmente durante tres días
consecutivos, pero 60 min cada día (16.920 J m-2). (Copia et al., 2012).
-Diseño experimental y obtención de extracto.

A partir del cultivo control y los cultivos experimentales (irradiados) de la primera

etapa, al día siguiente de cada término de exposición, se obtendrán los inóculos para
iniciar la nueva etapa de cultivo (2a etapa). Posteriormente, los tres cultivos
experimentales (R1, R2 y R3) nuevamente serán expuestos a radiación UV-B (470 μW
cm2) durante tres días consecutivos con dosis de 2.820, 5.640 y 8.460 J m-2 con
agitación manual cada 1 min (2a y 3a etapa). En la última etapa (4a etapa) los cultivos
serán irradiados por tres días consecutivos 1 h (16.920 J m-2) cada día. La
determinación de los parámetros de capacidad de producción de polifenoles. (Copia et
al., 2012).

Al término de cada etapa de irradiación de cultivo (posterior a las irradiaciones) se

tomarán 50 mL de cada cultivo (C, R1, R2, R3) los cuales serán centrifugados en tubos
tipo Falcon (previamente pesados) a 4.000 rpm durante 15 min a 10°C con una centrifuga
Hettich Universal K2S, el sobrenadante será eliminado por trasvasije y se conservará el
precipitado (células microalgas). Se agregará 1 mL de etanol p.a. al 99,9% por cada 200
mg de microalgas. Las células en etanol serán sonicadas durante 2 h a temperatura
ambiente en un sonicador Elma Transsonic T310. El homogenizado celular
(células/etanol) obtenido después de la sonicación debe ser centrifugado a 4.000 rpm
durante 10 min a 10°C, el precipitado será descartado y el sobrenadante (extracto) será
guardado en tubos Eppendorf 1,5 mL, almacenados en frío y oscuridad para su posterior
análisis. (Copia et al., 2012).

-Determinación de polifenoles totales.

Para la determinación de polifenoles totales se utilizó el método Folin-Ciocalteu

(Waterman & Mole, 1994). El método de Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los
fenoles para reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene
molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol (Peterson,
1979). formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngsticos que a pH básico se reducen
formando óxidos cromógenos de color azul. (Cortez, et al. 2018).
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