Purificación de ácidos Nucleicos En Bacterias Escherichia Coli Y Staphylococcus

Aureus a partir de cuatro métodos de extracción

Autores: Debora Abigail Argueta Recinos 1109-19-2027

Sindy Dalila Hidalgo Avila 1109-19-14861
Leidy Analy Vasquez 1109-19-5963
Jason Marsoliny Hidalgo Avila 1109-19-6931
Christofer Bladimir Samayoa 1109-19-2018

ABSTRACT
DNA extraction is one of the key steps for nucleic acid analysis, it is based on the
isolation and purification of DNA molecules, mainly based on the characteristics of the
molecule. The main objective was to compare four useful methods for the extraction
of nucleic acids, which were the Salting out method, the organic method, the boiling
method and the adsorption method in E. coli culture samples, for which the
concentration of acids was determined. nucleic acids extracted by different methods.
it was estimated spectrophotometrically by its absorbance at 260 nm. The purity of
the sample was examined by absorbance index, obtaining absorbance indexes at
260/280 nm and 260/230 nm in the agarose gel, respectively. It was possible to
evaluate the methods on the agarose gel in which the four samples extracted from the
E.coli cultures were run. However, a better result was obtained with the organic
method, since the extraction protocol developed allowed obtaining DNA in conditions
of purity and sufficient quantity, presenting a complete sample compared to the other
methods evaluated.

Key words: Extraction, nucleic acids, E. coli, agarose gel, methods.

I. Introducción

Los á cidos nucleicos son biomoléculas de gran tamañ o conformados por nucleó tidos
que son la unidad fundamental de estos á cidos nucleicos, estos está n formados por un
azú car, un grupo fosfato y una base nitrogenada, en el siguiente informa de se llevó a
cabo en aná lisis de la extracció n de á cidos nucleicos con el objetivo de poder obtener
moléculas aisladas con alto grado de pureza, esto mediante la utilizació n de cuatro
diversos métodos de extracció n salting aut, orgá nico, ebullició n y absorció n, la mayor
parte de los métodos consistieron en lograr primero la lisis o ruptura de la célula, para
luego separar las moléculas de á cidos nucleicos del resto de los constituyentes de la
bacteria, dando resultados distintos para cada método, se evidencio la pureza de cada
una de las muestras mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa que el
método má s adecuado es el método orgá nico con un valor 1.82 y 2.01 con lo cual se
comprueba parcialmente la realizació n del procedimiento con éxito permitiendo la
obtenció n de ADN de calidad y pureza ó ptima.
II. Materiales y métodos
Se han desarrollado una serie de
experimento, en las cuales se
realizaron colonias bacterianas de
Escherichia coli y Staphylococcus
aureus, a las cuales se le aplicaron
cuatro métodos de extracció n de ADN
siendo estas las siguientes.
Título 1: Método Salting out.
Si bien muchos pasos y soluciones son
comunes al método de extracció n por
fenol-cloroformo, la principal
diferencia en esta metodología radica
en el empleo de una solució n
concentrada de sales en lugar de
solventes orgá nicos para la lisis celular
y la extracció n de proteínas. La adició n
de una solució n saturada de sales
provoca la agregació n de proteínas y
debris celular, lo que permite su
separació n de los á cidos nucleicos. Por
lo general, estas soluciones se preparan
a saturació n con NaCl. Una
centrifugació n posterior a la adició n de
la solució n concentrada de sales
precipita el debris y las proteínas y deja
libre el DNA en el líquido del
sobrenadante que se transfiere a un
nuevo tubo para su lavado y
precipitado. (Díaz, 2016)
Título 2: Método orgánico.
Los métodos de purificació n de á cidos
nucleicos combinan estrategias tan
diversas como la
extracció n/precipitació n, la
cromatografía, la centrifugació n, la
electroforesis y la separació n por
afinidad, como por ejemplo ara la
extracció n por la técnica del fenol-
cloroformo se utiliza una solució n que
tiene una relació n 25:24:1 v/v de
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico;
por lo general, se añ ade
hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona
como antioxidante del fenol, ademá s de
ser un inhibidor parcial de RNasas,
quelante débil de iones metá licos y
ayuda en la identificació n de la fase
orgá nica por el color amarillo que le
confiere. El alcohol isoamílico se
emplea para reducir la espuma que
puede generarse al agitar,
desnaturaliza las proteínas (entre ellas
las nucleasas) y mantiene la separació n
de la fase orgá nica y acuosa tras la
centrifugació n de la muestra. La
eliminació n de las proteínas y
componentes no hidrosolubles del
homogeneizado celular se efectú a con
la formació n de dos fases con
propiedades de solubilidad
particulares: a) una fase orgá nica
(fenó lica) en la parte inferior del tubo
de precipitado que contiene lípidos,
proteínas y debris celulares, y b) una
fase acuosa en la parte superior (menos
densa), que contiene los á cidos
nucleicos y otras pequeñ as moléculas
hidrosolubles. En la interfase se ubican
la mayor parte de las proteínas debido
a su contenido en aminoá cidos
hidrofó bicos e hidrofílicos. (Díaz, 2016)
Título 3: Método de ebullición.
Esta técnica se basa en que las altas
temperaturas causan dañ o a las
membranas y paredes celulares. Las a partir de las muestras trabajadas con
bajas temperaturas también destruyen cultivos de E. coli ú nicamente.
membranas celulares ya que induce a
la cristalizació n del agua adentro de la En la tabla 1 se muestran
célula lo cual conlleva a la destrucció n detalladamente los datos obtenidos de
de estructuras citoplasmá ticas segú n las diferentes técnicas de extracció n.
(QIAgen, 2016)
Tabla 1: Resultados de los diferentes
métodos de extracció n de ADN
Título 4: Método de adsorción.
Este método se basa en la adsorció n y Método Salting out.
desorció n de los á cidos nucleicos a Escherichia coli 108 ng/uL
membranas de sílice, en presencia de Staphylococcus 95 ng/uL
sales caotró picas. Al adicionar los iones aureus
caotró picos se destruye la capa Radio 260/280 1.85
hidratante, creando un entorno Radio 260/230 2.05
hidrofó bico, lo cual da acceso a que el Método orgánico.
ADN se enlace a las membranas de Escherichia coli 150 ng/uL
sílice de las columnas, por otro lado, las Staphylococcus 135 ng/uL
proteínas y otros contaminantes no se aureus
unen y son eliminados durante el Radio 260/280 1.82
proceso de lavado. El ADN se eluye de Radio 260/230 2.01
la membrana utilizando tampones de Método de ebullición.
elució n con sales ligeramente alcalinos Escherichia coli 78 ng/uL
o agua, que permiten recuperar la capa
Staphylococcus 54 ng/uL
hidratante liberá ndolos de la
aureus
membrana, sin afectar el ADN.
Radio 260/280 1.70
(Albadalejo, 2006)
Radio 260/230 1.45
Método de adsorción.
III. Resultados
Escherichia coli 178 ng/uL
A continuació n, se muestran los Staphylococcus 167 ng/uL
resultados teó ricos de las diferentes aureus
técnicas empleadas. Radio 260/280 1.80
Radio 260/230 2.00
Los resultados constan de
concentraciones de á cidos nucleicos Se realizó una verificació n de los
extraídos en (nanogramos por diferentes métodos de extracció n con
microlitro) en un volumen de 100 uL una electroforesis en gel de agarosa en
de solució n final. la cual se corren las cuatro muestras de
á cidos nucleicos extraídos por cultivos
Todas las muestras utilizadas para la de E. coli, en el marcador 1 Salting out,
extracció n contenían concentraciones 2. Método orgá nico, 3. Método de
de bacterias similares entre sí. Se ebullició n y 4. Método de adsorció n.
presentan radios de absorbancia a
260/280 nm y 260/230 nm obtenidos
Imagen 1: Patrón de la electroforesis
obtenida a partir de la extracción de
ácidos nucleicos de muestras de E.
coli.
1 2 3 4
IV. Discusión
La extracció n de ADN se realiza con el
objetivo de obtener moléculas aisladas
con alta grado de pureza. (Fraga
Nodarse, Rodriguez , Fuentes, Castex, &
Ferná ndez Calienes, 2004).
La elecció n de un buen protocolo para
la extracció n de ADN es un punto
crítico para una adecuada
amplificació n en la técnica de PCR, Los
resultados que se observan en la tabla
1 con relació n al método de Salting aut
ponen en manifiesto la gran
sensibilidad que puede presentar la
técnica al trabajar con pequeñ os
volú menes de muestra, se evidenció la
prevalencia de á cido nucleico con un
valor de 1.85 y 2.05 este valor se
considera aceptable, no obstante esta
relació n resulta un poco variable esto
dependiendo de factores como la
concentració n de ADN o de sales, por
otro lado en este método se puedo
evidenciar que la solubilidad de las
proteínas disminuye, dependiendo de
aminoá cidos hidrofó bicos e
hidrofó bicos que este pueda tener.
(Panilla Bermú dez, 2020).
Con respecto al método orgá nico el
rendimiento obtenido con este método
se sitú a en 150 ng/uL, este rendimiento
fue un rendimiento alto comparado con
los otros métodos, así mismo podemos
mencionar que es frecuente que restos
de solventes orgá nicos contaminen la
muestra, se pudo evidenciar la calidad
de la muestra (Alvis Arango & Giraldo
Vá squez, 2015). El valor de las
relaciones observando en la tabla 1
por lo que se considera que la pureza
del ADN es de pureza ó ptima. En el
método de ebullició n para la extracció n
de ADN, se observa en el gel una
muestra con poca fragmentació n,
observá ndose la prevalencia de á cido
nucleico. Como se muestra en los
resultados en la tabla 1 la relació n de
absorbancia nos indica un valor menor
al ratio esto puede deberse por
presencia de contaminantes, lo que
compromete la funcionalidad de la
muestra. Este método de ebullició n no
tiene ninguna desventaja crítica en
comparació n con las otras técnicas.
(Yamagishi, 2016). Ademá s, para la
extracció n de ADN, se deben considerar
la pureza, el rendimiento, el nivel de
contaminació n y la escalabilidad, para
obtener un resultado integro.
Por ú ltimo, en el método de adsorció n
se logro observar una muestra con
poca fragmentació n en el carril cuatro,
tomando en cuenta que en este método
de á cidos nucleicos está n recubiertos
de una capa hidratante de moléculas de extracció n de ADN es el método
agua que mantienen la solubilidad del orgá nico, es muy importante tomar en
DNA en soluciones acuosas. Ademá s, de cuenta las cantidades de los distintos
que la adició n de iones caotró picos a reactivos y soluciones a utilizar por
los á cidos nucleicos, hace que se muestra. Por otro lado, para futuras
destruya la ordenada estructura de practicas se debe contemplar que los
moléculas de agua de la capa ensayos de extracció n deben ser
hidratante, por lo que las sales sencillos, rá pidos, reproducibles,
caotró picas crean un entorno econó micos y seguros que permitan el
hidrofó bico alrededor del DNA, por lo manejo de la cantidad de muestras que
que puede ser posible que esto no haya se quieren analizar
ocurrido adecuadamente causando que
no se obtenga una banda integra.
(Cultek, 2006). Ya que si el ADN está V. Referencias
integro, se observa una banda estrecha
cercana al pozo en que se colocó la
mezcla de ADN, mientras que, si está
fragmentado, se observa una banda de
má s de un cm de ancho o un sendero
luminoso en el carril de la muestra,
como lo fue en el caso del carril 1, 3 y 4.
(Velá zquez, 2015).
La visualizació n de los fragmentos
mediante una la corrida electroforesis
en gel de agarosa Imagen 1 evidencian
la presencia de bandas
correspondiente a cada una de las
muestras de los métodos de extracció n
de ADN, estos resultados ponen en
manifiesto la sensibilidad de cada uno
de los métodos, el carril 2 se puede
evidenciar una sola banda bien definida
considerando que el método orgá nico a
comparació n del método del carril 3 y 4
se podría observar signos de
degradació n, ya que se observa un
pequeñ o extendido o barrido.

Conclusión

Se logró mediante la técnica de

electroforesis en gel de agarosa la
valoració n de la integridad y calidad de
ADN, presentando una banda de ADN
ú nica perfectamente definida que el
método má s adecuado para la
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