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En este capítulo presentamos una descripción general de las diversas técnicas y aplicaciones de la
biofísica. Estos son importantes principalmente por dos razones. Primero, necesitamos saber qué
podemos aprender de cada técnica y cómo cada técnica puede ser útil para estudiar los diversos
temas de biofísica. En segundo lugar, algunas de las técnicas son ramas de la biofísica en sí
mismas.
Las técnicas biofísicas se dividen en dos categorías principales: preparativas y analíticas. Las
técnicas preparativas son aquellas que purifican o aíslan muestras biológicas (organismos, células y
moléculas) o las preparan para su uso en algún otro proceso o experimentación adicional. Las
técnicas analíticas son aquellas que se utilizan para medir aspectos físicos de un sistema biológico.
Muchas técnicas biofísicas se clasifican en ambas categorías al mismo tiempo.
Ultracentrifugación
Una centrífuga es una máquina que se utiliza para hacer girar una muestra de material en círculos.
El movimiento circular ejerce una fuerza sobre la muestra. La fuerza es similar, pero normalmente
mucho mayor que la fuerza de gravedad normal. Una ultracentrífuga es una centrífuga
especialmente diseñada para girar a una velocidad extremadamente alta. Algunas ultracentrífugas
pueden ejercer fuerzas hasta 1 millón de veces mayores que la gravedad.
¿Por qué hacemos esto? Las centrífugas funcionan según el principio de sedimentación. La
sedimentación describe el movimiento de partículas en un fluido bajo la aplicación de una fuerza.
Tomemos, por ejemplo, una bola de nieve; ya sabes, esos recipientes de vidrio o plástico
transparente llenos de agua y algunas partículas brillantes como la nieve. Normalmente, el globo
también contiene algún tipo de escena invernal. Agitas las partículas del interior y luego bajas la
bola de nieve. La fuerza de la gravedad hace que las partículas desciendan lentamente en el agua,
haciendo que parezca que está nevando dentro del globo. Esta es la sedimentación. De hecho, los
chubascos de nieve reales son el resultado de la sedimentación de los copos de nieve en la
atmósfera.
Una ultracentrífuga analítica contiene dispositivos ópticos y sensores especiales que pueden
rastrear el movimiento de moléculas a medida que se centrifugan. Las tasas de sedimentación se
pueden medir directamente en diversas condiciones. Podemos usar las fórmulas que describen la
física de la sedimentación para calcular el tamaño y la forma aproximada de las moléculas.
También se puede utilizar una ultracentrífuga analítica para detectar transiciones
conformacionales y para determinar el número de subunidades que forman un complejo
molecular.
Electroforesis
Un tipo muy común de electroforesis es la electroforesis en gel. Un gel es un fluido que tiene una
estructura molecular que le confiere propiedades similares a un sólido. Las jaleas y mermeladas
son geles. La estructura molecular que le da al gel sus propiedades sólidas también actúa para
obstruir el movimiento de las moléculas disueltas en el gel. Las moléculas más grandes se
obstruyen más fácilmente que las moléculas más pequeñas, por lo que el gel en realidad aumenta
las diferencias en las velocidades de sedimentación entre moléculas de diferentes tamaños dentro
del gel.
Piense en pelotas rodando colina abajo e imagine que hay muchos obstáculos en la colina (postes
de cerca, árboles, arbustos, cajas, etc., cualquier cosa que obstruya las bolas que ruedan
libremente colina abajo). Las bolas rebotan en los obstáculos pero finalmente encuentran su
camino hacia los espacios entre los obstáculos y continúan rodando colina abajo. Pero si las bolas
son de varios tamaños, es más probable que las bolas más grandes, que son más grandes y ocupan
más espacio, golpeen los obstáculos en el camino. Esto es especialmente cierto si los espacios
entre los obstáculos no son mucho más grandes que las bolas más grandes. Cada vez que una
pelota golpea un obstáculo, ralentiza su descenso.
Las bolas más pequeñas, sin embargo, navegan a través de los espacios entre los obstáculos y se
mueven más rápido al pie de la colina. De la misma manera, las moléculas más pequeñas y
compactas se mueven a través de un gel mucho más rápido que las moléculas más grandes.
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es otra técnica que se basa en la sedimentación.
SEC, sin embargo, usa la gravedad, o algunas veces la presión, para sedimentar una solución a
través de un gel. Los geles usados en SEC, sin embargo, difieren de los usados en electroforesis de
la siguiente manera. Los geles SEC no son una pieza sólida de gel, sino más bien una suspensión
compacta de perlas de gel o partículas con espacios entre ellas. Hay poros en la superficie de las
partículas de gel a través de los cuales pasan las moléculas para ingresar a la matriz de gel en el
interior de cada partícula o perla. Estos poros, sin embargo, son muy pequeños, excluyendo
moléculas más grandes. Las moléculas más pequeñas entran en estos poros, pero cuando lo
hacen, pueden tardar un tiempo en atravesar o salir de la perla de gel. Esto ralentiza las moléculas
más pequeñas. Las moléculas más grandes chocan con las partículas de gel (como vimos con la
electroforesis) pero se mueven alrededor de los espacios entre las perlas de gel mucho más rápido
que las moléculas más pequeñas que quedan atrapadas temporalmente dentro de las perlas de
gel. El resultado final es similar a la electroforesis en que las moléculas se separan en función de su
tamaño. Sin embargo, en SEC son las moléculas más grandes las que atraviesan el gel más rápido y
las moléculas más pequeñas las que se quedan atrás. El uso de geles con poros de diferente
tamaño puede "excluir" moléculas de diferente tamaño del interior de las partículas de gel.
Espectroscopia
Solo como recordatorio, toda la radiación electromagnética se puede caracterizar por longitud de
onda o frecuencia. Los dos son inversamente proporcionales. Si conocemos uno, podemos calcular
el otro.
c
ν=
λ
donde ν es la frecuencia, c es la velocidad de la luz (2.9979 × 10 -8 m/s) y λ es la longitud de onda.
Entonces, trazar un espectro por longitud de onda o frecuencia es más o menos lo mismo.
Ciertamente contiene la misma información. La frecuencia, sin embargo, tiene la ventaja de que es
proporcional a la energía; así
E=hν
Originalmente, las técnicas de espectroscopía se desarrollaron usando solo la porción de luz visible
del espectro electromagnético [longitudes de onda de aproximadamente 380 a 750 nanómetros
(nm)], y luego crecieron para incluir ultravioleta, infrarrojo y un rango mucho más amplio de
longitudes de onda.
A lo largo de los años, se han desarrollado técnicas adicionales que no implican necesariamente
radiación electromagnética pero que, no obstante, producen una especie de espectro. Por
ejemplo, la espectroscopia electrónica mide la energía cinética de los electrones que emergen de
la muestra. La espectrometría de masas produce un espectro en función de la masa. Sin embargo,
en general, la mayoría de las técnicas espectroscópicas implican radiación electromagnética. Por lo
tanto, cuando sea necesario para distinguir las formas de espectroscopia que utilizan radiación
electromagnética de otros usos de la palabra espectroscopia, utilizaremos específicamente el
término espectroscopia EM.
Hay docenas de técnicas espectroscópicas utilizadas en las ciencias biofísicas. En las siguientes
secciones describimos brevemente algunas de ellas. Cada tipo de espectroscopia nos enseña algo
diferente sobre la muestra biológica, con cierta superposición en lo que podemos aprender de
cada técnica. Por lo general, las técnicas espectroscópicas proporcionan información sobre la
identidad de las moléculas biológicas, su estructura, transiciones conformacionales, unión y
cinética.
Una nota sobre el uso de la palabra luz: A lo largo de este libro usaremos a menudo la palabra luz
con bastante libertad para referirnos a radiación electromagnética. Estrictamente hablando, la
palabra luz está destinada a distinguir aquellas partes del espectro electromagnético que son
visibles para los organismos vivos. En la práctica, la luz es algo con lo que estamos muy
familiarizados, y el uso de la palabra luz para referirse a la radiación electromagnética enfatiza el
hecho de que todas las formas de radiación EM tienen la misma naturaleza básica que la luz. Es
decir, son campos eléctricos y magnéticos que oscilan rápidamente de varias frecuencias (que
percibimos como color) y amplitudes (que percibimos como intensidad o brillo). Por lo tanto,
puede asumir dentro del contexto que la luz está destinada a transmitir en general cualquier parte
o todo el espectro electromagnético, desde los rayos gamma y los rayos X, a través de la luz
visible, las microondas e incluso las ondas de radio. Por supuesto, siempre que sea importante
distinguir una porción del espectro electromagnético de otra o dejar muy claro de qué tipo de luz
estamos hablando, entonces usaremos calificadores específicos como infrarrojo, visible,
ultravioleta, rayos X y seguimos.
Espectroscopía de absorción
La absorbancia de una muestra determinada depende de tres cosas: (1) la capacidad intrínseca de
las moléculas en solución para absorber luz, (2) la concentración de las moléculas en solución y (3)
la longitud de la trayectoria de la luz a medida que pasa a través de la muestra (es decir, si el
recipiente de la muestra es más grande, entonces la luz tiene que atravesar más solución antes de
llegar al otro lado, y así se absorberá más luz). Dado que nuestro objetivo es conocer la capacidad
de una molécula determinada para absorber luz, de alguna manera necesitamos tener en cuenta
la concentración de la solución y la longitud de la trayectoria de la luz. El coeficiente de extinción
molar es una medida que tiene en cuenta tanto la concentración como el espesor de la muestra
en estudio. Lo hace expresando la absorbancia en unidades que son por concentración y por
longitud (M-1cm-1).
Observe en la figura 3-1 que la diferencia de absorbancia entre las dos formas de hemoglobina es
mayor a una longitud de onda de aproximadamente 690 nm. Esto significa que podemos medir la
absorbancia a 690 nm como una forma conveniente de determinar la proporción de hemoglobina
con oxígeno unido a ella. Por ejemplo, digamos que tenemos una muestra de hemoglobina. Ahora
digamos que medimos la diferencia de absorbancia entre nuestra muestra y la hemoglobina libre
de oxígeno para que sea solo 3/4 de la diferencia que esperamos para la hemoglobina
completamente oxigenada. Entonces podemos decir que el 75% de los sitios de unión de oxígeno
en nuestra muestra de hemoglobina tienen oxígeno unido a ellos, mientras que el 25% permanece
desocupado.
En muchas moléculas, la absorción de luz también varía con la conformación, así como con la
presencia o ausencia de ligandos unidos. Por tanto, la espectroscopia de absorción se puede
utilizar para seguir las transiciones conformacionales y la unión del ligando. La espectroscopía de
absorción por barrido de temperatura mide la absorbancia (generalmente en una sola longitud de
onda) en un rango de temperaturas. Esto es útil para estudiar las transiciones conformacionales
inducidas por la temperatura, es decir, los cambios en la forma molecular que pueden producirse
por cambios de temperatura. Esta es una técnica común para estudiar las transiciones
conformacionales en membranas, proteínas y ADN (ácidos nucleicos). Vea la Fig. 3-2.
Figura 3-2 • Una hélice de ADN monocatenaria
absorbe más luz a 260 nm que una doble
hélice. Esto hace posible utilizar la absorción a
260 nm para medir el desenrollamiento de la
doble hélice del ADN en hebras individuales de
ADN. La transición conformacional de ADN de
doble hélice a monocatenario puede inducirse
aumentando la temperatura. Esto hace que la
espectroscopia de absorción por barrido de
temperatura sea una herramienta conveniente
para estudiar estas transiciones
conformacionales en el ADN.
Espectroscopia de fluorescencia
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es una técnica en la que moléculas o partes de moléculas se ionizan y
luego pasan a través de un campo magnético. Al medir el movimiento de las moléculas cargadas
en el campo magnético, es posible obtener una medición muy precisa de la masa o el peso
molecular de las moléculas.
La espectrometría de masas se utiliza tanto para determinar los pesos moleculares como para
identificar moléculas (una vez que se conoce el peso molecular). Cuando se combina con otros
métodos, la espectrometría de masas también puede revelar información sobre la estructura de
las moléculas. Las moléculas muy grandes que se encuentran típicamente en los sistemas
biológicos presentan desafíos particulares. Las moléculas grandes pueden ser difíciles de ionizar de
una manera cuantificable y puede ser difícil hacer que vuelen a través del vacío (un requisito para
la espectrometría de masas). Sin embargo, los avances recientes están haciendo que el uso de la
espectrometría de masas en biofísica sea bastante fructífero.
Cristalografía de rayos X
La cristalografía de rayos X es una técnica para determinar las posiciones relativas de los átomos
dentro de un cristal. Un cristal es una disposición ordenada, tridimensional y repetitiva de átomos
o moléculas. Se pueden cristalizar muchas sustancias; esto significa que las condiciones se pueden
arreglar para que las fuerzas intermoleculares hagan que las moléculas se alineen de manera
organizada y repetida.
Los rayos X, como saben, son un tipo de radiación electromagnética, al igual que la luz. Pero los
rayos X no son visibles a simple vista. En su lugar, utilizamos películas fotográficas y otros
dispositivos de detección para "ver" los rayos X y medir su intensidad.
• La RMN implica la interacción de la luz (EM) con los núcleos de los átomos de una molécula,
mientras que la mayoría de las formas de espectroscopia EM implican la interacción de la luz con
los electrones de la molécula.
• La RMN implica la aplicación de un fuerte campo magnético a la muestra que se está estudiando.
Este campo magnético altera y limita algunos de los estados de energía disponibles para los
núcleos; esto es lo que permite medir la absorción y emisión de EM por los núcleos de la muestra.
• La RMN usa EM en la porción de radiofrecuencia (RF) del espectro (mientras que, por ejemplo, la
espectroscopia de absorción y fluorescente generalmente se basa en EM en las regiones
ultravioleta, visible e infrarroja del espectro EM).
La RMN funciona según el principio básico de que una carga giratoria (como el núcleo de un
átomo) genera un campo magnético. En otras palabras, el núcleo es como un pequeño imán. En
condiciones normales, los espines de los distintos núcleos se orientan aleatoriamente en cualquier
dirección. Sin embargo, bajo la influencia de un campo magnético fuerte, los espines nucleares
están limitados a solo ciertas orientaciones con respecto al campo magnético externo (típicamente
paralelo y antiparalelo al campo magnético).
Cuando un núcleo salta de una orientación de espín a otra, absorberá o emitirá radiación EM. La
frecuencia de esta radiación EM será proporcional a la diferencia de energía entre los dos estados
de espín. Al escanear el espectro EM, podemos encontrar todas las frecuencias específicas en las
que los núcleos están absorbiendo y emitiendo radiación, y así determinar todas las diferencias de
energía entre los estados de espín. Cada una de estas diferencias de energía depende de la fuerza
del campo magnético en la región local de la molécula que rodea el núcleo. Los núcleos que están
protegidos por electrones y otros átomos experimentarán menos del campo magnético aplicado,
por lo que la diferencia de energía entre sus estados de espín será menor. La menor diferencia de
energía entre los estados de espín significa que estos núcleos resonarán con frecuencias más bajas
(menos energía) de EM. Por otro lado, los núcleos que están menos protegidos por electrones y
otros átomos estarán más expuestos al campo magnético. Estos núcleos resuenan con EM de
mayor frecuencia. Por lo tanto, al observar qué frecuencias de luz se absorben y emiten como
resultado del campo magnético, podemos inferir información estructural sobre las moléculas.
Microscopio electrónico
Los microscopios de luz más potentes proporcionan solo el aumento suficiente para ver objetos de
más de 200 nm. Esta limitación se debe a la longitud de onda de la luz visible. En 1928, el físico
Ernst Ruska estaba experimentando con lentes magnéticos para enfocar haces de electrones y se
dio cuenta de que era posible aprovechar la longitud de onda más pequeña de los electrones para
crear un dispositivo de imagen que teóricamente podía tener un aumento mayor que un
microscopio óptico. En 1931, Ruska y su compañero, el ingeniero Max Knoll, construyeron el
primer microscopio electrónico. Aunque no era más poderoso que un microscopio óptico, habían
probado el concepto de usar haces de electrones enfocados para obtener imágenes
microscópicas. En 1933 construyeron un microscopio electrónico que superó el poder de
resolución de los microscopios ópticos. Hoy en día, los microscopios electrónicos son capaces de
ver objetos de 1000 a 2500 más pequeños de lo que se puede ver incluso con el microscopio
óptico más potente.
Mientras que un microscopio óptico enfoca un haz de luz sobre la muestra que se va a ampliar, los
microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones altamente acelerados. Existen varios tipos
de microscopía electrónica. Los dos tipos más comunes son la microscopía electrónica de
transmisión y la microscopía electrónica de barrido. La microscopía electrónica de transmisión
(TEM) es similar a la microscopía óptica en que el rayo pasa a través de una muestra cortada en
rodajas muy finas para proporcionar una imagen en el otro lado. Dado que los electrones no son
visibles para el ojo, la imagen se crea enfocando el haz de electrones en una pantalla de
visualización recubierta con algún material que fluoresce (emite luz visible) en respuesta a los
electrones entrantes. La imagen se puede mejorar aún más utilizando detectores similares a los
que se encuentran en las cámaras digitales.
La microscopía de fuerza atómica (AFM) proporciona imágenes ampliadas similares a las de SEM,
pero con una resolución similar a las de TEM (es decir, aproximadamente 10 veces mejor que
SEM). AFM funciona moviendo una sonda mecánica a través de la superficie del objeto que se
escanea. Por lo tanto, AFM proporciona información verdadera y tridimensional sobre el objeto.
Hay varias variaciones de AFM que varían un poco en cómo se recopilan los datos y en cómo se
manipula la sonda. Todos forman parte de la clase más general de técnicas llamadas microscopía
de sonda de barrido (SPM). Las técnicas más avanzadas de SPM y AFM mantienen la sonda a una
distancia constante de la superficie del objeto para evitar la posibilidad de que la sonda dañe o
deforme la superficie del objeto que se escanea.
Una pinza óptica es un instrumento que usa rayos láser enfocados para crear fuerzas de tamaño
piconewton (10-12 N) que pueden usarse para sostener y manipular partículas microscópicas,
incluso tan pequeñas como una sola molécula o átomo. El fenómeno de los rayos láser enfocados
que mantienen una sola partícula en su lugar en tres dimensiones se llama trampa óptica. Por esta
razón, a las pinzas ópticas también se las denomina trampas ópticas.
Las pinzas ópticas se pueden utilizar para sujetar y manipular partículas de 0,1 nm
(aproximadamente del tamaño de un átomo) a 10,000 nm de tamaño (aproximadamente el
tamaño de una bacteria), y se han utilizado para atrapar virus individuales, moléculas de ADN,
bacterias, células vivas y orgánulos. Las trampas ópticas son particularmente útiles para investigar
la mecánica y las fuerzas asociadas con los motores moleculares. Se pueden usar para clasificar y
separar células de varios tipos o para medir las fuerzas necesarias para doblar o romper una
molécula de ADN.
Pinza de voltaje (Voltage Clamp)
Un voltage clamp es una técnica utilizada en electrofisiología para medir y caracterizar las
corrientes eléctricas en las células, particularmente en las células de tejido excitables como las
neuronas (células nerviosas). La base de la técnica es la capacidad de insertar un microelectrodo
muy fino en la célula, con otro electrodo en contacto con el fluido alrededor del exterior de la
célula. Los electrodos se pueden usar para medir (y manipular) el voltaje o la corriente a través de
la membrana celular. En la técnica de voltage clamp, el voltaje se fija, o se mantiene constante, a
través de un mecanismo de retroalimentación. El valor del voltaje que se mantiene constante se
llama command voltage. El mecanismo de retroalimentación detecta incluso el más mínimo
cambio en el voltaje e inmediatamente bombea corriente a través de la membrana a través del
electrodo para mantener el voltaje en command voltage. Para hacer esto, la corriente generada
por el electrodo debe ser igual y opuesta a la corriente generada por la célula. Registramos la
corriente generada por el mecanismo de retroalimentación y la usamos para calcular la corriente
generada por la célula.
Un voltaje clamp nos permite medir la corriente eléctrica de la célula en una variedad de
condiciones. Si hacemos esto para un rango de command voltage, también podemos medir cómo
afecta el voltaje a la corriente. Esto es útil para descubrir y caracterizar los canales iónicos
activados por voltaje, que son proteínas que se encuentran en algunas membranas celulares y que
permiten que los iones pasen a través de la membrana solo cuando el voltaje está dentro de un
rango particular.
El current clamp es una técnica similar al voltaje clamp, excepto que el mecanismo de
retroalimentación del electrodo se utiliza para mantener constante la corriente (a través de la
membrana) mientras permite que varíe el voltaje. De esta manera podemos medir cómo la célula
varía el voltaje a través de su membrana en respuesta a una corriente particular u otras
condiciones.
El patch clamp es una técnica alternativa para aplicar el electrodo a la célula. En lugar de
introducir un electrodo de metal afilado a través de la membrana celular, el electrodo se coloca
dentro de una micropipeta (un tubo de vidrio muy delgado) lleno de una solución de electrolito, y
la micropipeta se coloca contra la membrana celular. Se aplica una succión suave, formando un
sello hermético entre la micropipeta y la membrana celular (ver Fig. 3-5). Este sello hermético
tiene una alta resistencia eléctrica [1 a 10 megaohmios (MΩ)] aislando eléctricamente el pequeño
parche de membrana debajo del electrodo. Esto nos permite investigar el comportamiento de un
solo canal iónico dentro de la membrana.
FIGURA 3-5 • Técnica de patch clamp: en
lugar de introducir un electrodo de
metal afilado a través de la membrana
de la célula, el electrodo se coloca en
una micropipeta (un tubo de vidrio
delgado) y la micropipeta se sostiene
contra la membrana de la célula.
NOTA: Los términos voltaje clamp, current clamp y patch clamp suenan como dispositivos en lugar
de técnicas. El dispositivo, sin embargo, es el mismo para los tres. El dispositivo consta de un
electrodo, algunos cables y una unidad de retroalimentación electrónica que es capaz de medir y
manipular tensiones y corrientes simultáneamente. Las técnicas difieren principalmente en la
configuración del dispositivo: si medir corriente o voltaje, cuál mantener fijo (y a qué valor) y cuál
manipular a través del mecanismo de retroalimentación. En el caso de la pinza de parche, se
agrega una micropipeta (un tubo de vidrio delgado, que se encuentra comúnmente en cualquier
laboratorio de fisiología) en la que se coloca el electrodo.
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