Tesis - Linares - Rebollo BDZ PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA
DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

ZARAGOZA
IDENTIFICACIN DE METABOLITOS DE BENZODIACEPINAS EN

ORINA MEDIANTE LAS TCNICAS DE INMUNOENSAYO Y GC/MS
T S I S
PARA OBTENER EL TTULO DE :
QUMICO FARMACUTICO BILOGO

P R E S E N T A :
MIRNA LINARES REBOLLO
DIRECTOR DE TESIS: MTRO. en C. ISIDRO HINOJOSA LPEZ
MXICO D.F. 2013

IDENTIFCACIN DE METABOLITOS DE BENZODIACEPINAS EN ORINA MEDIANTE LAS TCNICAS DE INMUNOENSAYO Y GC/MS.
CONTENIDO. Pg.
1. Resumen. 4
2. Introduccin. 5
3. Marco Terico. 6
3.1 Antecedentes Histricos. 6
3.2 Estructura Qumica de Benzodiacepinas. 8
3.3 Clasificacin de Benzodiacepinas. 10
3.4 Rutas Metablicas de Benzodiacepinas. 12
3.5 Consideraciones Generales. 22
3.5.1 Farmacocintica. 22
3.5.2 Farmacologa, Receptores. 23
3.5.3 Reacciones Adversas. 27
3.5.4 Sobredosis. 27
3.5.5 Toxicologa de Benzodiacepinas. 28
3.5.6 Interacciones. 29
3.5.7 Dependencia y Tolerancia. 30
3.6. Cadena de Custodia para Muestras de Orina. 31
3.6.1 Coleccin de Muestras para Deteccin de Drogas. 31
3.6.2 Invalidacin de Muestras de Orina. 32
3.6.3 Deteccin de Adulteracin de Muestras de Orina. 33
3.6.4 Seguridad de Personal de Laboratorio. 33
3.6.5 Transporte y Almacenamiento de Muestras de Orina. 34
3.6.6 Forma de Anlisis de Drogas. 34
3.6.7 Garanta de Calidad. 34
3.7. Tcnicas de Inmunoensayo para Benzodiacepinas y sus Metabolitos en Orina. 35
3.7.1 Tcnica de Inmunoensayo Enzimtico Multiplicado (EMIT). 36
3.7.2 Inmunoensayo Cromatogrfico de Flujo Lateral en un Solo Paso. 37
3.8. Hidrlisis, Extraccin y Derivatizacin, para deteccin de Benzodiacepinas. 39
3.8.1 Hidrlisis Enzimtica. 41
3.8.2 Extraccin Lquido-Lquido. 41
3.8.3 Extraccin Fase Slida. 43
3.8.4 Derivatizacin. 45
3.9. Tcnicas de Confirmacin para Benzodiacepinas y sus Metabolitos en Orina. 47
3.9.1 Cromatografa de Gases (CG). 47
3.9.2 Cromatografa de Gases-Espectrometra de Masas (CG/MS). 48
2
.
4. Planteamiento del Problema. 50
5. Justificacin. 50
6. Importancia del Estudio. 50
7. Objetivo General. 51
7.1 Objetivos Particulares. 51
8. Metodologa. 52
9. Diagrama de Flujo. 52
10. Resultados. 53
10.1 Tcnicas de Inmunoensayo Cromatogrfico en un Solo Paso y EMIT. 55
10.2 Hidrlisis Enzimtica, cida, Alcalina / Extraccin lquido-lquido en orina. 61
10.3 Hidrlisis Enzimtica / Extraccin Fase Slida en Orina. 67
10.4 Tcnicas GC, GC/MS. 71
11. Anlisis de Resultados. 84
12. Conclusiones. 86
13. Glosario. 87
14. Referencias. 89
15. Anexos. 93
15.1 Ejemplos de caractersticas de Benzodiacepinas. 94
15.2 Ejemplo de Formato de Cadena de Custodia. 100
15.3 Ejemplos de Espectrogramas. 101
3
1. Resumen
El presente trabajo es una revisin de manuales, libros, revistas de forma fsica y
electrnica de las tcnicas de orientacin preliminar de inmunoensayo
cromatogrfico de flujo lateral en un solo paso, EMIT y confirmatoria GC, GC/MS,
ms empleadas en los laboratorios de toxicologa para la identificacin de
benzodiacepinas y sus metabolitos en una matriz biolgica como es la orina, para
su aplicacin clnica y forense.
Estos mtodos son fundamentales en cualquier investigacin criminalstica con el

fin de esclarecer un hecho delictivo por ello las tcnicas de inmunoensayo resultan
adecuadas para proporcionar una respuesta cualitativa rpida y fiable sobre el
consumo de benzodiacepinas en combinacin con la cromatografa de gas y
espectrometra de masas, que son consideradas como tcnicas vlidas de
confirmacin. Tienen como finalidad el diagnstico del abuso en el consumo de
benzodiacepinas en el marco de un proceso penal, como monitoreo clnico en
toxicologa y en tratamientos de rehabilitacin.
4
2. Introduccin.
El abuso de benzodiacepinas puede presentarse bajo dos patrones: el abuso

deliberado por parte de personas que usan drogas con fines placenteros y el abuso
no intencional por pacientes que comienzan a utilizar benzodiacepinas para el
tratamiento de un trastorno de ansiedad y posteriormente se autoadministran dosis
mayores a las prescritas o lo hacen durante un tiempo ms prolongado del indicado
por el mdico, con frecuencia abusan tambin de otras sustancias con el mismo
objetivo, para evitar efectos desagradables por la abstinencia de opioides o tratar
los efectos adversos de otras drogas (cocana y otros psicoestimulantes).
Se ha asociado, a algunas benzodiacepinas en crmenes como robo, secuestros y
violaciones; ingeridas en combinacin con comida o licor, por tener efectos
amnsicos fuertes e incluso se pueden cometer actos de extrema violencia;
dejando al atacante sin memoria de lo ocurrido, durante su estado inducido por la
droga. Se ha propuesto que los actos criminales y violentos producidos bajo los
efectos de benzodiazepinas pueden estar relacionados a niveles bajos de
serotonina por medio de efectos gabanrgicos.
Debido a la transformacin parcial de las benzodiacepinas en el organismo da lugar
a la aparicin de entidades qumicas diferentes, lo que conlleva a la actualizacin
de informacin para el desarrollo de tcnicas de laboratorio lo suficientemente
sensibles y especficas para la deteccin de benzodiacepinas en matrices
biolgicas por lo que se necesita de tcnicas inmunoensayo y equipos
especializados como CG/MS para el anlisis confirmatorio adems de contar con
patrones de referencia de benzodiacepinas y sus metabolitos.
La deteccin de benzodiacepinas es de gran inters para la bsqueda de un

diagnostico inicial de farmacodependencia, ingesta incontrolada, descartar una
intoxicacin, como prueba para iniciar un tratamiento o para investigar el
cumplimiento en la medicacin y el esclarecimiento de un hecho delictivo.
5
3. Marco Terico.
3.1 Antecedentes Histricos.

La primera benzodiazepina (BZD) fue el clordiazepxido, nombrado inicialmente
Metaminodiazepxido, descubierta en 1949 por el cientfico Leo Sternbach y
sintetizada luego en 1955 por laboratorios Roche en Nutley, Nueva Jersey,
comercializada a partir 1957 bajo el nombre de Librium. Las pruebas realizadas con
el clordiazepxido en animales demostraron que el compuesto era un efectivo
hipntico, ansioltico y relajante muscular. Despus del lanzamiento del
clordiazepxido, se comercializ el Diazepam con el nombre de Valium, una
versin simplificada del clordiazepxido, seguido por otras benzodiacepinas,
empleadas en problemas con etiologas emocionales, provocando una reaccin de
bienestar.1,2
El principio activo se sintetiza por condensacin, entre una o-aminobenzofenona
sustituda y un derivado del aminocido glicina; la obtencin de los precursores es
por medio de una hidrlisis de benzodiacepinas, lo cual constituye un indicio de una
posible degradacin del frmaco.3
Las benzodiacepinas son actualmente los psicofrmacos ms prescritos a nivel

mundial por sus propiedades sedantes, hipnticas, ansiolticas, miorrelajantes
(relajantes musculares) y anticonvulsivas. Se utilizan en terapia de ansiedad,
epilepsias, abstinencia alcohlica y espasmos musculares. Son tambin usados en
ciertos procedimientos invasivos como endoscopa o procedimientos dentales
cuando el paciente presenta ansiedad o inducir sedacin y anestesia. Se usan para
tratar los estados de pnico causados en intoxicaciones por alucingenos.4
Producen dependencia tanto psquica como fsica, que se conoce como sndrome
de abstinencia. Son depresoras del sistema nervioso central se utilizan con fines
delictivos para robo o abuso sexual dejando a la victima indefensa.5 Presenta, el
fenmeno de tolerancia, en especial la "tolerancia cruzada", que es un efecto por el
cual un consumidor de varias drogas se hace tolerante a otras, a pesar de no haber
tenido con stas ningn encuentro previo.6
Un ejemplo de benzodiacepina es el flumitrazepam cuyo nombre comercial es
Rophynol, frmaco empleado en el tratamiento a corto plazo de insomnio y como
un sedante hipntico y pre-anestsico (entre sus consumidores es conocido como
"chicota" al usarse por va nasal). Tambin es empleado en tratamientos de
procesos de intoxicacin en presencia de convulsiones crnico-clnicas. 6
Este frmaco es producido y vendido legalmente en Estados Unidos, Europa y

Amrica Latina bajo prescripcin y control mdico, generalmente se asociado al
trfico de otras substancias ilegales, principalmente cocana y marihuana. 6
Las estadsticas indican que su distribucin y abuso estn aumentando, debido a

su bajo costo; informes epidemiolgicos muestran el marcado crecimiento de su
consumo por parte de los jvenes, en Mxico el flunitrazepam es una de las
6
benzodiacepinas de mayor consumo, en concentraciones menores de 1 mg/tab;

con base en las estadsticas, se puede dar referencia un mercado cautivo en los
reclusorios del Distrito Federal y de los estados en general, se consume con
alcohol o despus de la ingestin de cocana.7,8
La gran difusin de esta sustancia, puede explicarse, debido a la creencia errnea

de que se trata de sustancias que no pueden ser adulteradas, en segundo lugar
porque piensan que no puede detectarse su consumo mediante anlisis de orina. 6
7
3.2 Estructura qumica de Benzodiacepinas.
En general las benzodiacepinas estn compuestas por un anillo bencnico (A),

unido a un anillo diazepnico (B).9, 10
Figura 1.- Estructura general de Benzodiacepinas (Tomado de: Sllhuber, 1996).
Las BZD ms utilizadas se pueden dividir en tres subgrupos:

1,4-Benzodiacepinas: Contienen tomos de nitrgeno en las posiciones 1 y 4 del
anillo diazepnico. A este grupo pertenecen las BZD ms importantes desde el
punto de vista teraputico, Ej: Diazepam, Clordiazepxido y Lorazepam (Ver
Anexos 15.1).11
1,5-Benzodiacepinas: Contienen tomos de nitrgeno en las posiciones 1 y 5 de
anillo diazepnico. Ej. Clobazam (Ver Anexos 15.1).11
BZD tricclicas: Se componen a menudo del ncleo 1,4 benzodiacepina con un
anillo adicional acoplado en las posiciones 1 y 2. Algunos de este grupo son el
Alprazolam, Triazolam y Midazolam (Ver Anexos 15.1).11
No se ha establecido una correlacin definitiva entre la estructura qumica y la
accin farmacolgica de estos derivados. Se sabe que los diversos sustituyentes
inducen cambios relativos tanto en, potencia farmacolgica, propiedades
farmacocinticas que condicionan la distribucin del frmaco y la duracin de su
efecto.10
8
Tabla 1.- Ejemplos de substituyentes de Benzodiacepinas. (Tomado de: COFCR,

2010).
Benzodiacepina R1 R2 R3 R7 R2*
Anillo triazolo
Alprazolam -H -Cl -H
fusionado
Anillo triazolo Anillo
Brotizolam -H -Cl
fusionado tieno
Clordiazepxido (-) -NHCH3 -H -Cl -H
Clobazam -CH3 =O -H -Cl -H
Clonazepam -H =O -H -NO2 -Cl
Clorazepato -H =O -COO- -Cl -H
Demoxepam -H =O -H -Cl -H
Diazepam -CH3 =O -H -Cl -H
Flurazepam -CH2CH2N(C2H5)2 =O -H -Cl -F
Halazepam CH2CF3 =O -H -Cl -H
Lorazepam -H =O -OH -Cl -Cl
Anillo imidazol
-H -Cl -F
Midazolam fusionado
Nitrazepam -H =O -H -NO2 -H
Nordazepam -H =O -H -Cl -H
Oxazepam -H =O -OH -Cl -H
Prazepam =O -H -Cl -H
Quazepam -CH2CF3 =S -H -Cl -F

Temazepam -CH3 =O -OH -Cl -H
Anillo triazolo
Triazolam -H -Cl -Cl -Cl
fusionado
La denominacin de estos compuestos, suele peculiarizarse por la terminacin -lam

o -lan (Triazolam, Oxazolam, Estazolam) y por la terminacin pam y pan
(Diazepam, Lorazepam, Lormetazepam, Bentazepam, Flurazepam, Flunitrazepam,
Clonazepam). No obstante, hay excepciones como el Clorazepato Dipotsico
(Tranxilium) o el Clordiazepxido (Librium).9, 10
9
3.3 Clasificacin de Benzodiacepinas.
Las benzodiacepinas se dividen en tres grupos en base a su perfil metablico:

Grupo I: Aquellas que son biotransformadas en el hgado por reacciones oxidativas
(N-Desmetilacin, Hidroxilacin), generando frecuentemente metabolitos activos
que antes de su excrecin tambin sern metabolizados. Un ejemplo es el
Clordiazepxido, que origina varios metabolitos activos importantes desde el punto
de vista clnico (Figura 2).11, 12
Grupo II: Benzodiacepinas conjugadas, no tienen metabolitos activos por lo que la

actividad reside en el compuesto original. Algunos de ellos son Lorazepam,
Oxazepam (Figura 2).11, 12
Grupo III: Aquellas que experimentan un fuerte efecto de primer paso antes de
acceder a la circulacin sistmica y su velocidad metablica est muy unida al flujo
sanguneo heptico. Pueden tener metabolitos de vida media corta pero activos.
Ejemplos son Triazolam, Midazolam (Figura 2).11, 12
10
Figura 2.-Diagrama general de metabolitos de benzodiacepinas. (Tomado de:

Hurl, 2008).
11
3.4 Rutas Metablicas de Benzodiacepinas.
Las benzodiacepinas se metabolizan a travs de la superfamilia conocida como

citocromo P-450. Esta familia es la ruta ms importante de las reacciones de
biotransformacin, est compuesta de al menos 14 familias de genes P-450.
Muchas benzodiacepinas se metabolizan exclusivamente por la va conocida como
CYP3A, su actividad vara mucho entre individuos.3 Tambin se encuentra en el
tracto gastrointestinal. El Midazolam, por ejemplo, es un medicamento
metabolizado exclusivamente por esta enzima, se usa como marcador de la
actividad de esta enzima en los seres humanos. La biotransformacin ocurre
principalmente a nivel de los microsomas hepticos: oxidacin, desmetilacin,
hidroxilacin, desalquilacin, conjugacin con cido glucurnico.13, 14
El metabolismo heptico difiere entre las diferentes benzodiacepinas; algunas

tienen que pasar tanto por fase I-II, como Diazepam, Clordiazepxido, Flurazepam,
Triazolam, Midazolam y Clonazepam, otras como Lorazepam, Oxacepam y
Temacepam slo precisan de la fase II.
En Fase I, mediante la va oxidativa, se produce la hidroxilacin o N-desalquilacin

por parte del sistema enzimtico citocromo P-450, oxdando metabolitos
farmacolgicamente activos. La Fase II consiste en una conjugacin de grupos
hidroxilos y aminos para formar compuestos inactivos que son excretados por la
orina. La mayora de los casos, los metabolitos de la fase I tienen una actividad
biolgica que puede ser ms grande o menor que el compuesto original. Algunas
benzodiacepinas pueden ser considerados profrmacos o prodrogas.13, 14
Adems, la fase I es una va cuya actividad depende de varios factores: puede

estar disminuida su actividad por la edad, enfermedades hepticas. Por el
contrario, es activada por el humo del tabaco o la administracin simultnea de
frmacos que estimulan la activacin del sistema del citocromo P-450 como el
fenobarbital. Por el contrario, la fase II de conjugacin es ms estable y no es
afectada por todos los factores anteriores.13, 14
La enzima CYP3A, slo metaboliza parcialmente el Diazepam y el Flunitrazepam.

Aproximadamente 40% (o ms en el caso del Flunitrazepam) se metaboliza por la
va de la enzima denominada CYP2C19 (Ver Anexo 15.1).13, 14
12
Figura 3.- Va metablica 1,4-benzodiacepina; Nordazepam y Oxacepam son los

metabolitos comunes. (Tomado de: UNDCP ST/NAR/28,1997).
Ketazolam
Medazepam Camazepam
G
l
Clorazepato
u
Diazepam Temazepam
c
u
r
o
Clordiazepxido
n
i
d
Oxazepam
Nordazepam a
c
Oxazolam
i

n
Pinazepam Prazepam Halazepam
13
Figura 4.- Ilustra la ruta general de metabolismo para triazolo- e imidazo-

benzodiazepinas, la hidroxilacin en posicin 1 y 4 que constituye a Alprazolam del
anillo (metilaminobenzofenona) (Tomado de: UNDCP ST/NAR/28,1997).
-hidroxilacin
Glucuronidacin
Apertura del anillo 4-hidroxilacin

(Alprazolam)
-hidroxilacin
Alprazolam R1=CH3 R2=H X=N

Brotizolam R1=CH3 R2=Cl X=N
Estazolam R1=H R2=H X=N
Midazolam R1=CH3 R2=F X=CH
Triazolam R1=CH3 R2=Cl X=N
14
Figura 5.- Ilustra la va metablica para 7-nitrobenzodiacepina, como Nitrazepam,

Flunitrazepam, Nimetazepam y Clonazepam, (reduccin del grupo nitro, seguida de
una acetilacin) (Tomado de: UNDCP ST/NAR/28,1997).
3-hidroxilacin
N-acetilacin
3-hidroxilacin G
l
u
c
u
r
o
Reduccin n
i
d
3-hidroxilacin
a
Desmetilacin
c
i

n
Apertura del anillo

(Nitrazepam)
3-hidroxilacin
Clonazepam R1=H R2=Cl

Flunitrazepam R1=CH3 R2=F
Nimetazepam R1=CH3 R2=H
Nitrazepam R1=H R2=H
Flunitrazepam reducido a 7-amino-flunitrazepam y acetilado para 7-

acetamidoflunitrazepam. Adems, flunitrazepam pasa por N-desmetilacin. Se
debe romper el anillo, para obtener la aminobenzofenona correspondiente.15
15
Figura 6.- Ilustra la va metablica para otras benzodiacepinas, Parte I (Tomado

de: UNDCP ST/NAR/28,1997).
Desmetilacin
Glucuronidacin
Lorazepam
Lormetazepam
3-hidroxilacin
Apertura del anillo
Cloxazolam
Delorazepam
Apertura del anillo 3-hidroxilacin

Glucuronidacin
Haloxazolam
3-hidroxilacin Glucuronidacin
Bromazepam Apertura del anillo hidroxilacin
16
Figura 7.- Ilustra la va metablica para otras benzodiacepinas, Flurazepam es

transformado a desalquilflurazepam, Parte II (Tomado de: UNDCP
ST/NAR/28,1997).
Desalquilacin 3-hidroxilacin
Glucuronidacin
Dezalquilflurazepam
Flurazepam
Hidrlisis Desalquilacin
Etil loflazepato
Fludiazepam
Desalquilacin 4-hidroxilacin
Glucuronidacin
Clobazam Norclobazam
hidroxilacin Glucuronidacin
Desalquilacin
Norclotiazepam Clotiazepam
3-hidroxilacin Glucuronidacin
Tetrazepam
17
La duracin de su accin depende de la liposolubilidad de cada compuesto, si los

compuestos son ms lipoflicos tienen una accin ms corta, ya que tienden a
repartirse rpidamente entre la sangre y el cerebro.13
Las benzodiacepinas y sus metabolitos activos se fijan a las protenas plasmticas

en un porcentaje muy alto (85-99%). Su volumen de distribucin depende de la
liposolubilidad y puede variar ampliamente (Ver Anexo 15.1). 13
Tambin se han clasificado de acuerdo a la intensidad y duracin de la

sintomatologa dependiendo de la farmacocintica (Tabla 2). En benzodiacepinas
de accin larga, el cuadro es suave durando vario das, mientras que en las de
accin corta es intensa pero breve.10, 11
Tabla 2.- Ejemplos de Benzodiacepinas conforme a la duracin del efecto. 2,16
BZD Nombre
Vida Media
(P. Activo) Comercial
Accin Larga
Clarmyl
Clobazam 20-30 mg/d o 10-15 mg/12h
Noiafren
Clordiazepoxido Omnalio *
Clorazepato Nansius
15-30 mg/d o 5-15 mg/12h
Bipotasico Tranxilium
Diacepex
Diazepam
Diazepam Drenain 5-10 mg/d o 2-/10 mg/12h
Stesolid
Valium
Quazepam Quiedorm 7.5-15 mg/d
Accin Intermedia
Bromazepam Lexatin 1.5-6 mg/8h

Accin Corta
Alzam
Alprazolam 0.25, 0.5, 1,2 mg
Farmapram
Abumbra
Oxazepam 15-30 mg/d o 10-30 mg/6-8h
Aplakil
Accin Ultracorta
Midazolam Dormicum 7.5-15 mg/d
18
En las Tablas 3-5, presenta los metabolitos presentes en sangre y orina de

benzodiacepinas. Las propiedades qumicas de estos compuestos determinarn el
tipo de procedimiento analtico.15
Tabla 3.- Metabolitos de Benzodiacepinas en Sangre y Orina (Parte I) (Tomado de:

UNDCP ST/NAR/28,1997).
Benzodiacepina Metabolito en Sangre Metabolito en Orina

Alprazolam
- Hidroxialprazolam
5-Clorobenzofenona
Alprazolam Alprazolam 4-Hidroxialprazolam
2-(3-Hidroximetil-5-metil-
triazol)-5-cloro-
benzofenona
Bromazepam
Bromazepam Bromazepam
3- Hidroxialprazolam
Brotizolam
Brotizolam Brotizolam
- Hidroxibrotizolam
Clordiazepxido
Desmetilclordiazepxido
Demoxepam
Clordiazepxido Demoxepam
Nordazepam
Oxacepam
Nordazepam
Clobazam
Clobazam Norclobazam Norclobazam
4-Hidroxinorclobazam
Clonazepam
Clonazepam
Clonazepam 7-Aminoclonazepam
7-Aminoclonazepam
7-Acetomidoclonazepam
Oxacepam
Clorazepato Nordazepam
Nordazepam
Clotiazepam
Clotiazepam
Clotiazepam Norclotiazepam,
Norclotiazepam
7-(Hidroxialquil)
Delorazepam Delorazepam
Cloxazolam
Lorazepam Lorazepam
Delorazepam Delorazepam
Delorazepam
Lorazepam Lorazepam
Nota: En orina los metabolitos hidroxi estn presentes casi completamente como
glucurnidos.
19
Tabla 4.- Metabolitos de Benzodiacepinas en Sangre y Orina (Parte II) (Tomado

Diazepam
Diazepam
Diazepam Oxacepam
Nordazepam
Nordazepam
Desalquilflurazepam
Etil loflazepato Desalquilflurazepam N-(1-Hidroxietil)
Flurazepam
Estazolam
Estazolam Estazolam
4-Hidroxiestazolam
Desalquilflurazepam
Etil loflazepato Desalquilflurazepam N-(1-Hidroxietil)
Flurazepam
N-(1-Hidroxietil)
Flurazepam Desalquilflurazepam
Flurazepam
Fludiazepam
Fludiazepam Desalquilflurazepam
Desalquilflurazepam
Flunitrazepam
7-Aminoflunitrazepam
Flunitrazepam
Flunitrazepam 7-Acetamidoflunitrazepam
7-Aminoflunitrazepam
Desmetilflunitrazepam
3- Hidroxiflunitrazepam
Oxacepam
Halazepam Nordazepam
Nordazepam
7-Bromo anlogo de
Haloxazolam Ausente
Desalquilflurazepam
Diazepam Ketazolam
Nordazepam Diazepam
Ketazolam
Oxacepam
Nordazepam
Lorazepam Lorazepam Lorazepam
Lormetazepam Lormetazepam
Lormetazepam
Lorazepam Lorazepam
Normedazepam Medazepam
Nordazepam Nordazepam
Medazepam
Oxacepam
Nordazepam
glucurnidos.
20
Tabla 5.- Metabolitos de Benzodiacepinas en Sangre y Orina (Parte III) (Tomado

Midazolam
-hidroximidazolam
Midazolam Midazolam
4-hidroximidazolam
,4 -hidroximidazolam
Nimetazepam
Nimetazepam 7-Aminonimetazepam
7-Aminonimetazepam
Nitrazepam
7-Aminonitrazepam
Nitrazepam 7-Aminonitrazepam 7-Acetamidonitrazepam
2-amino-5-
nitrobenzofenona
Nordazepam
Nordazepam Nordazepam
Oxazepam
Oxazepam Oxazepam Oxazepam
Oxazolam
Oxazolam Nordazepam Oxazepam
Nordazepam
Pinazepam
Pinazepam Nordazepam Oxazepam
Nordazepam
Prazepam
Prazepam Nordazepam Oxazepam
Nordazepam
Temazepam
Temazepam Temazepam
Oxazepam
Tetrazepam
Tetrazepam Tetrazepam
3-Hidroxitetrazepam
Triazolam
Triazolam Triazolam
-Hidroxitriazolam
glucurnidos.
21
3.5 Consideraciones Generales.
3.5.1 Farmacocintica.
La tasa de absorcin es sumamente importante despus de la administracin oral
de las benzodiacepinas para determinar el inicio de los efectos farmacolgicos. Los
cambios cronolgicos de la ocupacin de los receptores dependern de las
variaciones en las concentraciones cerebrales totales, las cuales dependen del
patrn farmacocintico de distribucin, eliminacin y aclaramiento sistmicos.11
Las caractersticas farmacocinticas de las benzodiazepinas van a depender de los
sustituyentes del anillo principal que determinarn su liposolubilidad y metabolismo
(Ver Anexo 15.1).
Tabla 6.- Caractersticas farmacocineticas de Benzodiacepinas (Tomado de:
Mondragn, 2005).
Farmacocintica de Benzodiacepinas
Dosis Unin a
Semivida Metabolitos
Frmaco equivalente protenas
(horas) activos
(mg) plasmticas
(%)
Alprazolam 9-20 No significativos 1 70-75
Betazepam 4-5 No 50-75
Bromazepam 8-30 Si 6 74
Clonazepam 19-60 No 2 86
Clorazepato 30-60 Si 15 82
Clordiazepxido 40-100 Si 25 94-97
Diazepam 40-200 Si 10 97-98.5
Flunitrazepam 15-24 No 1 77-88
Flurazepam 50-160 Si 30 97
Halazepam 15-35 Si 40 98
Ketozolam 30-100 Si 15 96
Loprazolam 8 Si 1-2 80
Lorazepam 9-22 No 2 85
Lormetazepam 9-15 No 1-2 85
Medazepam 26-53 Si 99-99.5
Midazolam 1.5-3 Si 3 0.8-2
Nitrazepam 15-40 No 10 87
Oxazepam 4-24 No 15-30 87-90
Quazepam 25-41 Si 10-15 95
Triazolam 1.5-5 No significativos 0.5 78-85
Asimismo experimentan mltiples pasos metablicos, se acumulan de forma

gradual y son eliminados lentamente del organismo. Los metabolitos tienen su
propia vida media.11
22
Absorcin: se absorben muy bien por va oral. La velocidad de absorcin depende

de la liposolubilidad (entre 30 y 240 minutos). El equilibrio plasma/SNC se alcanza
rpidamente. Por va intramuscular, la absorcin es lenta e irregular. En situaciones
de emergencia (convulsiones) puede utilizarse la va intravenosa.10, 13
Distribucin: Se unen en una proporcin aproximada del 90% al sitio II de la
albmina humana.10
Metabolismo: Estos frmacos se metabolizan a nivel microsomal heptico por
oxidacin, desalquilacin e hidroxilacin. Despus son conjugados con cido
glucurnico o sulfatos, posteriormente eliminados por el rin. A veces los
metabolitos hidroxilados y desalquilados son muy activos, algunos de ellos con
vidas medias superiores a las del frmaco original.10
23
3.5.2 Farmacologa, Receptores.
El GABA es un neurotrasmisor aminocido (cido gamma-aminobutrico), su

receptor se diferencia de los receptores de los neurotrasmisores, en que est
formado por complejos receptores, con lugares de accin para otros compuestos
que modulan la respuesta del receptor al aminocido o a sus agonistas.10, 16
El receptor benzodiazepnico y el receptor del GABA son dos entidades separadas
situadas en la proximidad de un canal inico comn. La fijacin a su receptor del
GABA, o un agonista GABArgico, causa un cambio en su conformacin que
conduce a un aumento en la permeabilidad de la membrana al in cloruro y a la
inhibicin subsiguiente, por hiperpolarizacin, de la neurona postsinptica. La
fijacin del agonista de la benzodiacepina a su receptor causa un cambio en la
disposicin del receptor del GABA que aumenta la afinidad de fijacin para su
ligando, producindose un incremento en la accin del GABA. En consecuencia,
las benzodiacepinas extienden notablemente el perodo durante el cual ni los
estmulos aplicados ni los espontneos pueden desencadenar una descarga
neuronal. 10, 11,16
Figura 8.-Modelo de diversos lugares de accin de distintos frmacos en receptor
GABA (Tomado de: COFCR, 2010).
El receptor GABA es un miembro de la familia de receptores asociados a canales

inicos, formados por una combinacin de subunidades proteicas. Las subunidades
se unen formando canales inicos con selectividad para el ion cloruro. Los
receptores de GABA actan como dianas farmacolgicas de distintos
compuestos como las BZD. La farmacologa de un receptor GABA depende de las
isoformas de las subunidades proteicas que lo constituyen. Se conocen hasta 7
clases distintas de subunidades con mltiples variantes (1-6, 1-3, 1-3, 1-
3, , y ).10
24
Figura 9.-Modelo de complejo macromolecular del canal de cloro receptor GABA

(Tomado de: COFCR, 2010).
Se sabe que la mayora de los receptores GABA estn formados por subunidades,
, constituido por una protena oligomrica, compuesta por 5 unidades. Se ha
sugerido la existencia de subtipos de receptores benzodiacepinicos en funcion de
la subunidad:
Receptores de benzodiacepinas BZ-1(W1), contienen la subunidad 1.

Receptores de benzodiacepinas BZ-2(W2), contienen subunidades 1, 3, 5.10
Tabla 7.- Receptores benzodiacepinicos.13, 14
BZ-1 (W1) BZ-2 (W2)
Sueo Miorrelajante
Anticonvulsivante
Amnesia Dependencia
Cognicin
Sedante Memoria
Las Benzodiacepinas ejercen su accin mediante la interaccin con receptores en

el SNC:
Hipocampo
Cerebelo
Ganglios basales
Hipotlamo
Mdula espinal
El determinante principal de la ocupacin de esos receptores es la concentracin

del frmaco en el plasma sistmico.11, 14
25
Figura 10.-Diagrama del mecanismo de accin del neurotransmisor natural GABA

(cido gamma-aminobutrico) y de las benzodiacepinas en las clulas del sistema
nervioso (neuronas) en el cerebro. (Tomado de: Heather, 2002).
(1,2) Impulso nervioso que hace que el GABA sea liberado de los sitios en que est
almacenado en la neurona 1
(3) El GABA liberado en el espacio interneuronal
(4) El GABA reacciona con los receptores de la neurona 2; la reaccin permite la

entrada de los iones de cloruro (Cl-) en la neurona
(5) Este efecto inhibe o detiene el progreso del impulso nervioso
(6,7) Las benzodiacepinas reaccionan con el sitio de refuerzo de los receptores

GABA
(8) Esta accin aumenta los efectos inhibidores del GABA; el impulso nervioso en
curso puede quedar bloqueado completamente. 17, 18
26
3.5.3 Reacciones Adversas.
El perfil toxicolgico de las benzodiacepinas ansiolticas (o tranquilizantes) es muy

parecido, aunque la frecuencia y gravedad de las reacciones puede variar de unas
a otras. En la mayor parte de los casos, las reacciones adversas son una
prolongacin de la accin farmacolgica y afecta al SNC; puede presentarse de
mayor o menor grado de somnolencia durante los primeros das de tratamiento.
Frecuentemente aparece: sedacin, somnolencia, ataxia. Ocasionalmente: mareos,
sedacin, cefalea, depresin, desorientacin, disfasia o disartria (alteracin del
lenguaje), temblor, cambios en la libido, alteraciones urinarias, diarrea o
estreimiento.
Excepcionalmente: hepatitis, ictericia, dermatitis, urticaria, prurito, discrasias
sanguneas, alteraciones de la visin y audicin.
Pueden producir incoordinacin motora con riesgo de cada, amnesia antergrada
(dificultad para recordar hechos recientes) y dificultad de concentracin.
La intensidad de los efectos depende de las dosis utilizadas y son ms importantes
en personas con alteraciones hepticas y en ancianos porque al disminuir su
metabolismo aumenta mucho su semivida plasmtica.
A veces producen conducta agresiva y hostil por desinhibicin o un estado de
hiperactividad, nerviosismo o locuacidad previo al efecto sedante. 2,10
3.5.4 Sobredosis.
En caso de dosis excesiva producen la depresin del SNC, por los efectos
inhibidores de neurotransmisor. Causan fundamentalmente ataxia, letargo y habla
farfullante. Los efectos de la sobredosis por va oral son moderados.
Otras manifestaciones clnicas de sobredosis incluyen hipotermia, hipotensin y

bradicardia (ritmo cardiaco lento).4
Las benzodiacepinas tienen un antdoto especfico, el Flumazenil: Se trata de un

antagonista especfico que acta en el receptor, impidiendo que acten las
benzodiacepinas. Su vida media es corta, de modo que la reversin de los efectos
dura 45-60 minutos, pasado el tiempo pueden volver a los efectos de la sedacin,
Es un frmaco til, debe de usarse con cautela, ya que tiene muchas
contraindicaciones (siempre que exista riesgo de convulsiones).2, 16
27
3.5.5 Toxicologa de Benzodiacepinas.
El mecanismo de toxicidad de las benzodiacepinas, consiste en potencializar la

accin inhibitoria del neurotransmisor cido gaba amino butrico (GABA), y favorece
el ingreso de iones de cloro a la clula, generando hiperpolarizacin celular y
disminuye la excitabilidad neuronal.2
En general, el nivel de toxicidad para benzodiacepinas es muy alto. Se han descrito

ingestiones de Diazepam de 1520 veces la dosis teraputica sin presentarse
deterioro importante de la conciencia; sin embargo, la administracin intravenosa
es rpida, aun en dosis teraputicas, induciendo un paro respiratorio, posiblemente
debido al vehculo de la ampolleta (propilenglicol). Las manifestaciones clnicas,
son sntomas de depresin del SNC, suelen iniciarse rpidamente por va
intravenosa de 30 a 120 minutos por va oral, dependiendo del compuesto.19
Tabla 8.- Sntomas de intoxicacin aguda por benzodiacepinas.12
Sntomas de Intoxicacin por Benzodiacepinas
Desinhibicin y labilidad afectiva

Sedacin y somnolencia
Dificultad para hablar, disartria, lenguaje farfullante
Ataxia, dficit en la coordinacin de movimientos
Deterioro de la memoria, dficit de capacidad de juicio
Movimientos inusuales de los ojos (nistagmus)
Hipotermia
Hiporreflexia (Disminucin de los reflejos)
Hipotensin y taquicardia
Sialorrea, nusea, vmito, disminucin de la motilidad gastrointestinal y
estreimiento
Intoxicacin severa puede originar estupor o coma con depresin
respiratoria.
Cuando se asocia la coingestin con otras substancias, (sedantes, hipnticos,

etanol o anti-psicticos) sus efectos se potencializan, y las consecuencias pueden
ser graves, observndose efectos paradjicos como agresin, excitacin, psicosis o
deterioro neurolgico es importante en ancianos y nios que son ms susceptibles
e inmovilidad prolongada por inconsciencia: la mortalidad es muy rara, son
frmacos con un ndice teraputico elevado. Los frmacos de accin corta, como
Temazepam, Alprazolam y Triazolam producen cuadros txicos ms graves.2, 4
28
3.5.6 Interacciones.
Las benzodiacepinas son metabolizadas en el hgado y pueden interaccionar con

cualquier frmaco que utilice el sistema enzimtico del hgado. Inhiben su
metabolismo heptico con el aumento de los niveles de este grupo de frmacos
(excepto Lorazepam, Lormetazepam y Oxazepam).12, 14
Tabla 9.- Principales interacciones de Benzodiacepinas con frmacos (Tomado de:
Mondragn, 2005).
Principales Interacciones de Benzodiacepinas (BZD)
BZD + Alcohol - Potencializacin de efectos sedantes.

BZD + Carbamazepina - Disminuye la concentracin plasmtica de BZD.
- La Cimetidina potencia la accin de las BZD,
BZD + Cimetidina excepto la de Alprazolam, Lorazepam, Oxazepam y
Temazepam.
BZD + Clozapina - Riesgo de depresin respiratoria.
BZD + Digoxina - Las BZD potencian los efectos de la Digoxina.
- Fluoxetina aumenta la semivida Alprazolam y
BZD + Fluoxetina
Diazepam.
- Las BZD disminuye los efectos antiparkinsonianos
BZD + Levodopa
del Levodopa.
- La Nefazodona aumenta la semivida de Diazepam,
BZD + Nefazodona y de Alprazolam o Lorazepam, siendo aconsejable
evitar esta ltima asociacin.
BZD + Opiceos - Potenciacin de los efectos sedantes.
BZD + Propanolol - El Propanolol potencializa acciones de las BZD.
- El Valproato aumenta la concentracin plasmtica
BZD + Valproato
de BZD.
- Las Xantinas antagonizan la disminucin del
BZD + Xantinas
rendimiento psicomotor, producido por las BZD.
Los depresores del SNC (alcohol, analgsicos opioides, anestsicos,

anticonvulsivantes, antidepresivos tricclicos, antihistamnicos sedantes,
neurolpticos y otros tranquilizantes) aumentan el efecto de las benzodiazepinas. 12
Los Anticidos, barbitricos, cafena, carbamazepina, teofilina y tabaco disminuyen

los niveles plasmticos de las benzodiazepinas, y su efecto se ve disminuido. 4, 10
29
3.5.7 Dependencia y Tolerancia.

Tolerancia es la necesidad de un aumento progresivo de la dosis para conseguir el
mismo efecto. Se desarrolla rpidamente la tolerancia al efecto hipntico y ms
lentamente al efecto ansioltico. Generalmente se presenta tiempo despus del
consumo prolongado de altas dosis de una determinada benzodiacepina, esto se
traduce en un sndrome de abstinencia al dejar de tomarlas. Los sntomas de
abstinencia, aparecen de dos a cinco das de la supresin farmacolgica. 4, 12
El cuadro se caracteriza por:
- El sndrome mayor, consiste en un cuadro de delirio, alucinaciones, confusin y

convulsiones.
- Sntomas psicolgicos de ansiedad: insomnio, irritabilidad, disforia.
- El sndrome menor, cursa con sntomas somticos de ansiedad: temblor,
palpitaciones, vrtigo, sudoracin, espasmos musculares, intestino irritable
hiperventilacin.
- Trastornos de la percepcin: intolerancia al ruido y a la luz, sensacin de
movimiento, sabor metlico.
- La posibilidad de aparicin del sndrome de abstinencia aumenta con la dosis y
la duracin del tratamiento.2, 10, 16
El 35% de los pacientes tratados con benzodiacepinas durante ms de 4 semanas

desarrollan dependencia fsica. Las benzodiacepinas que presentan dependencia
son las de mayor potencia y menor semivida de eliminacin. La prescripcin de
dosis bajas minimiza considerablemente el problema de tolerancia y
dependencia.12
30
3.6 Cadena de Custodia para Muestras de Orina.
Se entiende por Cadena de Custodia al procedimiento de asegurar la trazabilidad

e inviolabilidad de muestras de inters legal; son acciones especficas a seguir por
el profesional o institucin que solicita el anlisis; es la identificacin inequvoca e
inmediata de la muestra, sellada de modo que no pueda abrirse sin notificarse. Las
muestras deben estar en todo momento bajo la responsabilidad de una persona,
cuyos datos, conformidad y observaciones si hubiera, se registrarn de manera
fidedigna (Ver Anexo 15.2). 18, 19
Cuando la muestra llega al laboratorio, se debe revisar la solicitud de peritaje,

asegurando que los datos coincidan, reteniendo una muestra para reiteracin de
los anlisis, si es necesario. Se proporciona un registro de entrada y un nmero
consecutivo que ser escrito en la solicitud y en los frascos, por la persona que la
reciba, anotando la cantidad de muestra recibida, hora de recepcin, etc. Al
concluir el caso se realiza un informe pericial dirigido al rgano de instruccin que
lo solicit, el cual refleja los resultados de los anlisis y procedimientos que se
utilizaron19. De manera general los anlisis de drogas en fluidos biolgicos tienen
esencialmente dos objetivos fundamentales:
- Diagnstico del consumo de una droga de abuso en el marco de un proceso

penal.
- Diagnostico clnico en toxicologa clnica y en tratamientos de rehabilitacin.
3.6.1 Coleccin de Muestras para Deteccin de Drogas.
Para mantener la validez de los resultados analticos en el contexto forense, debe

estar bajo supervisin, la recoleccin, transporte y almacenamiento de la muestra.
La supervisin debe ser hecha por personal entrenado, que implica el aspecto
legal, asegurando que ninguna sustancia sea adicionada o que pueda contaminar
la orina. 19
i) El personal debe ser capacitado para comprender el proceso de recoleccin,

etiquetado, embalaje, transporte de muestras, documentacin, mtodos y su
trascendencia de los resultados del laboratorio.
ii) El lugar de recoleccin debe ser supervisado y presenciado por personal
entrenado y autorizado.
iii) Las instalaciones para la recoleccin de orina, deben ser apropiadas, el lugar no
debe tener dosificadores de jabn limpiadores que puedan invalidar la
muestra.
iv) El espcimen de orina debe ser colectado por duplicado en recipientes de
aproximadamente 50 mL.
v)
Para anlisis de drogas y metabolitos en orina debe evitarse recipientes de
plstico y tapas de goma. Por razones prcticas los recipientes de plstico
empleados deben ser desechables, asegurando que no modifican la
composicin o concentracin de droga(s) o metabolito(s) en orina, garantizando
el cierre hermtico.15, 19
31
3.6.2 Invalidacin de Muestras de Orina.
La manipulacin de la muestra de orina se define como la alteracin intencional de

su integridad con el propsito de falsear el resultado de pruebas bioqumicas.
Puede efectuarse de diferentes maneras, siendo las ms comunes la sustitucin,
adulteracin y la dilucin. Tambin puede producirse mediante la ingestin de
sustancias que modifiquen la funcin renal (diurticos, inhibidores) o sustancias
mscara.15, 19
Tabla 10.- Manipulaciones: dilucin, sustitucin o adulteracin.20, 21
Tipo de Orina Manipulacin de la Muestra
-Por ingesta abundante de lquidos, uso de diurticos o

dilucin de la muestra con agua.
Diluida
-Creatinina: <20mg/dL y densidad <1.003.
-Sacar el agua del WC, para diluir la orina.
-Por jugo de manzana, refrescos.
-Creatinina: 5mg/dL y densidad 1.001 o 1.020
Sustituida
-Obtener orina de personas ajenas al anlisis, que no usan
drogas.
-Con cloruro de sodio, vinagre, amonio, hipoclorito de sodio
Adulterada o jabn.
-pH 3 o 11 y una concentracin de nitritos 500 fg/mL
Para evitar que la orina sea manipulada o remplazada, se recomienda el uso de

una cadena de custodia: 20, 21
i) Inmediatamente despus de la recoleccin, medir la temperatura dentro de los

primeros 3-4 minutos (32C-38C) y pH de la muestra de orina. Si se
sospechosa de adulteracin de la muestra, inmediatamente debe ser notificado
al laboratorio.
ii) Es importante que el donante presencie el cerrado del recipiente y firmar con
iniciales la etiqueta de la muestra.
iii) El donante no debe tener ninguna participacin en la post-coleccin; como en
el tratamiento de la muestra, etiquetado, embalaje y transporte al laboratorio.
iv) Las muestras no aptas para anlisis son aquellas en las que se han adicionado
conservadores como etanol o formaldehido, etc., putrefactas o en estado de
descomposicin o si la cantidad de muestra es insuficiente para el anlisis.
v) Las etiquetas deben ser pegadas al recipiente de orina y no a las tapas.
32
La etiqueta debe contener por lo menos la siguiente informacin.15, 19
Nombre de donante:
Nmero de identificacin:
Fecha y tiempo de la recoleccin:
Lugar de recoleccin:
Nombre de la persona que supervisa la recoleccin:
Droga (s) a evaluar:
Nmero de muestra:
3.6.3 Deteccin de Adulteracin de Muestras de Orina.
La orina es procesada para detectar si es una muestra real, o adulterada, para lo

cual se determina olor, temperatura, concentracin de creatinina, pH y densidad. Si
la muestra no cumple con los criterios estndar, se desecha y se pide una segunda
muestra.22, 23
Tabla 11.- Pruebas de Identificacin de Orina. 20, 21
Pruebas de Identificacin de Orina
Utilizar una muestra con lmites de 1C de la temperatura

Temperatura
corporal aprox.
Aspecto Un aspecto turbio puede deberse a un jabn lquido.
Lmite de 4.6-8.0, para el cribado preliminar. La acidificacin
de la orina puede acelerar la eliminacin de anfetaminas
pH
antes de la prueba. La alcalinizacin de la orina retrasa la
excrecin durante el periodo de prueba.
Los valores de creatinina <30 mg/dL o densidad especfica
< 1.003 puede deberse a la dilucin externa de la muestra, el
Creatinina consumo de grandes cantidades de lquidos o a la utilizacin
de diurticos. Valores de creatinina <10 ng/dL pueden indicar
la sustitucin de agua. Una densidad especifica > 1.035
puede deberse a contaminacin por cloruro sdico.
Nitritos Adulterantes comerciales (compuestos por nitritos (KNO3-).
Identificacin De cadena de custodia y del individuo.
Tolmetina, naproxeno, etodolac, fenoprofeno, oxaprozn, sertralina
Frmacos e Ibuprofeno; por consumo puede producirse resultados
falsos positivos de inmunoanlisis de benzodiacepinas.
3.6.4 Seguridad de Personal de Laboratorio.
Todo personal debe tomar las precauciones necesarias y seguir procedimientos de

seguridad, conforme a procedimientos internos (como llevar guantes, ropa de
proteccin, etc.).15, 19
33
3.6.5 Transporte y Almacenamiento de Muestras de Orina.
i) Las muestras deben ser protegidas de la luz directa y calor durante el

transporte y almacenamiento, la muestra es guardada en fro durante el
transporte, preferentemente en una caja aislada.
ii) La persona responsable de transportar las muestras al laboratorio debe de
mantener los registros de custodia para asegurar que las muestras no son
alteradas durante el transporte y para el informe de laboratorio.
iii) Una persona autorizada de laboratorio debe recibir y verificar las muestras,
documentos, asegurar que las muestras y la forma de solicitud estn en orden,
un acuse de recibido por escrito y firmado.
iv) El laboratorio debe mantener registros bien documentados, para asegurar
integridad de las muestras y confidencialidad de los resultados.
v) Si el anlisis es retrasado ms de uno o dos das, las muestras son
resguardadas en un refrigerador bajo llave, aprox. a 4C, sin la adicin de
conservadores. 15, 19
3.6.6 Forma para Anlisis de Drogas.
i) La forma de solicitud de anlisis, acompaa a las muestras permitiendo que el

laboratorio coteje las muestras, para confirmar la identidad del donante.
ii) La forma debe contener fecha de identificacin del donante, de la persona que
supervisa la recoleccin y de la persona de comunicada, nmero de muestras,
fecha de tiempo de recoleccin, temperatura y pH de la muestra.
iii) Despus de la terminacin, el formulario debe ser firmado por una persona
autorizada y franqueado con un sello oficial.
iv) Cualquier informacin relacionada con el donante y resultados del anlisis debe
ser confidencial. 15, 19
3.6.7 Garanta de la Calidad.
El personal debe ser apropiadamente entrenado y experimentado para la

confiabilidad de los resultados, la actualizacin de los procedimientos de
laboratorio, capacitacin continua de personal, para mantener la calidad y
confiabilidad del laboratorio.15, 19
Control de calidad interno; Un programa de garanta de calidad debe ser

documentado e incluir, la trazabilidad de exactitud y precisin de todos los anlisis.
Valoracin de calidad externa; El laboratorio debe ser acreditado por un

laboratorio externo. Una forma de valorar al laboratorio, es enviando muestras que
contienen concentraciones diferentes de analito (s), al laboratorio de referencia
externo.15, 19
34
3.7 Tcnicas de Inmunoensayo para Benzodiacepinas y sus Metabolitos en

orina.
Una primera etapa preliminar o screening, son mtodos de inmunoensayo, que es

la identificacin inicial, aplicable para el anlisis de drogas de abuso, que descarta
las muestras negativas y una segunda etapa o confirmatoria emplea otra tcnica
para muestras positivas.
El screening cuenta con caractersticas de selectitividad, sensibilidad, rpidez y

econmia, en caso de ser positiva es necesario confirmarse. Existe una gran
cantidad de mtodos aplicables para el anlisis drogas de abuso. Algunos mtodos
preliminares son test de color o inmunoensayos de panel, algunos de estos
mtodos requieren instrumentacin.23
Los tiempos de deteccin en orina en pruebas de inmunoensayo como EMIT, para

benzodiacepinas: No suelen ser positivas despus de una dosis nica con una
funcin renal normal. En consumidores crnicos, de 3 a 7 das, slo cantidades
menores del 1% de la mayora de las benzodiacepinas se eliminan inalteradas en
la orina, apareciendo la mayor concentracin en orina en forma conjugada, por lo
que hay ventajas y desventajas para este tipo de anlisis.20
Ventajas:
- Los metabolitos encontrados en la orina son estables.
- Las benzodiacepinas y metabolitos se detectan por un periodo mayor. 24
Desventaja:
- Las concentraciones pueden tener una variacin importante, dependiendo de la
ingesta de lquidos.23
Las interferencias en pruebas de Inmunoensayo para deteccin de

benzodiacepinas se deben a los valores inapropiados de corte (cut-off). Un bajo
nivel de corte, habr un exceso de resultados negativos analizados por GC/MS, y
en el test preliminar las muestras positivas pueden ser reportadas como negativas,
si presentan valores altos de corte, si el compuesto presente tiene un nivel por
debajo del lmite de deteccin del mtodo de confirmatorio, el proceso de test
preliminar seria ineficiente.25
El nivel de corte es la cantidad de droga contenida en la orina necesaria para ser

detectada por los test recomendados por entidades internacionales como FDA,
(Food Drug Administration), SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health
Services Administration), que forma parte del NIDA (U.S. National Institute of Drug
Abuse).25
Un ejemplo para el nivel de corte de calibracin en anlisis de benzodiacepinas,
utilizando es Oxacepam Nordazepam como patrn de referencia el nivel de corte
es de 200 a 300 ng/mL.26
35
Es importante que los equipos de ensayo inmunolgico sean utilizados conforme a

las instrucciones del fabricante o sobre la matriz sobre el cual se desarrollara la
prueba despus de haber sido validada. Si hay cambios en los procedimientos
recomendados por el fabricante, la confiabilidad del procedimiento ser afectada y
el mtodo tendr que ser reexaminado para establecer confiabilidad para el
propsito previsto.
3.7.1 Tcnica de Inmunoensayo Enzimtico Multiplicado (EMIT).
El inmunoensayo EMIT est basado en la competicin de los sitios de unin de

benzodiacepinas a sus anticuerpos. Las benzodiacepinas en la muestra compiten
por unin de los anticuerpos con las del Enzima-Reactivo, que est marcado como
G6PHDH.26
La enzima activa (no unida) convierte el NAD (Dinucletido de Nicotinamida y

Adenina) presente en su forma reducida, NADH reactivo de anticuerpo, resultando
un cambio en la cintica de absorbancia (nm) que es medible
espectrofotomtricamente.26
El resultado cualitativo se basa en una comparacin de la tasa de la muestra, con

del valor lmite calibrado; una tasa normal muestra igual o mayor que la tasa del
valor lmite se considera positiva. El sistema efecta todos los clculos
internamente y presenta el resultado cualitativo final, calificado como positivo o
negativo.15, 23
Un resultado positivo, solo indica la presencia de benzodiazepinas y no se

correlaciona necesariamente con el alcance de efectos fisiolgicos y psicolgicos.
Un resultado negativo de la prueba indica que las benzodiazepinas, o no estn

presentes, o estn en niveles inferiores al lmite de deteccin de la prueba.15, 23
36
3.7.2 Inmunoensayo Cromatogrfico de Flujo Lateral en un Solo Paso.
El inmunoensayo cromatogrfico de flujo lateral en placa, es una prueba para la

deteccin cualitativa de metabolitos de drogas de abuso en orina humana. La
sensibilidad de este tipo de pruebas se realiza en un estudio controlado, evaluando
y comparando muestras de orina con test comerciales y con pruebas de
inmunoensayo EMIT. 25, 27
Los ensayos de flujo lateral se caracterizan por el hecho de que una solucin
lquida que contiene un analito a detectar es transportada lateralmente por accin
capilar a lo largo de una banda de membrana. Por lo general, la banda de
membrana tiene reactivos impregnados.22
Las pruebas de benzodiacepinas en placa, son rpidas, no ocupa aparatos para el

desarrollo del anlisis; utiliza la combinacin de anticuerpos monoclonales y
policlonales, basado en el principio de uniones competitivas. Compiten frente al
conjugado de la misma benzodiacepina en los puntos de unin del anticuerpo, para
detectar de manera selectiva en orina, originando resultados positivos cuando la
presencia de benzodiacepinas en orina supera el nivel de cut-off.27
Las benzodiacepinas presentes en la orina en concentraciones inferiores a la del

cut-off, no saturarn los puntos de unin de los anticuerpos. Las partculas
recubiertas de anticuerpos sern capturadas en la membrana del conjugado
inmovilizado de protena-benzodiacepina y una lnea visible de color aparecer en
la zona de la prueba, debido a una ausencia de metabolitos en la muestra de orina.
Cuando la muestra est a una concentracin por debajo de los niveles de corte, los
anticuerpos no se enlazan a los metabolitos en la regin T. 27
La lnea de color no se formar en la zona de prueba si el nivel del analito est por
encima del cut-off porque saturar todos los puntos de unin de los anticuerpos de
anti-benzodiacepinas, debido a la competencia con los metabolitos de la muestra.
Si la benzodiacepina est presente en la muestra de orina, rivaliza con la droga
(que est inmovilizado en la membrana), por los limitados anticuerpos presentes en
la regin T, inhibiendo el desarrollo de una banda distintiva de color rosceo.27
Limitaciones
- La prueba solo proporciona slo un resultado analtico preliminar cualitativo.

- Si se sospecha de adulteracin en la muestra, la prueba debe repetirse con
otra muestra de orina.
- Un resultado positivo indica la presencia benzodiacepinas o sus metabolitos,
pero no indica el nivel de intoxicacin, la va de administracin o la
concentracin de droga en la orina.
- Un resultado negativo no necesariamente indica la ausencia de
benzodiacepinas en orina. Pueden obtenerse resultados negativos cundo est
presente en niveles inferiores a los del cut-off de la prueba.
37
- Factores no descritos el test (ficha tcnica), interfiriendo en el resultado,

causando falsos resultados (ejemplo, errores tcnicos o de procedimiento).
- Son mtodos para un matriz especifica (orina), no en otros fluidos.
- Se realiza el test con una muestra de orina que no sobrepase 7das, desde que
se tom.25, 27
Dependiendo del proveedor las pruebas de inmunoensayo cromatogrfico de flujo

lateral, dan la informacin en las fichas tcnicas, sobre la especificidad y nivel de
corte (ng/mL) de las benzodiacepinas y metabolitos que detectan e indican las
consideraciones especiales dependiendo de cada prueba.
Almacenamiento y Estabilidad
- Almacenar la placa tal como est empaquetado en la bolsa sellada a

temperatura ambiente o refrigerado (2-30C) dentro del estuche original.
- La placa de anlisis es estable hasta la fecha de caducidad registrada en el
empaque.
- La placa de anlisis se mantendr en la bolsa sellada hasta su uso.
- No congelar.
- No utilizar despus de la fecha de caducidad.
- La fecha de caducidad es establecida bajo estas condiciones de
almacenamiento del proveedor. 25, 27
Se debe de tener ciertas precauciones para este tipo de anlisis:
- Evitar la contaminacin cruzada de muestras de orina. Para ello usar un

recipiente para cada muestra de orina y cuentagotas desechables.
- Las muestras de orina son potencialmente infecciosas. Por eso debe tomar las
precauciones de higiene habituales para una manipulacin adecuada.
- Solo para el diagnstico in vitro. No usar despus de la fecha de caducidad.
- La prueba, una vez utilizado, debe desecharse de acuerdo con las regulaciones
locales.
- El kit debe permanecer en su estuche original hasta su uso.
- No usar el test si el estuche est daado o el sello roto.
- No usar el kit despus de la fecha de caducidad.
- El test sirve para un solo uso
- Este mtodo est establecido para su uso con orina. No se han evaluado otros
fluidos. 25, 27
38
3.8. Hidrlisis, Extraccin y Derivatizacin, para deteccin de

Benzodiacepinas.
El primer paso para el anlisis en una muestra de orina o clean up, tiene por
objeto concentrar las sustancias buscadas y eliminar las interferencias producidas
por otros componentes de la orina. Este procedimiento, se puede realizar por dos
mtodos clsicos: extraccin lquido/lquido o extraccin en columnas de fase
slida (SPE, por sus iniciales en ingls).28, 29
Tabla 12.- Mtodo general en el anlisis de drogas en fluidos biolgicos.30
1. Preparacin Homogeneizacin de muestras, ajuste de pH, hidrlisis (cida,

de la Muestra bsica o enzimtica), precipitacin, centrifugacin.
Extraccin del analito, puede ser extraccin liquido/liquido y/o
2. Aislamiento extraccin en fase slida; confiere a la muestra selectividad,
del Analito ahorro de disolventes, tiempo, extractos ms limpios y mayor
rendimiento de los analitos.
Concentrar el analito en un volumen mnimo de disolvente para
3.Concentracin aumentar la sensibilidad del anlisis; las condiciones ideales es
del extracto concentrar a temperatura ambiente y en corriente de nitrgeno o
de aire..
Un nivel primario utiliza tcnicas como Cromatografa en Capa
fina y Espectrofotometra UV, Reacciones colorimtricas, etc.
Un nivel secundario involucra tcnicas como Cromatografa de
gases y C. Lquida de alta resolucin, como determinacin
directa.
4. Identificacin Un nivel terciario utiliza la Espectrometra de masas acoplada con
del Analito una cromatografa separativa.
Antes de la aplicacin de la CG, la derivatizacin de los grupos
funcionales es esencial para la deteccin de drogas a bajos
niveles, para mejorar la separacin, especificidad, sensibilidad y
precisin de los anlisis. Los procedimientos de derivatizacin
utilizados son la silanizacin, alquilacin, acilacin.
5. Cuantificacin Una vez identificado el analito, la cuantificacin se realiza con una
del Analito: tcnica directa, utilizando patrones de referencia, generalmente es
GC, GC/MS.
Los procedimentos de extraccin, deteccin, confirmacin y cuantificacin puede

incluir la adicin de un patrn interno (derivados de benzodiacepinas), empleados
en mtodos Cromatogrficos. Los patrones de referencia pueden conseguirse de
manera deuterada y especifica, por ejemplo Sigma Co. y Radin (Austin, TX). Sin
embargo, algunos procedimientos emplean benzodiacepinas no deuteradas para
el anlisis de otra benzodiacepina, por ejemplo, Triazolam como patrn interno
para el anlisis de Alprazolam, N-Desmetildiazepam y Diazepam se emplean como
patrn interno para la medicin de Medazepam.28
39
Tabla 13.- Ejemplos de benzodiacepinas deuteradas especficas: 28
Benzodiacepinas Deuteradas
Diazepam-d5, Triazolam-d5,
Desmetildiazepam-d5, - Hidroxitriazolam-d4,
Oxazepam-d5, Flurazepam-d5,
Clordiazepoxido-d5, Lorazepam-d4,
Alprazolam-d5, Nitrazepam-d5,
-Hidroxialprazolam-d5, Temazepam-d5
Figura 11.- Diagrama de flujo general para el anlisis confirmatorio en muestras

biolgicas para benzodiacepinas (Tomado de: UNDCP ST/NAR/28,1997).
*Seleccin y adicin del

estndar interno
*Preparacin de estndar
para el anlisis cuantitativo
Pre-tratamiento de la muestra
(Hidrlisis enzimtica)
Extraccin
(Lquido-Liquido Fase Slida)
Nueva extraccin o
segunda extraccin
Derivatizacin
Procedimiento Analtico
Confirmatorio: GC/MS
* Cuando aplique en el anlisis.
40
3.8.1 Hidrlisis Enzimtica
Las benzodiacepinas en su mayora se excretan conjugadas con cido glucurnico

como metabolitos hidroxi, excretados en orina, por lo tanto para una extraccin
eficiente de los metabolitos glucurnidos deben ser hidrolizados para la unin con
anticuerpos en el ensayo inmunolgico y cromatogrfico.
La hidrlisis enzimtica en condiciones extremas de acidez o basicidad, puede

causar a la benzodiacepina la divisin o reordenamiento de la estructura. La
hidrlisis cida de benzodiacepinas, produce benzofenonas.31
3.8.2 Extraccin Lquido-Lquido.
La extraccin lquido-lquido es un mtodo muy til para separar componentes de

una mezcla. Este mtodo depende de la diferencia de solubilidad del compuesto a
extraer en dos disolventes diferentes. Cuando se agita un compuesto con dos
disolventes inmiscibles, el compuesto se distribuye entre los dos disolventes. A una
temperatura determinada, la relacin de concentraciones del compuesto en cada
disolvente es siempre constante, y esta constante es lo que se denomina
coeficiente de distribucin o de reparto.32
Las mezclas de reaccin en disolucin o suspensin acuosa, se agitan las dos

fases para aumentar la superficie de contacto entre ellas y permitir un equilibrio
ms rpido del producto a extraer entre las dos fases, produciendo una
transferencia del producto deseado desde la fase acuosa inicial hacia la fase
orgnica, en una cantidad tanto mayor cuanto mayor sea su coeficiente de reparto,
unos minutos despus de la agitacin, las dos fases se separan de nuevo, con lo
que la fase orgnica que contiene el producto deseado se podr separar mediante
una simple decantacin de la fase acuosa conteniendo impurezas. La posicin
relativa de ambas fases depende de la relacin de densidades. Despus de esta
extraccin, la fase acuosa an contiene cierta cantidad del producto deseado, y se
repite el proceso de extraccin. 32
Una vez realizada la extraccin, se tiene que recuperar el producto extrado a partir
de las fases orgnicas reunidas. Para ello, se tiene que secar la fase orgnica
resultante con un agente desecante, filtrar la suspensin resultante y finalmente
eliminar el disolvente orgnico de la disolucin seca conteniendo el producto
extrado por destilacin o evaporacin. Normalmente la extraccin se utiliza para
separar el producto deseado selectivamente tambin se utiliza para la extraccin y
eliminacin de impurezas no deseadas de una disolucin. 32
41
La extraccin de un componente de una mezcla disuelta en determinado

disolvente se puede conseguir aadiendo otro disolvente que cumpla las siguientes
condiciones:
- No debe ser miscible con el otro disolvente. El disolvente de extraccin debe ser
inmiscible con la disolucin a extraer. El agua o una disolucin acuosa suele ser
uno de los disolventes implicados. El otro disolvente es un disolvente orgnico.
- El componente debe ser ms soluble en el disolvente de extraccin que en el
disolvente original.
- El resto de componentes no deben ser solubles en el disolvente de extraccin.
- Suficientemente voltil, de manera que se pueda eliminar fcilmente del
producto extrado mediante destilacin o evaporacin.32
Las benzodiacepinas y sus metabolitos conjugados pueden ser extrados por

tcnicas de extraccin lquido-lquido y fase slida con disolventes orgnicos y las
muestras pueden ser hidrolizadas enzimticamente antes de la extraccin. La
seleccin de un sistema de disolventes para la extraccin es importante. En la
Tabla 14 se presenta algunos ejemplos de disolventes empleados en el
aislamiento de benzodiacepinas, con eficiencias altas en la extraccin.15
Tabla 14.- Eficiencia de disolventes para extraccin de benzodiacepinas.15
Solvente (%) Recuperado
Cloruro de n-butilo 50-100
Hexano Diclorometano
79-90
(70:30)
Cloruro de n-butilo - Acetato de Etilo

91-107
(1:4)
42
3.8.3 Extraccin Fase Slida.
Los mtodos de extraccin fase slida en fluidos biolgicos como orina se utilizan
materiales como tierra de diatomeas, sorbentes, materiales adheridos en slica; que
son extractos preparativos hidrolizados.33
La extraccin fase slida SPE (Solid Phase Extraction), por sus siglas en ingls, es
una tcnica de limpieza y extraccin de analitos, empleada en laboratorios forenses
y de toxicologa. El SPE tiene ventajas sobre la extraccin liquido-liquido,
incluyendo automatizacin, selectividad, reproducibilidad y extractos ms limpios.
Otra ventaja es el efecto de la concentracin; los sorbentes de slica, presentan un
rea superficial que interacta con el analito en el cartucho de extraccin que
concentra el analito. Se han puesto resinas de fase mltiple que contienen varias
clases de sorbentes, sobre un soporte slido de slica, empleadas para la
separacin de compuestos que presentan propiedades fsicas y qumicas
diferentes.34
El copolmero de intercambio catinico / fase-reversa, para ensayos de drogas en

orina, utiliza una combinacin de intercambio inico y propiedades hidrofbicas
obteniendo extractos limpios con alta eficiencia de extraccin.34
Para la tcnica SPE, requiere el uso de cantidades importantes de disolvente que

son txicos. En algunos mtodos el disolvente es evaporado para concentrar los
analitos de inters y conseguir los lmites de deteccin. Dependiendo de las
propiedades qumicas de los analitos, pueden requerir pasos preparativos
adicionales para la muestra como derivatizacin.33
Un ejemplo de extraccin, es el sistema automatizado (Pipeta Desechable). Los

pasos se llevan a cabo automticamente. El sorbente est acondicionado con el
disolvente antes del proceso de extraccin.34, 35
1. La muestra est en la punta de pipeta, para el contacto directo con el sorbente

en fase slida.
2. Una parte de aire es succionado por la punta de la pipeta. La turbulencia de aire
ayuda a mezclar creando una suspensin de sorbente en la muestra, asegurando
el contacto ptimo haciendo la extraccin muy eficiente, y una recuperacin alta.
3. Aproximadamente en un tiempo de extraccin de 30 segundos. El sorbente
puede ser lavado para retirar el residuo.
4. Los analitos extrados son eludos, con el disolvente apropiado y adicionado por
la parte de arriba para una elucin ms eficiente. La muestra eluda es colectada
en una vial para ser introducida al GC/MS.
El tiempo total aproximado para la extraccin es 6 minutos en orina. 34, 35
43
Figura 12.- Extraccin Automatizada en Fase Slida (SPE). (Tomado de: Foster,
2010).
* Opcional dependiendo del mtodo
Figura 13.- Extraccin Automatizada en Fase Slida (SPE). (Tomado de: Foster,
2010).
*Los compuestos retenidos eluyen del cartucho de SPE en un frasco cerrado a

travs de la jeringa. Esto elimina el riesgo de contaminacin cruzada. El eluido
obtenido se puede concentrar por evaporacin del disolvente directamente en el
interior tubo de recoleccin del SPE.34
44
3.8.4 Derivatizacin.
La Derivatizacin es una serie de reacciones qumicas que confiere nuevas

caractersticas qumicas empleadas para la cuantificacin, separacin y
compatibilidad para la determinacin de los analitos, con el sistema cromatogrfico
de gases y sus diferentes mdulos: fase mvil, sistema de inyeccin, columna
cromatogrfica y detector.36, 37
Es importante en compuestos con una volatilidad y estabilidad trmica pobre, o

compuestos que son adsorbidos en el inyector, al no observar reas, alturas y
picos reproducibles.38 Las muestras tienen que ser lo suficientemente voltiles para
ser transportadas por la fase mvil (gas inerte) hasta el detector, algunas
caractersticas que confiere la derivatizacin son:
1. Conferir volatilidad; en compuestos que son prcticamente no voltiles a

causa de las fuerzas intermoleculares.
2. Estabilidad; el uso de derivados protectores ayuda a evitar la degradacin

trmica a causa de grupos sensibles e interactivos en la molcula.
3. Mejora las propiedades cromatogrficas; congruencia entre las muestras y la

fase estacionaria, mejorando los coeficientes de particin evitando efectos de
absorcin.
4. Eficiencia de Separaciones; Forma derivados que incrementan sensiblemente

el peso molecular, y el pico puede ser eludo en zonas alejadas de alto
background.
5. Anlisis de grupos funcionales; obtencin de informacin de grupos

funcionales presentes en la muestra de compuestos en forma libre con respecto
a los obtenidos en uno o ms procesos de derivatizacin.36
Los derivados se preparan antes de realizar el anlisis, debido a que algunos de

ellos descomponen.37
Ejemplos de Derivatizantes utilizados para anlisis de drogas son: 31
N,O-bis-trimetilsililtrifluoroacetamida (BSTFA).
N,O-bis-trimetilsililacetamida (BSA).
N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA).
Hexametildisilasano (HMDS) + piridina.
Trimetilclorosilano (TMCS) + piridina.
Anhidrido Pentafluoropropinico. (PFPA).
Anhidrido Trifluoroactico (TFAA).
N-metil-n-ter-butildimetilsililtrifluoroacetamida (MTBSTFA).
t-butildimetilsililtrifluoroacetamida (TBDMTFA).
Hidrxido de Tetrametilamonio (TMAH).
45
Los derivatizantes de silicio; BSTFA (N, O-bis(trimetilsililtrifluoroacetamida), con 1%

de TMCS (trimetilclorosilano), Trimetill/silicio y derivados de tert-butil de metilo
silicio MTBSTFA (N-metilo-N-tert- butildimetilsililtrifluorocetamida), tienen la ventaja
que dan iones de alto peso molecular, estables para espectrometra de masas
para el anlisis de benzodiacepinas.15
Para derivatizar las benzodiacepinas en muestras de orina con BSTFA se calienta

con el extracto y para derivados ms estables con t- butildimetilsilil para anlisis
por GC/MS diseado para identificacin de analitos de benzodiacepina. La
acetilacin tambin forma derivados estables, empleados en la identificacin
cualitativa de benzodiacepinas y metabolitos en hidrolisis cida.28
46
3.9. Tcnicas de Confirmacin para Benzodiacepinas y sus Metabolitos en

orina.
3.9.1 Cromatografa de Gases (CG).
La cromatografa de gases GC (Gas chromatography), por sus siglas en ingls es

un mtodo recomendado para benzodiacepinas, en especial en aquellas que se
reordenan como 3-hidroxi (con mltiples apogeos mximos, que se relacionan
entre s). El cido de Clorazepato da un apogeo mximo, que tiene un valor de
ndice de retencin que corresponde a Nordazepam y Ketazolam con un apogeo
mximo que es muy similar a Diazepam.38
Los ndices de retencin para benzodiacepinas han sido demostrados en funcin
de la temperatura de la columna. Los valores deben ser verificados antes de iniciar
el mtodo de anlisis mediante patrones de referencia.15, 38
Las propiedades de muchos analitos con sustituyentes hidroxi- y amino- pueden

limitar la eficiencia de la cromatografa de gas debido a la polaridad, por lo tanto la
derivatizacin es necesaria. La derivatizacin de los extractos, prolonga el tiempo
requerido para realizar un anlisis, disminuye su costo, mejora la precisin
especificidad, sensibilidad, linealidad de los anlisis, estabilidad de los analitos y
evita la descomposicin trmica de los mismos.15
A concentraciones altas de los analitos, pueden ser detectados sin derivatizacin

(inyecciones de 1-2 L), pero en concentraciones altas del analito en orina
hidrolizada en la tcnica C/G con columna empacada, la sensibilidad es muy
limitada. Para garantizar la estabilidad de la columna durante el anlisis, como
medida de precaucin, se ponen muestras control antes y despus del anlisis, de
las muestras a confirmar. 15
Los detectores apropiados para el anlisis de benzodiacepinas por GC incluyen el

Detector de Captacin de Electrones (EDC) y Detector de Nitrgeno-Fsforo
(NPD). El Detector de Ionizacin de Flama (FID), no tiene sensibilidad suficiente
para el anlisis de benzodiacepinas en general. Los fragmentos de material
biolgico tienden a estar contaminados y no es adecuado para Detectores de
Nitrgeno-Fsforo (NPD).15
47
3.9.2 Cromatografa de Gas/Espectrometra de Masa (CG/MS).
La Cromatografa de Gas acoplado con la Espectrometra de Masas CG/MS (Gas

Chromatography / Mass Spectrometric), por sus siglas en ingls son mtodos de
confirmatorios empleados para benzodiacepinas. La separacin e identificacin del
analito es obtenida comparando su tiempo de retencin con una base de datos de
referencia de iones patrn.15, 38
La espectrometra de masas es una tcnica microanaltica que requiere solo

nanomoles de muestra para obtener una informacin sustancial de la estructura y
peso molecular del analito, al acoplar esta tcnica a una mezcla de compuestos
inyectados en el cromatgrafo de gases, son separados en la columna
cromatogrfica, obteniendo la elucin sucesiva de los componentes aislados, que
pasan inmediatamente al espectrmetro de masas. Cada uno de estos
componentes se registra en forma de pico cromatogrfico y se identifica mediante
su respectivo espectro de masas.39
En este proceso, el espectrmetro de masas, adems de proporcionar los

espectros, acta como detector cromatogrfico al registrar la corriente inica total
generada en la fuente inica, cuya representacin grfica constituye el
cromatograma o TIC (Total Ion Current, por sus siglas en ingles). La corriente
inica generada por todos los iones da lugar a un pico gaussiano de rea
proporcional a la concentracin del compuesto detectado. 40
En esta tcnica las molculas reciben una cierta cantidad de energa, que provocan
la ionizacin de las mismas. Este ion producido, se denomina ion molecular, en la
mayora de los casos se fragmenta en varios iones, resultando as el espectro de
masas, que se puede considerar como la huella dactilar de la molcula en cuestin.
Los procesos de fragmentacin ocurren despus de la ionizacin del electrn.
La ionizacin qumica in negativo por GC/MS, es ideal para la cuantificacin, por

la sensibilidad de la tcnica. Los espectros de masa de ionizacin-negativa de
benzodiacepinas, constan de uno o varios grupos abundantes de picos base.28
Para el anlisis por espectrometra de masas la muestra debe entrar en la cmara

de ionizacin directamente (por impacto electrnico) o por Cromatografa de Gas y
se emplea Splitless injection (Inyeccin sin divisin), a una temperatura
programada de por lo menos 300C. Las triazolobenzodiacepinas y varias
diazolobenzodiazepinas eluyen en horno a temperaturas cerca de 300C, en
columnas capilares como metilsilicona y fenilmetilsilicona. Se ha visto una mejor
separacin, para analitos de benzodiacepinas en columnas capilares de dimetro y
polaridad mayor.32
48
Una desventaja de la tcnica de ionizacin qumica es que los espectros pueden

ser afectados por los cambios de temperatura de la fuente y por la presencia de
cantidades mnimas de oxgeno en el in. Los iones por debajo de 50 m/z no es
posible dar un diagnostico afirmativo del analito.15, 28
Cuando el analito es cuantificado, se realiza una curva de calibracin al mismo

tiempo que se estn corriendo las muestras y las muestras de la calibracin deben
estar en la misma matriz que las muestras por cuantificar. Es importante realizar los
procedimientos de derivatizacin, antes de proceder a los anlisis
cromatogrficos.15
Se utilizan cromatogramas previos de iones, de las posibles benzodiacepinas a

analizar, para garantizar la especificidad y cuantificacin, comparando el in de
apogeo mximo con el rea representativa del in del estndar interno y de la
curva de calibracin. Los estndares de referencia para GC/MS, son compuestos
deutero-etiquetados apropiados para la observacin-cuantificacin del in
seleccionado.15
Limitaciones:
- Algunas benzodiacepinas son degradadas trmicamente cuando se inyectan

en el Cromatografo de gas, cuando la extraccin es directa.
- Varias benzodiacepinas son transformadas en el cuerpo en metabolitos
polares, por lo cual que no son apropiados para un anlisis por GC/MS, sin
una derivatizacin previa.
- Algunas benzodiacepinas son transformadas a benzofenonas, por ser
compuestos ms apropiados para analizar por GC/MS.
- Se necesita de un anlisis especfico para la identificacin de la
benzodiacepina que estaba presente en el espcimen biolgico.
- Las triazolobenzodiacepinas no son convertidas a benzofenonas por
hidrolisis cida.28
49
4. Planteamiento del problema
Los qumicos encargados del anlisis toxicolgico requieren de tcnicas

especficas, y sensibles acordes con la tecnologa, para confirmar la presencia de
benzodiacepinas y los productos de su descomposicin, denominados metabolitos
en una matriz biolgica como la orina, debido al metabolismo que sufren en el
organismo.
Se requiere de la recopilacin de tcnicas preliminares y confirmatorias para la

identificacin de benzodiacepinas y su metabolitos en orina, por lo que se realizo
una revisin de manuales, libros, revistas de manera fsica y electrnica, dichas
tcnicas de orientacin son empleadas en los laboratorios de toxicologa,
consideradas como tcnicas vlidas de confirmacin para sustentar la investigacin
requerida por el laboratorio.
5. Justificacin
Se requiere de una compilacin de tcnicas preliminares y confirmatorias acordes

con la tecnologa actual para identificar benzodiacepinas y su metabolitos en una
matriz biolgicas como la orina, para el esclarecimiento de una investigacin,
tratamiento de un diagnostico inicial de farmacodependencia, descartar una
intoxicacin y de ms relevancia si est involucrado en un hecho delictivo. Abordar
esta temtica permitir a los qumicos toxicolgicos una visin general de las
tcnicas preliminares y confirmatorias. Esperando as mejorar la oportunidad y la
seguridad, con resultados analticos confiables, con aporte de la calidad tcnica y
cientfica, referenciadas internacionalmente, tiles a la administracin de justicia y
sociedad.
6. Importancia del Estudio
El inters particular de este trabajo es el de compilar tcnicas acordes con la

tecnologa actual para aportar una visin general al qumico toxicolgico de las
tcnicas de inmunoensayo y GC/MS para identificar benzodiacepinas y sus
metabolitos en una matriz biolgica como la orina.
50
7. Objetivo General.
Elaborar una revisin de manuales, libros, revistas de manera fsica y electrnica
de las tcnicas de inmunoensayo y GC/MS para identificar benzodiacepinas y
sus metabolitos en una matriz compleja como es la orina.
7.1 Objetivos Particulares.
Investigar metodologas de inmunoensayo para la determinacin de
benzodiacepinasy sus metabolitos en orina.
Investigar metodologas GC/MS para determinacin de benzodiacepinas y
sus metabolitos en orina.
51
8. Metodologa.
Se realiz una revisin de manuales, libros, revistas, fichas tcnicas, patentes,
sitios de internet de publicacin reciente, sobre las tcnicas existentes para
identificar de benzodiacepinas y sus metabolitos en orina, se selecciono en base a
la veracidad, lo cual se logro cotejando la informacin entre cada uno de ellos.
La informacin se clasific en: conceptos bsicos, tcnicas de inmunoensayo
cromatogrfico en placa, EMIT, hidrlisis enzimtica, extraccin lquido-liquido /
fase slida y tcnicas de GC, GC/MS.
9. Diagrama de Flujo.
Revisin de: Manuales, libros,

revistas, fichas tcnicas, patentes
sitios de internet (publicaciones
electrnicas).
Seleccin y clasificacin de la
informacin .
Benzodiacepinas y sus
Tcnicas de Inmunoensayo Tcnicas de GC/MS.
metabolitos en orina.
Resultado: Esquemas de
Tcnicas para identificar
Benzodiacepinas y sus
metabolitos en orina.
Tcnicas de: Hidrlisis enzimtica, cida, Hidrlisis enzimtica / Tcnicas de:

Inmunoensayo alcalina / Extraccin liqudo- Extraccin fase slida. Derivatizacin
cromatogrfico en placa liqudo GC, GC/MS.
EMIT
Anlisis de Resultados
y Conclusiones
52
10. Resultados
Se empez con la revisin en manuales, libros, revistas y fichas tcnicas,

consultados fsicamente en las bibliotecas de FES-Zaragoza, Facultad de Qumica
y PGR, igualmente en sitios de internet (publicaciones electrnicas recientes). En
las cuales se clasific la informacin para el anlisis de identificacin
benzodiacepinas y sus metabolitos en muestras de orina utilizando tcnicas de
inmunoensayo cromatogrfico en placa, EMIT, hidrlisis enzimtica, tcnicas de
extraccin liquido-liquido / fase slida y tcnicas de GC, GC/MS.
Las tcnicas descritas en el presente trabajo requieren de muestras de orina. Las

muestras deben seguir la cadena de custodia en todo momento, bajo la
responsabilidad de una persona cuyos datos, conformidad y observaciones se
deben registrar de manera fidedigna, para mantener la trazabilidad e inviolabilidad
que asegure una validez de los resultados analticos en el contexto toxicolgico.
La actualizacin de la informacin para identificar benzodiacepinas y sus
metabolitos, representa el disear esquemas acordes con la tecnologa actual que
puedan ser empleados como herramienta de trabajo, que orienten el anlisis
toxicolgico para la bsqueda de resultados confiables.
Tcnicas de Anlisis Preliminar: Inmunoensayo cromatogrfico de flujo

lateral en placa de un solo paso y EMIT.
La orina es la matriz biolgica preferible para la identificacin de benzodiacepinas y

sus metabolitos, porque se pueden detectar hasta en siete das o ms,
dependiendo si son tomadas de manera crnica, o en cuatro das en una sola dosis
tambin si son de accin corta, intermedia o prolongada, no estn en proporcin
con la concentracin de la ltima dosis administrada.
El anlisis de identificacin inicial; son diversas tcnicas de inmunoensayo, la

literatura reporta tres grandes grupos de tcnicas analticas empleadas, para
anlisis preliminar de benzodiacepinas: inmunolgicas, cromatogrficas y
colorimtricas. Para la identificacin preliminar de benzodiacepinas y sus
metabolitos en orina, se eligieron las tcnicas de inmunoensayo cromatogrfico de
flujo lateral en un solo paso y EMIT, por la relevancia al ser empleados en la
actualidad en los laboratorios toxicolgicos, porque cuentan con selectividad, son
sensibles, rpidas, econmicas, el tiempo de anlisis confirmatorio puede ser
disminuido, si se ha procedido de manera eficiente al realizar el mtodo preliminar.
53
Tcnicas de Anlisis Confirmatorio: GC, GC/MS.
La literatura relevante describe que se requiere un mtodo especifico y sensible

para la determinacin de diferentes benzodiacepinas y sus metabolitos en orina,
debido a las concentraciones en el rango de nanogramos, la combinacin de las
tcnicas de cromatografa de gas y espectrometra de masas, son consideradas
como tcnicas vlidas en el Test de Drogas Confirmatorio.
Antes de la aplicacin de la GC, es necesaria la derivatizacin para mejorar la

separacin, especificidad, sensibilidad y precisin de los anlisis de los grupos
funcionales.
Las tcnicas confirmatorias para benzodiacepinas y sus metabolitos se basan en
cuatro paso fundamentales.
1. Hidrolisis con -glucuronidasa en muestras de orina.

2. Extraccin lquido-lquido fase slida.
3. Derivatizacin.
4. Anlisis confirmatorio: GC, GC/MS.
54
10.1 Tcnicas de inmunoensayo

cromatogrfico en un solo paso
y EMIT.
55
Tcnica de Inmunoensayo Cromatogrfico de Flujo Lateral de un Solo Paso;

SureStep / Caspositte.25, 27
Reactivos contenidos en la prueba en orina en placa de inmunoensayo.
- Anticuerpos monoclonales de ratn Anti-Benzodiacepinas unidos a partculas.

- Conjugado de Protena-Benzodiacepinas.
- Anticuerpo de cabra (empleado en el sistema de la lnea del control).
Materiales Suministrados que incluye el kit.
- Tira reactiva dentro de una casette.

- Pipeta de plstico.
- Almohada desecante para absorber la humedad.
- Ficha tcnica: Instrucciones de uso del test.
Materiales Requeridos no Suministrados.
- Contenedor para recoger la muestra.

- Cronmetro.
Valoracin de la Muestra.
- Las muestras de orina deben ser usadas inmediatamente. Si la muestra se

mantuvo en refrigeracin, dejar a temperatura ambiente antes de realizar el test.
- Las muestras deben ser recolectadas en un recipiente limpio de plstico que no
haya sido usado previamente.
- Se pueden usar muestras de orina, recogidas en cualquier momento del da.
- Si la orina presenta partculas visibles deben ser centrifugadas y filtradas.
- Las muestras frescas de orina no requieren ninguna manipulacin especial o
pretratamiento.
Consideraciones generales (Figura 14):
- Tomar la muestra, con el gotero y colocarlo en posicin vertical, aadir 3 a 4

gotas de orina en el pocillo de la muestra (S), absorbida por capilaridad.
- Evitar burbujas de aire en el pocillo de muestra.
- Dejar que se absorba antes de aadir la siguiente. Esperar cinco segundos
entre cada gota.
- Debe aparecer una banda coloreada en el rea de resultados C que indica
que el test ha terminado.
- Si se observa que no corre bien la orina, aadir ms gotas. En la mayora de los
casos, la lnea de control C ser visible antes de que la lnea T. Esto es
normal y significa que el test se ha efectuado correctamente.
Nota: Los resultados observados despus de quince minutos pueden ser

considerados invlidos.
56
Diagrama 1.- Procedimiento25, 27:
Realizar la prueba a temperatura

ambiente (15-30 C)
Tener a temperatura ambiente:

- muestra de orina
- y/o los controles
Sacar la placa de la bolsa sellada

(usarla lo antes posible)
Colocar la placa en una

superficie limpia y lisa
No tocar la zona donde

aparecen los resultados
Tomar la muestra y gotero del test

(colocarlo en posicin vertical)
Aadir 3 a 4 gotas de orina

en el pocillo de la muestra (S)
Poner el cronmetro en marcha
Leer el resultado del test

de 5 10 minutos, inmediatamente
(conforme a la ficha tcnica)
57
Kit de Inmunoensayo Cromatogrfico de un Solo Paso; SureStep / Caspositte.
Figura 14.- Interpretacin de Resultados. (Tomado de: Benzodiacepinas en

Caspositette, 2008).
Interpretacin de Resultados:
Resultado negativo:* Una muestra de orina negativa o una muestra con una
concentracin inferior a la del cut-off generar una lnea en la zona de la prueba
(T). Si aparecen dos lneas. Una lnea roja debe estar en la zona del control (C) y
otra lnea roja o rosa aparecer en la zona de la prueba (T), indica que la
concentracin de Benzodiacepinas est por debajo del nivel detectable del cut-off.
*Nota: La intensidad del color rojo de la lnea de la regin de la prueba (T) puede
variar, pero cualquier coloracin roja, por muy dbil que sea, deber considerarse
como resultado negativo.
Resultado positivo: Aparece una lnea de color rosa en la zona de control (zona
C) debido a la competencia del analito y ninguna lnea en la zona de resultados
(zona T). Este resultado indica que la concentracin de Benzodiacepinas excede
los niveles detectables. Para un resultado definitivo la muestra requiere de un
segundo anlisis para su confirmacin.
Resultado nulo: Un test debe ser considerado sin resultado alguno si no aparece
ninguna banda de color ni en la zona de control (zona C) ni en la zona de
resultados (zona T), o bien, si slo aparece una banda coloreada en la zona T
La presencia de una banda de color en la zona de control C es siempre
necesaria para validar el resultado. Un volumen de muestra insuficiente o un
procedimiento incorrecto son las posibles razones de la ausencia de la lnea de
control. En este caso revisar el procedimiento y repetir, empleando un nueva
prueba.
58
La siguiente tabla se enlista algunas de las benzodiacepinas y metabolitos que se

detectan en orina por medio de inmunoensayo cromatografico en placa, conforme
a lo reportado en fichas tcnicas de algunos proveedores.
Tabla 15.- Nivel de corte de benzodiacepinas reportado en fichas tcnicas (ng/mL)

de proveedores de Sure Step y Caspositte. 25, 27
Sure Step Caspositte

Benzodiacepina
(ng/mL) (ng/mL)
Alprazolam 196 500

-Hidroxialprazolam 1.262 --
Bromazepam 1.562 600
Clordiazepoxide 1.562 300
Clobazam 98
Clonazepam 781 500
Clorazepato Dipotasio 195 --
Delorazepam 1.562 --
Desmetildiazepam -- 750
Diazepam 195 400
Flunitrazepam 390 400
Flunazepam -- 1000
Desalquilflurazepam 390 --
Estazolam 2.500 --
Lorazepam 1.562 500
Lorazepam glucurnido 156 --
Lometazepam -- 400
Medazepam -- 1000
Midazolam 12.500 --
Nitrazepam 98 200
Nordiazepam 390 --
Oxazepam 300 200
Prazepam -- 1000
Temazepam 98 250
Triazolam 2.500 500
-- No reportadas en la ficha tcnica.
59
Tcnica de Inmunoensayo, EMIT II Plus. Schironia.26
Esta tcnica presenta dificultad para la deteccin de benzodiacepinas de accin

corta (Lorazepam y Lormetazepam) o sus metabolitos debido a:
a) La mnima recuperacin de la benzodiacepina original en orina.

b) Altas concentraciones de la benzodiacepina.
c) Las nuevas generaciones de benzodiacepinas que se administran a dosis
inferiores a 5 mg con vidas medias cortas como Flunitrazepam, Lorazepam,
Lormetazepan, Nitrazepam, Clonazepam.
Material:
- Test EMIT II Plus para benzodiacepinas. Dade Behring.

- Calibrador: Benzodicepinas de lormetazepam (lmite de deteccin de 200 ng/mL).
- -glucuronidasa Tipo B1. Sigma-Aldrich. 100.000 unidades.
- Autoanalizador: MEGA. Merck.
El sistema monitorea los cambios en absorbancia a 340 nm y expresa el resultado

en las unidades de la reaccin (mA/min).
La solucin de -glucuronidasa es aadida a la muestra previamente al

inmunoensayo.
Metodologa:
Analizar previamente las muestras de orina por el mtodo EMIT II plus Dade
Behring sin tratamiento con -glucuronidasa.
Tratamiento de la muestra
Aadir 33 L de muestra ms 100 L de -glucuronidasa reconstituida con 7 mL de

agua destilada.
Volumen de muestra diluida: 20 L.

R1: 125 L (Reactivo de anticuerpo).
R2: 75 L (Reactivo de enzima).
60
10.2 Hidrlisis enzimtica /

extraccin lquido-lquido en
orina.
61
Hidrlisis Enzimtica.31
La hidrlisis enzimtica con -glucuronidasa, tiene por objeto romper la unin de

las benzodiacepinas con las protenas y compuestos endgenos en orina.
La actividad de enzimtica de la -glucuronidasa puede variar de grupo a grupo.

Los mtodos de anlisis deben incluir un control de hidrlisis para cada grupo de
muestras analizadas.
Diagrama 2.- Tcnica I. 31
HIDRLISIS ENZIMATICA
A 10 mL de orina,
ajustar a pH 7.0
si es necesario
Aadir por cada 1 mL de orina:

- 50 L de Buffer de acetato de sodio 2 M, pH 4.5
- 50 L de -glucorinidasa
Sonicar las muestras

por 15 minutos
Incubar por 24 h Incubar por 1 2 h

a 37 C a 55 C
Nota: La hidrlisis se lleva a cabo de 20-30 minutos, pero es ptimo dejar por 2h.31
62
Diagrama 3.- Tcnica Il.28
A 10 mL de orina,
ajustar a pH 7.0
si es necesario
Aadir por cada 1 mL de orina:

- 0.1 mLde Buffer pH 5.5
de Acetato - A. Acetico 0.1 M
- 0.02 mL-glucorinidasa

por 15 minutos
Incubar por 24 h Incubar por 1 2 h

a 37 C a 55 C
Extraer con:
Tolueno: Hexano : A. Isoamlico
en proporcin 78 : 20 : 2
Nota: La eficiencia de extraccin es de 73 a 89 %.
63
Hidrlisis cida / Alcalina Extraccin Lquido - Lquido en Orina
En estas tcnicas las benzodiacepinas se hidrolizan en solucin cida o alcalina,

formando benzofenonas para favorecer su extraccin en disolventes orgnicos.
Las Benzodiacepinas son insolubles en agua pero solubles en la mayora de los

disolventes orgnicos como: metanol, cloroformo, acetato de etilo, entre otros.
Diagrama 4.- Tcnica I. 28, 31
Aadir 3 mLde HCl

por cada 10 mLde
Orina
Mantener a 100 C por 30 minutos
Enfriar a
temperatura ambiente
Extraer con 10 mL Extraer con

de ter Etlico Diclorometano : Isopropanol : A. de Etilo
en proporcin 1:1:3
y ter de dietilo
Agitar suavemente
(evitar la formacin
de emulsiones)
Dejar reposar
(para la separacin de fases)
Recoger la fase orgnica
Adicionar 10 mL
de ter Etlico
Agitar y reposar
Juntar las fases orgnicas
Lavar los extractos

con 5 mLde NaOH 1M
El extracto etreo pude contener benzofenonas, por hidrolisis de cida, tambin se

emplea ter de Dietilo.
64
Diagrama 5.- Tcnica II. 28, 31
Acidificar 20 mL de orina Alcalinizar la muestra

con HCl H2SO4 al 10% con NH3,
hasta un pH 2 pH entre 8-9
Extraer con 10 mL Extraer con 10 mL

de ter Etlico de ter Etlico
Agitar suavemente Agitar suavemente

(evitar la formacin
(evitar la formacin
de emulsiones)
de emulsiones)
Dejar reposar La fase acuosa Dejar reposar

Fase orgnica Recoger la fase orgnica
Adicionar 10 mL Adicionar 10 mL
de ter Etlico de ter Etlico
Agitar y reposar Agitar y reposar

Juntar las fases orgnicas Juntar las fases orgnicas
Lavar los extractos Lavar los extractos

con 5 mL de NaOH 1M con 5 mL de NaOH 1M
y concentrar y concentrar
ADVERTENCIA: La concentracin de los extractos se lleva a cabo sobre plancha

calefactora, controlar temperatura o en bao maria.
65
Diagrama 6- Tcnica III.15
Transferir 5 mL Orina
en un embudo de extraccin
Adicionar un patrn interno
Aadir : - 1 mL de Buffer Tris 2M a pH 9.0

- 8 mL de Cloruro de n- butilo
Mezclar suavemente
15 minutos
Centrifugar
Transferir la capa de n- butilo ( capa superior)

a un vaso de ppdo. limpio
Evaporar a sequedad
Reconstituir en Metanol
Notas:
- El mtodo puede ser modificado con volmenes inferiores de muestra,
reduciendo el volumen de buffer Tris.
- El mtodo fue empleado para Diazepam, Oxacepam, Temazepam, Nitrazepam,
Clonazepam, Flunitrazepam y 7-amino-metabolitos.
66
10.3 Hidrlisis enzimtica /

extraccin en fase slida en
orina.
67
Extraccin en Fase Slida en Orina. 15

Los procedimientos de extraccin en fase slida de manera general constan de 7
pasos fundamentales:
1. Acondicionamiento de la columna.
2. Aplicacin de la muestra.
3. Lavado de la columna.
4. Ajuste de pH si lo requiere.
5. Secado de la columna.
6. Elucin de la droga.
7. Concentracin de los eludos resultantes y se somete a un proceso de
derivatizacin para anlisis por cromatografa de gases.
En esta tcnica de fase slida, los sorbentes pueden ser de tres clases de acuerdo
a la naturaleza de la interaccin, sorbentes polares, apolares y de intercambio
inico. Los mas empleados para extraccin de drogas en fluidos bilgicos se
realizan con sorbentes apolares (C2, C8 y C18).
68
Diagrama 7- Tcnica I.
Hidrolizar 5 mL orina con
- glucorinidasa
Adicionar un patron interno
Acondicionar y lavar previamente

una Columna DAU con: - 3 mL de Metanol
- 3 mL de Agua,
- 1mL de Buffer de Fosfato 100mM, pH 6.0
* Pasar la muestra por la columna

con un flujo de 1-2 mL/min
Lavar la columna con:

2 mL de Agua,
2mLde Acetonitrilo,
en 100mM de Buffer de
Fosfato , pH 6.0
Secar la columna dejando el vaco

aproximadamente 5 minutos
Lavar la columna con 2 mL de Hexano
Eluir la muestra con

3 mL de Acetato Etilo
Evaporar a la sequedad
Reconstituir el residuo en 100 L

de Acetato de Etilo
* Ajustar el vaco de 10-17 kPa

Notas: El porciento extraido de benzodiacepinas se extienden de 85 a 94% para
Diazepam, Nordazepam, Oxacepam, Lorazepam, Nitrazepam, Temazepam,
Clonazepam, -Hidroxilalprazolam, -Hidroxitriazolam.
69
Tcnicas de Hidrlisis Enzimatica / Extraccin Fase Slida.28, 31

Diagrama 8.-
Hidrolisis Enzimtica
con -glucorinidasa
A B C D
Acidificar con A. Actico 1M Alcalinizar la muestra con NH3,

pH entre 8-9
Verter en una columna

Bond Elut Certify Verter en una columna
Sep-Pak C18, previamente
activada y lavada con agua
Eluir con una solucin:
Hidrxido de Amonio al 3% Eluir con:
en Acetato de Etilo Hexano : Isopropanol
Aadir 3 mL de HCl en proporcion de 9 :1
Alcalinizar la muestra con NH3,
por cada 10 mL de pH entre 8-9
Orina

A 100 C por 30 minutos Chem Elut, previamente
activada
Enfriar a Eluir despes de 3 minutos

temperatura ambiente dos porciones de 15 mL de una mezcla de:
1. diclorometano: Isopropanol : Amoniaco conc. (78:20:2)
2. diclorometano: Isopropanol (9:1)
Sep-Pak C18, Reunir los extractos y
previamente activada adicionar unas gotas de HCl al
y lavada con agua 1% en Etanol
Eluir con: Cloroformo Concentrar el extracto y reconstituir en Etanol
A) Eficiencia de recuperacin de 73 a 83 % para N-Desmetildiazepam, Desalquilflurazepam, -Hidroxialprazolam,

Temazepam y Oxacepam.28
B) Con una eficiencia de recuperacin de 90% para benzofenonas. 24
D) Eficiencia de recuperacin de un 90%.- columnas Sep-Pak C18 activadas para Cromatografa de Gas Capilar.28
70
10.4 Tcnicas GC, GC/MS.
71
Tcnicas de Cromatografa de Gas (CG): Columna Empacada / Columna

Capilar.15, 38
Es una tcnica para benzodiacepinas que se reordenan como 3-hidroxi, con un

valor de tiempo de retencin que corresponde a Nordazepam y Ketazolam con un
factor de respuesta muy similar a Diazepam.
Los tiempos de retencin para benzodiacepinas se han demostrado en funcin de

la temperatura de la columna. Los valores deben ser verificados antes de iniciar
con el mtodo de anlisis mediante patrones de referencia.
Mtodo
Las soluciones patrn y las muestras (1mg/mL) se preparan en metanol,

inyectndose 1L a 2 L en el CG.
Preparacin de la muestra:
Las muestras de orina deben ser hidrolizadas enzimticamente antes de la

extraccin en el Diagrama 2-3. La extraccin recomendada es descrita en el
Diagramas 4-6.
Tcnica de GC; Columna Empacada.15, 38
Las consideraciones generales para estos mtodos es el acondicionamiento de la

columna, generalmente la temperatura de preparacin, es por lo menos de 30C
por encima de la temperatura de anlisis, a menos que requiera sobrepasar el
lmite superior de temperatura de la columna, especificado por el fabricante. El
acondicionamiento se realiza con el gas acarreador (como nitrgeno), con un flujo
normal y con el detector desconectado.
Mtodo A*: 15
Columna empacada de vidrio, de 0.91 m x 4
Columna: mm, 10 % OV-1 sobre Cromosorb G-HP,
malla 80-100.
Gas portador: Argn/Metano (95:5), 50 mL/min*.
Temperatura de la columna: 230C
Temperatura del inyector: 230C
Temperatura del detector: 300C
72
Mtodo B*: 15
Columna empacada de vidrio, de 1.83 m x 2

Columna: mm, 17.3 % OV-1 sobre Cromosorb W-HP,
malla 80-100.
Gas portador: Argn/Metano (95:5), 30 mL/min*.
Temperatura de la columna: 260C
*Detector: D. de captura de electrn Ni63, (ECD)
Mtodo C: 38
Columna: 6 ft ( 2 m), 2 a 4 mm ID de vidrio

3% SE-30 OV-1 en 80-100 Cromosorb W
Empaquetado:
HP
Gas portador: Nitrgeno.
Temperatura de la columna: Se programar a 200 C con intervalos de 16
C/min hasta 280 C.
Detector: D. de Ionizacin de Flama (FID).
73
Tcnica GC; Columna Capilar.15
La tcnica de CG Columna Capilar es parecida en cuanto a las condiciones

operativas a la CG de Columna Empacada.
Las columnas de Dimetil Silicona Fenil Metil Silicona al 5% pueden ser

empleadas en extracciones derivatizadas y no derivatizadas.
Tcnica de Columna Capilar; Condiciones operativas:
Mtodo A: 18
12m x 0.53mm Columna capilar de pared

recubierta de silica, recubrimiento de 1.0 m
Columna:
de fenil metil silicona al 5% (BP-5 o
equivalente).
Gas portador: Helio 2-3 mL/min*.
Inyeccin: Modo de splitless (inyeccin sin divisin)
100C durante 2 min. Programar 7.5C/min
Temperatura de la columna: hasta 310C, mantener por 310C por 10
min.
Detector: D. de Nitrgeno-Fsforo (NPD) D. de Captacin de Electrn (ECD).
Mtodo B: 38
Slicio fundido, unida qumicamente con metil

Columna:
silicona, como BP-1, DB-1 o equivalente
Espesor de pelcula: 0.25 mm
Gas portador: Nitrogeno 1 mL/min.
Longitud: 25 m, ID 0.25 mm
Inyeccin: 20:1
Temperatura de la columna:
250 C
Temperatura de detector: 275C
Detector: D. de Ionizacin de Flama (FID).
74
Tabla 16.- Tiempos de retencin relativos para benzodiacepinas por columna

capilar CG (Tomado de: UNDCP ST/NAR/28,1997).
Benzodiacepina Tiempo de Retencin Relativo
Alprazolam 1.225
Bromazepam 1.079
Clordiazepoxido 1.025
Clobazam 1.053
Clonazepam 1.186
7-Aminoclonazepam 1.186
Diazepam 1.000
Flunitrazepam 1.086
7-Aminoflunitrazepam 1.099
Flurazepam 1.136
Desalquilflurazepam 1.002
Lorazepam 0.986
Midazolam 1.069
Nitrazepam 1.159
7-Aminonitrazepam 1.148
Nordazepam 1.034
Oxacepam 0.843
Prazepam 1.088
Temazepam 1.075
Triazolam 1.276
75
Tcnica A; GC/MS, Columna Capilar.15
Preparacin de la muestra.
Las muestras de orina deben ser hidrolizadas enzimticamente, antes de la
extraccin de acuerdo con el procedimiento descrito en Diagrama 2-3. La
GC-MS
extraccin recomendada de acuerdo a los procedimientos descritos en el Diagrama
4-6.
Diagrama 9.- Tcnica A; GC/MS, Columna Capilar .18
Evaporar el extracto a la sequedad
Aadir a cada muestra

25 L de BSTFA con TCMS al 1%
Mezclar
Acondicionar a una temperatura de 60 C

Durante 15 minutos
Inyectar 1 L ,
Analizar por GC/MS.
Condiciones operativas:
A) 12.5 m x 0.20 mm columna capilar de
pared recubierta de silica con 0.33 m,
recubrimiento de dimetil silicona (ejemplo,
HP-1).
Columna:
B) 25 m x 0.20 mm columna capilar de pared
recubierta de silica con 0.33 m,
recubrimiento de fenil metil silicona al 5%
(ejemplo, HP-5).
Helio 0.65 mL/min, velocidad linear
Gas portador:
34.7cm/s.
Inyeccin: Modo de splitless (inyeccin sin divisin)
Temperatura de la columna: Programar 140C durante 1 min, enseguida
30C/min hasta 260C por 5 min, despus
elevar la temperatura 50C/min hasta 320C.
Temperatura de interface: 280C
Detector: Impacto de electrn en 70eV
76
Tabla 17.- Datos de Espectro de masa (EI+) para benzodiacepinas (Tomado de:
UNDCP ST/NAR/28,1997).
Benzodiacepina Pico Base ion, m/z Otros iones m/z (abundantes)
Alprazolam 308 297, 204

-hidroxialprazolam-TMS 381 382 (30),396(40),383 (39)
Bromazepam-TMS 388 374 (16), 386 (95), 387 (96)
Clordiazepoxido 282 283. 284
Clonazepam-TMS 387 352 (87), 386 (45)
7-aminoclonazepam-TMS 429 394 (99), 414 (30)
Diazepam 256 283 (92), 284 (67), 221
Flunitrazepam 312 286 (85), 285 (71)
7-aminoflunitrazepam-TMS 355 327 (87), 326 (36)
Flurazepam 86 99 (9), 387 (3)
Desalquilflurazepam-TMS 359 360 (91), 341 (62), 245
Halazepam 324 352, 289
Lorazepam-diTMS 429 430 (43), 431 (33)
Midazolam 310 297, 312
-hidroximidazolam-TMS 310 312 (34), 399 (10), 413 (37)
Nitrazepam-TMS 352 353 (65), 306 (26)
7-aminonitrazepam-diTMS 394 395 (87), 396 (30)
Nordazepam-TMS 341 342 (56),343 (45), 327
Oxacepam-diTMS 429 415 (18), 401 (20), 430
Pinazepam 308 280 (99), 307 (86)
Prazepam 269 295 (83), 91 (54), 241, 324
Temazepam 343 283, 257
Triazolam 313 238, 312, 314, 342
-hidroxitriazolam-TMS 415 417 (70), 430 (50), 432 (34)
Nota: Ver Anexo 15.3.
77
Tcnica B; GC/MS, Columna Capilar.40
Esta tcnica utilizada para deteccin de benzodiacepinas como: Alprazolam,

Bromazepam, Clordiazepoxido, Clobazam, Clorazepato, Diazepam, Estazolam,
Flunitrazepam, Lorazepam, Oxacepam, Midazolam.
Equipo: Espectrmetro de Masas Hewlett Packard cuadrupolar (QMS) modelo

5972A equipado con un Cromatgrafo de Gas 5890 (GC).
Diagrama 10.- Tcnica B; GC/MS, Columna Capilar .41
Ajustar a pH 6, 10 mL de orina
con Buffer de Fosfato
Hidrolizar con 50 L de -glucuronidasa

a 48 C durante 1 hora.
Evaporar a sequedad
Derivatizar los extractos secos con

70 L de MSTFA A 70C
durante 20 minutos
Inyectar 1 L ,
Analizar por GC-MS.
Columna capilar HP-5MS (5%-fenil-
Columna: metilpolisiloxano, 30 m x 0,25 mm x 0,25 m,
J&W Scientific, Folsom
Gas portador: Helio 0.7 mL/min*.
Inyeccin: Modo split, relacin de split, 1:10 y volumen
de inyeccin fue 2L.
Temperatura de la columna: 60-300C a 10C/min; 300C (5 min.).
Temperatura de interfase: 290C
* Operar en modo scan, m/z 50 a 550.
78
Tcnica C; GC/MS, Columna Capilar.41
Equipo
Hewlett Packard HP-5890 Serie II/EM 5971

Detector Espectromtrico Agilent de Masa 5973, en modo de scan (m/z 50-500).
- Presin del cabezal calculado con software RLT.

- Estndar Palmitato de Etilo para el tiempo de retencin (tR) de 17.68 min.
- Controlar el grado de pureza de los disolventes y reactivos.
Calibracin
Adicionar en soluciones estandar de Metanol de 10L, Diazepam, Flunitrazepam y

Flurazepam, en muestras blanco de orina (5mL) en concentraciones individuales
entre 50 y 500 g/L.
Adicionar N-metilclonazepam como estandar interno a cada muestra a un nivel de

50 g/L.
Diagrama 11.- Tcnica C; GC/MS, Columna Capilar.41
A 10 mL de Orina,
ajustar a pH 7.0
si es necesario
Aadir por cada 1 mL de Orina:

- 50 l de -glucorinidasa

por 15 minutos
Adicionar un patrn interno

(Prazepam)
Adicionar a las muestras 1 mL de

Buffer de Acetato de Amonio pH 6.5
Extraer las muestras con

Columnas Bond Elut Certify
Para derivatizar las benzodiacepinas con derivados de t- butildimetilsilil, calentar

con el extracto para anlisis por GC/MS.
79
Heliflex AT-5ms, 30 m x 0.25 m

Columna:
Gas portador: Helio a 0.8mL/min (29cm/s)
240C (Se mantiene10 min) ha

Temperatura de columna:
sta 315C (Se mantiene por 5 min.) a
10C/min
Detector: D. de nitrgeno-fsforo (NPD)
Tabla 18.- Ejemplo de tiempos de retencin (tR). Iones de inters (iones blanco:
Tion) y iones calificados (qualifier ions: Q1-Q3) en la biblioteca del equipo (Tomado
de: Pomilio, 2006).
Nombre del tR (min) Tion Q1 Q2 Q3

compuesto
Alprazolam 26.67 279 308 204 273

Bromazepam 22.08 315 58 317 236
Clonazepam 25.92 280 314 315 288
Diazepam 22.53 283 256 284 285
Flunitrazepam 24.00 312 285 313 286
Flurazepam 25.20 86 99 87 387
N-1-metilclonazepam 25.25 329 328 302 294
Nordazepam 23.13 242 241 270 269
Temazepam 23.83 271 273 272 300
Triazolam 27.42 313 315 342 238
80
Tcnica D; Sistema automatizado, MPS-DPX-CIS-GC/MS.34, 35
Tcnica para el anlisis de benzodiacepinas y sus metabolitos con estndares

internos deuterados como OH-Alprazolam-d5 y Nordiazepam-d5 con el sistema
automatizado MPS-DPX-CIS-GC/MS.
Diagrama 12.- Etapa 1; Preparacin de la muestra. 34, 35
Adicionar 10 L de -glucuronidasa,
para una muestra de orina 0.2 mL de orina
Adicionar 50 L de
Buffer de Fosfato de Sodio 0.1M a pH 4.0
Incubar por 2 h a una

temperatura de 55C,
Dejar enfriar a
temperatura ambiente
Adicionar 0.25 mL de Acetonitrilo

(formacin de un precipitado de la enzima)
Centrifugar la muestra, el sobrenadante,

transferir y etiquetar
Adicionar 200 L de HCl 0.1M
81
Posteriormente el muestreo se realiza con el muestreador automatizado (MPS), de

extraccin DPX (Extraccin con Pipetas Desechables), con tips de un 1 mL CX (las
puntas de CX contienen una tela de intercambio de cationes con caractersticas
ligeramente apolares). 34, 35
Diagrama 13.- Etapa 2; DPX automatizado: Muestreo del extracto. 34, 35
Adicionar 250 L de una solucin al 30 %

de Acetonitrilo-Agua, distribuyndose en la
punta en el sorbente DPX.
Desechar el disolvente
Sumergir La punta DPX en la muestra y

aspirar un volumen definido
Aspirar una parte de aire en la punta,

ocasionando un mezclado turbulento.
Mantener la mezcla 30 segundos

(parte de la muestra se asienta en el sorbente).
Desechar los residuos de la muestra.
Enjuagar el sorbente dos veces:

1. Solucin al 30 % de Acetonitrilo-agua
(0.5 mL)
2. Despus con Acetonitrilo. (0.5 mL)
Eluir los analitos extrados adicionando 0.7 mL

de una solucin de:
CH 2Cl 2 (78 %)
Isopropanol (20 %),
Amonaco Conc. (2 %)
Poner directamente en un frasco inyector
El tiempo aproximado de extraccin y manipulacin de solventes por muestra es de

6 minutos.
82
Equipo:
Sistema de GC/MS Agilent de 6890N/5975 (XL inerte).
Equipado con un sistema de inyeccin de Cooled (CIS 4) entrada PTV-type.
Muestreador MPS PrepStation con DPX.
Software de ChemStation Agilent para el sistema GC/MS.
El sistema de inyeccin refrigerado (CIS), evapora y purga el exceso de disolvente

al mismo tiempo que realiza la derivatizacin de los analitos (por el material inerte y
temperatura ambiente, programado en el equipo). Succiona lentamente disolvente
con la jeringa y es retirado en su totalidad a travs de una abertura antes de la
derivatizacin (mtodo de circulacin programada).30, 31
El proceso de derivatizacin
Programarinicia con una temperatura
una temperatura de CIS dede300C,
CIS de 300C, ayuda a
transferir los analitos derivatizados
para transferir a la columna
los analitos de GC aenlamodo
derivatizados de splitless.
columna
de GC en modo de splitless.
Diagrama 14.- Etapa 3; Sistema de Inyeccin CIS-GC/MS
Evaporar a sequedad el eluido del DPX

bajo una circulacin de Nitrgeno,
en el vial de muestra.
Adicionar 50 L de MTBSTFA y 50 L de
Acetato Etilo
Mantener la mezcla a una temperatura

de 70C durante 20 minutos.
Enfriar la soluci n
Adicionar 50 L de la solucin al CIS
El Diazepam, Nordiazepam, Oxazepam, Temazepam, -hidroxialprazolam y

Alprazolam combinando DPX para GC/MS, ha proporcionado excelentes resultados
para benzodiacepinas en orina.34, 35
83
11. Anlisis de Resultados.

- Las benzodiacepinas son de los medicamentos ms consumidos mundialmente,
con dosis relativamente bajas, en concentraciones de 0,25 - 20 mg por dosis.
- En general, los tiempos de deteccin para las benzodiacepinas se pueden detectar

de tres a siete das, en consumidores crnicos, slo cantidades menores del 1% de
la mayora de las benzodiacepinas se eliminan inalteradas en la orina, apareciendo
la mayor concentracin en forma conjugada, y si es una sola dosis de dos a cuatro
das por lo que la orina es la matriz biolgica preferible para el anlisis de deteccin
de benzodiacepinas y sus metabolitos.
- En la sociedad actual, el anlisis de benzodiacepinas ha cobrado gran importancia,

por lo que las prueba analticas cada vez son ms significativas, por favorecer la
toma de medidas preventivas, proporciona lmites claros a los consumidores o para
el esclarecimiento en un hecho delictivo.
- Es importante seguir la cadena de custodia, para asegurar la trazabilidad e

inviolabilidad de la muestra, con personal altamente capacitado entrenado para
recolectar, transportar, almacenar, para mantener una validez de los resultados
analticos en el contexto toxicolgico.
- Una vez que la muestra de orina llega al laboratorio, se inicia un anlisis cualitativo
con un alto grado de sensibilidad y sin una preparacin significativa, en este
procedimiento se utiliza generalmente una tecnologa de inmunoensayo en placa
que proporciona un resultado negativo positivo, tras el anlisis cualitativo inicial
se inicia un test confirmatorio solamente con los resultados positivos.
- Los mtodos analticos empleados para determinar benzodiacepinas en muestras

biologicas en laboratorios toxicolgicos dependen de varios factores, tales como la
sensibilidad requeridad, tiempo de analisis, nmero de muestras analizar, costos,
entre otros.
- Las tcnicas de inmunoensayo cromatogrfico de flujo lateral en un solo aplica para

benzodiacepinas y sus metabolitos, que sean metabolizadas en comn en el
organismo y depende de las benzodiacepinas reportadas en las fichas tcnicas del
proveedor.
- En consecuencia, los fabricantes de inmunoensayos en placa basan sus

"positivos" y "negativos" en niveles de corte segn normativas americanas como
las directrices de FDA, SAMHSA, NIDA.
- Los analistas toxicolgicos deben enfocarse a determinar la presencia de la

benzodiacepina en forma libre, de manera conjugada y sus metabolitos que es la
forma activa metablicamente, por lo que la muestra debe ajustarse a los principios
de qumica analtica.
- Es necesario realizar un pretratamiento de extraccin a las muestras para eliminar

las posibles interferencias por contaminacin o presencia de protenas (hidrlisis
enzimtica) y es necesaria una derivatizacin previa para obtener resultados
84
reproducibles para CG, CG/MS, la eliminacin de este paso, impactara

significativamente de forma negativa en los resultados obtenidos.
- El mtodo de derivatizacin, mejora significativamente su separacin en el anlisis

para GC, GC/MS.
- Los mtodos de GC, GC/MS, son tcnicas verstiles que permiten la separacin e
identificacin de los componentes en mezclas complejas, a nivel de trazas.
- En los mtodos de confirmacin se puede adicionar un patrn interno, en este caso

para las benzodiacepinas puede ser de manera deuterada o la misma
benzodiacepina.
- Algunos laboratorios encargados de la manufactura de Rohypnol, han adicionado

un colorante que lo haga evidente en las bebidas. En seguridad vial las
benzodiacepinas son un peligro en potencia porque retrasan el tiempo de
respuesta y rendimiento psicomotor.
85
12. Conclusiones
Debido a que se desconoce la benzodiacepina consumida, por el proceso

metablico que sufren, el anlisis txicologico para su identificacin es
compleja.
La cantidad mnima de orina para el anlisis toxicolgico es de 20 mL.
Las muestras deben de contar con cadena de custodia para una validez en el
resultado analtico.
Las tcnicas de inmunoesayo son eficientes en anlisis toxicolgico de fluidos

biolgicos como screening.
Es necesario realizar previamente una hidrolisis enzimtica para el tratamiento

de la muestra de orina para las extracciones liquido-liquido y fase solida.
La GC/MS es una prueba determinante para el anlisis de benzodiacepinas y

sus metabolitos en fluidos biolgicos y son consideradas tcnicas validas
confirmatorias con reconocimiento internacional en el anlisis toxicolgico.
Se debe de seguir actualizando las tcnicas de identificacin para resultados

reproducibles que den evidencia analtica ms sustentable, y conforme se
avance en la tecnologa.
El creciente aumento de uso de drogas ilcitas ha creado la necesidad de que

los laboratorios toxicolgicos sten dotados con tcnicas actualizadas y
equipos de tecnologa con gran capacidad de adquisicin y procesamiento de
datos
En este trabajo se dieron ejemplos de esquemas de preparacin de muestras

de orina para el anlisis preliminar y confirmatorio de benzodiacepinas y sus
metabolitos en el rango de nanogramos; las principales tcnicas seleccionadas
de pretratamiento consistieron en hidrolisis enzimtica, cida, alcalina,
extraccin liquida-liquida, extraccin en fase slida, derivatizacin y en
combinacin la cromatografa de gas y espectrometra de masas, consideradas
tcnicas vlidas en el test de drogas confirmatorio.
86
13. Glosario.
Abstinencia (Sndrome de): Conjunto de sntomas fsicos y psquicos que

sobreviven despus de suprimir el consumo de una sustancia toxicomangena.
Adsorcin: Basado en diferencias en la afinidad entre una fase mvil y la fase

estacionaria.
Amnesia antergrada: Incapacidad para recordar acontecimientos que puede

producirse como consecuencia de una patologa importante (por ejemplo, inicio de
un delirio), o de la administracin de un frmaco como las benzodiacepinas o como
el midazolam (un frmaco anestsico).
Amnesia: Prdida de la memoria adquirida. En trminos generales se suelen

diferenciar las amnesias para hechos recientes (fijacin) y para hechos antiguos
evocacin).
Ataxia: Imposibilidad para coordinar los movimientos voluntarios con especial

referencia a los de las extremidades.
Calibrador: Material de caractersticas conocidas (concentracin, actividad,

reactividad) usado para calibrar o ajustar un procedimiento de ensayo. El material
debe tener las mismas caractersticas de rendimiento que las muestras el
procedimiento.
Comicial: Relacionado con la epilepsia.
Comorbilidad: trmino mdico, que se refiere a dos conceptos: La presencia de

uno o ms trastornos (o enfermedades) adems de la enfermedad o trastorno
primario. El efecto de estos trastornos o enfermedades adicionales.
Confusin: Disminucin del nivel de conciencia con merma la capacidad de alerta

y vigilancia que puede arrastrar deficiencias en el funcionamiento intelectual y
alteraciones en las percepciones (alucionaciones) y en el pensamiento (delirio).
Copolmero: Macromolcula compuesta por dos o ms unidades repetitivas

distintas, que se pueden unir de diferentes formas por medio de enlaces qumicos.
Crbado: Operacin consistente en examinar mediante determinados criterios las

caractersticas de un objeto para encontrar aquellos que cumplen una determinada
propiedad. A menudo, se utiliza el trmino ingls "screening".
cut-off: es la cantidad mnima para ser considerada en un anlisis; corte
Disartria: Es una alteracin del lenguaje producida por una lesin cerebral. Se
distingue de las afasias motrices en que no se presentan alteraciones en la
prolongacin ni en la secuencia del lenguaje sino dificultades asociadas con los
componentes fonolgicos, es decir con la realizacin de los sonidos dl lenguaje.
Disnea: Es la dificultad respiratoria o falta de aire.
87
Farfullar: susurrar, balbucear, tartamudear, murmurar.
fg: fentogramo
FID: Detector de ionizacin de llama (FID, Flame Ionization Detector).
Inmunocomplejos: Complejos formados por la unin de molculas de antgenos y

anticuerpos, con o sin fijacin del complemento.
Labilidad Afectiva: Inestabilidad del estado afectivo en el que se producen

cambios con suma facilidad. Es propio de ciertos trastornos neurolgicos.
Miorrelajante: relajante muscular o antiespasmdico, frmaco que disminuye el

tono de la musculatura estriada. Se utiliza para relajar el sistema msculo
esqueltico y reducir el dolor debido a esguinces, contracturas, espasmos o
lesiones.
Precisin: punto hasta el cual los anlisis de replicacin de una muestra

concuerdan entre s. Estadsticamente, es lo contrario de la varianza.
Profrmaco: Sustancia farmacolgica que se administra en forma inactiva o poco

activa. Posteriormente, el profrmaco es metabolizado in vivo hasta un metabolito
activo.
Screening: El examen analtico o screening constituye la fase para la

confirmacin del compuesto a analizar, que tiene como objetivo identificar los
analitos de inters.
Sialorrea: Produccin excesiva de saliva.
Sndrome: Conjunto de signos y sntomas que agrupados constituyen un estado

reconocible. Es un concepto menos preciso que el de enfermedad el cual supone
una etiologa y fisiopatologa conocida.
Tolerancia: Estado de adaptacin del organismo a una sustancia que se

manifiesta por la necesidad por la necesidad de aumentar las dosis para obtener
los mismos efectos.
Tris: Hidroximetil Aminometano de frmula (HOCH2)3CNH2
88
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92
15. A N E X O S
93
15. Anexos
15.1 Ejemplos de caractersticas de Benzodiacepinas.
DIAZEPAM *
C16H13ClN2O Accin: Prolongada
Acta incrementando la actividad del
M. Accin:
cido gamma-aminobutrico (GABA).
Va metablica: Principalmente en plasma
Citocromo P450 3A4 (CYP3A4)
Metabolismo: Citocromo P450 1A2 (CYP1A2)
(CYP2C19)
Metabolitos activos
Metabolitos: N-desmetildiazepam,
oxazepam y temazepam
U. a protenas (%): 96-99
Liposolubilidad: 1.0
% sin modificar en
orina
1-25
Semivida (h): 20 50 y hasta 100 h
Eliminacin: Renal, leche materna
hipntica, anticonvulsivante, sedante,
Actividad:
relajante muscular y amnsica
V. de administracin: Oral, i.m., rectal, i.v.
Dosis: 5-30 mg
p.m: p.f.: Alupram, Diacepan, Diapam, Diastat,
284.7 131-135C Diazepan, Dipam, Kiatrium, Levium
Nombre comercial:
Novazam, Umbrium,Valium, Zipan
Tensopam
Nombre IUPAC:
7-chloro-1-methyl-5-phenyl- Produce sus acciones en especial a nivel de sistema lmbico
3H-1,4-benzodiazepin-2-one dos o tres veces ms potentes que el clordiacepoxido. Cruza la
barrera hematoenceflica y placentaria
* Referencias Bibliogrficas: 12, 13, 14, 20, 38,42.
94
ALPRAZOLAM *
C17H13ClN4 Accin: Corta
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolismo: CYP3A3/4
alfahidroxialprazolam (con poca
Metabolitos: actividad farmacolgica) y benzofenona
(inactivo).
% sin modificar en
orina
20
Semivida (h): 9 -20
Renal. Se elimina con la orina el 80%
Eliminacin: en forma metabolizada y en leche
materna.
Hipntica, anticonvulsivante, sedante,
Actividad: relajante muscular y amnsica;
antidepresiva.
V. de administracin: Oral
Dosis: 0.25 - 2 mg (mximo 8mg por da)
p.m: p.f.:
308.8 228-228.5C Alzam, Alplax ,Alpronax, Bestrol
Nombre comercial:
Esparon, Intensol, Niravam, Tranax
Nombre IUPAC:
8-chloro-1-methyl-6-phenyl- Produce acciones inhibitorias en al SNC, en especial a nivel de
4H-[1,2,4]triazolo[4,3- sistema lmbico. Cruza la barrera hematoenceflica y barrera
a][1,4]benzodiazepine fetoplacentaria.
*
BROMAZEPAM
C14H10BrN3O Accin: Intermedia
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolismo: Glucoronidacin
3-hidroxibromazepam
farmacolgicamente act. (13-30%) y 2-
Metabolitos:
(2- amino 5 bromo-3-3 hidroxibenzoil)
piridina ( 40%)
U. a protenas (%): 70 80
% sin modificar en
orina 2% de forma inalterada
Semivida (h): 20
Eliminacin: Renal
Ansiolitico, hipntica, anticonvulsivante,
Actividad: sedante, relajante muscular y
amnsica.
Dosis: 1.5 -12 mg/da
p.m: p.f.: Calmepam, Creosedin,Durazanil
316.2 237-238.5C Gen-Bromazepam, Lekotam, Lexotan,
Nombre comercial:
Lexotanil, Otedram
Nombre IUPAC:
7-bromo-5-pyridin-2-yl-1,3- Produce sus acciones inhibitorias en al SNC, en especial a
dihydro-1,4-benzodiazepin- nivel de sistema lmbico.
2-one
95
CLORDIAZEPOXIDO, CLORHIDRATO *
C16H14ClN3O Accin: Prolongada
M. Accin:
Va metablica: Hgado;
desmetilclordiazepxido, demoxepam,
Metabolitos:
desmetildiazepam y oxazepam
U. a protenas (%): 94 -97
Liposolubilidad: --
% sin modificar en
orina
<1
Semivida (h): 6 27
Eliminacin: Renal
Hipntica, anticonvulsivante, sedante,
Actividad:
relajante muscular y amnsica.
V. de administracin: Oral, parenteral, i.m
Dosis: 15-100 mg/da
p.m: p.f.:
299.8 236-236.5C
Nombre comercial: Librium, Librax
Nombre IUPAC:
7-chloro-4-hydroxy-N- Poco potencial de abuso por inicio lento de accin. Produce
methyl-5-phenyl-3H-1,4- sus acciones inhibitorias en al SNC, en especial a nivel de
benzodiazepin-2-imine sistema lmbico. til en desintoxicacin, alcohlica.
CLOBAZAM *
C16H13ClN2O2 Accin: Prolongada
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolismo: Citocromo P450 2C19 (CYP2C19)
N-desmetilclobazam con actividad
farmacolgica, 4-hidroxi-clobazam, y en
Metabolitos:
menor cantidad 4-hidroxi-N-desmetil-
clobazam
% sin modificar en
orina
--
Semivida (h): 20 - 50
Eliminacin: Renal.
Actividad:
Dosis: 10 mg
p.m: p.f.:
Chlorepin, Clorepin, Frisium, Mystan
300.7 180-182C
Nombre comercial: Urbadan
Nombre IUPAC:
8-chloro-5-methyl-1-phenyl- Estados de ansiedad grave, la que acompaa a estados
1,5-benzodiazepine-2,4- depresivos o a psicosis , desintoxicacin etlica y predelirium.
dione
96
ESTAZOLAM *
C16H11ClN4 Accin: Corta
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolitos: 4-hidroxi-estazolam
U. a protenas (%): 93
Liposolubilidad: --
% sin modificar en
orina
--
Semivida (h): 10-24
Eliminacin: Renal, biliar, y en heces del 4%
Actividad:
relajante muscular
Dosis: 2 mg
p.m: p.f.:
Pro Som, Tasedan, Eurodin, Julodin
294.8 227-233C
Nombre comercial: Nemurel, Nuctalon
Nombre IUPAC:
8-chloro-6-phenyl-4H- Produce sus acciones en especial a nivel de sistema lmbico e
[1,2,4]triazolo[4,3- hipotlamo
a][1,4]benzodiazepine
FLUNITRAZEPAM *
C16H12FN3O3 Accin: Intermedia
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolismo: Citocromo P 450 2C 19 (CYP2C19)
N- desmetilnitrazepam
7- aminoflunitrazepam (activo),
Metabolitos:
3- hidroxiflunitrazepam y derivados
desmetilados.
% sin modificar en
orina
--
Semivida (h): 19-24
Eliminacin: Renal en 81%, heces 11%
Actividad: relajante muscular y amnsica,
preanestsico
V. de administracin: Oral, i.m.
Dosis: 1-2 mg
p.m: p.f.:
313.3 166-167C Narcozep, Primun, Rohypnol,
Nombre comercial:
Zetraflum,
Nombre IUPAC:
5-(2-fluorophenyl)-1-methyl- Produce sus acciones en especial a nivel de sistema lmbico
7-nitro-3H-1,4- (hipocampo) o centro de emociones del SNC, amnesia
benzodiazepin-2-one antergrada.
97
CLORAZEPATO DIPOTASICO *
C16H11ClN2O3 Accin: Prolongada
Acta incrementando la actividad
M. Accin: del cido gamma-aminobutrico
(GABA).
Se descarbolxila rapidamnete a pH
Va metablica:
cido del estomago y en Hgado
Metabolismo: Glucorinidacin
N-desmetildiazepam (Nordazepam,
activo), oxacepam conjugado (3
Metabolitos: hidroxi- nordiaxepam) y pequeas
cant. de p- hidroxinordiazepam y
nordiazepam.
Liposolubilidad: --
% sin modificar en
orina --
Semivida (h): 24-210
Eliminacin: Renal en 62-67%, heces 15-19%
hipntica, anticonvulsivante,
Actividad: sedante, relajante muscular y
amnsica
V. de administracin: Oral, i.m.
Dosis: 5-20 mg/da
p.m: p.f.:
408.9 209-211C
Nombre comercial: Gen-xene, Tranxene
Nombre IUPAC:
7-chloro-2-oxo-5-phenyl-1,3- Ansioltico. Sedante/hipntico. Relajante del msculo
dihydro-1,4-benzodiazepine- esqueltico.
3-carboxylic acid
OXACEPAM *
C15H11ClN2O2 Accin: Intermedia
M. Accin:
Va metablica: Hgado
oxacepam conjugado (3 hidroxi-
Metabolitos:
nordiaxepam)
% sin modificar en
orina
--
Semivida (h): 4-24
Eliminacin: Renal en 90%
Ansioltico, hipntica, anticonvulsivante,
Actividad:
sedante, relajante muscular y amnsica
Dosis: 15-30 mg/da
p.m: p.f.:
286.7 204-206C Tacepam, Tazepam, Uskan, Zaxopam
Nombre comercial:
Nombre IUPAC:
7-chloro-3-hydroxy-5- De eleccin en ancianos y pacientes con trastornos renales o
phenyl-1,3-dihydro-1,4- hepticos.
benzodiazepin-2-one
98
TETRAZEPAM *
C16H17ClN2O Accin: Intermedia
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolitos: Conjugado 3- hidroxitetrazepam
Liposolubilidad: --
% sin modificar en
orina
--
Semivida (h): 22-24
Eliminacin: Renal en 70% y heces 30%
Actividad:
Dosis: 25-50 mg
p.m: p.f.:
288.8 144C
Nombre comercial: Miolastan
Nombre IUPAC:
7-chloro-5-(cyclohexen-1- Acta como ansioltico y relajante muscular.
y1),1,3-dihydro-1-methyl-
2H-1,4-benzodiazepin-2-one
MIDAZOLAM, MALEATO *
C18H13ClFN3 Accin: Corta
M. Accin:
Va metablica: Hgado
Metabolismo: CYP2D6/3A4, CYP3A5, CYP2B6
-hidroximidazolam,
Metabolitos: 1-hidroximidazolam,metabolitos
conjugados,
% sin modificar en
orina
<1
Semivida (h): 1.5-3
Eliminacin: Renal en 60-80%,en heces 2-10%
Ansioltica, hipntica, anticonvulsivante,
Actividad:
sedante, relajante muscular y amnsica
V. de administracin: Oral, parenteral, i.m.

Dosis: 3-15 mg/da
p.m: p.f.:
325.7 159C Nombre comercial: Dormicum, Versed
Nombre IUPAC:
8-chloro-6-(2-fluorophenyl)- premedicacin antes de una intervencin. Anestesia: induccin
1-methyl-4H-imidazo[1,5- y mantenimiento
a][1,4]benzodiazepine
99
15.2 Ejemplo de Formato de Cadena de Custodia.
100
15.3 Ejemplos de Espectrogramas.
Espectrogramas de Oxazepam.
i)
ii)
101
iii)
iv)
102
Espectrogramas de Oxazepam-derivatizados.
i)
103
ii)
iii)
104

Tesis - Linares - Rebollo BDZ PDF

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

IDENTIFICACIN DE METABOLITOS DE BENZODIACEPINAS EN

QUMICO FARMACUTICO BILOGO

DIRECTOR DE TESIS: MTRO. en C. ISIDRO HINOJOSA LPEZ

MXICO D.F. 2013

Estos mtodos son fundamentales en cualquier investigacin criminalstica con el

El abuso de benzodiacepinas puede presentarse bajo dos patrones: el abuso

La deteccin de benzodiacepinas es de gran inters para la bsqueda de un

3.1 Antecedentes Histricos.

Las benzodiacepinas son actualmente los psicofrmacos ms prescritos a nivel

Este frmaco es producido y vendido legalmente en Estados Unidos, Europa y

Las estadsticas indican que su distribucin y abuso estn aumentando, debido a

benzodiacepinas de mayor consumo, en concentraciones menores de 1 mg/tab;

La gran difusin de esta sustancia, puede explicarse, debido a la creencia errnea

3.2 Estructura qumica de Benzodiacepinas.

En general las benzodiacepinas estn compuestas por un anillo bencnico (A),

Las BZD ms utilizadas se pueden dividir en tres subgrupos:

Tabla 1.- Ejemplos de substituyentes de Benzodiacepinas. (Tomado de: COFCR,

Quazepam -CH2CF3 =S -H -Cl -F

La denominacin de estos compuestos, suele peculiarizarse por la terminacin -lam

3.3 Clasificacin de Benzodiacepinas.

Las benzodiacepinas se dividen en tres grupos en base a su perfil metablico:

Grupo II: Benzodiacepinas conjugadas, no tienen metabolitos activos por lo que la

Figura 2.-Diagrama general de metabolitos de benzodiacepinas. (Tomado de:

3.4 Rutas Metablicas de Benzodiacepinas.

Las benzodiacepinas se metabolizan a travs de la superfamilia conocida como

El metabolismo heptico difiere entre las diferentes benzodiacepinas; algunas

En Fase I, mediante la va oxidativa, se produce la hidroxilacin o N-desalquilacin

Adems, la fase I es una va cuya actividad depende de varios factores: puede

La enzima CYP3A, slo metaboliza parcialmente el Diazepam y el Flunitrazepam.

Figura 3.- Va metablica 1,4-benzodiacepina; Nordazepam y Oxacepam son los

Pinazepam Prazepam Halazepam

Figura 4.- Ilustra la ruta general de metabolismo para triazolo- e imidazo-

Apertura del anillo 4-hidroxilacin

Alprazolam R1=CH3 R2=H X=N

Figura 5.- Ilustra la va metablica para 7-nitrobenzodiacepina, como Nitrazepam,

Apertura del anillo

Clonazepam R1=H R2=Cl

Flunitrazepam reducido a 7-amino-flunitrazepam y acetilado para 7-

Figura 6.- Ilustra la va metablica para otras benzodiacepinas, Parte I (Tomado

Apertura del anillo

Apertura del anillo 3-hidroxilacin

Bromazepam Apertura del anillo hidroxilacin

Figura 7.- Ilustra la va metablica para otras benzodiacepinas, Flurazepam es

La duracin de su accin depende de la liposolubilidad de cada compuesto, si los

Las benzodiacepinas y sus metabolitos activos se fijan a las protenas plasmticas

Tambin se han clasificado de acuerdo a la intensidad y duracin de la

Tabla 2.- Ejemplos de Benzodiacepinas conforme a la duracin del efecto. 2,16

Bromazepam Lexatin 1.5-6 mg/8h

Midazolam Dormicum 7.5-15 mg/d

En las Tablas 3-5, presenta los metabolitos presentes en sangre y orina de

Tabla 3.- Metabolitos de Benzodiacepinas en Sangre y Orina (Parte I) (Tomado de:

Benzodiacepina Metabolito en Sangre Metabolito en Orina

Tabla 4.- Metabolitos de Benzodiacepinas en Sangre y Orina (Parte II) (Tomado

Benzodiacepina Metabolito en Sangre Metabolito en Orina

Tabla 5.- Metabolitos de Benzodiacepinas en Sangre y Orina (Parte III) (Tomado

Benzodiacepina Metabolito en Sangre Metabolito en Orina

3.5 Consideraciones Generales.

Asimismo experimentan mltiples pasos metablicos, se acumulan de forma

Absorcin: se absorben muy bien por va oral. La velocidad de absorcin depende

3.5.2 Farmacologa, Receptores.

El GABA es un neurotrasmisor aminocido (cido gamma-aminobutrico), su