Selección de columnas Sugerencias para limitar el

de HPLC y como uso y gasto de solvente

reducir el consumo de
disolvente

A il t T
Agilent Technologies
h l i

ACN(MeCN)
( )

1
Alternativas para el ahorro de acetonitrilo
Siempre es conveniente ahorrar en solvente, pero más hoy
debido a la escasez de Acetonitrilo
1) Revise la flexibilidad de su método y si es posible hacer
ajustes
j en el metodo. Analizar q qué ajustes
j requiren
q revalidación
del método y cuales no.(Criterios de ajustes de métodos)
2) Contemple el uso de un solvente alternativo (metanol) y de
columnas con dimensiones diferentes.
3) Sugerencias de ahorro no relacionadas con el cambio de
método o columna
4)Utilice un equipo UHPLC 1290 de altas prestaciónes y
columnas RRHD de 2,1mm

2
 1) Criterios USP y FDA de ajuste de métodos
Criterios de ajuste de Método para las dimesiones de la columna
Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/ejemplos
250mm 75mm
Longitud de columna ± 70%
150mm 50mm
±50%
% ((FDA O
ORA-LAB 5.4.5*)
*)
USP – ± 25% 4.6 mm 3.0 mm (-35%)
Diametro interno de columna Se puede ajustar el diámetro interno 4.6 mm 2.1 mm (-54%)
de la columna siempre que se
mantenga constante la velocidad 3.0 mm 2.1 mm (-30%)
lineal**(en estudio)
Flow Rate ±50%
Reducir lo que necesite-
necesite Si se cambia
bi a una columna
l más
á
Injection Volume manteniendo la precisión y pequeña haz el cambio apropiado en
limites de detección- el volumen de inyección.
Puedes cambiar la long de la col y el
tamaño de particula para mantener la
misma resolución
Tamaño de particula Reduce como máximo el 50%
5um 3.5um (-30%)
35
3.5um 1
1.8um
8 ((-49%)
49%)
5um 2.7um (-46%)
*Paraver la copia oficial, ir la página http://web.ora.fda.gov/dfs/policies/manuals/default.htm
(ORA: Office Regulatory Affairs) // //** USP 30 Revisiones al Segundo Suplemento,
Suplemento PF34(1)

3 May 4, 2010
2) Varios enfoques para reducir el gasto de
solventes en el HPLC
a) Reducir el diametro de la columna – Cambiar a columnas “Solvent Saver”
(3.0mm ID) o Narrow Bore (2.1mm ID)
• Se adecúa a las normativas de la FDA y a las futuras normativas de la USP
b) Reducir la longitud y el tamaño de partícula de la columna
• Mayor flexibilidad,
flexibilidad Asegurate que encuentras la Resolución necesaria
• Columnas más cortas con tamaño de partícula pequeño
– Columnas “Rapid
Rapid Resolution “ para cualquier LC (3
(3.5um)
5um)
– Columnas Rapid Resolution HT( 1.8um) – 50mm para cualquier LC y más
largas para RRLC (1200) o columnas RRHD para UHPLC (1290)
– Columnas Poroshell 120 (2.7um) para cualquier HPLC o UHPLC
– Esto puede hacerse siguiendo las directrices de la USP y FDA sobre
métodos
ét d oficiales
fi i l
c) Reducir simultáneamente la longitud, el tamaño de partícula y el diametro.

4 May 4, 2010
 a) Primer enfoque: Reducir el diametro
Selección del diametro de la columna
La selección del diametro de la columna tendrá un gran impacto en el gasto
de disolvente porque el flujo depende del diametro interno de la columna!
Cuando se cambia el ID hay que mantener la misma velocidad lineal y por
tanto reducir el flujo y se podría reducir el volumen de inyección

F2 = r22 F1
r12
Pasando de 4.6mm i.d. a 1mL/min a 3.0mm i.d. :-
3 02 x 1.0
F2 = 3.0 10 = 0 0.42mL/min
42mL/min
4.62
Escala volumenes de Inyección
V2 = V1 x [(r22 x L2)/(r12 x L1)] r = radio de columna,
L= longitud
L

5
Beneficios al reducir el Diametro de la columna

• Reducir el uso y gasto de solvente

• Mantener el tiempo de análisis y la

resolución

• Aumentar sensibilidad con el mismo

volumen de inyección (por lo tanto puedes
reducir el volumen de inyección cambiando
el ID)

6
 Columnas de HPLC de diámetro interno más
pequeño reducen el gasto de solvente

Analitica Estándar Solvent Saver Narrow Bore

ID Columna 4 6 mm
4.6 3 0 mm
3.0 2 1 mm
2.1

Actual Solvente
100 mL 40 mL 20 mL
usado
% disminución
de Solvente - 60% 80%
Usado
Reduciendo el ID el uso del solvente se reduce en gran medida– Primer paso para
ahorrar
h solvente!
l t !

7
Separación de Antibacteriales en Columnas con
diferentes diametros
Columna: ZORBAX SB-C18 Fase Móvil*: 20% ACN: 80% Citrato/fosfato pH 2.6 *200/87/713 ACN/0.2M Na2HPO4/0.1M ácido cítrico
Temperatura: ambiente Muestra: Antibacteriales 1. Sulfamerazina 2. Furazolidona 3. Acido Oxolínico 4. Sulfadimetoxina 5. Sulfaquinoxolina
6. Ácido Nalidíxico
SB-C18 Solvent Saver SB-C18 SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 um 3 0 x 150 mm, 5 um
3.0 2 1 x 150 mm, 5 um
2.1
1
1
4
4

6 6
2 2 5
3 5 3 1
4
2 6
3 5

0 Time (min) 40 0 Time (min) 40 0 Time (min) 40

Solvente Usado: 31 mL Solvente Usado: 15 mL Solvente Usado: 8 mL

% Ahorro
Ah S l
Solvente=
t 52% % Ah
Ahorro S
Solvente=
l t 74%
Flujo: 1.0 mL/min Flujo: 0.5 mL/min Flujo: 0.25 mL/min
y
Inyección: 3 uL Inyección: 2 uL Inyección:
y 1 uL
V l
Volumen C ld Detector:
Celda D t t 8 uL
L Volumen Celda Detector: 2 uL
Volumen Celda Detector: 8 uL

Las columnas “Solvent Saver” reducen el uso de solvente más del 50% mientras mantienen los mismos
tamaños de particula, fase ligadas y longitudes de columna.
Esto cumple con las directrices de la FDA para el ajuste de método.

8 May 4, 2010
 b) Segundo enfoque: Variación de la longitud y
del tamaño de partícula.
partícula
Reduce el tamaño de p
particula y longitud
g de
columna simultaneamente para:

Reducir tiempo de analisis

R d i ell uso y gasto
Reducir t de
d disolvente
di l t
Mantener la resolución

9 May 4, 2010
 Análisis de Propranolol con una columna ‘Rapid Resolution’
(3.5um) usando 50% menos de Acetonitrilo
SB-C18 SB-C18 Rapid Resolution
4 6 x 150 mm
4.6 mm, 5 μm 4 6 x 75 mm,
4.6 mm 3.5
3 5 μm

Plates: 6371
Platos: 6370
USP Tf (5%): 1.09
1 09
USP Tf (5%): 1.14
Tiempo de
Tiempo de
retención: 6.50 min Fase Móvil: 75% 50 mM KH2PO4,
pH 44.4:
4: 25% ACN retención: 3.11 min
S l
Solvente Flujo: 1.5 mL/min
Solvent
Usado: 12 mL Muestra: 1. Propranolol
Usado: 6 mL
Solvent
So e t
Ahorrado: 50%

0 5 10 0 5 10
Time (min) Time (min)

• Excelente forma de pico en columnas SB-C18 , cumplen los requerimientos con muy poco tailing.
• Rapid
R id Resolution
R l ti SB-C18
SB C18 reduce
d ell ti
tiempo d
de análisis
áli i con resultados
lt d equivalentes.
i l t

10 May 4, 2010
Paso siguiente– Columnas Rapid Resolution HT
(RRHT 600 bares) o RRHD 1200 bares para UHPLC
o Columnas Poroshell para uso en HPLC o UHPLC
Las columnas ‘Rapid Resolution HT’ y ‘Rapid Resolution HD’
tienen tamaño de particulas de1.8um
Esta reducción en el tamaño de partícula permite incluso el uso
de columnas más cortas con la misma resolución.
Las columnas Poroshell 120 también generan más eficacia a
presiones de HPLC convencional
Columnas más cortas implica menores tiempos de análisis y
ahorro substancial de disolventes.
disolventes

11
Se pueden hacer Ajustes al Método para Transferir el
Ensayo USP para la Suspensión de Ibuprofeno Oral a
columnas RRHT Requerimientos USP:
mAU 4.6 x 150 mm, 5 um Columna L7
5uul iny.
y R >1.5
60
TF(5%) < 2.0
40
32 mL Solvent Usado
20
R = 11
0
0 2 4 6 8 10 12 14 min
)
mAU
4.6 x 100 mm, 3.5 um Los factores de cola para todos los picos son<1.15
3.3 ul iny.
60 20 mL Solvente Usado
40 38% ahorro disolvente
20 R = 11
0
0 2 4 6 8 10 12 14 min
)
mAU Rapid Resolution HT 4.6 x 50 mm, 1.8 um 1.7 ul iny.
11 mL Solvente Usado
60
66% ahorro disolvente Fase Móvil( 63:37) agua :acetonitrilo + 1
1.8
8 ml H3PO4
40
Flujo = 2.0ml/min. Temp. : ambiente LC: Agilent 1100
20
R = 10.0 Muestra: Suspensión Oral de Ibuprofeno para niños, con
benzofenona como estandar interno preparado según USP
0
0 2 4 6 8 10 12 14 min

12 May 4, 2010
¿Qué Clase de Productividad puede lograrse
usando las columnas RRHD con el 1290 Infinity LC?
1. Análisis Rápidos y con bajo consumo de disolventes–
especialmente con muestras algo complejas
1. Análisis en gradiente con 4-10 componentes
2. Más resolución en menor tiempo
1. Elección de diferentes longitudes de columna para obtener la
resolución deseada
2. Maximizar la capacidad de picos en separaciones de gradientes de
muestras complejas

Page 13
Análisis Rápidos en ZORBAX Rapid Resolution
High Definition Eclipse Plus C18
DAD1 D, DAD1C, DAD: Signal C, 280 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)
DAD1 E, DAD1D, DAD: Signal D, 255 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)
mAU
THBP RRHD Eclipse
p Plus C18,, 2.1 x 50mm,, 1.8um,,

415
0.4
600

Pmax 1070 bar

Esta muestra de 10 compuestos requiere un
500
gradiente q
g que va más allá de los 1000 bar.
Es una separación de menos de 2 minutos!
400 Gasto de solvente: 2,9mL
Datos Cortesía de: Gerd Vanhoenacker
Research Institute for Chromatography
300
Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium
0.272

PG
OG
DG

1.055
200
NDGA

1.524
TBHQ
0.757

BHA
BHT AP
0.480

0.883

1.684
100

Ionox-100
Ionox 100

556
1.5
1.011
0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 min

Page 14 Month ##, 200X

 Análisis Rápido en Agilent Zorbax Rapid
Resolution High Definition Eclipse Plus C18
Método
Columna ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 
(SN USDAY01001)
Fase Móvil A=0.02% H3PO4, B=acetonitrilo/metanol 3/1
Flujo
l 1.6 mL/min
/
Gradiente 0‐1.85 min 30‐100% B
Volumen de inyección 1 µL
D t t
Detector Si 280/10
Sig=280/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz
R f 400/50 80 H
Sig=255/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz
Temperatura 45°C
Muestra Mezcla de Antioxidantes, ca. 100 ppm
de Antioxidantes ca 100 ppm

Un flujo de 1.6 mL/min es muy rápido, y permite una rápida separación.

Datos Cortesía de: Gerd Vanhoenacker Research Institute for Chromatography

Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

Page 15 Month ##, 200X

¿Dónde cae este ejemplo en el Rango del 1290 Infinity?

1070 bar, 1.6ml/min Esta app. cae en el “Power Range”

Page 16 Month ##, 200X

Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis y la Rs
Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo,
agua:acetonitrilo Flujo: 0.5
0 5 mL/min,
mL/min Temp: ambiente,
ambiente Columnas: RRHD SB-C18SB C18, 2
2.1
1 mm ID
ID, Longitudes
abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona

RRHD 1.8um 1200 bar Rs3,2: 5.64

N6 : 10,700
50 mm Presión: 350 bar
Solvente: 1,25mL
min
0 1 2 3 4

Rs3,2: 9.02
N6 : 21,100
100 mm Presión : 566 bar
Solvente: 1,75mL
0 1 2 3 4 min

Rs3,2: 11.98
R 11 98
150 mm N6 : 34,100
Presión :750 bar
0
Solvente: 2,5mL
2 5mL
0 1 2 3 4 min

La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar alta

resolución
l ió con ell 1290 Infinity
I fi it LC.
LC

Page 17 Month ##, 200X

Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:

Las columnas Poroshell 120 tienen:

• 80-90%
80 90% d
de eficicacia
fi i i de
d las
l subb2
2um
• A presiones un ~40-50% más bajas
• El doble de la eficacia de las
columnas 3.5um (totalmente porosas)
• Con un tamaño de partícula de 2.7um
• Con una frita de entrada de 2um que 0.5um
no se bloquea
• Con un límite de presión de 600 bar,
1.7um
para uso en HPLC y UHPLC

• La partícula tiene un núcleo sólido

(1.7um) y una cubierta exterior porosa 0.5um

de 0
0.5um
5um como zona de difusión
Confidentiality Label

18 May 4, 2010
Las Columnas Poroshell 120 proporcionan

Separaciones de Alta Velocidad y Alta Resolución a presiones

convencionales de HPLC.
• Compatible con HPLC estandard– incluso con columnas 150mm largas!
• Columnas de alta eficacia significa alta resolución y capacidad de flujos altos.
altos
Separaciones de Ultra Resolución a presiones UHPLC
U solución
Una l ió adicional
di i l de
d AAgilent
il t para una mayor productividad
d ti id d
• Solo Agilent tiene partículas superficialmente porosas de 2.7um y partículas
t t l
totalmente
t porosas sub b22um
• Distintas soluciones para resolver las distintas necesidades de los clientes –
y no una explicación
p de p
porqué
q el único p producto q
que la competencia
p tiene
resolverá todas las necesidades.

Page 19
Elija Poroshell 120 para HPLC de Alta Eficacia
Columnas: 3.0 x 100mm, Fase Móvil: 65% A: 0.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocratico, Flujo 0.5 mL/min
1 µL inyección 26 °C Sig = 220, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P-hidroxibenzoico
4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico

Casii 2X la
C l eficacia
fi i de
d 3.5um
35
mAU
Poroshell 120 EC-C18, Presión HPLC (< 400 bar)
300
3.0 x 100mm, 2.7 µm;
200

100
N = 21
21,567,
567 P = 300 bar
0

1 2 3 4 5 6 min
mAU

300
RRHT Eclipse Plus C18 1,2 ml de
200
3.0 x 100mm, 1.8 µm; consumo
100
N = 25753, P = 456 bar
0

1 2 3 4 5 6 min
7
mAU
Rapid
p Resolution Eclipse
p Plus C18,,
250
200 3.0 x 100mm 3.5 µm;
150
100 N = 11651, P = 153 bar
50
0

1 2 3 4 5 6 7 min

Page 20
Poroshell 120 EC-C18 para Separaciones rápidas en
UHPLC
Columna: Poroshell 120 EC-C18 3.0 x 100mm, 2.7um Fase Móvil: 65% A: 0.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocrático,
Varios Flujos 1 µL inyección 26 oC Señal = 220, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P-
hidroxibenzoico 4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico

mAU
300

200 Flujo = 0.5 mL/min,

100
P = 300 bar
bar, NAB = 24567
0

2 4 6
mAU
300

200 Flujo = 0.75 mL/min,

100 P = 433 bar
0

2 4
mAU

200 Flujo = 1.0 mL/min,

100 P = 559 bar
0

2 4 min
3
Pueden usarse Solventes más viscosos como el metanol a presiones HPLC o UHPLC
UHPLC.

Page 21
Lista Completa de Part Numbers C18
Poroshell 120 Part Number Poroshell 120 Part Number
EC-C18, 2.7um SB-C18, 2.7um
4.6 x 150mm 693975-902 4.6 x 150mm 683975-902
4.6 x 100mm 695975-902 4.6 x 100mm 685975-902
4.6 x 75mm 697975-902 4.6 x 75mm 687975-902
4.6 x 50mm 699975-902
699975 902 4.6 x 50mm 689975-902
689975 902
4.6 x 30mm 691975-902 4.6 x 30mm 681975-902
3.0 x 150mm 693975-302 3.0 x 150mm 683975-302
3 0 x 100mm
3.0 695975-302 3 0 x 100mm
3.0 685975-302
3.0 x 75mm 697975-302 3.0 x 75mm 687975-902
3.0 x 50mm 699975-302 3.0 x 50mm 689975-302
3 0 x 30mm
3.0 691975 302
691975-302 3 0 x 30mm
3.0 681975 302
681975-302
2.1 x 150mm 693775-902 2.1 x 150mm 683775-902
2.1 x 100mm 695775-902 2.1 x 100mm 685775-902
2.1 x 75mm 697775-902 2.1 x 75mm 687775-902
2.1 x 50mm 699775-902 2.1 x 50mm 689775-902
2.1 x 30mm 691775-902 2.1 x 30mm 681775-902

Page 22
Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC
EC-C18
C18 4
4.6
6 x 100 mm
mm, 2
2.7um
7um Sulfadiazina,
Fase Móvil: Tiempo %B
Tiempo %B Sulfatiazol
A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua 0 8
0 8 Sulfapiridina
B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN 12 33
33 33 Sulfamerazina,
13.2 33

96
34 33 Sulfametazina
Sulfametazina,

11.59
mAU Columna: 4.6 x 100mm
Columna: Eclipse Plus C18 Sulfametazol,
100 Poroshell 120 EC-C18,
4.6 x 250mm, 5um Sulfametoxipiridazina,

12.674
2.7um
Flujo: 1 mL/min Sulfacloropiridazina

16.435
16.151
80 Flujo: 1.85 mL/min

29.290
15.248
Sulfametoxazol,

11.116
9.712
Sulfadimetoxina

687
13 ml de 60

20.6
9
110 bar

23.076
consumo
40

20

0
5 10 15 20 25 30 min
7.037

mAU
¾Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)
2.311

250 325 bar

¾ Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)
200
¾ Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)
2.606

5.450
1.719

4.4374.558
2.189

5.920

150 ¾ Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
¾ No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada
3.867

6 ml de 100
consumo de 2 micras en ambas columnas.
50

0
5 10 15 20 25 30 min

Page 23
Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC
EC-C18
C18 4
4.6
6 x 100 mm
mm, 2
2.7um
7um
Ver condiciones en diapositiva anterior

96
11.59
mAU
100

12.674

16.435
16.151
80

29.290
15.248
11.116
9.712

687
60

20.6
9
110 bar

23.076
40

20

0
mAU 5 10 15 20 25 30 min

7.037
2.311

250
325 bar Mejor Resolución ,
200
2.606

linea base!!

5.450
1.719

4.558
2.189

4.437

5.920
150
3.867

100

50

5 min

Page 24
Análisis Rápidos de Analgésicos en Poroshell 120 –
Son posibles Flujos elevados, para Análisis Rápidos
1. Acetaminofen 2. Cafeina 3. 2-acetamidofenol 4. Acetanilida 5. Fenacetin 6. Ácido Salicílico

mAU

40 1 3 1 0 mL/min
1.0 L/ i 142 bar
b
4 5
20 2
6
0

1 2 3 4 min
mAU
40
1.5 mL/min 211 bar
20

1 2 3 4 min
i
mAU
40

20
2.0 mL/min 279 bar
0

1 2 3 4 min
mAU
40

20
2.5 mL/min 347 bar
0

1 2 3 4 min

Condiciones: Columna: Poroshell 120 SB-C18, 4.6 x 50mm, 2.7um Fase Móvil: 0.2% Ácido Fórmico 80% agua:20%
ACN Temperatura:
T t 25 °C,
°C Deteción:
D t ió 275 nm, Inyección
I ió de
d muestra:
t 2ul
2 l

Page 25 Month ##, 200X

 Sub 2um vs. Poroshell 120
Análisis de 17 Amino Acidos en 1290 Infinity
Poroshell 120 EC-C18
3 0 x 100
3.0 100mm, 22.7um
mAU Rs6,5=1.98 W½ 9 =0.043 min . Rs14,13=1.81
Pmax=331 bar
50 F=0.86 mL/min
0
0 2 4 6 8 10 12 min
RRHT Eclipse Plus C18
mAU
AU Rs6,5=2.28
=2 28
W½ 9 =0.045 min . 3 0 x 100mm
3.0 100mm, 1
1.8um
8 m
Rs14,13=1.81
50 Pmax=474 bar
F=0.86 mL/min
0
0 2 4 6 8 10 12 min
RRHD Eclipse Plus C18
mAU
Rs6,5=2.90 W½ 9 =0.036 min . 3.0 x 100mm, 1.8um
Rs14,13
14 13=2.34
2.34

50 Pmax=528 bar
F=0.86 mL/min
0
0 2 4 6 8 10 12 min
i
Group/Presentation Title
Agilent Restricted
Page 26 Month ##, 200X
c) Tercer enfoque: Variación de la longitud, el
tamaño de particula y el diámetro interno

Asegurese de que los cambios de parámetros se ajustan a la

normativa definida p
para la modificacion de métodos en su
método en cuestión.

Page 27
Cambiando longitud,diametro y tamaño de
partícula de la columna
Cambio de columna de 4.6 x 250 mm (5 um) a 3.0 x 100 mm (3.5 um).
Fase Móvil: 25% metanol en 0.4% Ácido Fórmico Ajuste de Método:
mAU 1
175
ZORBAX SB-C18
SB-C18, 4
4.6
6 x 250 mm
mm, 5 um Longitud: -60% (70%)
150
1 mL/min Tamaño Partícula:-30% (50%)
ID: -45% (50% FDA ok)
3 Solvente usado: 34 mL
125

100

75

2 4
50
5 6
25

0
mAU 5 10 15 20 25 30 35 min
175
ZORBAX Solvent Saver Plus SB-C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 um,
150
0 425 mL/min
0.425 L/ i
125

100 Solvente usado: 5.7 mL, disminuye 83%

75
((disminución en tiempo
p de análisis de 57%))
50

25

0
5 10 15 20 25 30 35 min

Page 28
28 May 4, 2010
Combine RRHT y Solvent Saver para la Máxima
Reducción de Solvente – Muestra Diet Soda
Ajuste de Método:
1. Saccharine Eclipse Plus C18
2. Caffeine 1 4.6 x 150, 5um Longitud: -67% (70%)
3. Aspartame F=1.0 mL/min (P=96 bar) Tamaño
T ñ Partícula:-64%
P tí l 64% (50%)
4. Benzoic acid ID: -35% (50% FDA ok)
2
11 mL/análisis 4
3

min
2 4 6 8 10
Solvent Saver HT
Eclipse Plus C18
3.0 x 50, 1.8um 1.6 mL/análisis
F=0.43 (P=181bar) 85%
menos
solvente
2 3 4

Fase Móvil.: A: 20 mM Fosfato B: acetonitrilo A:B (79:21) Temp: 25º C Detección: UV 220nm,16, ref=420,20
Celda de Flujo: 3mm, 2uL Veloc adqu. datos: 1 s Vol. iny 3 uL for 4.6, 1.5 for 3.0 Instrumento Bin 1200SL
Muestra: diet soda filtrada en 0
0.2
2 um

May 4,292010
29
Page May 4, 2010
¿Hay alguna otra forma de ahorrar ACN?
Reciclaje de solvente con o sin detección de pico.
• Solamente útil con métodos isocráticos con solventes premezclados
• Riesgo de contaminación de solventes
p
• Ruido inesperado yppicos en el cromatográmaÎ
g inaceptable
p a nivel de
trazas y análisis regulados
Cambio de solvente a metanol
• Puede requerir una revalidación del método.
• Puede requerir redesarrollo substancial del método por cambios de
selectividad.
• La separación en fase reversa con metanol requiere frecuentemente
tiempos de análisis más largos que con acetonitrilo.
acetonitrilo

30
Si tienes que/o quieres cambiar a metanol
Empieza
p e a po
por ca
calcular
cu a eel p
procentaje
oce aje ap
apropiado
op ado de metanol
ea o
para tener la misma fuerza que el acetonitrilo.
Correr la muestra ((misma columna))
Evaluar la retención y resolución del método
• Tendrás tiempos de análisis más largos si tu método contiene compuestos
básicos
• Los compuestos neutros no deberían mostrar mucho cambio
• Aunque pueden ocurrir cambios en selectividad y resolución
Ajustar la composición en metanol para cambiar la retención
según se necesite (fuerza isoelutrópica)
Cambia la fase ligada como última opción para ajustar las
necesidades de selectividad cuando la columna establecida no
funciona.
• Ver Poster de Desarrollo de Métodos, pub no 5989-7282EN
5989 7282EN para distintas posibilidades.

31
Comparación de Acetonitrilo y MeOH para la
misma separación- ComportamientoTípico
Columna: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 μm
Fase Móvil : A: 25 mM NaH2PO4 , pH 3.0 B: organico
Flujo:
j 2.0 mL/min Temperatura:
p 30°C Detección: UV 240 nm
mAU 1 Muestra: Fármacos Cardíacos 1.Pindolol 2. Disopiridamida 3.Propranolol 4.Diltiazem 5. Dipiridamol
140
120
3 4 Resolución de los pares
100 5
80 2 (2,3), (3,4), (4,5)
60
40
50% MeOH es mejor en MeOH.
20 Cambio de Selectividad en
0
-20
Pico 5
1 2 3

mAU 5 4
140
1 3
120
100
80 Resolución del par critico
2
60
40
30% ACN ((1,2),
) es mejor
j en ACN
20
0
-20
1 2

32 May 4, 2010
3) Sugerencias de ahorro no relacionadas
con el cambio de método o columna
• ¿Puedes reducir el tiempo de estabilización y re-estabilización
d lla columna?
de l ?LLa mayoríaí de
d las
l fases
f reversas de
d las
l
columnas se equilibrarían con 10 volúmenes de columna.
• ¿Tienes
Ti un stop
t time
ti establecido
t bl id muchoh másá tarde
t d que tu
t
último pico y estás gastando solvente extra?
• ¿Estás
E tá perdiendo
di d tiempo
ti entre
t análisis?¿Puedes
áli i ? P d programar
tu HPLC para inyectar más rápido o estar preparado para
inyectar rapidamente?
• Aunque el acetonitrilo es un buen solvente para limpieza
/almacenamiento ¿podrías emplear metanol para estos
pasos?

33
Conclusiones

Puede reducir el consumo de disolvente con los nuevos

UHPLC1290 Infinity.
Infinity
Sencillos cambios en la columna para controlar el uso de
solvente son efectivos en la reducción del uso de acetonitrilo
• ‘Solvent Saver’ (3 mm) y ‘Narrow Bore’ (2.1mm)
• ‘Rapid Resolution’ (3.5um) – con columnas más cortas
• ‘Rapid Resolution HT’ ó RRHD (1.8um) – con columnas aún más cortas
• Columnas Poroshell (2.7um)- con columnas cortas
Muchos cambios pueden realizarse siguiendo las directrices
para ajustes de métodos de los organismos oficiales.
Se requerirá documentación, pero no la completa revalidación
del método

34
 Recursos adicionales

Páginas:
www.agilent.com/chem/savesolventnow
www.zorbaxmethod.com
www zorbaxmethod com para cualquier
recomendación de columnas y
métodos.
métodos

Folleto:

Soluciones Agilent ante la escasez de acetonitrilo

Page 35
Soluciones Agilent ante la Escasez de ACN

Page 36