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1220 Infinity

1260 Infinity 1290 Infinity


Transferencia de
Mtodos de HPLC
a UHPLC:
Estrategias y
Criterios de
Seleccin de
Columnas.
Isidre Masana
Agilent Technologies
Especialista Productos UHPLC/MS
UHPLC MasterClass
Junio 2013

Agenda
1. Introduccin
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Isocrtico y Gradientes Concentracin
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Fase estacionaria y tipo de columnas
Dimetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con informacin adicional.

Pgina: 2
Agenda
1. Introduccin
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Isocrtico y Gradientes Concentracin
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Fase estacionaria y tipo de columnas
Dimetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con informacin adicional.

Pgina: 3
Introduccin Mtodos HPLC UHPLC
Pgina: 4
HPLC UHPLC:
Columnas HPLC 5 y 3.5m UHPLC: 1.8m (TP) o 2.7m (SP).
OBJETIVOS / Estrategias:
Reducir Tiempos de Anlisis SIN perder Resolucin.
Aumentar la Resolucin SIN incrementar tiempo de Anlisis.
Fundamentos:
Poder trabajar a flujos elevados sin perder eficacia con rellenos TP<2m SP 2.7m.
Aumento de la capacidad de separacin en gradientes con flujos elevados.

* Trabajando con gradientes de concentracin
Transferencia de mtodos de HPLC a UHPLC/RRLC
www.agilent.com/chem
Instruments
Liquid Chromatography
Buscar: Method translator
Pgina: 5
http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe
para descargrselo (6Mb requiere Flash Player).

Agenda
1. Introduccin
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Isocrtico y Gradientes Concentracin
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Fase estacionaria y tipo de columnas
Dimetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con informacin adicional.

Pgina: 6
Estrategias de Traspaso de Mtodos HPLC a
UHPLC

Mtodo ya validado? Se quieren mantener condiciones
dentro del rango de cambios admitidos por USP?
Admite 5m 2.7m (SP). Pero NO a < 2.5m.
3.5m 2.7m (SP), 1.8m (TP). Pero NO < 1.75 m.
Mantener validacin USP Adicionalmente estar limitado a:
Reduccin Dimetro columna: : 0.50 x D p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)
Subida Flujo: 1.50 x F
Subida Temperatura: T+10C

OBJETIVO:
Reducir tiempos de Anlisis?
Aumentar Resolucin?
Combinacin de ambas?

Poroshell 120: 2.7m
Superficialmente
porosas
Pgina: 7
Cuanto Puede Cambiarse en HPLC/UHPLC
un Mtodo USP Standard?
pH de la Fase Mvil: +/- 0.2 unidades
Concentracin de sales en tampn: +/- 10%
Ratio de componentes in fase mvil para componentes minoritarios:
< +/- 30% relativo. / <10% absoluto.
Longitud Columna: +/- 70% p.e. 250mm75mm 150mm50mm
Dimetro Interno Columna: +/- 50%. Adaptando el flujo para mantener la velocidad
lineal constante. F
2
= F
1
x D
2
2
/ D
1
2
p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)
Tamao Partcula: puede reducirse en un 50% p.e. 5m 2.7m (NO a 1.8m)
Flujo: +/-50%. Si se reduce d.i. columna se aplicar el +/-50%
al resultante de F
2
= F
1
x (L
2
D
2
2
) / (L
1
D
1
2
).
Long. Onda (UV-VIS): ninguno (error detector < +/- 3 nm)
Temperatura Columna: +/- 10C.
Volumen Inyeccin: cualquier volumen menor que cumpla
requisitos.
Fuente: Pg. 6 USP 34 Physical Tests / <621> Chromatography 1
Poroshell 120: 2.7m
Superficialmente
porosas
Pgina: 8
Conversin Mtodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Mtodos

Reduccin de Tiempo:
Reducir la longitud y
tamao de partcula de la
columna: cambio .a
columnas de 1.8 m (TP),
2.7 (SP) (o 3.5 m).
Aumentar el flujo.
Aumentar la temperatura.
Utilizar eluyentes menos
viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolucin :
Reducir el tamao de
partcula manteniendo
longitud columna: Cambio
a columnas de 1.8 m (TP),
2.7 (SP) (o 3.5 m).
Aumentar el flujo con
gradientes de
concentracin.
Utilizar eluyentes menos
viscosos (p.e. acetonitrilo)
Alternativa: acoplar varias
columnas en serie de 5m.
1.8 m Mxima eficacia / min. cm columna.
5 m Mxima eficacia / bar presin (pero tiempo)
Pgina: 9
Conversin Mtodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Mtodos

Reduccin de Tiempo:
Reducir la longitud y
tamao de partcula de la
columna: cambio .a
columnas de 1.8 m (TP),
2.7 (SP) (o 3.5 m).
Aumentar el flujo.
Aumentar la temperatura.
Utilizar eluyentes menos
viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolucin :
Reducir el tamao de
partcula manteniendo
longitud columna: Cambio
a columnas de 1.8 m (TP),
2.7 (SP) (o 3.5 m).
Aumentar el flujo con
gradientes de
concentracin.
Utilizar eluyentes menos
viscosos (p.e. acetonitrilo)
Alternativa: acoplar varias
columnas en serie de 5m.
1.8 m Mxima eficacia / min. cm columna.
5 m Mxima eficacia / bar presin (pero tiempo)
Pgina: 10
min 5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
5
10
15
20
25
30
Gradiente = 67min
Capacidad picos = 694 (10/min)

Resolucin GC
Mapa pptidico de BSA digerida con tripsina con
Agilent 1200-RRLC (SL)
Zorbax SB-C18, 2.1x150mm, 1.8m

min 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Gradiente = 30min
Capacidad picos = 540 (18/min)
Cromatografa de Alta Resolucin con el Agilent
1200 RRLC (SL) + Columnas 1.8m y 150mm
Capacidad de Separacin de Picos: 700
Eficacia : 36.000 platos/columna 15cm x 1.8m
(tpica de columna GC de 10metros x 0.32mm)

8 Columnas x 5m 200.000 platos/ 2 metros
Pgina 11

Pgina 12
Cromatografa de Alta Resolucin por Acoplamiento
en Serie de Columnas de 5m
0.4ml/min H2O/CH3CN 60/40 80C
4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5m
8 Columnas en serie 8 x 25cm x 4.6mm - 5m
1 Columna 25cm x 4.6mm - 5m
70bars


177bars


360bars
20.000 platos
100.000 platos
200.000 platos
105min
14min

Pgina 13
Cromatografa de Alta Resolucin con 5m y 80C
100.000 platos en 30min
380bars
4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5m
1 y 2 ml/min H2O/CH3CN 60/40 30 y 80C
29min
Conversin Mtodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Mtodos

Reduccin de Tiempo:
Reducir la longitud y
tamao de partcula de la
columna: cambio .a
columnas de 1.8 m (TP),
2.7 (SP) (o 3.5 m).
Aumentar el flujo.
Aumentar la temperatura.
Utilizar eluyentes menos
viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolucin :
Reducir el tamao de
partcula manteniendo
longitud columna: Cambio
a columnas de 1.8 m (TP),
2.7 (SP) (o 3.5 m).
Aumentar el flujo con
gradientes de
concentracin.
Utilizar eluyentes menos
viscosos (p.e. acetonitrilo
Acoplar varias columnas
en serie de 5m.
1.8 m Mxima eficacia / min. cm columna.
5 m Mxima eficacia / bar presin (pero tiempo)
Pgina: 14
Traspaso de Mtodos Isocrticos a UFLC.
Columna referente: 5m x 150mm (12.500 platos)
Reduccin del Tiempo de Anlisis*
Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3
1.8m x 50mm
(12.000 platos)
1/3
30min10min
1/6
30min5min
1/9
30min3.3 min
3.5m x 75mm
(10.500 platos)
1/2
30min15min
1/4
30min7.5min
1/6
30min5 min
3.5m x 100mm
(14.000 platos)
2/3
30min20min
1/3
30min10min
2/9
30min6.7 min

La resolucin ser semejante a la original. La misma proporcin aplica a D.I. 2.1 y 3mm
*Nota: Reduccin del tiempo de anlisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5m
**Incremento presin: +2% para 7.5cm x 3.5m +35% para 10cm x 3.5m +150% para 5cm y 1.8m (P = f (
.
u
.
L/ dp
2
))
Mantener: composicin y n puntos muestreo pico ( Hz).
Subir Flujo (hasta p.e. 80% presin mxima columna/ instrumento).
Reducir volumen inyeccin (proporcionalmente a. reduccin volumen columna).
Pgina: 15
Ajuste de la Frecuencia de Adquisicin de Datos:
Compromiso entre Resolucin Cromatogrfica y Sensibilidad.
Aumentar la frecuencia de adquisicin de datos proporcionalmente
a la reduccin del tiempo de anlisis.
Ajustar Peak width adquisicin al width de
integracin de los resultados del pico ms fino de inters.



Proporcionar unos 35-40 puntos de medicin por pico para
mxima resolucin cromatogrfica.
El ruido se reduce con el aumento del n de puntos promediados:

Ruido ~ 1 / n promedios
Para mxima sensibilidad ajustar a 8-10 puntos
(RSD% 10-15%).
Para ptima repetibilidad cuantitativa adquirir >15 puntos
(RSD< 1%).
Pgina: 16

Pgina 17
Parmetros Optimizacin Resolucin Cromatogrfica
R
s
= 2 (T
1
-T
2
) /( W
b1
+W
b2
) N= 5.54 ( T
r
/ w
50%
)
1/2


= (T
2
T
0
)/(T
1
T
0
) K = (T
r
T
0
) / T
0
* Para picos de tamaos muy distintos se recomienda R
s
> 2
Parmetro
Modificado
% Mejora
Resolucin
Incremento
Tiempo Anlisis
Long. x 2 40% x 2
K: 0.5 2 100% x 2
K: 5 10 10% x 2
El incrementar la retencin por encima de K=5
apenas mejorar la resolucin.
OBJETIVO R
s
> 1.5 (2)*
1 < K'< 10
R
s
= 0.25 N
1/2
((- 1)/ ) (K'/(K'+1))
RETENCIN
Poder Eluotrpico Eluyente
% modificador Orgnico
SELECTIVIDAD
Fase Estacionaria y Soporte
pH Fase Mvil (si pH prximo a pK)
Modificador Orgnico y su %
Aditivos Fase Mvil
Temperatura
EFICACIA

Tamao Partcula del Relleno
Longitud de la Columna
Excesivos Volmenes Muertos (-)
Flujo:
ISOCRTICO:
k' k'/k'+1 T. anlisis
0,2 0,17 1.2 x T 0
0,5 0,33 1.5 x T 0
1 0,50 2 x T 0
2 0,67 3 x T 0
3 0,75 4 x T 0
4 0,80 5 x T 0
5 0,83 6 x T 0
10 0,91 11 x T 0
20 0,95 21 x T 0
La mejora de Resolucin
es muy importante al
incrementar la retencin
hasta K= 5
R
s
= f ( K/[K+1] )
0,2
0,5
1
2
3
4
5
10
20
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
K'
k
'
/
k
'
+
1

k'/k'+1
La mejora de Resolucin
es muy importante al
incrementar la retencin
hasta K= 5
N= f(L/ 2d
p
)
Para mejorar resolucin de
picos con K > 5 mejor
aumentar long. columna. Para
K<2 reducir poder
eluotropico del eluyente
DISMINUCION 10% ORGANICO ===> K
2
= (2 3) x K
1
Log K =aprox f
lineal
(%orgnico)
Traspaso de Mtodos con Gradientes
S: definir la sensibilidad del analito a variaciones en la proporcin de modificador orgnico.
Valores tpicos S: aumentan con el tamao de la molcula
2-5 molculas pequeas / 10 molculas grandes (pptidos) / 40 molculas muy grandes (protenas)
Al aumentar el tamao de la molcula aumenta su sensibilidad a cambios de composicin del eluyente.
K = (87 x F x T
g
) / ( % x V
0
x S)
Parmetro dependiente de:
Analito
Modificador Orgnico
Volumen muerto de la columna
% de incremento de Modificador Orgnico Tiempo del gradiente (min)
Flujo (ml/min)
Factor de Capacidad
Retencin en Gradientes
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5m
Gradiente 45 90% B en 3 y 2 min
Fase Mvil: A:25mM Na
2
HPO
4
, pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35C
Muestra: Frmacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
EJEMPLO 1 - REDUCCIN TIEMPO ANLISIS: Reducir Tg Aumentando F
Al mantener T
G
x F = constante el perfil de la separacin NO vara
1
2
3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F = 2.0 mL/min
T
g
= 3 min
3
min
1
2
3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F = 3.0 mL/min
T
g
= 2 min
2
min
Si K se mantiene constante el poder de separacin no variar
Pgina: 18
Comparacin Estrategias Mejora de la Resolucin
k = (87 x F x T
g
) / ( % x V
0
x S)
Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 60% B en 10 min o 60 min
Fase Mvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2
B: Acetonitrilo
Flujo: 1.0 mL/min
Temperatura: 35C
Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine
5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor
T
g
= 10 min
4.6 x 150 mm, 5 m
N = 12,000
V
0
=1.5ml
15
min
1,2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15
Time (min)
Aumentar Tg (el resto de parmetros no se modifican )
1
T
g
= 60 min a 1mL/min
4
2
0 25 50
Time (min)
3
5
8
6
7 40
min
4.6 x 150 mm, 5 m
N = 12,000
V
0
=1.5ml
Tradicional
Reducir V
0
y Subir Flujo
4.6 x 75 mm, 3.5 m V
0
=0.75ml
N = 10,000
T
g
= 15 min a 2mL/min
Moderna:
Si k se aumenta (T
g
, F, V
0
)
el poder de separacin mejorar.
Pgina: 19
Time (min)
0 5 10
2
3
4
5
6
7
8
1
7
min
1x10/1.5= 6,7
2x15/0.75= 40
1x60/1.5= 40
Se reduce
Tiempo anlisis
a 1/6 pero se
mantiene la
Separacin !!!
Cmo mejorar?
Ejemplo de Reduccinde Tiempo SIN Cambiar de
Columna 5m 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg
1mL/min 10 min Gradiente FxTg=10
1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5m 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min
Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando
Pmx. columna: 400bars) 40C
Inyeccin: 2 l muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm
o-terfenilo en metanol)
12min.
2mL/min 5 min Gradiente FxTg=10
6min.
3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10
4min.
4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10
3min.
Pgina: 20
Ejemplo de Reduccinde Tiempo SIN Cambiar de
Columna 5m 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg
Representacin Normalizada en el Eje de Tiempo
1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5m 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min
Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando
Pmx. columna: 400bars) 40C
Inyeccin: 2 l muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm
o-terfenilo en metanol)
1mL/min 10 min Gradiente FxTg=10
12min.
2mL/min 5 min Gradiente FxTg=10
6min.
3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10
4min.
4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10
3min.
Pgina: 21
Ejemplo de Reduccinde Tiempo SIN Cambiar de
Columna 5m 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg
Representacin Normalizada en el Eje de Tiempo
1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5m 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min
Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando
Pmx. columna: 400bars) 40C
Inyeccin: 2 l muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm
o-terfenilo en metanol)
1mL/min 10 min Gradiente AZUL FxTg=10
2mL/min 5 min Gradiente ROJO
3mL/min 3.33 min Gradiente VERDE
4mL/min 10 min Gradiente FUCSIA
50% altura pico
0.006min 0.08% 0.012min 0.16%
10% altura pico
0.015min 0.19%
0.024min 0.29%
8min.
F=1ml/min
8min.
F=1ml/min
14mL/min
ancho pico
0.018min
26% pk wd
0.24% Tr
14mL/min
ancho pico
0.0398min
30% pk wd
0.48% Tr
Pgina: 22
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
Ecuacin de Van Deemter
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula.
Nuevos tipos de columnas para
poder hacer UHPLC en HPLC's
convencionales (Poroshell).
Dimetro
3. Conclusiones.
Pgina: 23
Seleccin de la Longitud Columna y Tamao de
Partcula del Relleno versus Eficacia

Longitud
(mm)

Eficacia
N(5 m)

Eficacia
N(3.5 m)

Eficacia
N(1.8 m)
150 12,500 21,000 36.000
100 8,500 14,000 24,000
75 6000 10,500 18.000
50 4,200 7,000 12,000
30 2.500 4,200 6,500
15 1.250 2,100 2,500

Tiempo
Anlisis*
-
- 33%
- 50%
- 67%
- 80%
- 90%
La Eficacia aumenta con la reduccin del tamao de partcula ( N= f(L / 2d
p
) )
El tiempo de anlisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) )
Reduciendo Longitud y Tamao de partcula, pero manteniendo flujo y n platos proporcionados por la
columna, se conseguir reducir el tiempo de anlisis y consumo de disolvente sin perder Resolucin.
* Reduccin con respecto a una columna de 150 mm
+
Eficacia
(N)

+
Presin
- Tiempo
Anlisis
- Volumen
Pico
- Consumo
Solvente
Pgina: 24
Recomendacin: Columnas 5cm para gradientes 5min, 10cm para 5-30min, 15cm para > 30min
Viscosidad versus Composicin Orgnico/Agua.
En UHPLC se suele utilizar Acetonitrilo
Gradiente 10100%
Metanol
Tener en cuenta:
La alta viscosidad de las mezclas metanol/agua (mximo a 40/60)
3 3

0 20 40 60 80
1
2
1
2
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

[cP]
a 20 C
100%
n-Propanol
Etanol
Metanol
Acetonitrilo
Perfiles de Presin con Gradientes Concentracin
Perfil de Concentracin
Presin CH
3
-CN / H
2
O
Presin CH
3
OH / H
2
O
Este grfico es til para poder calcular relaciones
aproximadas de viscosidad entre distintas
composiciones de eluyentes y poder calcular
presiones equivalentes:
p.e. 100 bars con CH3-CN/H20 70/30 equivalen a 100 x
(1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30
~ 0.6
~ 1.3
70/30 org. /agua
CH
3
OH
CH
3
CN

mAU







0
50
100
150
200
250
300
350

Bar
25
o
C (355b)
80C (140bars)
% Orgnico[w/w]
50C (220bars)
C
Posible flujo con
respecto a 25C
50C x 1.6
80C x 2.5
Pgina: 25
+ info en Anexo final
Traspaso de Mtodos de H
2
0/CH
3
0H a H
2
0/CH
3
CN.
Composiciones Fase Mvil con Fuerza Eluotrpica
Equivalente

Acetonitrilo / Agua (da menor presin)
Metanol / Agua
Tetrahidrofurano / Agua
%MeOH
%ACN %THF
20 15 10
40 30 25
60 50 38
80 72 53
100 98 72
%ACN
%MeOH
%THF
20 30 18
40 50 30
60 72 45
80 85 58
100 >100 72
%THF %MeOH %ACN
20 35 28
40 65 55
60 88 82
80 >100 >100
100 >100 >100
72%
53%
80%
En RRLC se recomienda trabajar con fases poco viscosas
Pgina: 26

Pgina 27
Reduccin del Tiempo de Anlisis mediante
Incremento de la Temperatura
Ejemplo a Flujo Constante
Trabajar a temperaturas elevadas permitir reducir considerablemente los tiempos de anlisis y
en ocasiones cambiar la selectividad de la separacin. la alta estabilidad trmica de las columnas
StableBond a pHs cidos: hasta 80C (90 para las SB-C18) amplan esta posibilidad.
Optimizacin
Mtodo
Alta
Temperatura
Baja
Temperatura
Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 m
Eluyente: 74% 7.4 mM hexano sulfonato y
0.07% cido fosfrico
26% MeOH
Flujo: 1 mL/min (constante)
Deteccin: UV 280 nm
Muestras: Vitaminas B
min.
Acorta a 1/3 el
tiempo anlisis
Cuando se trabaja a altas temperaturas se
recomienda enfriar el eluyente a la salida de la
columna antes de entrar en el detector (no hace
falta con MS). En los Agilent Series 1100 / 1200
utilizar el 2 intercambiador (el de 3l) de los
T.C.C, o el especfico del 1200-SL (1.5l).
Cte Dielctrica Agua: 20C=80 / 60C=67 / 90C=58
Metanol a 25C=33 Hexano a 20C=2
+ info en Anexo final
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
Ecuacin de Van Deemter
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Fase estacionaria y tipo de
columnas.
Dimetro
3. Conclusiones.
Pgina: 28
Seleccin Fase Estacionaria (Relleno)
Si es posible, mantener el mismo relleno que en
HPLC simplemente cambiando tamao partcula
(p.e. Zorbax XX).
Si NO se quiere revalidar de nuevo los mtodos al
transferir HPLCUHPLC, la limitacin en la reduccin
de tamao de partcula en mtodos validados obliga a
pasar de rellenos 5m (TP) a 2.7m (SP) cambio
fase.
Con HPLC convencionales (400 bars) utilizar rellenos
SP de 2.7m
Pgina: 29
Para 1.8m utilice las Zorbax de 600-1200bars. Adems reducen la
presin de trabajo en >20%, gracias a la distribucin del tamao de
partcula ingeniada por Agilent.
Utilice el mismo tipo de Zorbax: muy fcil
escalabilidad debido a la idntica selectividad
de Zorbax - independiente del tamao de
partcula (5, 3.5,1.8m) y dimensiones de la columna.
Zorbax Eclipse Plus / XDB para separaciones a pHs intermedios y
traspaso de columnas de otros fabricantes (excepto a pHs extremos).
Zorbax Stablebond (SB) para separaciones a pH muy cidos (hasta pH
0.8) y/o a Alta Temperatura hasta 90 C (100C).
Zorbax Extended para separaciones a pH bsicos (hasta pH 11.5)
Excelente tiempo de vida y resistentes a las ms altas presiones
gracias a la alta resistencia mecnica de las partculas ZORBAX (+1300 b) .
Seleccin del Tipo de Fase Estacionaria con
Columnas ZORBAX 1.8m
Pgina: 30
+ info en Anexo final
Tabla de Similitud* de Fases Recomendadas para el
Traspaso de mtodos a RRLC con Zorbax 1.8m 2.7m.
Ace C18, Develosil-ODS-HG,Develosil-ODS-MG, Develosil-
ODS-UG, Hichrom C18, Hichrom RPB, Hypersil HyPURITY
C18, Inertsil ODS, Inertsil ODS2, Luna 5 C18(2), Nucleosil
C18 HD, Prodigy ODS2, Symmetry C18, Xterra MS C18,
YMC ODS A, YMC ODS AM, YMC Pro C18
ECLIPSE PLUS o XDB
(C18 o C8 segn el caso)
Poroshell 120 EC (C18 o C8)
Cosmosil C18-AR, Exsil ODS, Hypersil BDS C18,
LiChrosorb RP-18, Novapak C18, Nucleosil C18AB, Partisil
ODS3, Resolve C18, Synchropak CR101, TSK ODS-120T,
TSK ODS-80TM, u-Bondapak C18, Ultrasphere ODS,
Vydac 218MS, Vydac 218TP,Vydac Selectapore 300M,
Vydac Selectapore 300P, Vydac Selectapore 90M, Waters
Spherisorb ODS1, Waters Spherisorb ODS2, Waters
Spherisorb ODSB, YMC J'Sphere ODS M80
STABLEBOND (SB)
(SB-C18 o C8 segn el caso)
Poroshell 120 SB C18
Genesis C18, Inertsil ODS3, Kromasil C18, Prodigy ODS3,
Purospher RP18-e
EXTENDED o XDB
(C18 o C8 segn el caso)
*Sugerencia de columna a probar en primer lugar, por su mayor similitud. Obviamente pueden
haber diferencias de selectividad. La mejor depender de los analitos a separar.
Pgina: 31
+ info en Anexo final

Pgina 32
Ejemplo Comparativo
min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
mAU
-2
0
2
4
6
8
10
DAD1B, Sig=275,8Ref=400,80(ACECLO070918\004-0301.D)

0
.
0
0
7

0
.
9
1
0

0
.
9
6
4

1
.
0
3
3

1
.
4
2
9

1
.
5
1
6

1
.
6
7
3
1.67 min
20.2 min
Symmetry C18 5 m 250 x 4.6 mm;
Gradiente 1ml/min
Zorbax Eclipse Plus C18 1.8 m 50 x 4.6 mm;
Gradiente 3.4 ml/min
500bars- 50C
Agilent 1200 RRLC
1.67 2.4min a 25C y
2.4ml/min -500 bars
Tipo de Columna: Superficial o Totalmente Porosas?

Superficial Totalmente Porosa
Poroshell-120 reduce 40-50% de presin con similar resolucin
2.7m (capa porosa: 0,5m)
1.8m
Ventajas Poroshell 120:
Reducir la presin para aumentar el flujo.
Importante con HPLC de 400 bars
Mejorar la resolucin en Mtodos USP
con 5m (2.7m <50% en disminucin
del tamao de partcula).
Robustez: fritas 2m (en lugar de 0.5m de las de 1.8m)

Ventajas 1.8m Totalmente Porosas:
Mayor surtido de fases.
Zorbax 1.8-3.5-5m con idntica
selectividad.
10-20% ms eficacia/cm.

Pgina: 33
Poroshell -120
+ info en Anexo final
Comparacin Eficacia Partculas Superficial
versus Totalmente Porosas (SP vs TP)
Poroshell 120 proporciona:
Eficacia muy similar* (>80-90%.) a partculas 1.8m totalmente porosas.
Curva de Van Deemter plana en un amplio rango de flujos.
Su mayor permeabilidad le permite trabajar a flujos ms elevados.

* Tambin su capacidad de carga

Poroshell -120
Mnimo flujo recomendado (columna 4.6mm d.i.)
PF
Pgina: 34
+ info en Anexo final
Muestra de tranquilizantes
Columna: Porosa superficial
Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um
Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar
Gradiente 2-92% ACN en 0.4min
T= 80 C
0.095sec PW
0.140secPW
Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de
separacin con todo tipo y marcas de columnas

Columnas Superficialmente Porosas:
permiten muy elevadas velocidades lineales
con elevada resolucin y menor presin
0.5 s
Ncleo
Slido
1.7um
} 0.5m
2.7m
Pgina: 35
+ info en Anexo final
1.8m Eclipse Plus C18 vs. Poroshell 120 EC-C18
Anlisis de 17 Aminocidos con 1290 Infinity
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50

min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50

min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50

Poroshell 120 EC-C18
3.0 x 100mm, 2.7um

Pmax=331 bar
F=0.86 mL/min
RRHT Eclipse Plus C18
3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=474 bar (Porosh.+43%)
F=0.86 mL/min
RRHD Eclipse Plus C18
3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=528 bar (HT+11%)
F=0.86 mL/min
Rs
6,5
=1.98
Rs
6,5
=2.28
Rs
6,5
=2.90
Rs
14,13
=1.81
Rs
14,13
=2.34
Rs
14,13
=1.81
W
9
=0.043 min.
W
9
=0.036 min.
W
9
=0.045 min.
Selectividad Poroshell 120 EC-C18 ~ Eclipse Plus C18 (o Eclipse XDB)
P
mx.
=1200bars
P
mx.
=600bars
P
mx.
=600bars
Pgina: 36
+ info en Anexo final
Tipos Instrumentos y Columnas UHPLC

Tipos Instrumentos UHPLC
Presin mx. 1000-1200 bars y Flujo mx. 5 10 mL/min. (Fluj. elev.todo tipo columnas)
Presin mx. 1000-1200 bars y Flujo mx. 1 -2 mL/min (Fluj. elev. columnas 2-3mm d.i.)
Presin mx. 600 bars y Flujo mx. 5 10 mL/min (Fluj. elev. Columnas SP)

Tipos Columnas UHPLC
Totalmente porosas <2m (1.7, 1.8, 1.9m). USP 50% 5m = 1.75m
- Zorbax ofrece distribucin asimtrica del tamao de partcula reduce la presin en un 20-30%
- Zorbax ofrece la misma selectividad independientemente del tamao de partcula: 1,8, 3.5 y 5m.
Superficialmente porosas 2.7m (efectivo 0.5m). reduce presin en un 40-50%
Dimetros: 2.1 a 4.6 mm. 0,6mL/min en d.i. 2.1 3mL/min en d.i. 4.6mm

UHPLCs que permitan llegar a 5 mL/min permitirn obtener todo el rendimiento
de las columnas Superficialmente Porosas y de columnas con 4.6mm d.i.
Con Columnas UHPLC el trabajar a flujos elevados permitir mejorar
la capacidad de separacin en gradientes

El flujo mximo es un parmetro clave en un UHPLC
Superficialmente
porosas
Pgina: 37
NO es imprescindible un cromatgrafo de Alta
Presin (600-1200bars) para trabajar en UHPLC

Tipo
Cromatgrafo
(Presin Mxima)
Mxima Longitud Columna*
1.8m (TP)** Poroshell-120
2.7m (SP)**
400 (HPLC) 5 (10) cm 10 (15) cm
600 (UHPLC) 10 (15) cm 15 (20) cm
1200 (UHPLC) 25 (30) cm 35 (40) cm
* En UHPLC suele utilizarse acetonitrilo; el utilizar metanol reducir los flujos mximos de trabajo (especialmente con
contenidos de agua alrededor del 60% ).
** TP: Totalmente Porosa *** SP: Superficialmente Porosa; las columnas SP permiten utilizar columnas entre un 40 y
60% ms largas que las TP (o trabajar a flujos mayores).
Equivalencia Eficacia columnas UHPLC
(1.8m TP/ 2.7m SP)
Columnas HPLC
5m
5 cm 15 cm
10 cm 30 cm
25 cm 75 cm
+ info en Anexo final
Pgina: 38
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
Ecuacin de Van Deemter
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Nuevos tipos de columnas para
poder hacer UHPLC en HPLC's
convencionales (Poroshell).
Dimetro
3. Conclusiones.
Pgina: 39
Qu Dimetro de Columna Utilizar?:
d.i. (mm): 2.1, 3, 4.6?: Mantener la del mtodo validado.
Recomendacin LC/MS: 2.1mm con Electrospray (ptimo 0.5-0.8mL/min) //
3-4.6mm con APCI (/APPI con dopante): ptimo ~ 1.5mL/min (acta como detector que
responde a la cantidad absoluta de analito mejor inyectar cantidades lo mayores posible).
Recomendacin LC/DAD/UV/FLD/. : 2.1- 3 - 4.6mm.
El flujo debe ser proporcional a la seccin de la columna utilizada.
Al reducirse el dimetro se reducir el flujo de trabajo (para mantener la misma
velocidad lineal dentro de la columna).
3mL/min en 4.6mm d.i. ~ 1.26mL/min en 3.0mm ~ 0.6mL/min en 2.1mm
Reducir el dimetro permite reducir consumo de disolvente y si se inyecta la misma cantidad
absoluta de muestra, ganar sensibilidad pero:
Se debe de inyectar menor volumen/cantidad de muestra para:
NO sobrecargar la columna de analito (prdida de resolucin por saturacin
columna).
NO deformar el perfil del pico por un exceso de poder de elucin del volumne (p.e.
en fase reversa disolver la muestra en solvente orgnico)
Se debe reducir los volmenes del sistema: bombas, capilares, celdas de deteccin,.
(a 1/5 al pasar de d.i. 4.6mm a 2.1 mm)
Pgina: 40
Influencia Volumen de Dispersin en la Eficacia
Flujos ajustados al d.i. de la columna:
4.6 mm columna 1 mL/min
3 mm columna 0.43 mL/min
2.1 mm columna 0.21 mL/min
Ejemplo para compuesto con K=4
Columna:
50 mm long.
1.8 m tam. part.

Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 x V
0
columna <0.1x V pico
d.i. mm capilar V
0
L/cm.
0.17 mm 0.227 L/cm
0.12 mm ** 0.113 L/cm
0.05 (slice fundida) 0.020 L/cm
0.025 (slice fundida) 0.00467 L/cm
*
* Volumen dispersivo: el que recorre la muestra fuera de la columna ** 0.12mm recomendado para columnas de 2-3mm d.i.
Pgina: 41
Tpico 60 cm capilar 0.12mm = 7L + X L celda + Y L vol. Inyectado total > 10L




R
e
q
u
e
r
i
r


H
P
L
C

s

a
d
e
c
u
a
d
o
s

Seleccin D.I. de Columna segn Sistema de Bombeo
Mejora de la Sensibilidad y Consumo Disolvente con la Reduccin del D.I.
MS con Nano-
Electrospray o
HPLC-Chip Cube
Nano LC 100 m
75 m
50 m
500 nl/min
250 nl/min
100 nl/min
Micro LC 1 mm
800 m
40 l/min
20 l/min
LC Capilar 300 m
180 m
4 l/min
2 l/min
LC Estndar
4.6 mm
2.1 mm
1000 l/min
200 l/min
Flujo
tpico
D.I. Columna
Ganancia Terica
en Sensibilidad UV
~ 1
~ 5

~ 20
~ 30

~ 200
~ 600


~ 2000
~ 3500
~ 8500

Celdas DAD / MWD:
x10
x200
Muy utilizadas en ESI
LC Estndar
4.6 mm
2.1 mm
1000 l/min
200 l/min
CUATERNARIA*
Mezcla a baja presin
N
a
n
o
-
1
2
0
0

1
2
0
0

C
a
p
i
l
a
r

U
V

/

V
I
S

Standard: 13l y 10mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm
Semi-Micro: 5l y 6mm, 120bar para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm
Micro - Alta Presin: 1.7l y 6mm columnas D.I 1 mm
Semi-Nano: 500nl y 1cm para columnas DI > 1mm
Nano: 80nl y 6mm para columnas DI >= 180-300m.
Con columnas cortas de
1.8m y flujos elevados
se deber reducir el
volumen de la celda
BINARIA
Mezcla alta presin
L
C
/
M
S

D.I.
Dimetro de referencia (D.I.): 4.6mm
Sensibilidad Consumo Disolvente V
o
columna
2.1 mm x 5 1/5 (-80%) 1/5 (-80%)
3 mm x 2.35 1/2.35.(-57%) 1/2.35.(-57%)
d.i. columna V
muertos

que recorre la muestra (d.i. capilares,
volumen de la celda de deteccin,)
Pgina: 42
*1290 cuaternario permite
tambin 2.1mm d.i.
???
Aumento Tiempo de Retardo del Gradiente
0 min 0 min
Reducir flujo (/d.i. columna) gradiente tardar ms en llegar a la columna:
se deber reducir volumen barrido por el gradiente
en inyector y bomba.
Pgina: 43
d.i.: 4.6mm d.i.: 2.1mm
Configuracin del Volumen de Retardo del
Gradiente de Concentracin
El volumen de retardo se recomienda no sea superior al V
o
de la columna
utilizada (como valor orientativo).
Con columnas de D.I. 2.1mm (usuales en LC/MS con ESI) o columnas cortas de
1.8m se recomienda utilizar un sistema con mezclado en alta presin (bombas
binarias) o 1290 cuaternarias.
Con columnas largas de 1.8m o flujos muy elevados se requerir sistemas de
bombeo de alta presin como el Agilent 1200-RRLC (SL), 1220, 1260 y 1290 infinity.
Gradientes con
Mezclado a Alta
Presin
Menor volumen de retardo Configurable
120-800L (1100,1200,1260) // 10-45L (1290)
Bombas binarias 1100, 1200, 1260 y 1290
Gradientes con
Mezclado a
Baja Presin
(en vlvula
proporcional)
Vlvula proporcional
Mayor volumen de retardo NO configurable
600-900L / (<350 1290 cuaternario)
Bombas cuaternarias 1100,1200, 1220, 1260 y 1290
Pgina: 44
slo 1220/1260
*Ambos 1290 NO llevan Damper
Amortiguador /Damper (slo 1260)
Bomba Binaria Serie 1200-RRLC: Muy Fcil Cambio
de Configuracin
Configuracin 1:
Volumen de retardo
estndar (mixer 400L)
Retardo: 600-800l
Retardo con Mixer
200L*: 400-600l
B A
600bar Amortiguador
200 o 400l
Mezclador
600 bars
Sensor
Presin
Vlvula Purga
Configs. 1 2: Desconectar
slo estos punto!
Configuracin 2: Bajo
volumen de retardo
Retardo: 120l
Conectar slo este
punto!
B A
Sensor
Presin
Vlvula Purga
600bar Damper
400l Mixer
Sensor Presin
Vlvula Purga
Inicio Mezcla: T
Recorrido del
Flujo
T
T
Incorpora amortiguador electrnico de pulsaciones
Sensor Presin
Vlvula Purga
Inicio Mezcla: T
Amortiguador
Mezclador 400 o 200l
*Solvent mixer, 200 l (600bars) ref.: 5067-1565
Pgina: 45
Reduccin Volumen de Retardo del Gradiente con
Bombas Binarias*: 1100/1200/ 1220/1260 versus 1290
Infinity

1220/60 Series
Channel A
Passive Damper
0 - 300 l
Passive Mixer
400 l (opcional 200)
1220/60 Series
Channel B
1290 Inifinity
Chanel A
1290 Inifinity
Chanel B
Very Low Noise
~ 600-800 l




+
=
Active Damping
10l
Jet Weaver Mixer
35l
Delay Volume
10l / 45l
80x / 20x lower
1290 Infinity
Pgina: 46
* En bombas con mezclado en baja presin sin mezclador (cuaternarias) el volumen de retardo NO se puede reducir.
Agilent 1200 Series HP Autosampler SL
Delay Volume Reduction and Overlapped Injections
Main Pass Bypass
Simultaneous Speed and Carry Over optimization by
Simple one-valve flow-through design
Automatic delay volume reduction (6ul)
Overlapped injection
Programmable sample flush-out time
External needle wash
Minimized Carry Over by additional valve
switches
Permitir reducir el volumen de retardo del gradiente, al
colocar la vlvula en posicin de Bypass cuando la
muestra ha salido del inyector (Sample Flush-Out Factor)
Pgina: 47
Problema: Reproduccin de Analisis en Gradiente con
diferentes HPLCs: - Impacto del volumen muerto y de la calidad de
la mezcla. Columna: 3 x 50 mm, 2.7 m Poroshell
min 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700
800
R
s
= 1.90
1100 Series Binary LC
1290 Infinity LC
- El gradiente llega antes
R
s
= 1.15
M
e
t
a
m
i
t
r
o
n

C
h
l
o
r
i
d
a
z
o
n
e

S
i
m
a
z
i
n
e

C
h
l
o
r
t
o
l
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r
o
n

D
i
u
r
o
n

P
r
o
p
a
z
i
n
e

T
e
r
b
u
t
y
l
a
z
i
n
e

P
r
o
m
e
t
r
y
n

C
y
a
n
i
z
i
n
e

1290 Infinity LC
with iSET
R
s
= 1.87
Pgina: 48
June 26, 2013
Confidentiality Label
49
Emulacin de cualquier HPLC/UHPLC con el
1290 y la nueva tecnologa ISET.
ISET: Tecnologa de Emulacin Inteligente
- Como trabaja (1290 con un 1200)
Programa de gradiente
1290 gradiente
1200 gradiente



0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
min
mAU
Inyecctin
Mismas condiciones de gradiente
pero desplazando el gradiente y
emulando el perfil del gradiente a
clonar
+ info en Anexo final
Pgina: 50
Agenda
1. Introduccin
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Isocrtico y Gradientes Concentracin
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Fase estacionaria y tipo de columnas
Dimetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con informacin adicional.

Pgina: 51
Resumen Traspaso de Mtodos a UHPLC/RRLC
Reducir Tiempo Anlisis sin perder Resolucin:
Reducir tamao de partcula y longitud de la columna pero manteniendo
constante n platos columna (15cm x 5m = 10cm x 3.5m = 5cm x 1.8m).
Las columnas TP de 1.8m o SP de 2.7m permiten trabajar a flujos elevados
para reducir tiempo de anlisis y mejorar resolucin en gradientes.
Maximizar la Resolucin:
Sin aumentar tiempo de anlisis: Reducir tamao de partcula y mantener
la longitud de la columna (p.e. 150mm x 1.8m).
Aumentado tiempo de anlisis: acoplar varias columnas en serie de 5m
requieren un equipo de alta presin como el Agilent 1200-RRLC (SL).
Columnas Poroshell 120 (superficialmente porosas):
Le permiten trabajar en UHPLC con HPLCs convencionales.
Poder trabajar a mayores flujos para:
reducir sus tiempos de anlisis.
incrementar la capacidad de separacin y resolucin en gradiente.
Pgina: 52
Capacidad de separacin en gradientes proporcional a F x T
g
/ V
0
Trabajar a flujos elevados permite mejorar la capacidad de separacin en gradientes de concentracin
1200 Infinity Method Translator
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Pgina: 53
Agilent 1290 Infinity LC
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Preguntas?
Agenda
1. Introduccin
2. Cmo convertir mtodos de HPLC
a UHPLC?:
Estrategias de Traspaso de Mtodos
Isocrtico y Gradientes Concentracin
Criterios de Seleccin de Columna
Longitud y Tamao Partcula
Fase estacionaria y tipo de columnas
Dimetro
3. Conclusiones.
4. Anexo con informacin adicional.

Pgina: 56
Columnas Poroshell-120 (600bars)
9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11), SB-
CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC. 3 Dimetros y 6 Longitudes

Info 2013
Pgina 57
Especificaciones Columnas Poroshell-120
9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11),
SB-CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC.

Info 2013
Pgina 58
13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Extend-
C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11), SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL
(USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)

Pgina 59
La Mayor Flexibilidad: Especificaciones 17 Fases Diferentes
RRHD de 1.8 m y 1200bars para Cualquier Aplicacin

Pgina 60
La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes
RRHT de 1.8 y 600bars para Cualquier Aplicacin
1.0
2.1
3.0
4.6
IDs
Longitudes: 20,30, 50, 100 y 150mm n Fases: 10
Con igual selectividad que los rellenos de 3.5 y 5m

Pgina 61
La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes
RRHT de 1.8 y 600bars para Cualquier Aplicacin
13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8
(USP L7), Extend-C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11),
SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL (USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)
Designaciones USP
Pgina 62
Designaciones USP
Pgina 63
Designaciones USP
Pgina 64
Designaciones USP
Pgina 65
Workshop 1200-RRLC: Conversin de
Mtodos de HPLC Convencional a
Cromatografa de Resolucin Rpida

Pgina 66
Flujo (mL/min)
Reduccin de la Presin de Trabajo mediante la
Optimizacin de la Distribucin del Tamao de Partcula
con Nuevos Rellenos Zorbax de 1.8m
0
50
100
150
200
250
300
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
P
r
e
s
i

n


(
B
a
r
s
)

+25% MS de
Presin a (2.0
mL/min)
Rellenos 1.8m standard
Nuevos Rellenos 1.8m
Distribucin Optimizada
Columnas: ZORBAX SB-C18
Dimensiones: 4.6 x 30mm, 1.8 m
Eluyenty: 85:15 ACN:Agua
Flujos: 0.05 5.0 mL/min
Temp: 20C
Muestra: 1.0L Octanofenona en Eluyente
Deteccin: UV 245nm
Presin Sistema (1100 sin Columna)
Manteniendo la eficacia, las nuevas columnas Zorbax de 1.8m
reducen la presin en + 20% y permiten trabajar hasta 600bares
Workshop 1200-RRLC: Conversin de
Mtodos de HPLC Convencional a
Cromatografa de Resolucin Rpida

Pgina 67
600 bar
5m
3.5m
2.3
2.1
1.8m
0
100
200
300
400
500
600
700
800
400 bar
Presin versus: Dimetro Partcula y Longitud
de Columna
Presin 1/(d
p
)
2

700-800
600-700
500-600
400-500
300-400
200-300
100-200
0-100
Presin (bars)
Longitud Columna (mm)
Dimetro Partcula (m)
1 mL/min H2O/CH
3
CN 50/50* Temp.: 25C
Calculado en base Agilent 1100 y columnas
Zorbax 4.6mmx1.8m con tecnologa de
400bars
15cm
3.5m
10cm
5cm
1.8m
400bars
600bars
200bars
25cm
5m
* Viscosidad 10-15% inferior a la del agua
J
-35%

-55%

-65%
Reduccin
viscosidad
Pgina 68
Efecto del Incremento de la Temperatura en la
Viscosidad del Eluyente y Presin de Trabajo
La viscosidad se reduce con
respecto a 25C:
a 80C: entre un 35 y
65%.
a 60C: entre un 25-
50%.
Flujo x 1.5-3)
P = f ( . u . L / dp2)

Subir temperatura permite trabajar a mayores flujos
Pgina: 69
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Modelo
UHPLC
Pres.
Mx
bars
Mxima Longitud
Columna UHPLC cm
Rango d.i.
Columna mm
Delay
Volume
Bomba
L
Flujo
mx.
mL/min
1.8m (TP)** Poroshell-120
2.7m (SP)**
1220 binario
1260 cuaternario
600 10 (15) cm 15 (20) 3-4.6 (16) 600-900 10
1260 binario 600 10 (15) cm 15 (20) 2.1-4.6 (8) 120 /600-800 5
1290 cuaternario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (16) <350 10
1290 binario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (8) 10 / 45 5
Qu UHPLC Agilent se Adapta Mejor a Sus
Necesidades/ Presupuesto?
+






















-

C
o
s
t
e

La seleccin del cromatgrafo depende del
dimetro y longitud de las columnas de UHPLC
que se quieran utilizar.
Algunos UHPLCs del mercado estn limitados a un flujo
mximo de 1-2mL/min NO permitir trabajar con
columnas de d.i. 4.6mm a velocidades lineales/flujos
elevados.
Bomba Binaria Series 1200/1100*- Configuraciones
*excepto modelo 1200-SL
Configuracin 1:
Volumen de retardo
estndar
Retardo: 600-900l

Sensor Presin
Vlvula Purga
Inicio Mezcla: T
Amortiguador
400l Mezclador
Configs. 1 2: Desconectar slo
estos puntos!
Recorrido del
Flujo
B A
400bar Amortiguador
+Sensor Presin
400l
Mezclador
Sensor
Presin
Vlvula Purga
T
Sensor Presin
Vlvula Purga
Inicio Mezcla: T
Amortiguador
80l filtro
Configs. 2 3: Desconectar slo
estos puntos!
Recorrido del
Flujo
B A
Configuracin 2:
Volumen de retardo
medio**
Retardo: 300-600l**
400bar Amortiguador
+Sensor Presin
80l

Filtro en
Lnea (400 bars)
Sensor
Presin
Vlvula Purga
T
** Al eliminarse el mezclador el ruido
de mezcla puede aumentar
Pgina: 70
Bomba Binaria Series 1200/1100- Configuraciones
*excepto modelo 1200-SL
Configuracin 3: Volumen
de retardo medio*
Retardo: 200-500l
** Al eliminarse el mezclador el ruido
de mezcla puede aumentar
Inicio Mezcla: T
Vlvula Purga
Amortiguador +
Sensor Presin
Configuracin 4: Volumen
de retardo muy bajo**
Retardo: < 200l
B A
400bar Amortiguador
+Sensor Presin
Sensor
Presin
Vlvula Purga
400l
Mezclador
T
Amortiguador +
Sensor Presin
Vlvula Purga
Inicio Mezcla: T
B A
400bar Amortiguador
+Sensor Presin
Sensor
Presin
Vlvula Purga
400l
Mezclador
T
Recorrido del
Flujo
Pgina: 71
Soluciones 1290 Infinity LC
- 2000 muestras/da usando ACR (Reg. Aut. de Columna)

Anlisis y Regeneracin de columna
simultneos con vlvula de 2
posiciones / 10 puertos
Tiempos de ciclo ms cortos y mayor
capacidad de anlisis de muestras para
laboratorios de HT y desarrollo de
mtodos
Respuestas ms rpidas en los
controles de calidad durante la fase de
produccin o de liberacin de producto
acabado

Pgina 73
Adaptacin HPLC: Mnimizar los Volmenes Extra-
Columna en Funcin su Tamao: Capilares de Conexin
Columna
Vol. Col. Flujo tip.
Vol. pico
d.i. mm L, mm
V
0
l
l/min l @k'=3
4.6
2.1
1
0.5
0.3
0.075
150 1329 1400 667
150 417 292 139
150 94 66 31
150 23.6 17 7.9
150 8.5 6.0 2.8
150 0.53 0.37 0.18
Capilar de 0,17 mm de d.i. x 150 mm = 3,4 l de vol. interno
Capilar de 0,12 mm de d.i. x 150 mm = 1,7 l de vol. interno
Capilar de 0,05 mm de d.i. x slice fundida 150 mm = 0,3 l vol
Capilar de 0,025 mm de d.i. x slice fundida 150 mm = 0,07 l vol
R
e
q
u
i
e
r
e
n

i
n
s
t
r
u
m
e
n
t
o
s

e
s
p
e
c

f
i
c
a
m
e
n
t
e

d
i
s
e

a
d
o
s


mx. D.I. cap.


0.17
0.12
0.075
0.05
0.025
(0.025)
Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 X V
0
columna <0.1 x V pico

Pgina 74
Reduccin Volmenes Extra-Columna: Celdas Deteccin
y Volumen de Retardo con Gradientes de Concentracin
Celdas de Deteccin DAD & MWD: (opciones parecidas con VWD)





Standard: 13l, 10mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm
Semi-Micro: 5l, 6mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm
Micro: 2l, 3mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 1 2.1 mm
Alta Presin 1.7l, 6mm, 400bar tpica para MS y columnas D.I 1 mm
Semi-Nano: 500nl, 10mm, 50bar tpica para columnas D.I.: 0.5 1 mm
Nano: 80nl, 6mm, 50bar tpica para columnas D.I.: 0.18 0.5mm
Preparativas: 3mm, 120bar / 0.3mm, 20bar / 0.06mm, 20bar
Con columnas cortas de 1.8m y flujos elevados
se deber reducir el volumen de la celda

Pgina 75
Adaptacin HPLC: Cromatogramas < 1min pueden
Requerir Frecuencias de Adquisicin Superiores a 20Hz:
Detectores DAD-SL y MWD-SL pueden adquirir hasta a 80Hz para picos de
tan slo 0.15 segundos de ancho

Para picos con PW (peakwidth al 50% de su altura)
> 0.01min (0.6seg) el DAD standard a 20Hz es suficiente
min
0.1 0.2 0.3 0.4
0.5
0
80Hz
PW=0.30sec
40Hz
PW=0.33sec
20Hz
PW=0.42sec
10Hz
PW=0.67sec
5Hz
PW=1.24sec
DAD standard
20Hz
Agilent SL Fast
DAD
RSD%<1% 15 ptos./pico
1<RSD%<3% 12 ptos./pico
RSD% 10-12% 8 ptos./pico
Muestra: Mezcla de Fenonas
Columna: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um
Gradiente: 50-100% ACN en 0.3min
Celda det.: 5ul
24pts.

80 pts.
12pts.

40 pts.
6pts.

20 pts.
Frec.
Adq..
Ancho pico Resolucin Capacidad
sep. picos
80 Hz 0.300 2.25 60
40 Hz 0.329 2.05 55
20 Hz 0.416 1.71 45
10 Hz 0.666 1.17 29
5 Hz 1.236 0.67 16

Pgina 76
Configuracin para Inyeccin Grandes
Volmenes
Bomba
Gradientes Detector
Columna
Inyector
Configuracin con Inyeccin Directa*: segn las condiciones
utilizadas el volumen de inyeccin est limitado por las dimensiones de la columna*
Vlvulas controladas por Agilent LC-1200/1100

Configuracin con Columna
Concentradora
Bomba de
Carga
Isocrtica
Pre-Columna
Concen-
tradora
en vlvula 2
posiciones
Desecho
Bomba
Gradientes
Inyector
Columna
Separadora
Detector
Carga
(p.e. 2 min)
Anlisis
Requiere 2 bombas
Concentracin
Permitir la inyeccin de grandes
volmenes. La elucin de la columna
concentradora se realiza en sentido contrario
a su sentido de carga
* Volumen tpico de inyeccin 1-2 (5) % del V
0
de la columna utilizada. V
0
(col. 100 x 4.6mm) =1.0ml
Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario
Prestaciones UHPLC para TODOS LOS LABORATORIOS:
Resolucin optimizada
3x100mm, 1.8m
Resolucin pico 5 = 7.16
Tiempo anlisis: 7 min

Velocidad y Resolucin optimizadas
3x50mm, 1.8m
Resolucin pico 5 = 4.79
Tiempo anlisis: 1.1min

Convencional
4.6x150, 5m
Resolucin pico 5 = 4.20
Tiempo anlisis: 11 min

min 0 2 4 6 8 10
min 0 2 4 6 8 10
min 0 2 4 6 8 10
10 x PRODUCTIVIDAD mayor n de datos y de mejor calidad!
Pgina: 77
600 bars
Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario
100% Compatibilidad con Mtodos HPLC
Reemplazo Sin Riesgo
1260/1220 Infinity LC
Sistema Cuaternario
1100/1200 Series
Sistema Cuaternario
Columna: 4.6 x 150mm, 5m
Gradiente: 0 min 20 % B
10min 95 %
Flujo: 1 mL/min

min 0 2 4 6 8 10
Ejecute sus actuales mtodos de HPLC y obtenga los mismos resultados
Pgina: 78
1100/1200 Binarios seran remplazados por 1260 Binario o 1290+ISET
600 bars
Problema: Reproduccin de Analisis en
Gradiente con diferentes HPLCs: - Impacto del
volumen muerto y de la calidad de la mezcla
min 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 B, Sig=275,4 Ref=400,40 (B:\RIC\AGI...RIC DATA\1 PHARMA METOCLOPRAMIDE\WAD PHARMA\XBRIDGE-2000004.D)

2
.
7
4
7

3
.
0
4
9

8
.
1
2
1

8
.
3
2
3

8
.
7
4
7

8
.
9
3
0

9
.
5
4
5

9
.
9
7
5

1
2
.
0
0
5

1
2
.
2
1
5

1
2
.
3
9
3
min 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000001.D)

2
.
7
4
4

2
.
8
8
4

6
.
0
8
8

6
.
3
2
8

6
.
6
7
3

6
.
8
7
2

7
.
4
8
0

7
.
9
2
3

9
.
9
3
7

1
0
.
2
4
9
min 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000003.D)

2
.
8
8
7

3
.
3
2
0

8
.
5
3
8

8
.
7
4
4

9
.
1
5
9

9
.
3
2
5

9
.
9
5
1

1
0
.
3
7
9

1
2
.
3
9
5

1
2
.
6
3
0

1
2
.
7
6
3
1200 Series LC Bomba Cuaternaria
1290 Infinity bomba Binaria
Sample: 0.5% impurities in formulation
(metoclopramide)
Xbridge C18, 150x3 mm, 3.5 m dp,
0.45 ml/min, Eluent: A =0 .25 % AmAc, B = ACN,
Gradient: 0-15 min; 5-57 % B
El resultado:
Diferencias en los RT y resolucin
Se juntan 2 picos!
Pgina: 79
June 26, 2013
Confidentiality Label
80
Emulacin de cualquier HPLC/UHPLC con el
1290 y la nueva tecnologa ISET.
Pesticidas: Ejemplo Emulacin 1100 con ISET
Columna: 3 x 50 mm, 2.7 m Poroshell
min 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700
800
R
s
= 1.90
1100 Series Binary LC
1290 Infinity LC
- El gradiente llega antes
R
s
= 1.15
M
e
t
a
m
i
t
r
o
n

C
h
l
o
r
i
d
a
z
o
n
e

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r
o
n

P
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p
a
z
i
n
e

T
e
r
b
u
t
y
l
a
z
i
n
e

P
r
o
m
e
t
r
y
n

C
y
a
n
i
z
i
n
e

1290 Infinity LC
with iSET
R
s
= 1.87
Intelligent System Emulation Technology
ISET: - Cmo programarlo?
Select pump
Select autosampler
Agilent 1100
Agilent 1200
Agilent 1220
Agilent 1260
Agilent 1290
Waters Alliance


Tecnologa de Emulacin Inteligente
- Como trabaja (1290 con un 1200)
Programa de gradiente
1290 gradiente
1200 gradiente



0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
min
mAU
Inyecctin
Mismas condiciones de gradiente
pero desplazando el gradiente y
emulando el perfil del gradiente a
clonar

Pgina 84
Resumen Conclusiones Adicionales
Posibilidades Adicionales para Reducir Tiempo Anlisis :
Trabajar a temperaturas elevadas permitir reducir el tiempo de anlisis, trabajar a
flujos ms elevados y reducir la resistencia a la transferencia de masa (til con
rellenos de 5m).
Aumentar el flujo con gradientes de concentracin permitir reducir
proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo la separacin.
Reducir el Vo de la columna permitir reducir proporcionalmente el tiempo del
gradiente manteniendo el poder de separacin (si FxT
g
/ V
0
= cte).
Requisitos de la Cromatografa Ultra-rpida:
Requerir reducir el volumen de los capilares de conexin y de las celdas de
deteccin, y aumentar la frecuencia de adquisicin de datos.
Requerir adecuar el volumen de retardo al flujo y dimensiones de la columna
utilizada.
Columnas de 2.1mm de D.I. requerirn un equipo con mezcla a alta presin y mnimo
volumen de retardo (como las bombas 1290, 1260, 1200, 1100 binarias o 1290 cuaternaria)
Requisitos de la Cromatografa de Alta-Resolucin:
Requerir un equipo de alta presin como el Agilent 1220, 1260 o 1290 y columnas
150mm x 1.8m, o acoplar varias columnas en serie de 250mm x 5m.
La flexibilidad de la Serie Agilent 12X0-Infinity le permite trabajar en
ptimas condiciones con todo tipo de cromatografa
Agilent 1290 Infinity LC
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