79 Cytomorfologiczne i fizjologiczne przemiany leżące u podstaw nabywania

embriogenicznej kompetencji przez eksplantaty paproci drzewiastej Cyathea

delgadii Sternb.

2. Resumen
La embriogénesis somática (SE), que es el proceso de formación de embriones a
partir de células vegetativas, es una manifestación de la extraordinaria plasticidad
de los organismos vegetales que ha fascinado a los investigadores durante más
de 60 años. A pesar del enorme progreso realizado durante este tiempo, la
cuestión de cómo una sola célula somática cambia su programa de desarrollo para
convertirse en una planta completa no ha sido suficientemente aclarada hasta el
momento. El sistema experimental SE desarrollado en 2015 en el helecho
Cyathea delgadii, gracias al origen unicelular de los embriones inducidos en el
medio sin el uso de reguladores del crecimiento vegetal, abrió el camino a la
investigación sobre la etapa de inducción y expresión temprana de este proceso.
El objetivo de la tesis fue conocer y describir las condiciones relacionadas con la
adquisición del potencial embriogénico por parte de explantes de C. delgadii a
nivel de estructura y ultraestructura celular, dependencias fisiológicas y
comunicación simplástica. El objeto de los experimentos fue el único helecho
hasta el momento para el cual se describió la capacidad de reproducirse por SE.
Se analizaron los explantes de pecíolos y entrenudos de esporofitos de C. delgadii
etiolados y pecíolos recolectados de plantas no etioladas.
Usando cromatografía líquida de alto rendimiento, se demostró que las
condiciones de luz en las que prosperan las plantas donantes afectan
significativamente el nivel y el equilibrio de las hormonas y los azúcares
endógenos. Se ha comprobado que el ácido abscísico (ABA) es la principal
hormona inhibidora de la SE, y un aumento repentino de la concentración de
sacarosa endógena es una señal que induce un cambio en el programa de
desarrollo de las células somáticas. Utilizando inhibidores del transporte y
biosíntesis de hormonas, se ha demostrado que estas sustancias en
concentraciones que inhiben la SE modifican significativamente el nivel de ácido
indolil-3-acético (IAA) endógeno y/o ABA y/o CK. Su uso también da como
resultado un cambio en la concentración de azúcares endógenos, especialmente
en la inducción de sacarosa clave de este proceso. Los experimentos que
utilizaron fluorocromos de transporte de simplastos de bajo peso molecular
mostraron una limitación en la conectividad de los simplastos en el explante justo
antes de las divisiones que dieron lugar a los embriones somáticos. Los cambios
en la continuidad del citoplasma se acompañaron de su remodelación en células
epidérmicas y corticales observadas con el uso de diversas técnicas
microscópicas. El desarrollo del embrión somático también estuvo asociado con la
limitación del movimiento de fluorocromos entre sus células y el explante, así
como dentro del cuerpo del embrión. Al analizar una serie de factores de cultivo
que pueden afectar el curso y la eficacia de SE, se encontró que, según el tipo de
explante utilizado para la iniciación del cultivo, los embriones somáticos de C.
delgadii están formados por uno (explante en la cola) o multicelular. (en el
explante del entrenudo). Mediante el tratamiento a corto plazo de los entrenudos
con soluciones de sacarosa, la eficacia de la SE puede aumentar muchas veces,
lo que está relacionado con el cambio de la ruta de diferenciación del embrión de
unicelular.
La investigación multifacética ha proporcionado nuevos conocimientos integrales
en el campo de los cambios que acompañan la transición de la célula somática de
un explante a un estado embriogénico y relacionados con la etapa temprana de
diferenciación del cuerpo del embrión de helecho.

3. Streszczenie w języku angelskim

La embriogénesis somática (SE) es la formación de embriones a partir de células
vegetativas. Este proceso, como ejemplo de la extraordinaria plasticidad de los
organismos vegetales, ha fascinado a los investigadores durante más de 60 años.
A pesar del enorme progreso realizado durante este tiempo, la cuestión de cómo
una sola célula somática cambia su programa de desarrollo para convertirse en
una planta completa no ha sido suficientemente aclarada hasta el momento. El
sistema experimental desarrollado en 2015 en el helecho arborescente Cyathea
delgadii se caracteriza por el origen unicelular de embriones somáticos inducidos
en medios sin reguladores del crecimiento vegetal. Estas cualidades particulares
han abierto el camino para la investigación sobre la inducción y expresión
temprana de SE. El objetivo de la tesis fue describir los determinantes
relacionados con la adquisición del potencial embriogénico por parte de explantes
de C. delgadii a nivel de estructura y ultraestructura celular, relaciones fisiológicas
y comunicación simplásmica. Los experimentos se realizaron en C. delgadii, el
único helecho en el que se descubrió SE hasta ahora. Se analizaron explantes de
estípite y entrenudos extirpados de esporofitos etiolados y explantes de estípite
tomados de plantas no etioladas.
El análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento mostró que las condiciones
de luz en las que se desarrollan las plantas donantes afectan significativamente el
nivel y el equilibrio de las hormonas y los azúcares endógenos. También demostró
que el ácido abscísico (ABA) es la principal hormona que inhibe la SE y el
aumento repentino en la concentración de sacarosa endógena es una señal que
induce un cambio en el desarrollo de las células somáticas. Los inhibidores del
transporte y la biosíntesis de hormonas utilizados en concentraciones inhibidoras
de SE cambiaron significativamente el nivel de IAA y/o ABA y/o CK endógenos. Su
aplicación también provocó cambios en la concentración de azúcares endógenos,
especialmente críticos para la inducción de SE, la sacarosa. Experimentos con
fluorocromos de bajo peso molecular de transporte simplásmico han demostrado
la restricción en la comunicación celular del estípite explante justo antes de que
ocurrieran las divisiones que dieron lugar a los embriones somáticos. Los cambios
en el flujo del citoplasma estuvieron acompañados de una remodelación en la
estructura de las células epidérmicas y corticales observada utilizando diversas
técnicas microscópicas. El desarrollo del embrión somático también se asoció con
la restricción del movimiento de los fluorocromos entre sus células y el explante,
así como dentro del cuerpo del embrión. Al probar una serie de factores que
pueden influir en el curso y la eficiencia de la SE, se encontró que, según el tipo
de explante utilizado para la iniciación del cultivo, los embriones somáticos de C.
delgadii eran uni (en los explantes del estípite) o multicelulares. (sobre la
implantación intersticial) en origen. El tratamiento a corto plazo de los entrenudos
con soluciones de sacarosa aumentó muchas veces la eficiencia de SE. Eso
estaba relacionado con el cambio de la vía de diferenciación del embrión de
multicelular a unicelular.
Los estudios proporcionaron conocimientos nuevos y completos sobre los cambios
celulares que acompañan la transición de las células somáticas al estado
embrionario y están relacionados con la etapa temprana de diferenciación del
embrión de helecho.

4. Introducción
La embriogénesis somática (SE) es el proceso de formación de embriones a partir
de células vegetativas que no están predispuestas a ella durante el desarrollo de
la planta. Las estructuras bipolares así formadas desarrollan su propio sistema
vascular no conectado con el tejido conductor del explante inicial. Estos
embriones, llamados somáticos, se diferencian directamente de las células del
explante o a través de la fase de callo de transición (directa o indirecta), y su
desarrollo se inicia por divisiones de una sola célula o de muchas células
adyacentes (de origen unicelular o multicelular) (Maheswaran y Williams 1985). ).
La formación de embriones somáticos es un ejemplo especial de la plasticidad de
los organismos vegetales, basado en un cambio en el programa de desarrollo
implementado hasta ahora (Elhiti et al. 2013). Tal reorganización en condiciones
de cultivo in vitro usualmente ocurre bajo la influencia de reguladores de
crecimiento vegetal (PGR) exógenos, menos frecuentemente solo después del uso
de factores de estrés como daño mecánico, tratamiento con alta o baja
temperatura, metales pesados o estrés osmótico (Loyola -Vargas y Ochoa-Alejo
2016; Nic-Can et al. 2016). El botánico austríaco Gottlieb Haberlandt (1854-1945),
quien en 1902 formuló una audaz hipótesis de que cada célula somática viva es
capaz de reproducir un organismo vegetal completo (Haberlandt 1902), sentó las
bases para los cultivos de tejidos vegetales, incluido el SE. Más de medio siglo
después, dos investigadores, Reinert y Steward, que realizaron estudios
independientes, describieron la formación de embriones a partir de cultivos de
suspensiones de células de Daucus carota (Steward et al. 1958; Reinert 1959). En
poco más de veinte años después del descubrimiento de SE, este proceso ha sido
documentado en 132 especies de gimnospermas y angiospermas,
monocotiledóneas y dicotiledóneas (Ammirato 1983). El último estudio que resume
el número de especies regenerables por esta vía data de 1995 (Thorpe 1995).
Actualmente, debido a las conocidas condiciones culturales y factores que
controlan el curso de SE, así como la alta eficiencia de este proceso, se utiliza a
gran escala para la reproducción clonal de plantas y es ampliamente utilizado en
horticultura, silvicultura, agricultura y medicamento. Desde un punto de vista
científico, la investigación contemporánea sobre SE tiene como objetivo
comprender y describir los mecanismos que controlan la embriogénesis de las
plantas (Elhiti et al. 2013; Fehér 2015).
A pesar de más de 60 años de experiencia en el descubrimiento de SE, el
conocimiento al respecto proviene completamente de la investigación sobre
Spermatophyta. Aparte del grupo de plantas con semillas, hasta ahora este
proceso solo se ha descrito en dos especies de musgo club, a saber, Lycopodiella
inundata (L.) Holub (Atmane et al. 2000) y Huperzia selago (L.) (Szypuła et al.
2005). Sus sistemas de regeneración se basan en un SE intermedio inducido por
reguladores de crecimiento añadidos al medio. En 2015, en nuestro laboratorio, se
describió SE por primera vez en el mundo en el helecho arborescente Cyathea
delgadii (clado Monilophyta). Este descubrimiento llenó el vacío en la comprensión
de este proceso en varios grupos filogenéticos de plantas telómicas (Mikuła et al.
2015b). El sistema desarrollado por C Delgadia, gracias a su alta eficiencia y la
posibilidad de obtener embriones somáticos sin el uso de reguladores de
crecimiento, ha abierto el camino a la investigación en áreas que antes no estaban
disponibles ni siquiera en plantas modelo. Vale la pena enfatizar que en los
últimos años se ha prestado atención al potencial de las plantas de esporas en el
estudio de procesos básicos de desarrollo in vitro. Los análisis realizados con el
uso del helecho herbáceo Adiantum capillus-veneris demostraron la actividad de
genes como SERK (CINASAS RECEPTORAS DE EMBRIOGÉNESIS
SOMÁTICA), WUS (WUSHEL), LEC1 (LEAFY COTYLEDON 1), AGL15
(AGAMOUS LIKE-15) y BBOMM ) durante la regeneración de brotes BABY,
formación de cuerpos globulares verdes y producción de callos (Li et al. 2015;
2017). La acción de reguladores clave de SE en diversos sistemas regenerativos
de helechos impulsa la búsqueda de mecanismos comunes a todo el mundo
vegetal, condicionando el proceso de diferenciación celular in vitro.
Muchos años de investigación utilizando diversas plantas, incluidas especies
modelo como zanahorias, alfalfa, maíz, arroz, algodón y rábano, han llevado a la
descripción de los orígenes y el desarrollo de los embriones somáticos. También
permitieron conocer los determinantes básicos hormonales, genéticos,
epigenéticos, bioquímicos y estructurales involucrados en el proceso de SE (Fehér
2015; Méndez-Hernández et al. 2019; Kumar y van Staden 2017; Horstman et al.
2017). A pesar del enorme progreso, la ciencia moderna todavía no tiene una
imagen completa de los cambios en la célula somática que conducen a su carácter
embriogénico. Los modelos de plantas que permiten rastrear, por ejemplo, los
mecanismos moleculares que ocurren en SE, no siempre son óptimos para
realizar investigaciones a otros niveles, por ejemplo, fisiológico o citomorfológico.
Por lo tanto, buscar e introducir nuevos modelos de plantas en la investigación
puede ser extremadamente valioso desde el punto de vista de la necesidad de
ampliar el conocimiento y construir una imagen completa del proceso de SE,
especialmente su fase más temprana llamada fase de inducción (Elhiti et al. 2013).

4.1. Aspectos fisiológicos de la inducción de SE

La respuesta al estrés y la respuesta hormonal son las primeras en iniciarse
durante la desdiferenciación de las células dentro de los explantes, lo que les
permite reprogramarse y seguir la vía SE (Ikeuchi et al. 2017; Mozgová et al.
2017). Por lo tanto, comprender las relaciones fisiológicas es crucial para
comprender los conceptos básicos del potencial embriogénico y la iniciación
somática de los embriones (Jimenez 2005; Méndez-Hernández et al. 2019). La
mayoría de los protocolos de inducción de SE publicados hasta la fecha han
demostrado un papel clave para las PCR. Solo para un pequeño número de
plantas es posible iniciar este proceso sin la presencia de estas sustancias en el
medio (Gaj 2004; Karami y Saidi 2010). Los sistemas SE en muchas especies
dependen de la auxina, con base en el uso de una auxina sintética como el ácido
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D; Gaj 2004; Karami et al. 2009). Por lo tanto, las
auxinas endógenas constituyen el grupo de hormonas más estudiado en el
contexto de la inducción de SE. Aparte de ellos, también las citoquininas son
necesarias en la fase de división celular inicial en este proceso (Karami et al.
2009). El etileno y el ácido abscísico (ABA), considerados hormonas del estrés,
también pueden estar involucrados en la adquisición de competencias para la
embriogénesis (Karami y Saidi 2010; Zheng et al. 2013; Nowak et al. 2015). En la
investigación sobre la regulación hormonal de SE, se presta mucha más atención
a los resultados de la adición de PGR al medio que al posible papel de las
fitohormonas presentes en los tejidos. Poco se sabe sobre las interacciones de los
reguladores de crecimiento exógenos con el sistema endocrino endógeno (Ayil-
Gutiérrez et al. 2013). El conocimiento del contenido de fitohormonas durante la
inducción de SE se limita con mayor frecuencia al análisis de uno o dos grupos de
compuestos (Grieb et al. 1997; Charrière et al. 1999; Jiménez y Bangerth 2001b;
Yang et al. 2012; Ayil-Gutiérrez et al. 2013; Igielski y Kępczyńska 2017;
Wójcikowska et al. 2018). Además, estos estudios comparan principalmente callos
embriogénicos con no embriogénicos (Jiménez y Bangerth 2000; Pintos et al.
2002) o explantes o genotipos capaces o incapaces de SE (Wenck et al. 1988;
Centeno et al. 1997; Limanton-Grevet et al. al., 2000; Jiménez y Bangerth, 2001a).
Los últimos informes basados en el análisis de un espectro muy amplio de
hormonas endógenas en Picea abies revelaron que las concentraciones de clases
individuales de fitohormonas difieren sustancialmente entre las fases SE:
proliferación, maduración y germinación de embriones (Vondrakova et al. 2018).
Aunque los aspectos fisiológicos del proceso de SE son un tema muy importante y
discutido con frecuencia, estos estudios se someten ocasionalmente a la fase de
inducción, en la que las células somáticas se reprograman en embriogénicas.
Debido a la falta de modelos experimentales apropiados, la investigación en esta
etapa es extremadamente difícil de llevar a cabo. Esto no se ve favorecido por
diversas vías de diferenciación embrionaria, cuya formación va acompañada de la
formación de tejido calloso o de la zona de células de transición, dando como
resultado diferentes patrones de respuestas hormonales y metabolismo de
azúcares. Por tanto, el conocimiento de esta etapa del SE es muy limitado.

4.2. La comunicación simplástica en el proceso de SE

Symplast, que forma parte del sistema de intercambio de información entre las
células vegetales, se considera uno de los elementos importantes que condicionan
la activación de los procesos morfogenéticos (Marzec y Kurczynska 2014; Otero et
al. 2016). La comunicación de Symplast también puede desempeñar un papel
clave en el inicio de un SE. Los experimentos en esta área se centraron
inicialmente en romper las conexiones plasmodésmicas iniciadas con soluciones
de plasmolisis y en el impacto de dicho tratamiento en el aumento de la eficiencia
de la producción de embriones somáticos (Choi y Soh 1997; Choi et al. 1999). El
análisis microscópico del plasmodesmo y la demostración de los cambios en su
número confirmaron el papel de la conectividad del simplasto en la SE (Verdeil et
al. 2001). Sin embargo, estudios realizados en los últimos años muestran que la
presencia de plasmodesmas no prueba por sí misma la funcionalidad del
simplasto. Su rendimiento puede estar regulado por muchos factores, como el
depósito de β-1,3-glucano (caloses; Chen y Kim 2009; Zavaliev et al. 2011) o la
actividad de las proteínas plasmodesmales de membrana (Burch-Smith et al.
2012; Burch-Smith et al. Zambelki 2012). Se puede obtener mucha más
información sobre el intercambio de citoplasma y las moléculas de señalización
que contiene (como hormonas, factores de transcripción y algunos ARN)
realizando análisis basados en el uso de fluorocromos de transporte de
simplastos. Estas sustancias, moviéndose solo a través de plasmodesmos,
permiten rastrear el flujo de citoplasma entre las células. Son ampliamente
utilizados en el estudio de procesos de diferenciación de células vegetales, como
el desarrollo de pelos en raíces de cebada (Marzec et al. 2014), el desarrollo de
embriones cigóticos (Kim y Zambelki 2005; Stadler et al. 2005; Wróbel-Marek et al.
2016) y en androgénesis (Wróbel et al. 2011). La SE con el uso de fluorocromos
ha sido estudiada hasta ahora en una sola especie del grupo de las plantas con
semilla, es decir, el modelo Arabidopsis thaliana. Estos estudios mostraron una
limitación de la comunicación simplástica entre las regiones del explante, a partir
de las cuales se diferencian los embriones somáticos, y las áreas no involucradas
en su formación (Kulinska-Lukaszek y Kurczynska 2012; Godel-Jedrychowska et
al. 2019). También se muestra el aislamiento temporal de un embrión somático en
la etapa cardíaca del explante a partir del cual se formó (Kurczyńska et al. 2007).
Durante mucho tiempo se ha postulado que el aislamiento de células somáticas,
incluso por simplasto, es una condición necesaria para reprogramar su desarrollo
hasta ahora y dirigirlo a la vía SE. Sin embargo, este problema aún no se ha
documentado en un modelo de diferenciación de embriones unicelulares.

4.3. Cyathea delgadii como modelo experimental único

Los estudios realizados hasta ahora con el uso del helecho arborescente tropical
C. delgadii han mostrado dos características específicas del proceso SE, que le
dan un carácter experimental único (Mikuła et al. 2015a, b). Incluyen: 1) inducción
y desarrollo de embriones que tienen lugar en medios sin reguladores de
crecimiento y 2) origen epidérmico unicelular de embriones somáticos.
El helecho C. delgadii es una de las pocas plantas en las que se puede inducir SE
sin usar reguladores de crecimiento en el medio (Raemakers et al. 1995; Gaj
2004; Yan-Lin y Soon-Kwan 2012). La capacidad de los explantes iniciales para
formar embriones somáticos depende de esta especie de las condiciones de luz
en las que se desarrollan las plantas donantes. Se ha demostrado que los
explantes tomados de plantas cultivadas en condiciones de fotoperíodo (16/8h)
son incapaces de producir embriones somáticos, mientras que los explantes de
plantas mantenidas en oscuridad permanente embriones con alta eficiencia
(Mikuła et al. 2015a). La eficiencia de SE en C. delgadii y el desarrollo de
embriones puede controlarse por el contenido de micro y macro elementos del
medio, la concentración de sacarosa y las condiciones de luz del cultivo. Los
análisis citomorfológicos mostraron que las primeras 8-10 divisiones que ocurren
dentro de la célula epidérmica inicial del explante de la cola de la hoja conducen a
la formación de una estructura embrionaria lineal, en la que se distinguen cuatro
dominios celulares y luego cuatro órganos del embrión somático: hoja, brote , raíz
y pie (Mikuła et al. 2015 b). El método lineal de diferenciación somática de
embriones de C. delgadii, caracterizado por la ocurrencia de divisiones celulares
solo transversales al eje del explante y una disposición en serie de células
divididas, es un fenómeno biológico que no ha sido descrito en el mundo vegetal
hasta el momento. . Esto prueba que el patrón de las primeras divisiones de
células somáticas competentes, diferente al descrito en la embriogénesis cigótica,
no es un obstáculo en el inicio de la SE y la formación de embriones somáticos.
Los estudios también han demostrado que la fase de inducción de SE no se
acompaña de división celular que da lugar a otros procesos morfogenéticos.
El sistema SE C. delgadii desarrollado en 2015 se convirtió en el punto de partida
de la investigación realizada en esta tesis doctoral. La independencia de las
granjas estatales predispone a este objeto experimental a la investigación sobre la
regulación hormonal endógena de la morfogénesis in vitro. El origen epidérmico y,
en particular, unicelular de los embriones somáticos hace de C. delgadii un modelo
conveniente para estudiar las interacciones y conexiones entre células. La
investigación in vitro sobre la embriogénesis de esta especie es también un
excelente complemento al conocimiento actual en el campo de la embriología de
los helechos.

5. Hipótesis de investigación y objeto del trabajo

El helecho arborescente de C. delgadii es una especie en la que la etiolación de
las plantas donantes y la escisión del explante son estímulos suficientes para
cambiar el programa de desarrollo existente de las células e iniciar el proceso de
SE en ellas (Mikuła et al. 2015a, b). Por lo tanto, en esta tesis doctoral se planteó
la hipótesis de que la base para obtener el carácter embriogénico de los explantes
de C. delgadii es un equilibrio hormonal endógeno apropiado, y la entrada de
células somáticas individuales en la vía SE está regulada por la limitación de la
conectividad simplástica entre el células de explante.
El objetivo de la investigación fue comprender y describir las condiciones
relacionadas con la adquisición del potencial embriogénico por parte de explantes
de C. delgadii a nivel de estructura y ultraestructura celular, dependencias
fisiológicas y comunicación simplástica.
En relación con lo anterior, se determinó:
• el nivel de hormonas y azúcares endógenos en explantes aptos para SE y no SE
(Publicación 1);
• dinámica de cambios en el nivel de azúcares y hormonas endógenas durante un
cultivo de 14 días de explantes con capacidad SE (Publicación 1);
• influencia de los inhibidores del transporte y biosíntesis de hormonas en SE y la
síntesis de hormonas seleccionadas (Publicación 2);
• cambios en la estructura y ultraestructura de las células del explante durante la
inducción de SE (publicaciones 3 y 4);
• cambios en la comunicación simplástica durante la adquisición del potencial
embriogénico y la etapa temprana de formación de embriones somáticos
(Publicación 3);
• influencia de factores dependientes de las características físicas del explante y
exógenos
factores de estrés sobre el origen de los embriones somáticos y la eficacia de SE
(Publicación 4).
6. Materiales y métodos
Este capítulo resume los métodos de investigación utilizados en los experimentos
cubiertos por esta disertación y utilizados para describir el SE en C. delgadii. Un
diagrama de la investigación realizada con la división en cuatro publicaciones
incluidas en la disertación se presenta en la Figura 1.
El material vegetal utilizado en la investigación fueron los cultivos axénicos de
esporofitos de C. delgadii derivados y mantenidos en el Jardín Botánico de la
Academia Polaca de Ciencias - CZRB en Powsin. Los explantes se obtuvieron de
las hojas más jóvenes de esporofitos de 2-5 hojas mantenidos en condiciones de
fotoperíodo (16/8 h luz/oscuridad; no etiolados) o en completa oscuridad
(etiolados). Se analizaron explantes de pecíolos y entrenudos de esporofitos
etiolados y pecíolos de esporofitos no etiolados. Los cultivos de explantes se
mantuvieron en la oscuridad. Todos los experimentos se llevaron a cabo en el
medio que contenía la mitad de los micro
y macronutrientes medio MS (Murashige y Skoog 1962) y un conjunto completo de
vitaminas (1MS) sin 2
reguladores del crecimiento o que contienen inhibidores del transporte y del
crecimiento hormonal.
La evaluación de la eficacia de SE se realizó después de dos meses de cultivo. Se
analizó el porcentaje de explantes productores de embriones somáticos, el número
de embriones somáticos por
el explante reactivo y el coeficiente de capacidad para producir embriones
somáticos.
Se utilizó microscopía óptica (análisis estructural), transmisión (TEM; análisis
ultraestructural) y microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM; análisis
morfológico) para visualizar los cambios citomorfológicos en los explantes durante
la inducción de SE y el desarrollo somático del embrión. Las observaciones en
microscopía de luz y TEM se realizaron sobre material vegetal fijado en una
mezcla de glutaraldehído al 2,5 % y formaldehído al 2,5 %, embebidos en resina
epoxi (Epon). Se realizaron preparaciones semifinas (2 μm) y ultrafinas (90 nm) en
el Departamento de Botánica de la Universidad de Ciencias de la Vida de Varsovia
(SGGW), donde también se realizó el análisis TEM. La observación en ESEM se
llevó a cabo con vida en material no fijado con el uso de un microscopio ambiental
en el Centro Analítico de la Universidad de Ciencias de la Vida de Varsovia. El
análisis TEM de alta resolución se realizó en el Instituto de Ciencias de los
Materiales de la Universidad
Śląski (UŚ) en Chorzów.
La investigación a nivel fisiológico se llevó a cabo con el uso de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en el Instituto de Fisiología
Vegetal de la Academia Polaca de Ciencias en Cracovia. Se probó el contenido de
hormonas, es decir, auxina (IAA; ácido indolil-3-acético), siete citoquininas
(cis/trans zeatina, cis/trans zeatina ribósido, kinetina, kinetina ribósido, isopentenil
adenina) y ácido abscísico (ABA). También se determinó el nivel de azúcares
endógenos: glucosa, fructosa y sacarosa.
El estudio de la comunicación de simplastos se basó en el uso de fluorocromos de
transporte de simplastos de bajo peso molecular (es decir, fluoresceína y sal
trisódica del ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-sulfónico; HPTS). Los explantes se
trataron con fluorocromo durante 60 min y luego se enjuagaron con agua
desmineralizada para eliminar cualquier fluorocromo no presente en las células. La
viabilidad de los explantes se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio y
azul de Evans.
Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal con un láser de argón
multibanda para excitación de fluorescencia para analizar la distribución de
fluorocromos. Los experimentos se realizaron en el Instituto de Biología,
Biotecnología y Protección Ambiental de la Universidad de Silesia en Katowice.
Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con el uso del software
Statgraphics Plus y STATISTICA versión 6.0. Los resultados se expresan como
medias de un mínimo de 2 réplicas biológicas y desviaciones estándar. Se
utilizaron análisis de varianza unidireccional o multivariante con la prueba de
diferencia mínima significativa de Fisher (Publicación 1, 2, 4) y la prueba T de
Student (Publicación 1, 2). El nivel de significación de todas las pruebas se fijó en
0,05.

7.1. Publicación 1
Grzyb M, Kalandyk A, Waligórski P, Mikuła A (2017) El contenido de hormonas
endógenas y azúcares en el proceso de embriogénesis somática temprana en el
helecho arborescente Cyathea delgadii Sternb. Cultivo de tejidos y órganos de
células vegetales 129: 387-397
SE en C. delgadii, inducida independientemente de los reguladores de crecimiento
exógenos, es un modelo excelente para la investigación de la regulación hormonal
endógena de la morfogénesis in vitro. Los experimentos realizados hasta ahora
con esta especie han demostrado que la etiolación de las plantas donantes es una
condición necesaria para llevar el material inicial al "estado de preparación", y el
factor clave que desencadena la activación del potencial embriogénico es la
escisión del explante. (Mikuła et al. 2015a). El objetivo del estudio fue investigar el
efecto de la etiolación en el nivel de fitohormonas y azúcares presentes en el
material vegetal inicial y determinar los cambios en su contenido durante la
inducción de SE y la etapa temprana de desarrollo de embriones somáticos.
Para el inicio del cultivo se utilizaron fragmentos de pecíolos de 2,5 mm de
esporofitos etiolados y no etiolados. Niveles de hormonas endógenas (es decir,
ácido abscísico (ABA), ácido indolil-3-acético (IAA), citoquinina (CK): cis/trans
zeatina, cis/trans zeatina ribósido, kinetina, kinetina ribósido e isopentenil adenina)
y azúcares (es decir, glucosa , fructosa y sacarosa) se midieron por HPLC. El
análisis cromatográfico se realizó para los explantes iniciales: incapaces
(derivados de esporofitos no etiolados) y capaces (derivados de esporofitos
etiolados) a SE, así como para el material vegetal recolectado cada 2 días durante
un cultivo de inducción de SE de 14 días.
En el explante inicial etilado se encontró: contenido de ABA 12 veces menor,
relación de coeficientes ABA/CK y ABA/IAA mucho menor, y contenido de todos
los azúcares analizados mucho menor que en los explantes no etiolados. El
análisis del explante etiolado sometido a cultivo de 14 días mostró que su escisión
disminuyó el nivel de todas las hormonas analizadas, pero no afectó el equilibrio
entre ellas. Durante el cultivo, las relaciones ABA/CK y ABA/IAA se mantuvieron al
mismo nivel que en el explante inicial. Solo cambió la relación IAA/CK. Los niveles
de citoquinina, excepto el día 6, estaban por encima del nivel de IAA. A partir del
día 10 de cultivo se observó un aumento en el nivel de ribósido de zeatina trans.
Además, se encontró acumulación de hexosas el 4º día de cultivo y 2 días más
tarde un aumento de 12 veces en el nivel de sacarosa.
Los resultados obtenidos prueban que:
1) las condiciones de luz en las que prosperan las plantas donantes afectan
significativamente el nivel y el equilibrio de las hormonas y los azúcares
endógenos;
2) la adquisición de competencia para SE por parte de las células del explante
inicial está estrechamente relacionada con la etiolación de las plantas donantes, lo
que reduce el contenido de ABA y azúcares endógenos y aumenta el nivel de IAA
y CK endógenos;
3) el aumento repentino en el nivel de sacarosa endógena puede ser un factor de
estrés que induce un cambio en el programa de desarrollo de las células
somáticas en los explantes de C. delgadii;
4) las primeras etapas de la iniciación del embrión somático se asocian con la
ventaja de los niveles de CK sobre los IAA, especialmente el ribósido transzeatina,
que puede estar involucrado en la división celular intensiva del embrión
emergente.

7.2. Publicación 2
Grzyb M, Kalandyk A, Mikuła A (2018) Efecto de TIBA, fluridona y ácido salicílico
sobre la embriogénesis somática y el contenido endógeno de hormonas y azúcar
en Cyathea delgadii Sternb. Acta Physiologiae Plantarum 40: 1
El contenido de fitohormonas en las células del explante inicial y su equilibrio
mutuo determinan la reacción en el cultivo in vitro (Jimenez 2005; Fehér 2015). El
objetivo del estudio fue determinar la influencia de los inhibidores del transporte y
la biosíntesis de hormonas en la inducción de SE y la formación de embriones
somáticos y su influencia en el nivel de hormonas endógenas durante el cultivo
inicial de explantes de peciolo de C. delgadii.
Se incubaron fragmentos de 2,5 mm de pecíolos etiolados en medios que
contenían inhibidores de: 1) transporte de auxina (ácido 2,3,5-triyodoico, TIBA; 4-
30 μM), 2) biosíntesis de ABA (fluridona; 1-40 μM) y 3 ) biosíntesis de etileno
(ácido salicílico; 1-125 μM). Tras dos meses de cultivo, se evaluó la eficacia de la
formación de embriones somáticos tras la aplicación de inhibidores individuales. El
nivel de hormonas endógenas y azúcares en el material vegetal recogido cada 2
días durante el cultivo de 10 días se analizó mediante HPLC.
Se ha demostrado que el uso de TIBA 30 μM o fluridona 40 μM o ácido salicílico
125 μM inhibe completamente la formación de embriones somáticos. Estas
sustancias cambian significativamente el nivel de IAA y/o ABA y/o citoquininas
endógenos, así como modifican las proporciones de las hormonas individuales
entre sí. La alteración en el nivel de fitohormonas también resultó en un cambio en
el contenido de azúcares endógenos (glucosa, fructosa, sacarosa). TIBA y
fluridona influyeron significativamente en el contenido de IAA, ABA, CK y
azúcares. El ácido salicílico influyó en el contenido de IAA y azúcares, además
modificó la relación IAA/CK. Todos los inhibidores aumentaron los niveles de
kinetina endógena.
Los resultados obtenidos prueban que:
1) los inhibidores no solo afectan a las hormonas diana, sino que también
modifican el contenido de otras fitohormonas, así como azúcares endógenos;
2) el equilibrio hormonal se altera como resultado del tratamiento con inhibidores
y el contenido de azúcar en los explantes, que impide la redirección del programa
de desarrollo de células somáticas hacia SE e inhibe la formación de embriones
somáticos.
7.3. Publicación 3
Grzyb M, Wróbel-Marek J, Kurczyńska E, Sobczak M, Mikuła A (2020) El
aislamiento simplásmico contribuye a la inducción y el desarrollo de embriones
somáticos en el helecho arborescente Cyathea delgadii Sternb. Fisiología Vegetal
y Celular. Doi: 10.1093 / pcp / pcaa058
El sistema de conexión citoplasmática es una forma rápida y precisa de
intercambio de información entre células, mediante la cual se controlan los
procesos de morfogénesis de las plantas (Marzec y Kurczynska 2014; Otero et al.
2016). El origen epidérmico y unicelular de embriones somáticos de explantes de
peciolo de C. delgadii predestina este objeto experimental para realizar
investigaciones sobre el papel de la comunicación simplástica en el proceso de
SE. El objetivo de este estudio fue demostrar los cambios en la conectividad del
simplasto de las células del explante de la cola durante la inducción de SE y en la
etapa temprana de la formación de embriones de helecho somático C. delgadii.
Para la iniciación del cultivo se utilizaron fragmentos de pecíolos de 2,5 mm
tomados de esporofitos etiolados. Los análisis se llevaron a cabo durante un
cultivo de 21 días. Los explantes iniciales fueron el control. El desplazamiento de
los fluorocromos de transporte de simplastos de bajo peso molecular, es decir, la
sal trisódica del ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-sulfónico (HPTS) y la fluoresceína, se
investigó utilizando un microscopio confocal. El análisis citomorfológico se realizó
mediante microscopía óptica y de transmisión y microscopía electrónica de barrido
ambiental.
Se demostró que en los explantes iniciales de los pecíolos, los fluorocromos
probados se distribuyeron uniformemente en la epidermis y penetraron
profundamente en el explante en 2-3 capas de células corticales. En explantes
sometidos a un cultivo de 6 días, se limitó su flujo entre algunas células
epidérmicas y entre la epidermis y la corteza. Justo antes de las primeras
divisiones que dieron lugar a los embriones somáticos, se observaron una serie de
cambios en la ultraestructura de las células epidérmicas, consistentes en limitar el
tamaño de las vacuolas y aumentar su número, aumentar la densidad del
citoplasma o depositar sustancias electrónicamente densas en la pared celular
Durante la diferenciación somática de los embriones se encontraron limitaciones
en la comunicación simplástica entre el embrión y las células del explante. El
embrión somático, hasta la etapa de la estructura de tres células, era un único
dominio de simplasto en el que los fluorocromos se movían libremente. Otras
divisiones dentro del embrión dieron como resultado la limitación del flujo de
fluorocromo entre sus células, lo que resultó en la formación de cuatro dominios
de simplasto correspondientes a los cuatro segmentos del cuerpo del embrión.
Los resultados obtenidos prueban que:
1) la condición para la liberación de la competencia embriogénica es la limitación
de la comunicación simplástica entre las células del explante correlacionada con la
remodelación de su citoplasma;
2) la comunicación simplástica juega un papel clave en el desarrollo somático del
embrión, mientras que su limitación en la relación entre los cuatro dominios
conduce a la diferenciación de órganos.
7.4. Publicación 4
Grzyb M, Mikuła A (2019) El tipo de explante y el tratamiento de estrés determinan
el origen uni y multicelular de los embriones somáticos en el helecho arborescente
Cyathea delgadii Sternb. Cultivo de células, tejidos y órganos vegetales 136: 221–
230
El material donante que es la fuente de los explantes iniciales y el estrés se
encuentran entre los factores clave que influyen en la respuesta morfogenética de
las plantas con semillas en condiciones de cultivo in vitro (Gaj, 2004; Loyola-
Vargas y Ochoa-Alejo 2016). Debido al pequeño número de especies de plantas
de esporas probadas para SE, los factores responsables de su inducción son poco
conocidos en este grupo de plantas. Por tanto, el estudio analizó la influencia del
tipo de explante, la longitud y el diámetro de la hoja donante, el tratamiento con
soluciones de sacarosa y la desecación con aire sobre el origen de los embriones
somáticos y la eficacia de la SE en helechos C. delgadii.
Para la iniciación del cultivo se utilizaron fragmentos de 2,5 mm de pecíolos (5, 10,
15 o 20 mm de largo y <300 o > 300 μm de diámetro) y fragmentos de entrenudos
(0,5, 1,0, 1,5 de largo); 2,0 o 2,5 mm ) aislado de esporofitos etiolados. Antes de
colocarlos en el medio, algunos explantes se desecaron con aire (con flujo de aire
estéril durante 15, 30, 45 o 60 minutos) o se trataron con soluciones de sacarosa
(0,4; 0,5; 0,6 y 0,7 M durante 15, 30, 45 y 60 minutos). minutos). Los resultados se
visualizaron mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido
ambiental.
La mayor eficiencia de SE se obtuvo en un explante de pecíolo que se tomó de
una hoja de 10 mm de largo y menos de 300 μm de diámetro. Los embriones
somáticos obtenidos en el explante de la cola se iniciaron mediante divisiones de
células epidérmicas individuales y, en el caso de los explantes de entrenudos, se
crearon mediante divisiones simultáneas de muchas células epidérmicas y de la
corteza primaria adyacentes. Aunque las divisiones celulares tuvieron lugar más
intensamente en los entrenudos, resultaron en la formación de un promedio de
solo 3 embriones. La desecación del aire inhibió la SE en los explantes de cola y
aumentó ligeramente el número de embriones somáticos formados en los
explantes de entrenudos (hasta 4). El tratamiento con solución de sacarosa inhibió
la SE en explantes de cola, y en el caso de entrenudos aumentó su efectividad
hasta 4 veces. El análisis microscópico mostró que el aumento en la eficiencia del
proceso SE obtenido en los entrenudos ocurre al cambiar la forma de diferenciar
los embriones somáticos de los embriones multicelulares.
Los resultados obtenidos prueban que:
1) el material donante que es la fuente de los explantes afecta significativamente
la efectividad de la SE;
2) el origen de los embriones somáticos de C. delgadii se correlaciona con el tipo
de explante
utilizado para la iniciación de la cultura;
3) es posible diferenciar embriones somáticos en explantes de entrenudos
controlado por el estrés osmótico exógeno.

8. Resumen de la investigación
Aunque el proceso SE se conoce desde hace más de 60 años, la investigación
presentada en esta disertación es pionera para el helecho, el clado Monilophyte y
el grupo de plantas de esporas. Además, su enfoque en una fase de inducción
definida con precisión, en la que las células somáticas se vuelven embriogénicas,
y en una etapa muy temprana de diferenciación del embrión somático, hace que
los resultados obtenidos también sean una contribución significativa para
comprender a los investigadores más fascinantes de la etapa temprana de SE.
La realización de investigaciones con el uso de un modelo experimental que no
requiere el uso de PGR permitió un estudio y descripción precisos por primera vez
en el mundo de los cambios endógenos de hormonas y azúcares que ocurren en
la fase de inducción y en la fase temprana de la directa. fase de expresión SE. La
imagen obtenida de la respuesta morfogenética del explante, provocada
únicamente por su escisión de la planta donante, arroja nueva luz sobre la
reacción de sus células. Vale la pena enfatizar que la escisión del explante
precede al inicio de la mayoría de los cultivos de plantas, sin embargo, la reacción
a este estrés es tomada en cuenta esporádicamente en el estudio de los
fundamentos de SE. El extenso análisis con el uso de inhibidores de la biosíntesis
y el transporte de hormonas, que se llevó a cabo en la disertación, mostró
relaciones e interacciones complicadas entre diferentes clases de hormonas y
azúcares, lo que demuestra que el equilibrio endógeno perturbado de estos
compuestos en los explantes hace que sea imposible redirigir el programa de
desarrollo de células somáticas hacia SE. Los resultados presentados por primera
vez también presentan un análisis de cambios en la comunicación simplástica en
helechos SE y prueban que también en el grupo de plantas de esporas, la
conectividad entre las células involucradas en la transición embriogénica es
extremadamente importante. El modelo experimental de C. delgadii basado en el
origen epidérmico unicelular de los embriones permitió estudiar la comunicación
simplástica en una etapa muy temprana de SE y rastrear el movimiento de
fluorocromos en un embrión somático de varias células, que hasta ahora ( debido
a la falta de un sistema experimental apropiado) era prácticamente imposible. El
conocimiento obtenido en el campo de los factores inductores de SE, incluido el
papel de la etiolación de las plantas donantes, puede ampliar el uso práctico de
este proceso, por ejemplo, en plantas, donde normalmente es difícil iniciar esta vía
de regeneración altamente eficaz.
Los resultados obtenidos permitieron:
1. demostrar que el equilibrio hormonal en el explante etiulado inicial tomado de la
planta donante es la base para que sus células adquieran capacidad
embriogénica, y que el inicio del programa SE está estrechamente relacionado con
la extirpación del explante y la subsiguiente cambios drásticos en el nivel de
sacarosa endógena;
2. documentar que la limitación de la comunicación simplástica es uno de los
primeros síntomas de la adquisición de la competencia embriogénica y una
condición clave para el desarrollo somático del embrión;
3. desarrollo de un nuevo sistema experimental de C. delgadii basado en el origen
multicelular directo de embriones somáticos del explante del entrenudo; y métodos
para controlar su eficacia modificando la ruta de iniciación del embrión;

4. ampliar el conocimiento de los helechos SE y el sistema modelo de helechos;

5. demostrar que el sistema experimental C. delgadii puede tener éxito
utilizado para complementar el conocimiento básico del proceso de SE.
Así, se confirmó la hipótesis de que la base de la producción embriogénica
por explantes de C. delgadii, existe un equilibrio hormonal endógeno adecuado y
la entrada de células somáticas individuales en la vía SE está regulada por la
restricción de la comunicación simplástica entre las células del explante.
9. Planes de investigación adicionales
Dos modelos independientes de inducción de SE en C. delgadii (a partir de células
individuales del explante de la cola o de múltiples células del explante del
entrenudo) y la posibilidad de manipulación a través de la formación de embriones
somáticos proporcionan una excelente plataforma de investigación para
comprender el mecanismo de SE inducción. Otros experimentos se centrarán en
determinar la base de una vía diferente de diferenciación de embriones somáticos,
derivada de los explantes de las colas y los entrenudos. La inspiración para
realizar estudios comparativos multifacéticos de ambos explantes es el deseo de
probar la tesis planteada en 1985 por Maheswaran y Williams de que la forma de
diferenciación del embrión somático depende de la edad del explante inicial y de la
capacidad de sus células para interactuar entre sí. otro.
Debido al papel clave demostrado de la comunicación simplástica en la inducción
de SE y el desarrollo somático del embrión, la investigación se extenderá al
análisis de la morfología y composición de la pared celular. Se supone que los
cambios en las propiedades de la pared celular durante el inicio de SE pueden ser
un marcador de diferenciación celular. Se prestará especial atención a la
documentación de la presencia y distribución de plasmodesmos en las paredes
celulares del explante, así como a la evaluación de su permeabilidad y actividad
biológica. Para determinar cualitativamente los cambios se realizará un análisis
inmunohistoquímico de los componentes que construyen las paredes de las
células de los explantes iniciales, así como durante su cultivo in vitro. El análisis
de los parámetros anteriores permitirá el marcaje de células con y sin capacidad
SE en la epidermis del explante, antes de que aparezcan las primeras divisiones
celulares que dan lugar a la formación de embriones somáticos. Las células
marcadas de esta manera pueden someterse a análisis comparativos precisos.
Por lo tanto, el próximo paso a dar será el análisis del transcriptoma dirigido a
identificar genes expresados diferencialmente en células de explante únicas,
embriogénicas y no embriogénicas. Este enfoque permitirá el seguimiento de la
reorganización del transcriptoma sin ser perturbado por reguladores exógenos
durante la transición de las células vegetales somáticas al estado embriogénico.
Un amplio espectro de investigaciones planificadas utilizando el carácter único de
los modelos de inducción SE desarrollados en C. delgadii puede proporcionar una
respuesta a la pregunta de cómo una sola célula somática cambia su programa de
desarrollo y se convierte en una planta completa en el futuro. Esta investigación
también abrirá la posibilidad de rastrear la evolución de los genes involucrados en
el proceso SE específico de la planta.