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Filtración de flujo cruzado

Manual de métodos
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Tabla de contenido
Tabla de contenido
1 Introducción ................................................. .................................................... ....... 5
1.1 ¿Qué es la filtración de flujo cruzado? .................................................... .................................................... ....... 6
1.2 Características clave de CFF ............................................... .................................................... ............................... 7
1.3 Áreas de aplicación de CFF ............................................... .................................................... ......................... 8
2 Sistemas de filtración de flujo cruzado ............................................. ............................... 9

2.1 Configuración del sistema ............................................... .................................................... ......................... 10
2.2 Filtros para filtración tangencial ............................................... .................................................... ............ 12
2.3 Volúmenes del sistema y capacidad de proceso ............................................... .......................................... 14
2.4 Sistemas de GE ............................................... .................................................... .................................... 15
3 Diseño y operación del proceso .................................................. ............................. dieciséis
3.1 Consideraciones del proceso ............................................... .................................................... ..................... 17

3.2 Selección de filtro .............................................. .................................................... ............................................. 19
3.3 Preparación del filtro .............................................. .................................................... .................................. 21
3.4 Parámetros de funcionamiento ............................................. .................................................... ...................... 23
3.5 Recuperación del producto ............................................... .................................................... ............................ 26
3.6 Limpieza y prueba de filtros ............................................... .................................................... ............... 28
3.7 Ampliación de los procesos ............................................... .................................................... .......................... 32
4 Optimización de procesos CFF ............................................... .................................... 33

4.1 Optimización de los parámetros del proceso ............................................... .................................................... .... 34
4.2 Optimización del rendimiento ............................................... .................................................... ..................................... 40
5 Recolección de células .................................................. .................................................... .... 42

5.1 Introducción .................................................. .................................................... .......................................... 43
5.2 Proceso de recolección de células .............................................. .................................................... ...................... 44
5.3 Selección de membrana y cartucho ............................................... .......................................................... 47
5.4 Parámetros de funcionamiento .............................................. .................................................... ...................... 49
6 Clarificación de células y lisados ............................................... .................................... 52

6.1 Introducción .................................................. .................................................... .......................................... 53
6.2 Selección de membrana y cartucho ............................................... .......................................................... 56
6.3 Parámetros de funcionamiento .............................................. .................................................... ...................... 58
6.4 Ejemplos de estrategias de aclaración ............................................... .................................................... ..... 59
6.4.1 Células mamíferas ................................................ .................................................... .......................... Células 60
6.4.2 bacterianas ...................... .................................................... .................................................... ......... 62
6.4.3 Levadura ........................................ .................................................... .................................................... ........ 64
7 Concentración y diafiltración ............................................................... ......................... 66

7.1 Introducción .................................................. .................................................... .......................................... 67
7.2 Consideraciones sobre productos y procesos ............................................... ............................................................. 69
Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB 3

Tabla de contenido
7.3 Selección de membrana ............................................... .................................................... .......................... 72
Apéndice A Abreviaturas y glosario ............................................... ................ 73

Índice .................................................. .................................................... ..................... 79
4 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

1. Introducción
1. Introducción
Acerca de este manual

El Manual del método de filtración de flujo cruzado brinda una introducción general a los principios
y aplicaciones de la filtración de flujo cruzado utilizando sistemas y filtros de GE. Con cada filtro se
proporcionan instrucciones detalladas para preparar, usar, limpiar y almacenar filtros particulares.
Acerca de este capítulo

Este capítulo presenta los principios, la terminología básica y las aplicaciones de la filtración de flujo
cruzado.
En este capítulo
Este capítulo contiene las siguientes secciones:
Sección Ver página
1.1 ¿Qué es la filtración de flujo cruzado? 6
1.2 Características clave de CFF 7
1.3 Áreas de aplicación de CFF 8

1. Introducción
1.1 ¿Qué es la filtración de flujo cruzado?
1.1 ¿Qué es la filtración de flujo cruzado?

Filtración de flujo cruzado(CFF, también conocido comofiltración de flujo tangencialTFF) es una técnica
de filtración en la que la solución de partida pasa tangencialmente a lo largo de la superficie del filtro. Una
diferencia de presión a través del filtro impulsa componentes que son más pequeños que los poros a
través del filtro. Los componentes más grandes que los poros del filtro se retienen y pasan a lo largo de la
superficie de la membrana, fluyendo de regreso al depósito de alimentación (verFigura 1.1). CFF es simple
en concepto, pero su correcta ejecución requiere un conocimiento detallado y una buena técnica de
filtración.
Figura 1.1: Principio de filtración de flujo cruzado.
La solución que se dirige a la superficie de la membrana se llamaalimento. La solución que pasa a lo largo
de la superficie de la membrana y regresa al depósito de alimentación es laretenido. Esta solución
generalmente se bombea de regreso al depósito de alimentación y se recircula. La solución que atraviesa
la membrana es laimpregnar.
Otros términos utilizados en CFF se explican enApéndice A Abreviaturas y glosario, en la página

73.

1. Introducción
1.2 Características clave de CFF
1.2 Características clave de CFF
Características
Una característica clave de CFF es el flujo de fluido a lo largo de la superficie de la membrana que barre la
acumulación de material en la superficie del filtro y reduce el ensuciamiento del filtro. Además, la solución
de retenido se puede recircular fácilmente, lo que permite un procesamiento completo de grandes
volúmenes de solución.
Diferencias entre CFF y

filtración de flujo normal
CFF difiere de la filtración de flujo normal (donde el material de partida simplemente pasa a través de los
filtros, también conocido comofiltración sin salidaofiltración de flujo directo) de tres maneras
principales:
• Los filtros CFF usan membranas exclusivamente, mientras que la filtración convencional puede usar membranas,
papel u otros materiales como fibra de vidrio para separar los componentes en una corriente de alimentación.
• CFF admite la recirculación de la solución de retenido. En la filtración de flujo normal, la

alimentación suele pasar una vez por el filtro.
• En un sistema CFF, el retenido permanece como una solución y puede recuperarse directamente. La
recuperación del retenido es relativamente poco común en la filtración de flujo normal y requiere la
resuspensión del material recolectado en el filtro.

1. Introducción
1.3 Áreas de aplicación de CFF
1.3 Áreas de aplicación de CFF

CFF se utiliza en investigación, desarrollo de productos y producción en las industrias médica
y biofarmacéutica.
Tabla 1.1resume las características de las aplicaciones típicas de CFF.
Tabla 1.1: Usos típicos de la filtración de flujo cruzado.
Solicitud Comentarios Utilizado en
Recolección de células Separación de células del caldo de fermentación. Procesamiento ascendente
Las células se recuperan en el retenido.
Clarificación de células o Separación de moléculas diana de células intactas,

lisados restos celulares y agregados moleculares.
Las moléculas diana se recuperan en el

permeado.
fraccionamiento de productos Separación de componentes en base al Procesamiento en bajada

tamaño molecular.
concentración de producto Concentración de la solución del producto antes del Procesamiento en bajada
ción procesamiento posterior mediante la eliminación del solvente y
formulación del producto
las moléculas pequeñas.
El producto se recupera en el retenido.
Diafiltración Intercambio de tampones.
El producto se recupera en el retenido.
Los documentos que describen algunos ejemplos de aplicaciones CFF están disponibles en GE.

2 sistemas de filtración de flujo cruzado

Este capítulo describe los componentes esenciales de los sistemas CFF y presenta los sistemas de
GE.
En este capítulo
2.1 Configuración del sistema 10
2.2 Filtros para filtración tangencial 12
2.3 Volúmenes del sistema y capacidad de proceso 14
2.4 Sistemas de GE 15

2.1 Configuración del sistema

La siguiente ilustración muestra un esquema generalizado para la configuración básica de un sistema CFF.
Tampón para diafiltración (opcional)
Presión
medir
Filtrar
PAGS
Alimento
reservorio
retenido
Impregnar
Alimento
Válvula
PAGS
bomba Alimento
Fuga Recopilación
línea buque
Figura 2.1: Configuración básica de un sistema CFF.
bomba ps y valvulas
El flujo de líquido en el sistema es mantenido por una o más bombas en las líneas de proceso (solo se muestra la
bomba de alimentación en la figura).Figura 2.1) :
• ABomba de alimentaciónmantiene la f bajo de alimentar al filtro.
• Abomba de retenidopodemos ser nosotros el Ed a mantener y controlar el flujo de retenido de regreso a

depósito de alimentación.
• Abomba de permeadopuede ser una Ed a controlar el flujo de permeado del filtro. La presión
bomba de carne, si se usa, si el filtrono cr negativa del permeado en el lado del permeado debe
(es decir, el flujo de la bomba r comió m ser menor que el flujo de permeado espontáneo).

• Abomba de transferenciase puede usar en aplicaciones de lavado y diafiltración para agregar líquido
(generalmente tampón) al depósito de alimentación a una velocidad controlada.
El flujo en las diversas líneas de proceso también puede regularse mediante válvulas con limitadores de
flujo. Juntos, las tasas de bombeo controladas y la restricción de la válvula crean la presión a través de la
membrana que impulsa el proceso de filtración.
Sensores de presión
Los sensores de presión en las líneas de alimentación y retenido son esenciales para monitorear y
controlar el proceso. También se puede usar un sensor de presión en el lado del permeado para
monitorear la presión del permeado.
Sensores de flujo
La medición de las tasas de flujo para la solución de alimentación, el retenido y/o el permeado y cualquier adición
de fluido al depósito de alimentación es necesaria para monitorear y controlar las condiciones del proceso durante
la filtración. Los sensores de flujo se colocan en puntos estratégicos del sistema.
Sensores de nivel de depósito

Un sensor de nivel en el depósito de alimentación monitorea y controla la cantidad de líquido en el
depósito.
Sensores de aire
Un sensor de aire ubicado en la corriente de alimentación permite el control continuo de las burbujas de aire en la
alimentación y evita la introducción de aire en el filtro. También se puede usar un sensor de aire en la línea de
transferencia para detectar cuándo el depósito de transferencia está vacío.
Sensores adicionales
Se pueden incluir sensores de temperatura, pH, absorbancia UV y conductividad en el
sistema de acuerdo con los requisitos del proceso específico.

2.2 Filtros para filtración tangencial

Los filtros para CFF se pueden clasificar según la configuración del filtro o el tamaño del poro del filtro.
Configuración del filtro

Por lo general, se utilizan dos configuraciones básicas de filtro (verFigura 2.2):
retenido
Membrana
Cartucho
(fibra hueca)
Alimento
Impregnar
Impregnar
Membrana
retenido
Casete
Impregnar
Impregnar
Alimento
Pantalla Impregnar
Figura 2.2: Configuración de cartuchos de fibra hueca y cassettes de hoja plana.
• Enfiltros de cartucho(llamado a menudofiltros de fibra hueca), la membrana forma un conjunto de

fibras huecas paralelas. La corriente de alimentación pasa a través del lumen de las fibras y el
permeado se recoge desde el exterior de las fibras. Los cartuchos se caracterizan en términos de
longitud de fibra, diámetro del lumen y número de fibras, así como tamaño de poro del filtro. Los
cartuchos de GE tienen longitudes de 30 a 110 cm y diámetros de luz de 0,5 a 1,75 mm.
• Enfiltros de casete, varias láminas planas de membrana se mantienen separadas entre sí y del
alojamiento del casete mediante pantallas de soporte. La corriente de alimentación pasa al espacio
entre dos láminas y el permeado se recoge del lado opuesto de las láminas. Los casetes se
caracterizan en términos de la longitud de la trayectoria del flujo y la altura del canal, así como el
tamaño de los poros de la membrana. La altura del canal está determinada por el grosor de la pantalla
de soporte.
Tanto los cartuchos como los casetes están fabricados con materiales elegidos por su
resistencia mecánica, compatibilidad química y física y bajos niveles de compuestos
extraíbles y/o tóxicos.
El área de superficie total de la membrana es uno de los factores que determinan la cantidad de alimentación que se puede
manejar en una ejecución del proceso. Los valores típicos para la selección de filtros por área de superficie de membrana son
los siguientes:
• Para microfiltración, 30 a 100 litros de alimentación por m2 de superficie de membrana

• Para ultrafiltración, 100 a 200 litros de alimentación por m2 de superficie de membrana
Tamaño de poro del filtro
Se distinguen dos clases de filtros en función del tamaño del poro del filtro, que también
distingue entre áreas de aplicación. En ambos casos, el tamaño de poro se expresa como
valor medio. El rango de tamaños de poro reales en un filtro dado determina la selectividad
del filtro.
Filtros de microfiltración
Los filtros con tamaños de poro de 0,1 μm y mayores se clasifican como microfiltros. En las aplicaciones
CFF, el tamaño de los poros suele estar en el rango de 0,1 a 1 μm. Estas membranas se utilizan para la
separación de células cultivadas del medio de cultivo (caldo), así como para la eliminación de partículas en
numerosos procesos biofarmacéuticos.
Filtros de ultrafiltración
Las membranas de ultrafiltración tienen tamaños de poro en el rango de 20 a 100 nm, y generalmente se
caracterizan en términos delímite de peso molecular nominal(NMWC), que es el peso molecular de la
proteína globular más grande que puede atravesar la membrana. Los valores de NMWC varían de 1 a 100
kD (kiloDalton). Estos filtros se utilizan para concentrar y fraccionar flujos de proteínas, concentración de
virus, desalinización e intercambio de tampones. El objetivo de la mayoría de los procesos de ultrafiltración
es retener macromoléculas solubles, como proteínas, por encima de un cierto tamaño, mientras que
permite que moléculas más pequeñas, como sales, aminoácidos y monosacáridos o disacáridos, pasen a
través de la membrana.
Filtros de GE
GE suministra cartuchos para microfiltración y ultrafiltración, y cassettes para ultrafiltración. La elección del
tipo de filtro a utilizar para una aplicación determinada se basa en primer lugar en los requisitos de
filtración: por lo tanto, los cartuchos se pueden utilizar para todas las aplicaciones, mientras que los
casetes son adecuados para manipular proteínas.
VerSección 3.2 Selección de filtro, en la página 19para obtener pautas más detalladas sobre la selección de
filtros. Información adicional está disponible de GE.

2.3 Volúmenes del sistema y capacidad de proceso
2.3 Volúmenes del sistema y capacidad de proceso
Volumen mínimo de trabajo

El volumen de trabajo mínimo de un sistema CFF representa la cantidad de fluido de alimentación/
retenido requerido para operar el sistema a la tasa de flujo transversal deseada sin aspirar aire a la
bomba de alimentación. El volumen de trabajo mínimo está determinado por el diseño del sistema
(volumen de tubería de alimentación y retenido, diseño del fondo del depósito), el volumen de
retención del filtro y la tasa de flujo cruzado. Es importante considerar el volumen de trabajo
mínimo de un sistema en el diseño de un proceso CFF y, en particular, confirmar que el volumen de
retenido objetivo final no sea inferior al volumen de trabajo mínimo del sistema.
Volumen de retención
El términovolumen de retenciónse refiere al volumen de líquido en el sistema de filtración. Para

algunos propósitos, es útil distinguir entre losvolumen de retención del filtro(el volumen en el
propio filtro) y elvolumen de retención del sistema(el volumen en las tuberías y bombas del
sistema). El filtro y el sistema deben elegirse con el volumen de retención más pequeño que sea
compatible con otros requisitos de rendimiento en el proceso.
Capacidad de proceso
La capacidad de proceso del sistema (el volumen de material inicial que se puede procesar en una
ejecución) debe elegirse en relación con el volumen planificado de material inicial. La capacidad del
proceso es en parte una función del tamaño y diseño del sistema, pero también varía según la
tendencia del material de partida a ensuciar el filtro. El uso de un sistema de alta capacidad para un
volumen de muestra pequeño dará lugar a una pérdida innecesaria de material en el volumen
muerto del sistema. Para procesos que serán escalados para producción, será necesario cambiar
entre diferentes sistemas una o más veces durante el desarrollo del proceso (verTabla 2.1). Los
procesos CFF que utilizan sistemas de GE son escalables, lo que facilita las transiciones entre
sistemas.

2.4 Sistemas de GE
2.4 Sistemas de GE
Los sistemas CFF de GE cubren una gama completa de capacidad de filtración desde la investigación de laboratorio
hasta la producción, y ofrecen diferentes niveles de monitoreo y control, desde sistemas manuales hasta
totalmente automatizados. También se pueden proporcionar sistemas personalizados.
Tabla 2.1resume las características de los sistemas disponibles. Información adicional, incluida la
matriz de aplicación del sistema y las guías de selección, está disponible en GE.
Tabla 2.1: Sistemas de filtración de flujo cruzado de GE.
Sistema Escala Aplicaciones
ÄKTACrossflow™ Laboratorio Investigar

Proceso de desarrollo
fundente ÄKTA™ Laboratorio a piloto Investigar

Proceso de desarrollo
Producción a pequeña escala
UniFlux™ Piloto a producción Fabricación

3 Diseño y operación de procesos

Este capítulo describe el diseño y la operación de un proceso CFF.
En este capítulo
3.1 Consideraciones del proceso 17
3.2 Selección de filtros 19
3.3 Preparación del filtro 21
3.4 Parámetros de funcionamiento 23
3.5 Recuperación del producto 26
3.6 Limpieza y prueba de filtros 28
3.7 Ampliación de procesos 32
dieciséis Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

3.1 Consideraciones del proceso

Varios factores influyen en el diseño de un proceso. Entre las más importantes se encuentran las
propiedades del material de partida (alimentación) y el producto, y el tiempo total requerido para el
proceso. Otros factores como el rendimiento y la concentración del producto también pueden ser críticos.
A veces, los factores pueden ser mutuamente excluyentes y se debe llegar a un compromiso: por ejemplo,
puede que no sea posible combinar el rendimiento máximo con la concentración máxima del producto.
Propiedades del pienso y del producto
La siguiente tabla enumera algunas de las principales propiedades del pienso y del producto que deben
tenerse en cuenta.
Propiedad Significado
Composición del pienso La composición de la alimentación afecta la tendencia al ensuciamiento del
filtro (verTamaño de poro del filtro, en la página 20), lo que a su vez influye en
la capacidad de procesamiento del sistema.
Pienso y producto Asegúrese de que el diseño de proceso elegido pueda manejar tanto el
volumen volumen de alimentación inicial como el volumen objetivo.
Sensor de temperatura El aumento de la viscosidad a temperaturas más bajas puede limitar las
actividad condiciones de flujo del proceso.
Sensibilidad al cizallamiento El esfuerzo cortante puede ser considerable a caudales altos, y la

estrés sensibilidad al esfuerzo cortante puede limitar los caudales utilizables.
Solubilidad Tenga en cuenta que las concentraciones cercanas a la membrana pueden ser
significativamente más altas que las concentraciones objetivo o de alimentación
(verGradiente de concentración y capa de gel, en la página 34).
Viscosidad Asegúrese de que el diseño del proceso pueda manejar la viscosidad de

las corrientes de alimentación, retenido y permeado, así como cualquier
aumento en la viscosidad que resulte del aumento local de la
concentración de material en la superficie de la membrana.
Requisitos de tiempo
Los requisitos de tiempo para completar una ejecución de CFF variarán ampliamente según la
aplicación, los requisitos y las características del sistema, y pueden ser un factor crucial para la
economía del proceso, así como para la estabilidad del producto. Como indicación general, el
tiempo total requerido para una ejecución típica oscila entre 3 y 8 horas, incluidas la preparación y
limpieza del sistema.
• preparación del filtro y el sistema para el procesamiento (hasta 2 h)

• realizar el proceso de filtración (según la aplicación)

• limpieza y lavado del sistema y el filtro para almacenamiento (hasta 2 h)
Otras Consideraciones
Otros factores importantes en el diseño de un proceso CFF incluyen:
• Rendimiento del producto: ¿qué tan importante es maximizar el rendimiento del producto?
• Concentración del producto: ¿Qué tan importante es obtener un producto a una alta concentración?
• Selectividad: ¿qué importancia tiene la pureza del producto?
• Estabilidad del filtro a largo plazo: ¿cuál es la vida útil del filtro en condiciones de proceso?
• Procesamiento posterior: ¿cómo se utilizará el producto en el próximo paso de procesamiento?

3.2 Selección de filtros

La elección del filtro entre microfiltración y ultrafiltración y entre cartuchos y
cassettes se rige por la naturaleza de la aplicación.
Solicitud Principio de separación Técnica y

filtrar
Recolección de células Las células se separan de las moléculas Microfiltración

solubles. (cartucho)
Clarificación de células o Las células y los desechos celulares se separan de

lisados las moléculas solubles.
Fraccionamiento de proteínas Las macromoléculas se separan en función Ultrafiltración

del tamaño. (cartucho o
casete)
Concentración y Las macromoléculas se separan de los
diafiltración componentes tampón de bajo peso molecular.
Dentro de ese marco, los filtros se eligen teniendo en cuenta la selectividad, el tamaño de poro del filtro
y la unión a proteínas.
Selectividad de filtro
La selectividad del filtro describe la capacidad de un filtro para separar partículas o especies moleculares en función del
tamaño. Los filtros con una distribución de tamaño de poro estrecha serán altamente selectivos, mientras que una
distribución de tamaño de poro más amplia dará como resultado un filtro menos selectivo.
Las aplicaciones de recolección y clarificación celular implican la separación de partículas relativamente

grandes (células y/o residuos celulares) de macromoléculas, por lo que generalmente no se requiere una
alta selectividad. La clarificación del lisado, por otro lado, puede tener demandas más estrictas, ya que el
lisado contendrá una amplia gama de proteínas y otras macromoléculas. El factor más importante es que
la proteína objetivo pueda pasar libremente a través del filtro para que los rendimientos no se vean
comprometidos.
La selectividad del filtro tampoco es crítica para la diafiltración, donde un producto macromolecular
se separa de los componentes del tampón. El factor de control aquí es que el filtro retiene
completamente la proteína objetivo, de modo que el producto no se pierde en el permeado. Por lo
general, se recomienda un filtro de ultrafiltración con un límite de peso molecular nominal (NMWC)
de 3 a 5 veces menor que el peso molecular de la molécula objetivo.

Tamaño de poro del filtro
Todos los filtros tenderán a ensuciarse (bloquearse por material particulado que se acumula en los poros del filtro),
especialmente durante aplicaciones como la clarificación de lisado que involucra material de partida particulado. El
ensuciamiento acortará el tiempo durante el cual se puede usar un filtro antes de que deba limpiarse y, por lo tanto,
restringirá la capacidad máxima de procesamiento por ejecución. La elección del tamaño de poro del filtro es
importante para minimizar el ensuciamiento del filtro. En general, los filtros con poros más pequeños mostrarán
menos tendencia a ensuciarse, porque el material particulado no puede penetrar y bloquear los poros.
Utilice las pautas de la siguiente tabla para seleccionar filtros para aplicaciones de recolección y
clarificación:
Solicitud Tamaño de poro del filtro
Recolección de células de mamíferos 0,2 a 0,65 micras
Recolección de células de levadura y bacterias 0,1 micras
Aclaración de células y lisados NMWC alrededor de 10 veces el tamaño de la molécula objetivo
Enlace proteico
El nivel de unión a proteínas depende del material del filtro y de las características de las proteínas, y
aumenta con el aumento de la hidrofobicidad. La unión a proteínas se ve como una reducción en el
rendimiento que no se explica por el producto que permanece en el retenido. Normalmente, la unión a
proteínas sigue siendo insignificante a escala de laboratorio, pero para membranas de ultrafiltración de
bajo NMWC puede ser un indicador de una propensión al ensuciamiento del filtro.
Tanto para aplicaciones de clarificación como de diafiltración, la unión de proteínas al filtro suele
convertirse en un problema cuando se intenta procesar pequeñas cantidades de proteína. En tales
casos, es importante seleccionar un filtro con baja tendencia de unión a la proteína objetivo y elegir
condiciones de tampón que minimicen la unión.

3.3 Preparación del filtro

La preparación de filtros para un proceso implica enjuagar para eliminar la solución de almacenamiento y
acondicionar el filtro con tampón de proceso. Para algunos procesos, es posible que sea necesario desinfectar y
despirogenizar el filtro antes de usarlo. Esta sección ofrece una breve descripción de los procedimientos de
preparación. Se proporcionan más detalles en las instrucciones que acompañan a cada filtro.
Higienización y despirogenización
Siga los pasos a continuación para desinfectar y despirogenizar el filtro si es necesario.
Paso Acción
1 Limpie y enjuague bien el filtro.
2 Recircule una solución de NaOH de 0,1 a 0,5 M (pH 13) durante 30 a 60 minutos a una temperatura de 30 °C
a 50 °C.
3 Drene el sistema a fondo.
4 Enjuague el filtro con agua limpia durante 30 minutos.
Enjuague
Los filtros de ultrafiltración nuevos se suministran llenos de una solución de glicerol que debe retirarse del
filtro antes de su uso. Remojar el filtro en etanol al 25 % o alcohol isopropílico durante 1 hora antes de
enjuagarlo mejorará la eliminación del glicerol. La eliminación completa del glicerol es importante para los
filtros que se autoclavarán o esterilizarán mediante procedimientos de vapor in situ.
También se recomienda enjuagar los filtros usados para eliminar la solución de almacenamiento. Los pasos de enjuague se
describen a continuación. Se proporcionan instrucciones detalladas con los filtros.
Paso Acción
1 Llene el depósito de alimentación con agua desionizada o agua para inyección (WFI). Use
temperatura ambiente o temperaturas de hasta 50°C. El agua fría será menos efectiva. La
adición de 100 ppm de hipoclorito de sodio (NaOCl) al agua de enjuague mejorará la
eliminación del glicerol.
2 Arranque la bomba a baja velocidad y ajuste la TMP a
• 1 bar (15 psi) para filtros de 1000 a 3000 NMWC
• 0,7 bar (10 psi) para filtros de 5000 a 50 000 NMWC
• 0,3 bar (4 psi) para tamaños de poro más grandes

Paso Acción
3 Para reducir el consumo de agua, ajuste la velocidad de la bomba y la contrapresión del retenido de
modo que el flujo del retenido sea aproximadamente una décima parte del flujo del permeado.
4 Enjuague con 50 L de agua por m2 de superficie de membrana, agregando más agua según sea
necesario.
5 Si se usa NaOCl, enjuague bien el filtro antes de introducir la solución de

proceso.
Acondicionamiento
Antes de procesar las muestras, se recomienda preacondicionar el sistema con un tampón similar
en pH y fuerza iónica a la de la muestra para evitar la desnaturalización y la precipitación de
proteínas. Acondicionar el sistema también ayuda a eliminar el aire atrapado.
Los pasos de acondicionamiento se describen a continuación. Se proporcionan instrucciones detalladas con los filtros.
Paso Acción
1 Haga circular el tampón a través del sistema con una presión de retenido de aproximadamente 0,3
a 1 bar (4 a 15 psi). Ejecute hasta que no aparezcan burbujas en la corriente de permeado.
2 Para garantizar la eliminación del aire atrapado, aumente el caudal de retenido y haga funcionar
durante varios minutos hasta que no aparezcan burbujas en el flujo de retenido.
3 Haga circular el tampón a través del retenido y permee a una presión de alimentación de
1,6 a 2,8 bar (25 a 40 psi) durante cuatro minutos para acondicionar el sistema en cuanto a
pH y estabilidad iónica.
4 Retire el tampón del depósito de alimentación. Mantenga un amortiguador en otras partes

del sistema para evitar que entre aire en el sistema.

3.4 Parámetros de funcionamiento

Un proceso CFF puede controlarse mediante una interacción de varios parámetros operativos de acuerdo
con los requisitos específicos del proceso. Los parámetros más importantes son
• Presión en varios puntos del sistema

• Caudal en varios puntos del sistema
• Tiempo de procesamiento
Presión y caudales
La presión del líquido y las tasas de flujo son factores esenciales para controlar y monitorear un proceso
CFF.
Presión
La presión puede controlarse en la corriente de alimentación, la corriente de retenido o la corriente
de permeado. Generalmente se utilizan dos mediciones de presión diferencial, ΔP y presión
transmembrana (TMP).
• ΔP es la diferencia de presión entre las corrientes de alimentación y retenido, y se puede utilizar

para controlar el flujo cruzado.
∆P = Presión de alimentación – Presión de retenido
• TMP representa la fuerza motriz para la transferencia de material a través del filtro y se calcula como se
muestra a continuación. TMP se puede utilizar para controlar el flujo.
Presión de alimentación + Presión de retenido – Presión de permeado

PTM =
2
Caudales
Los caudales pueden ser monitoreados en varios puntos. La suma de las tasas de flujo que salen del filtro
en los lados de retenido y permeado es igual a la tasa de flujo de alimentación al filtro. La velocidad de flujo
del retenido también se conoce comocaudal cruzadootasa de recirculación. La tasa de flujo de permeado
(la tasa de flujo de líquido a través de la membrana del filtro) se conoce como flujo.
El flujo se expresa comúnmente en unidades de litros por m2 de membrana por hora (LMH). Este valor es
escalable, lo que significa que se puede mantener constante cuando se amplía el proceso.
Para los filtros de fibra hueca, la tasa de flujo cruzado a través del lumen de la fibra se expresa a
menudo como latasa de corte1 en unidades de s-1, que es función del caudal por fibra y del
diámetro del lumen de la fibra.
La tasa de corte se calcula como:
1 No confunda la velocidad de corte con el esfuerzo de corte. El esfuerzo cortante es la fuerza que puede alterar las células o desnaturalizar las
proteínas en condiciones de flujo rápido. La tasa de corte es una tasa de flujo de líquido que influye pero no es equivalente a la tensión de corte.

y = 4q/πR3
Ecuación (1)
Vari- Descripción
poder
y tasa de corte (s-1)
q caudal volumétrico a través del lumen de la fibra, cm3/s por fibra
R radio de fibra (cm)
Expresar la tasa de flujo cruzado como tasa de corte hace posible escalar hacia arriba o hacia abajo entre
cartuchos. Mediante el uso de un gráfico de referencia de corte, es posible aproximar la tasa de flujo que
producirá la misma tasa de corte en la nueva escala.
Las tasas de cizallamiento no se usan comúnmente para casetes ya que el cálculo se complica por
la influencia de la pantalla de soporte. El cálculo de las tasas de corte para cassettes está más allá
del alcance de este manual.
Modos de control de procesos
Los sistemas CFF de GE que se ejecutan con el software UNICORN™ admiten los modos de control de procesos
comúnmente utilizados en aplicaciones de microfiltración y ultrafiltración/diafiltración, como el control de TMP y el
control de flujo. Estos modos de control se pueden combinar con instrucciones seleccionables de la bomba de
alimentación, como caudal de alimentación, presión de alimentación, ΔP, caudal de retenido o tasa de corte.
Modo de control TMP
En este modo, la TMP es controlada principalmente por la válvula de control de retenido, ajustando la válvula para
mantener una TMP constante. Se permite que el flujo varíe, generalmente dentro de los límites especificados.
El control de TMP generalmente se usa en ultrafiltración donde el sistema fuerza el retenido a través de los poros
relativamente pequeños de la membrana. El modo de control TMP se usa principalmente con flujo de alimentación
constante, flujo de retenido constante o ΔP constante.
Modo de control de flujo
En este modo, el flujo se mantiene a una velocidad controlada mediante la regulación del flujo de alimentación o
retenido y permeado. Se permite que el TMP varíe si es necesario, generalmente dentro de los límites
especificados.

El control de flujo generalmente se usa en microfiltración donde el sistema limita el flujo de permeado a
través de los poros relativamente grandes de la membrana. El modo de control se utiliza con flujo de
alimentación constante, flujo de retenido constante, tasa de corte constante o ΔP constante. En este modo,
el valor de TMP es una función del flujo de permeado.
Durante el control de flujo, es común que la presión de alimentación sea tan baja que la bomba de
permeado cree una presión negativa en la corriente de permeado. Un sistema automatizado debe incluir
procedimientos de control para manejar esta situación, por ejemplo, reduciendo temporalmente el flujo de
retenido para aumentar la presión del retenido y del permeado.
Tiempo de procesamiento
El tiempo del proceso de principio a fin (incluyendo la preparación y limpieza del sistema) puede ser de
crucial importancia para la economía de un proceso o para la calidad de un producto que muestra una
estabilidad limitada (por ejemplo, los lisados celulares a menudo contienen enzimas que pueden
degradar el producto, y es importante trabajar rápido en las primeras etapas de separación). Las
consideraciones prácticas, como poder completar el proceso en un día hábil, también pueden ser
relevantes.
Los requisitos de tiempo del proceso pueden influir en la elección del modo de control, así como en la
elección del sistema y el filtro.

3.5 Recuperación del producto

El producto se recupera del retenido o del permeado según el tipo de aplicación. La recuperación
en el permeado se puede maximizar a expensas de la concentración del producto lavando el
retenido con tampón como paso final en la filtración. La recuperación en el retenido se ve afectada
por la acumulación de material (incluido el producto) en una capa de alta concentración en la
superficie de la membrana y por el líquido que queda en las superficies húmedas de los tubos y
depósitos.
Recuperación de producto de la
superficie de la membrana
El producto puede recuperarse de la superficie de la membrana sin agregar tampón o permeado al
sistema. Esto permite obtener el producto más altamente concentrado a expensas de alguna
pérdida de rendimiento.
Por lo general, la recuperación del producto de la superficie de la membrana implica los siguientes pasos:
Paso Acción
1 Al final del proceso de recolección de células o de concentración de una proteína, cierre la

válvula de permeado o reduzca la presión de alimentación a 0,3 bar (5 psi).
2 Reduzca el caudal cruzado a 1/10 del caudal cruzado de procesamiento

recomendado y reduzca la velocidad del mezclador.
3 Haga circular el alimento durante 15 minutos. Esto ayudará a recuperar el producto que se
ha acumulado en la superficie de la membrana.
4 Bombear el producto al recipiente de recogida.
Enjuague del producto con tampón

Enjuagar el producto del sistema de filtración con tampón permite obtener el mayor rendimiento a
expensas de la concentración. En esta técnica, el producto primero se recolecta del sistema, luego
se agrega un pequeño volumen de tampón o permeado al sistema para eliminar el producto
residual del circuito de retenido de alimentación.
Este enfoque se puede combinar con la recuperación del producto de la superficie de la membrana. Por lo
general, el lavado del producto implica los siguientes pasos:
Paso Acción
1 A medida que el proceso CFF se acerca a su finalización, disminuya la velocidad de la bomba y la velocidad
del mezclador para minimizar el caudal, el vórtice en el tanque de alimentación y la posibilidad de formación
de espuma en el producto.

Paso Acción
2 Cuando se alcance el volumen ligeramente sobreconcentrado, bombear el producto

concentrado al recipiente de recolección.
3 Agregue un volumen apropiado de tampón al depósito. El tampón debe circular

durante dos o tres minutos con la válvula de permeado cerrada para ayudar a que el
producto residual entre en suspensión.
4 Bombee la solución tampón del sistema al recipiente de recolección.

3.6 Limpieza y prueba de filtros
Ciclo de vida del filtro
Muchos filtros de laboratorio están diseñados para un solo uso, pero la limpieza y reutilización de los
filtros es una consideración económica importante a escala de desarrollo de procesos, piloto y
producción.Figura 3.1ilustra el ciclo de vida típico de un filtro CFF.
Normalmente, el rendimiento del filtro se comprueba antes y después de su uso midiendo el

caudal de agua a través de la membrana en condiciones controladas. El filtro debe reemplazarse
cuando el flujo de agua cae a niveles inaceptables. Además, se pueden incluir pruebas de difusión
de aire y/o punto de burbuja para garantizar la integridad del filtro.
Las pruebas de difusión de aire y punto de

filtro CFF burbuja normalmente solo se completan cuando
(nuevo o usado) se utilizan equipos a escala piloto y de producción.
Difusión de aire Prueba fallida:

Almacenamiento
o prueba de punto de burbuja Deseche el filtro.
Prueba fallida:
Prueba fallida:
Limpie y pruebe de nuevo Limpie y pruebe de nuevo
Prueba de flujo de agua
o deseche el filtro. o deseche el filtro.
Usar y limpiar
filtro
Figura 3.1: Ciclo operativo del filtro de membrana s.

Procedimientos de limpieza
Los agentes de limpieza recomendados para los filtros CFF se enumeran enTabla 3.1. Se proporciona
información más detallada con los filtros.
Tabla 3.1: Agentes de limpieza recomendados para cassettes Kvick.
Agente de limpieza Condiciones
Detergente Alconox™ al 1,5 % Tiempo de contacto 60 minutos
Temperatura 40°C (104°F)
NaOH de 0,1 a 0,5 M Tiempo de contacto 60 minutos
Temperatura 40°C (104°F)
Hipoclorito de sodio de 200 a 300 ppm en NaOH de Tiempo de contacto 60 minutos

0,1 a 0,5 M Temperatura 20°C (68°F)
La prueba de flujo de agua mide el caudal de agua a través de la membrana en condiciones controladas. El
caudal proporciona una indicación de la capacidad de rendimiento de la membrana. Mediante el
seguimiento de las mediciones del flujo de agua a lo largo del tiempo, es posible determinar cuándo un
filtro llega al final de su vida útil. El flujo de agua normalmente se reducirá hasta en un 20 % de su valor
inicial en el primer ciclo de uso y limpieza. El nivel de rendimiento debería permanecer estable a partir de
ese momento. La prueba de flujo de agua generalmente se lleva a cabo cuando el filtro es nuevo y después
de cada uso o ciclo de limpieza.
Los detalles de cómo realizar y evaluar una prueba de flujo de agua se proporcionan con los filtros suministrados
por GE.
Pruebas de difusión de aire y punto de

burbuja
Las pruebas de difusión de aire y punto de burbuja son compatibles con algunos sistemas CFF de GE para verificar
la integridad del filtro. Los detalles de estas pruebas se proporcionan en la documentación del sistema respectivo.

Filtro de solución de problemas
actuación
La siguiente tabla enumera las causas posibles y las acciones correctivas para los problemas cuando el fundente se
deteriora.
Tabla 3.2: Solución de problemas de procesos de filtración de flujo cruzado.
Síntoma Causa posible Acción correctiva
Disminución gradual lenta Operación normal. Ninguna.
de flujo durante la operación a

alrededor del 90% del flujo
inicial en operación de estado
estable.
Disminución moderada de No se utiliza el mejor tamaño de poro Vuelva a evaluar el tamaño de los poros y la selección del
flujo durante la operación a para la aplicación. área de la membrana.
alrededor del 75% o menos del

Caudal cruzado insuficiente, Aumente el caudal cruzado.
flujo inicial en la operación de
formación excesiva de capa de gel.
estado estable (la disminución
aceptable puede ser mayor en
TMP demasiado alto, formación excesiva Baje la TMP, reduzca el índice de flujo de permeado
aplicaciones de concentración).
de capa de gel. utilizando el control de flujo de permeado.
Incompatibilidad química entre Compruebe la compatibilidad química entre la

los fluidos del proceso y la membrana y los fluidos del proceso.
membrana, membrana dañada. Reemplace el cartucho o casete.
El flujo de agua después de la Limpieza insuficiente. Aumente la temperatura de limpieza. Aumente la

limpieza es inferior al 60 % al 80 concentración de la solución de limpieza.
% del flujo de agua inicial.
Aumente el tiempo o la tasa de circulación de
limpieza. Utilice una solución de limpieza con
mejores propiedades de solubilización.
Incompatibilidad química entre Compruebe la compatibilidad química entre la

los agentes de limpieza y la membrana y el agente de limpieza. Reemplace
membrana, membrana el cartucho o casete.
dañada.
Flujo de agua inferior al 60 % del Disminución normal de la eficiencia Reemplace el cartucho o casete.
flujo de agua cuando el cartucho operativa.
era nuevo; los datos muestran una
disminución gradual a lo largo de
muchas ejecuciones.

Síntoma Causa posible Acción correctiva
Flujo de agua inferior al 60 % del Incompatibilidad química entre Compruebe la compatibilidad química entre la
flujo de agua cuando el cartucho agentes de limpieza y/o fluidos membrana y los agentes de limpieza y/o los
era nuevo; los datos muestran de proceso y membrana, fluidos de proceso.
que la disminución fue membrana dañada Reemplace el cartucho o casete.
repentino.
Limpieza insuficiente. Aumente la temperatura de limpieza. Aumente la
concentración de la solución de limpieza.
Aumente el tiempo o la tasa de circulación de

limpieza. Utilice una solución de limpieza con
mejores propiedades de solubilización.

3.7 Ampliación de procesos
3.7 Ampliación de procesos

La capacidad de escalar un proceso desde el laboratorio hasta la fabricación es un factor clave en el desarrollo del
proceso. Normalmente, la secuencia de ampliación se completa en varios pasos: de la escala de laboratorio a la
escala piloto y de la escala piloto a la escala de producción. Los incrementos de escalamiento razonables suelen ser
de 5 a 20 veces.
Ampliar un proceso implica aumentar el área del filtro para manejar mayores volúmenes de
material de partida sin cambiar significativamente las condiciones del proceso. Los siguientes
parámetros deben mantenerse constantes cuando sea posible:
• Relación entre el área del filtro y el volumen de alimentación
• Longitud de ruta de fibra o casete
• Altura del canal (cassettes) o tamaño del lumen (cartuchos de fibra hueca)
• Características de la membrana (tamaño de poro, selectividad, materiales)
• Tasa de flujo cruzado por unidad de área de filtro
• TMP
• La temperatura
• Concentración de alimentación
• Pasos y secuencia del proceso

4 Optimización de procesos CFF

Este capítulo considera la optimización de los procesos CFF.
En este capítulo
4.1 Optimización de los parámetros del proceso 34
4.2 Optimización del rendimiento 40
Los parámetros del proceso pueden optimizarse con respecto a varios factores, como la capacidad, el tiempo total
del proceso, el rendimiento y la pureza del producto, etc.

4.1 Optimización de los parámetros del proceso

Las recomendaciones de esta sección se aplican principalmente a las aplicaciones de concentración
y diafiltración. Si bien se aplican principios similares a la optimización de procesos para otras
aplicaciones, los detalles diferirán según el material de partida y si el producto se recupera en el
permeado o el retenido.
Gradiente de concentración y capa de

gel.
Un factor que influye en la optimización de los parámetros del proceso es la tendencia a formar
un gradiente de concentración de material (y en casos extremos una capa compacta similar a un
gel) en la superficie de la membrana del filtro.
Durante la filtración, las moléculas y partículas que no atraviesan la membrana se acumulan hasta cierto
punto en la superficie de la membrana, formando un gradiente de concentración (Figura 4.1A). La capa de
gradiente de concentración reduce el flujo en comparación con el flujo de agua o tampón. El flujo de
líquido turbulento a través de la superficie de la membrana ayuda a lavar el material concentrado
nuevamente dentro del retenido, reduciendo pero no eliminando el efecto de acumulación. La disminución
de TMP puede reducir la capa de gradiente de concentración y sus efectos sobre el flujo. El aumento de la
tasa de flujo cruzado ayuda a redistribuir los solutos concentrados nuevamente en la corriente de
alimentación a granel y a mantener el flujo.
A medida que el gradiente de concentración se vuelve más pronunciado, la mayor concentración de material en la
superficie de la membrana tenderá a formar una capa similar a un gel, lo que impedirá notablemente el flujo de
permeado (Figura 4.1B). La formación de una capa de gel se ve como una reducción en la velocidad de aumento del
flujo a medida que aumenta la TMP. La capa de gel también tiene un efecto considerable en el proceso de filtración,
influyendo tanto en la eficiencia como en la selectividad del filtro. Para controlar el proceso de filtración, se deben
tomar medidas para minimizar la formación de una capa de gel.
Las siguientes condiciones de funcionamiento reducen el riesgo de formación de una capa de gel:
• TMP baja
• Alta tasa de flujo cruzado
• Baja concentración de alimentación
La optimización de un proceso CFF debe incluir la determinación de la combinación de TMP y tasa

de flujo cruzado que proporcione la tasa de flujo más alta sin formar una capa de gel.

Figura 4.1: Durante el procesamiento, se forma un gradiente de concentración creciente de solutos entre el flujo de alimentación a granel y
la superficie de la membrana (A). Si el flujo de permeado es demasiado alto en relación con el flujo cruzado, la concentración en la
superficie de la membrana puede volverse lo suficientemente alta como para formar una capa similar a un gel (B).
Flujo versus TMP

En CFF, el parámetro de optimización clave es la tasa de flujo en función de TMP. Para una tasa de flujo cruzado
dada, TMP controla el flujo al comienzo de una ejecución. Si se forma una capa de gel, los aumentos en TMP no
darán como resultado aumentos en el flujo y proporcionarán poca o ninguna ganancia de rendimiento. El rango
óptimo de TMP para una operación eficiente y económica es justo antes de que la capa de gel comience a influir en
el flujo (Figura 4.2).
Región de control de la capa de gel
Agua CF1
fundente de permeado
TMP óptimo r ángel
Tparlamentario
Figura 4.2: Rango óptimo de TMP bajo una estafa caudal cruzado constante.

TMP y flujo cruzado

A una TMP dada, el aumento de la tasa de flujo cruzado ayuda a reducir la capa de gradiente de
concentración y aumenta el flujo. Los caudales cruzados pueden incrementarse hasta que el rendimiento
del proceso, la calidad del producto o la economía del proceso se vean afectados negativamente, por
ejemplo, por los efectos del esfuerzo cortante. La optimización de un proceso CFF como la concentración
de proteína debe incluir un examen de la interacción de las dos variables más importantes: flujo cruzado y
TMP. En la combinación óptima del flujo cruzado más alto y TMP, justo antes de la acumulación de la capa
de gel, se logrará la tasa de flujo más alta (Figura 4.3).
Condiciones óptimas de funcionamiento
CF5 Aumento de la FC
CF4
CF3
CF2
fundente de permeado
CF1
O mamá
pagsttiimetro
Opags
ayoyo
op Control de capa de gel

aire libremirraattiinortenortegramogramorrmimigramogramoiioonortenorte
TMP
Figura 4.3: Relación entre flujo y TMP a diferentes caudales cruzados.

Exploración de TMP
Exploración de TMP (a veces conocida comoExcursiones TMP) es una parte importante de la optimización de
procesos. El aumento de TMP cuando se ultrafiltra agua pura da como resultado un aumento proporcional en el
flujo. Con un fluido de proceso que contiene solutos, la tasa de aumento del flujo cae a medida que aumenta la TMP
y el gradiente de concentración restringe el paso del líquido a través del filtro. A valores altos de TMP, la formación
de una capa de gel bloquea efectivamente el filtro y no se observa un mayor aumento en el flujo. Los índices de
flujo cruzado más altos ayudan a prevenir la formación de una capa de gel, lo que permite lograr índices de flujo
más altos antes de que el flujo se vuelva independiente de la TMP.
La exploración de TMP implica medir la interdependencia de la tasa de flujo cruzado, TMP y flujo
para determinar las condiciones óptimas para la filtración, donde el flujo es alto pero aún depende
de TMP. El procedimiento estándar es realizar un experimento de exploración de TMP en el que se
mide una serie de puntos de ajuste de TMP a diferentes caudales cruzados. A partir de estos
experimentos se evalúa el efecto sobre el flujo y se pueden identificar el flujo cruzado y la TMP
óptimos.
Como ejemplo,Figura 4.4muestra los resultados de la exploración de TMP para una solución de BSA a una
concentración de 30 g/L y 150 g/L (que representan las concentraciones inicial y objetivo respectivamente).
El flujo se mide en 6 puntos TMP y 3 caudales cruzados con permeado reciclado al depósito de
alimentación para mantener un estado estable.
A la baja concentración de proteína, el flujo aumenta con TMP en todas las tasas de flujo cruzado y no hay
una configuración óptima clara. Sin embargo, a una concentración alta de proteína, las curvas se aplanan a
valores altos de TMP, lo que indica que la formación de un gradiente de concentración comienza a
restringir el flujo a través de la membrana. Con esta información, es posible diseñar un esquema de
control de procesos que mantenga un valor de flujo alto durante un tiempo de proceso razonable y
condiciones de proceso estables.
Excursiones TMP Excursiones TMP

BSA 30g/L BSA 150g/L
FC 42ml/min FC 33 ml/min FC 25 ml/min FC 42 ml/min FC 33 ml/min FC 25 ml/min

250
90
225
80
200
70
F lujo [ LMH ]
175
F lujo [ LMH ]
60
150
50
125
óptimo
100 40
75 30
0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 2,50 2,75
TMP [ barra] TMP [ barra]
Figura 4.4: Resultados de exploración de TMP a dos concentraciones de BSA (izquierda 30 g/L, derecha 150 g/L). Tenga en cuenta la
diferencia en la escala de tasa de flujo en las diferentes concentraciones de proteína.
Crosscaudal filtración ciónmetanfetamina

de Handbook 29-0850-76 AB 37
Tiempo de procesamiento
En un proceso de concentración, las condiciones optimizadas de flujo cruzado y TMP establecidas anteriormente se
pueden utilizar para identificar el punto de diafiltración (el punto que proporciona el intercambio de tampón más
rápido) y el consumo óptimo de tampón. Un archivo de resultados típico para la optimización del tiempo de
diafiltración se muestra enFigura 4.5.
Flujo
factor de concentración
Figura 4.5: Archivo de resultados para la optimización del tiempo de diafiltración.
El trazado del factor de concentración de flujo*contra el factor de concentración permite la optimización

del tiempo de diafiltración (Figura 4.6). El valor más alto en el eje y en la concentración más alta representa
la diafiltración más rápida con el consumo de tampón más bajo. En este ejemplo, la diafiltración lleva el
mismo tiempo si se realiza a una concentración de cuatro o cinco veces, porque la disminución del
volumen de retenido a una concentración de cinco veces se compensa con la disminución del flujo.

Figura 4.6: Optimización del tiempo de diafiltración.

4.2 Optimización del rendimiento

La optimización de un proceso de filtración de laboratorio para el rendimiento del producto garantiza el uso
eficiente de los recursos de laboratorio, así como proyecciones precisas para escalar a equipos piloto. En contextos
de producción, optimizar el rendimiento puede tener un gran impacto en la economía del proceso.
Además de la selección del filtro, los factores clave que influyen en el rendimiento del producto son:
• Producto no recuperable
• Pérdidas de producto por desnaturalización y degradación
Producto no recuperable
El diseño del sistema puede afectar el rendimiento del producto si impide la recuperación del producto. Los
sistemas mal diseñados incluyen tramos largos de tubería, tubería innecesariamente ancha, drenaje deficiente del
tanque y otros volúmenes no recuperables, como válvulas de drenaje mal ubicadas. Incluso en sistemas bien
diseñados, parte del producto retenido permanece en las superficies húmedas de la tubería y el depósito, a menos
que el sistema se enjuague con solución amortiguadora. La elección de la opción de recuperación depende de la
importancia relativa del rendimiento total y la concentración del producto final:
• Drenar el sistema sin enjuagar deja algo de fluido de proceso en el sistema pero
recupera el producto en la concentración más alta.
• El lavado del lado del retenido del sistema maximiza la recuperación del producto a expensas de
la concentración.
Desnaturalización y degradación
La pérdida de producto por desnaturalización y/o degradación puede ocurrir como resultado de un
esfuerzo cortante excesivo, temperatura inadecuada o acción enzimática durante el proceso de filtración y
recuperación.
Esfuerzo cortante
La sensibilidad de las biomoléculas al esfuerzo cortante generalmente aumenta con el tamaño molecular. La
mayoría de las proteínas son relativamente resistentes a la desnaturalización por esfuerzo cortante. Si no se conoce
la sensibilidad al corte del producto, se puede realizar un estudio de factibilidad rápido haciendo circular el
producto a través de la ruta de alimentación-retenido y monitoreando la bioactividad en función del tiempo del
proceso. Siempre que sea factible, se deben usar presiones bajas y velocidades de bomba bajas para minimizar los
esfuerzos cortantes en la trayectoria del flujo.
La temperatura
Para las proteínas sensibles al calor, la temperatura de la solución de proceso se puede modificar de varias maneras durante
el procesamiento para optimizar el rendimiento del producto:
• Preacondicione el sistema con un tampón enfriado antes de comenzar
• Baje la temperatura de alimentación antes de comenzar el proceso de filtración

• Use tampón refrigerado durante la diafiltración
• Use baja presión y baja velocidad de la bomba para reducir la generación de calor en la ruta de flujo
• Use una proporción baja de volumen de alimentación para filtrar el área de superficie para acortar el tiempo de proceso
• Coloque el sistema en una habitación fría
• Use un intercambiador de calor o una camisa de tanque
Acción enzimática
Las enzimas proteolíticas liberadas durante el cultivo celular o la lisis pueden seguir a la proteína objetivo a
través del proceso de filtración y causar degradación y pérdida de rendimiento. El efecto puede ser más
pronunciado en aplicaciones de ultrafiltración o diafiltración, donde tanto las enzimas como las proteínas
diana pueden concentrarse juntas en la capa de concentración en la superficie del filtro o en el retenido.
La actividad enzimática puede verse reducida por:
• Inclusión de inhibidores enzimáticos en la muestra
• Uso de una proporción baja de volumen de alimentación para filtrar el área de superficie para acortar el tiempo de proceso
• Bajar la temperatura del proceso

• Ajuste de las condiciones del tampón (fuerza iónica, pH, iones metálicos, etc.) para minimizar la actividad
enzimática

5 Recolección de células

Este capítulo considera el uso de CFF para recolectar células cultivadas.
En este capítulo
5.1 Introducción 43
5.2 Proceso de recolección de células 44
5.3 Selección de membrana y cartucho 47

5.1 Introducción
5.1 Introducción
La recolección de células es el proceso de separar las células del caldo de fermentación en el que se
cultivan. La microfiltración de fibra hueca o los cartuchos de ultrafiltración de NMWC superior se pueden
usar de manera efectiva para la recolección de células. Las células recolectadas se recuperan en el
retenido.
La cosecha de células exitosa se basa en el conocimiento de parámetros tales como:
• Robustez de las células cultivadas
• Volumen inicial y concentración de células
• Concentración y volumen finales deseados
• Rendimiento deseado e integridad de las células

5.2 Proceso de recolección de células

El proceso de recolección de células implica tanto la concentración como el lavado de las células.
Concentración
Las células se concentran como parte del proceso de recolección (Figura 5.1).
Inicio del paso de concentración Fin del paso de concentración
Depósito de alimentación
Filtrar Filtrar
El feed contiene celdas contiene concentrado
y no deseado células y residuos
componentes del caldo componentes del caldo
Impregnar
recopilación
El permeado contiene
buque
caldo no deseado
componentes
Figura 5.1: La concentración es el primer paso en la recolección de células.
El factor de concentración que se puede lograr depende de la concentración inicial y normalmente

está limitado por la fluidez de la suspensión celular concentrada. Los factores de concentración
típicos se muestran enTabla 5.1.
Tabla 5.1: Factores de concentración típicos para diferentes tipos de células.
Tipo de célula Factor de concentración típico
E. coli 5×
Levadura 2×
Mamífero 7 a 10 ×
44 Método de filtración de flujo cruzado d Manual 29- 0850-76 AB

Lavado
La recolección de células generalmente incluye un paso de lavado para garantizar la eliminación efectiva de los
componentes del caldo de las células (Figura 5.2).
Comienzo del paso de lavado Fin del paso de lavado
Buffer
Filtrar Filtrar
contiene concentrado
células y residuos Depósito de alimentación
componentes del caldo contiene células

y tampón
tampón y no deseado
componentes
Figura 5.2: Lavado de células recolectadas después de la concentración.
Después del lavado, el producto final ideal consistiría en células concentradas suspendidas en el tampón
utilizado para lavar las células. Sin embargo, en la práctica, las células recolectadas en el tampón pueden
contener niveles variables de elementos no deseados, como proteínas precipitadas, enzimas y desechos
celulares.
El proceso de lavado es comúnmente un proceso de diafiltración a volumen constante, en el que se agrega

tampón a la suspensión celular a la misma velocidad que el permeado fluye a través de la membrana. A
diferencia de las técnicas centrífugas en las que las células se empaquetan en una torta o gránulo denso, el
lavado de las células en un estado flotante permite la eliminación eficaz de los contaminantes.
Método de filtración de flujo cruzado Manual 29-0 850-76 AB 45

Pasos típicos del proceso

Los pasos típicos en un método de recolección de células se describen enCuadro 5.2:
Tabla 5.2: Pasos típicos en un método de recolección de células.
Paso Operación Objetivo
Preparación Enjuague Enjuague la solución de almacenamiento del filtro.
Descarga de agua Enjuague la solución de limpieza del sistema.
Prueba de flujo de agua Determine el rendimiento del filtro antes del procesamiento.
Condición de amortiguación- Acondicione el filtro y los componentes del sistema antes de

En g agregar el producto.
Cosecha Recolección de células Células concentradas.

(concentración)
Lavado de celdas Retire los componentes no deseados.

(diafiltración)
Recuperación de productos Recuperar las células cosechadas.
Refinamiento Lavado de búfer Enjuague el producto residual del sistema.
CIP Recircular la solución de limpieza.
Descarga de agua Enjuague la solución de limpieza del sistema.
Prueba de flujo de agua Determine el rendimiento del filtro después de su uso y

limpieza.
Almacenamiento Enjuague el filtro con solución de almacenamiento para evitar el crecimiento
bacteriano durante el almacenamiento.

5.3 Selección de membrana y cartucho

En la recolección de células, las membranas de microfiltración retendrán fácilmente todas las células. La clave para
la selección de membranas se basa en la optimización del proceso en lugar de la retención. Por ejemplo, las
membranas de tamaño de poro más pequeño a menudo muestran menos tendencia al ensuciamiento y
proporcionan el flujo de permeado más alto una vez que el sistema está en un estado estable (Figura 5.3). La
membrana de ultrafiltración de 500 000 NMWC suele ser el cartucho elegido para la recolecciónE. coli, aunque tiene
un tamaño de poro relativamente pequeño en comparación con el tamaño de las células.
Figura 5.3: Flujo de tres membranas con todos los parámetros constantes excepto el tamaño de los poros. La membrana A tiene un
tamaño de poro más grande que la membrana B, que tiene un tamaño de poro más grande que la membrana C.
Los cartuchos más cortos permiten una baja caída de presión para separaciones difíciles que utilizan una TMP baja.
Los cartuchos más largos tienen un área de membrana similar, pero requerirán menos flujo de circulación por
unidad de área. Por lo tanto, se prefieren cartuchos más largos para aplicaciones en las que una TMP más alta no
afecta negativamente a la separación (Cuadro 5.3).
Los diámetros de lumen de fibra adecuados para la recolección de células son de 0,75 a 1,0 mm. Deben usarse
fibras de mayor diámetro para soluciones con alto contenido de sólidos en suspensión, alta densidad celular y alta
viscosidad.
Tabla 5.3: Cartuchos recomendados para la recolección de células.
Tipo de célula Suspendido Sendero luz de fibra poro nominal

sólidos/viscosidad longitud (cm) diámetro tamaño/NMWC
(mm)
E. coli Moderado 30 o 60 1.0 0,1 micras
500 kD
750 kD
Levadura Alto 30 1.0 0,1 micras
0,2 micras
750 kD

Tipo de célula Suspendido Sendero luz de fibra poro nominal

sólidos/viscosidad longitud (cm) diámetro tamaño/NMWC
(mm)
Mamá- Bajo a moderado- 30 o 60 0,75 o 1,0 0,2 micras
maliense comió 0,45 micras
0,65 micras

Control de flujo de permeado
En la mayoría de las aplicaciones de recolección de células, el flujo de permeado suele ser alto, incluso con
una TMP baja, y el proceso se ejecuta bajo control de flujo para evitar el ensuciamiento prematuro de la
membrana. La restricción del flujo de permeado genera contrapresión en el lado de permeado del filtro.
que reduce efectivamente el TMP y reduce el ensuciamiento (Figura 5.4).
Flujo de permeado sin restricciones

Flujo de permeado
Control de flujo de permeado
Tiempo
Figura 5.4: El uso de control de flujo de permeado da como resultado un flujo más estable.
Condiciones típicas de inicio

Tabla 5.4: Punto de partida recomendado para desarrollar condiciones de proceso para aplicaciones de cosecha.
Células bacterianas Células mamíferas Concentración de partículas de

virus
concentración 10× después Concentración 10x seguida Concentración 5x seguida

reducido por diafiltración 3× de diafiltración 3x de diafiltración 3x
promedio mi
flux 25 LMH con Flujo de permeado c controlar en Baja TMP y 6.000 s-1 de
ce alto inicio de densidad ll 30 LMH, sin red volver
norte cizallamiento, 20-50 LMH.
material al y sin restricciones presión
por mi aTe.
este pr descripción del proceso Este proceso se des cription es Esta descripción del proceso es
es para re movimiento de células. mi
lls y
para la eliminación de c solo para la purificación de
recuperación óptima y de ex- partículas de virus con
objetivo presionado p rsolo nota. condiciones de proceso suaves.
Flujo cruzado método de filtración Handb ook 29-0850-76 AB 49

Parámetros de operación
La siguiente tabla resume los principales aspectos del diseño del proceso para la recolección de células.
Tabla 5.5: La influencia de las variables del proceso y la solución de alimentación en el proceso CFF.
Variable Consideraciones de selección
Variables de proceso
Recolección de células Utilice cartuchos de microfiltración para la recolección de células. Seleccione el tamaño de
poro de la membrana en función de la aplicación específica para lograr una tasa de flujo
estable.
Variables de solución
concentración celular Determine el porcentaje de células húmedas para anticipar el grado de

concentración que se puede usar. Una masa celular altamente concentrada puede
parecer eficiente, pero también puede resultar en altas presiones de entrada:
puede ser preferible una longitud de paso más corta y menos eficiente (30 cm).
Carga de sólidos Para las células enteras, no es raro alcanzar el 70 % del peso de la célula húmeda
mientras se mantienen las condiciones de estado estable. Sin embargo, los lisados
tienden a necesitar un nivel de sólidos más bajo para promover el paso del
material objetivo. Comience con sólidos en el rango de 5 a 10 % y controle la
transmisión así como la TMP durante la fase de concentración.
Sensibilidad al corte Si la corriente de alimentación es particularmente sensible a la cizalladura y

se reduce el caudal de recirculación, puede ser necesario reducir el caudal
de permeado (cuando se utiliza el control de flujo de permeado) para
optimizar el rendimiento.
Volumen Al escalar un proceso, el diámetro de la carcasa del cartucho aumenta

para mantener constante la relación volumen/área. Estime la tasa de
flujo para que el volumen inicial sea adecuado para el tiempo de
proceso objetivo.
La temperatura A medida que disminuye la temperatura, el tiempo de filtración a menudo aumenta
debido a los efectos de la viscosidad, y los cartuchos más grandes pueden ser apropiados.
Por ejemplo, el procesamiento en una cámara frigorífica a 4 °C puede demorar el doble
que el procesamiento a temperatura ambiente.
Otras variables
Restricciones de tiempo El área de membrana aumentada y el tamaño de carcasa más grande acortan el
tiempo de proceso.

Esterilización por calor Elija modelos autoclavables o de vapor en el lugar para los procesos
que se ampliarán para la producción.
Cuando se trabaja con células que aún pueden estar parcialmente activas, los métodos rápidos pueden ser
importantes. Esto se puede lograr aumentando la relación entre el área de la membrana y el volumen del proceso.
El uso de más área de membrana no solo permite una mayor tasa de flujo de permeado, sino que también reduce
el riesgo de incrustaciones al esparcir el material sobre un área más grande.
El flujo depende de la concentración de partículas. Con la alta carga de partículas típica de la

recolección de células, se deben usar presiones transmembrana de bajas a moderadas (<1 bar, 15
psi).
Temperatura de proceso
Se recomienda la temperatura ambiente, pero solo si los componentes del proceso son estables a esta
temperatura. De lo contrario, opere de 4° a 12°C pero con un flujo más bajo.

6 Clarificación de células y lisados

Este capítulo considera el uso de CFF para la clarificación de cultivos celulares y lisados.
En este capítulo
6.2 Selección de membrana y cartucho 56
6.4 Ejemplos de estrategias de aclaración 59

6.1 Introducción
6.1 Introducción
Los procesos de clarificación se utilizan en dos contextos:
• Clarificación celular
• Clarificación del lisado
En ambos casos, el producto se recupera en el permeado, mientras que los restos celulares y las partículas
más grandes permanecen en el retenido y se desechan (Figura 6.1). Un paso de lavado después de la
clarificación inicial se usa comúnmente para maximizar la recuperación del producto (Figura 6.2). El
permeado generalmente incluirá componentes no deseados del medio de cultivo o del lisado celular, y se
necesitan pasos posteriores adicionales para purificar el producto.
Inicio de aclaración inicial Fin de la aclaración inicial
proteína de interés Filtrar Depósito de alimentación Filtrar

con células o desechos contiene principalmente
celulares y componentes células o restos celulares
de caldo o lisado y algunas proteínas
de interés
Impregnar
recopilación El permeado contiene
buque proteína de interés y
caldo o clarificado
componentes del lisado
Figura 6.1: El paso de clarificación inicial recupera la mayor parte del producto en el permeado y deja material particulado no
deseado en el retenido.

6.1 Introducción
Comienzo del paso de lavado Fin del paso de lavado
Filtrar Depósito de alimentación Filtrar
contiene principalmente
contiene principalmente
células o restos celulares
células o restos
y algunas proteínas
celulares y tampón
de interés
proteína de interés y
tampón
Figura 6.2: Un paso de lavado después de la clarificación inicial maximiza la recuperación del producto.
La clarificación exitosa de las corrientes de alimentación para recuperar las proteínas objetivo requiereconocimiento
conocer las especificaciones del producto inicial y del producto terminado, tales como:
• Peso molecular, morfología y robustez de la molécula diana

• Volumen inicial y concentración de la proteína objetivo
• Concentración y volumen deseados de proteína final
• Rendimiento y calidad (actividad) deseados de la proteína
• Nivel de sólidos en suspensión
Al igual que con la recolección de células, los tiempos de procesamiento rápidos pueden reducir la exposición el objetivo
de la proteína t a las fuerzas de cizallamiento, la acción enzimática y la temperatura elevada.
54 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29 - 0850-76 AB

6.1 Introducción
clarificación celular
La clarificación celular se utiliza para recuperar la proteína diana que se expresa en el medio de cultivo
durante el cultivo celular. Las células se filtran y permanecen en el circuito de alimentación/retenido,
mientras que el permeado contiene la proteína o molécula de interés. La separación de una proteína de un
cultivo celular es similar a la recolección de células, excepto que el producto de interés es la proteína en el
permeado. Un proceso de clarificación celular eficaz permite el paso de la mayor cantidad de moléculas
diana. Para optimizar la recuperación de la proteína objetivo, a menudo se agrega un paso de lavado al
proceso de clarificación celular para ayudar a eliminar las moléculas objetivo a través de la membrana (
Figura 6.2).
Las células se concentran a medida que se elimina el líquido en el permeado. El nivel al que se pueden concentrar
las células durante la clarificación celular varía según los tipos de células. Para conocer los factores de
concentración típicos, consulteTabla 5.1.
Clarificación de lisado
La clarificación del lisado se usa después de la lisis de las células recolectadas para recuperar la molécula diana del
contenido celular. Los componentes de los lisados suelen obstruir los poros de la membrana. Para minimizar el
ensuciamiento de los poros y permitir que el filtro funcione en condiciones de equilibrio, las pruebas iniciales de
clarificación del lisado suelen incluir un lavado de volumen constante con poca o ninguna concentración. Se usa un
gran volumen de lavado (típicamente 5 veces el volumen inicial de lisado) para asegurar una recuperación eficiente
de la proteína objetivo.


Para la clarificación de células y lisados, las membranas de microfiltración retienen fácilmente todas las células y los
desechos celulares. La clave para la selección se basa en el paso de la molécula objetivo en lugar de la retención de
componentes no deseados.
Selección de membrana
Los filtros de tamaño de poro más pequeño resisten el ensuciamiento más que los filtros con tamaño de poro más grande.
Una pauta general es seleccionar las clasificaciones de tamaño de poro más pequeñas que sean al menos 10 veces más
grandes que el tamaño de la proteína objetivo en su estado más grande o dimensión más larga.
Para la clarificación de cultivos de células de mamíferos, los microfiltros (tamaño de poro de 0,2 a 0,65 µm) son
generalmente adecuados. La clarificación de cultivos bacterianos suele utilizar ultrafiltros con NMWC 500 o 750 kD.
Tanto los ultrafiltros de 750 kD como los microfiltros de 0,1 µm se han encontrado adecuados para cultivos de
levadura.
Cuando se trabaja con lisados, que pueden contener una amplia gama de tamaños de partículas y muchos tipos de
proteínas y componentes celulares pegajosos, elegir un tamaño de poro pequeño puede ayudar a prevenir la
obstrucción de los poros de la membrana.
Tabla 6.1presenta características típicas de cartucho y membrana para aplicaciones comunes de

clarificación.
Selección de cartucho
La presencia de partículas en la corriente de alimentación requiere la selección de cartuchos de
paso corto (30 a 60 cm) con grandes diámetros de luz (0,75 a 1,0 mm). VerTabla 6.1para las
especificaciones del cartucho.
Tabla 6.1: Cartuchos recomendados para cultivo celular y clarificación de lisados.
tipo de aclaración Suspendido Longitud de la trayectoria luz de fibra poro nominal

sólidos/viscosidad (cm) diámetro tamaño/NMWC
(mm)
Anticuerpo monoclonal de Bajo a moderado 30 o 60 1.0 0,2 micras
cultivo de células de hibridoma 0,45 micras
0,65 micras
Aclaración de adenovirus Bajo 30 0.75 0,65 micras
de cultivo celular 293
Clarificación de proteína (<60 Alto 30 o 60 1.0 0,1 micras
kD) deE. colicaldo de celulas 500 kD

enteras 750 kD

tipo de aclaración Suspendido Longitud de la trayectoria luz de fibra poro nominal

sólidos/viscosidad (cm) diámetro tamaño/NMWC
(mm)
Clarificación de proteína de Moderado 30 o 60 1.0 750 kD

20 kD deE. colilisado
Clarificación de proteína de Alto 30 1.0 0,1 micras
40 kD dePichia pastoris
Cuadro 6.2resume las consideraciones de selección de cartuchos en relación con las variables de la
aplicación.
Tabla 6.2: La influencia de las variables del proceso en la selección de un cartucho de flujo cruzado.
Variables de solución
concentración celular Determine el porcentaje de células húmedas para anticipar el grado de concentración
que se puede usar. El beneficio de una masa celular altamente concentrada puede
equilibrarse con la posibilidad de requisitos de alta presión de entrada o la necesidad
de utilizar cartuchos de paso corto (30 cm) menos eficientes.
Carga de sólidos Las células recolectadas pueden alcanzar hasta un 70 % del peso celular húmedo. Sin embargo, los
lisados tienden a necesitar un nivel de sólidos más bajo para evitar el ensuciamiento. Comience con
sólidos en el rango del 5 % al 10 % y controle el flujo y la TMP durante la fase de concentración.
Tamaño del material Para separaciones con material objetivo grande, puede ser mejor evitar cualquier
objetivo concentración, sino realizar un lavado de volumen constante desde el principio. Recuerde
que el uso de una membrana más abierta puede requerir el uso de cartuchos cortos y
control de flujo de permeado. Utilice membranas de UF abiertas para aclarar pequeñas
proteínas de los flujos.
Sensibilidad al corte Si la corriente de alimentación es particularmente sensible a la cizalladura y se reduce el caudal de

recirculación, puede ser necesario reducir el caudal de permeado (cuando se utiliza el control de
flujo de permeado) para optimizar el rendimiento.
Tenga en cuenta que las células frágiles pueden romperse por las fuerzas de cizallamiento durante la
clarificación, lo que da como resultado la contaminación del material objetivo con componentes
intracelulares.
Otras variables
Restricciones de tiempo El área de membrana aumentada y el tamaño de carcasa más grande acortan el tiempo de producción.
Esterilización por calor Elija modelos esterilizables en autoclave o vapor en el lugar para los procesos que se
ampliarán para la producción.


Las variables clave del proceso durante la clarificación son el caudal de permeado (flujo) y la TMP. En los
procesos de clarificación, como en la recolección de células, el flujo suele ser alto incluso con valores bajos
de TMP y se deben tomar medidas para disminuir el flujo para evitar el ensuciamiento prematuro de la
membrana. Referirse aCapítulo 5 Recolección de células, en la página 42para más detalles.Cuadro 6.3
describe las condiciones iniciales típicas para la clarificación de diferentes tipos de células.
Tabla 6.3: Punto de partida recomendado para desarrollar condiciones de proceso para clarificación.
fermentación bacteriana fermentación de levadura célula de mamífero 293 o HeLa lisado de levadura
ción cultura cultivo de células
Ex-proteína diana Ex-proteína diana Anti- monoclonal Adeno-asociación- par-

presionado extracelular- extracelular prensado cuerpo expresado atedvirusclari- (VLP) ex-
mentira larly extracelularmente ficación presionado intra-
celularmente
concentración 5× después concentración parcial concentración 10× concentración 5× sin concentración

bajada por una ción de 1,5 a 2× en el mejor ción seguida de ción seguida de constante
diafiltración de 3 a 5× de los casos seguida de 3 a 3× diafiltración. Lavado 5×. lavado de volumen
5× de diafiltración. hasta 5×.
Para proteínas diana Membranas clasificadas en Utilizar microfiltración Operar a baja operar en
grandes, utilice membranas 750 kD y 0,1 µ han de 0,2 o 0,45 µ tasa de corte us- alta tasa de corte
de microfiltración con funcionado bien membranas con ing 0,65 µ con permeado
control de flujo de permeado sin restricciones flujo de permeado membranas control de flujo
fijado en 20 a 30 LMH. flujo de permeado. control establecido en y permear fijado en 20 LMH.
30 LMH. Sin presión conjunto de control de flujo
Para moléculas más pequeñas, Si la densidad celular es
trasera retenida a las 20 a
utilice membranas de bastante alta, de cerca
750 o 500 kD sin monitorear la entrada
Por supuesto. 30 LMH.
permeado restringido presión para evitar

lecturas de flujo y TMP sobre concentración.
de 1 a 1,5 bar (15 a 22
psi).

6.4 Ejemplos de estrategias de aclaración

Los ejemplos de esta sección ilustran el desarrollo de las condiciones del proceso con células
de mamíferos, células bacterianas y levaduras.

6.4.1 Células de mamíferos
Introducción
Muchas proteínas terapéuticas se derivan de fuentes de cultivo celular. Estos se cultivan con mayor
frecuencia con líneas celulares de mamíferos en medios altamente purificados. Aunque hay una variedad
de células que son adecuadas y las densidades celulares oscilan entre 106 y 107 células por ml, el proceso
de clarificación es similar para cada tipo.
Membrana y cartucho
selección
Si la proteína de interés es un anticuerpo, se pueden utilizar membranas de 0,2, 0,45 o 0,65 µm. La turbidez
del permeado será ligeramente inferior si se utilizan filtros de 0,2 µm. La clasificación de 0,65 µm
generalmente proporciona el mejor rendimiento. Estos cartuchos se pueden probar con solución de
alimentación para determinar qué calificación proporciona el mejor rendimiento general. Las membranas
de microfiltración anteriores están disponibles en un solo diámetro de fibra, y la única variable restante es
la longitud del camino del cartucho, 30 o 60 cm. La prueba inicial debe comenzar con una trayectoria de 30
cm para ayudar a mantener lecturas bajas de TMP. Cuando se hayan elegido la membrana y las
condiciones de operación apropiadas, se pueden usar pruebas adicionales usando la longitud de la
trayectoria de 60 cm para determinar si este diseño es adecuado para la ampliación.
Condiciones del proceso y

vigilancia
El caudal de circulación debe ajustarse a un máximo de 4000 s-1. Si las pruebas muestran daños en
las células, se debe reducir el caudal de circulación. El caudal de permeado debe establecerse entre
30 y 50 LMH. Usando estas condiciones, la TMP inicial comenzará a aproximadamente 70 mbar (1
psi). Dado que las células se retienen por completo y la proteína pasará inicialmente
cuantitativamente a través de la membrana, el objetivo de la prueba debe ser determinar la
capacidad de filtración. Como regla general, una vez que la TMP ha aumentado en un factor de 4 a
5 desde la lectura inicial, la membrana está agotada. En este ejemplo, trabajando con el control de
flujo de permeado establecido en 30 LMH, si la TMP comienza en 70 mbar (1 psi), cuando la TMP
alcanza de 250 a 350 mbar (3,5 a 5 psi), se habrá alcanzado la capacidad del cartucho.
Usando el cambio en TMP como indicador, es posible comparar una variedad de clasificaciones de
membrana y controles de proceso. Una vez que se ha adoptado un conjunto de condiciones estándar, la
eficiencia de filtración también se puede estudiar en función del proceso de cultivo celular. Por ejemplo,
con una viabilidad celular baja, el rendimiento de la membrana trabajando con una membrana de 0,45 μm
podría ser tan bajo como 50 L/m2. Con células sanas operando en las mismas condiciones, el rendimiento
podría llegar a los 120 L/m2. Operar a una tasa de flujo más alta generalmente disminuye la capacidad de
producción.

Para obtener altos rendimientos trabajando con anticuerpos monoclonales derivados de células CHO,
normalmente es posible concentrar las células 10x y seguir con un lavado de 3x a 5x.

6.4.2 Células bacterianas
Introducción
E. coliy bacterias relacionadas se han utilizado durante muchos años para la expresión de una amplia gama
de proteínas recombinantes, vacunas y enzimas. Los tiempos de fermentación pueden variar desde menos
de un día hasta una semana. Debido al corto tiempo de duplicación de estas células, la fermentación
prolongada puede resultar en una masa celular significativa. Además, el medio nutritivo suele ser mucho
más complejo y menos purificado que el medio utilizado para las células de mamífero. Como resultado,
separar estas células de la proteína diana puede ser un proceso más complejo.
Membrana y cartucho
selección
Para proteínas relativamente pequeñas (<40 kD), las membranas de ultrafiltración abiertas
clasificadas en 500 kD y 750 kD deben probarse primero. Estas membranas proporcionarán una
tasa de flujo estable y resistirán el ensuciamiento rápido. Para proteínas grandes, se deben usar
membranas de microfiltración de 0,1 o 0,2 μm, pero solo junto con el control de flujo de permeado.
Para hacer una comparación de cualquiera de estas selecciones sin una contribución significativa
de una capa de gel, se deben usar condiciones de operación uniformes con una velocidad de corte
relativamente alta en el flujo de circulación y una TMP baja. La prueba inicial debe utilizar el diseño
de fibra de lumen de 1 mm con una longitud de paso de 30 cm. Cuando se hayan elegido la
membrana y las condiciones de operación, se pueden usar pruebas adicionales usando la longitud
del camino óptico de 60 cm para determinar si este diseño es adecuado para la ampliación.
columna Ei procesos de fermentacion.

vigilancia
A diferencia de las frágiles células de los mamíferos, las células bacterianas pueden soportar fuerzas de
cizallamiento significativas sin sufrir daños. Los resultados de las pruebas han demostrado que los flujos de
circulación altos con velocidades de corte de 12 000 a 16 000 s-1 proporcionan una mejor transmisión de la proteína
objetivo y velocidades de flujo más estables. Una velocidad de corte insuficiente o una TMP excesiva provocarán la
formación de una capa de gel en la superficie de la membrana que actúa como una capa de filtración adicional. Por
lo tanto, las pruebas iniciales requerirán un ensayo confiable para establecer un proceso estable con buenos
rendimientos. Con corrientes de alimentación que contienen una masa celular alta y una molécula objetivo grande,
la prueba debe comenzar con el control de flujo de permeado establecido en un valor tan bajo como 10 a 20 LMH.
Cuando se trabaja con membranas de ultrafiltración, la TMP debe aumentarse gradualmente para ver si hay un
aumento proporcional y estable en el flujo. Con membranas de microfiltración, la tasa de flujo debe aumentarse
gradualmente mientras se controla el TMP. Si el TMP aumenta con el tiempo,

la tasa de flujo debe ajustarse a una configuración más baja hasta que permanezca estable. Incluso con
una masa celular inicial relativamente alta, a menudo es posible realizar una concentración de 5x sin sufrir
un aumento significativo en la caída de presión a lo largo del cartucho. Si la presión de entrada comienza a
aumentar abruptamente, normalmente no se debe a la obstrucción del cartucho sino al aumento de la
viscosidad de la alimentación, y no se recomienda una concentración adicional. Con la prueba inicial, se
debe usar un aumento de 2 veces en la caída de presión como límite superior. El lavado a volumen
constante debe iniciarse sin interrumpir el flujo de circulación. Si la tasa de flujo ha disminuido más de 4
veces, se recomienda abrir temporalmente la válvula de contrapresión y cerrar el flujo de permeado. Esta
técnica puede ayudar a disminuir los efectos de la formación de la capa de gel.

6.4.3 Levadura
6.4.3 Levadura
Introducción
Pichia pastorisy otros tipos de levadura han sido extremadamente populares para expresar proteínas
diana. A menudo, una fermentación exitosa dará como resultado un material altamente viscoso con hasta
un 50 por ciento de masa celular. Esto representa un desafío para cualquiera de las tecnologías de
clarificación candidatas. Sin embargo, las proteínas diana suelen ser pequeñas. Además, la tecnología de
fibra hueca es linealmente escalable y no requiere dilución previa para proporcionar buenos rendimientos.
Membrana y cartucho
selección
Las membranas más populares para garantizar un buen paso de proteínas diana de hasta 70 kD de peso molecular
han sido las membranas de microfiltración de 0,1 µm y de ultrafiltración de 750 kD. Las proteínas más grandes se
han procesado con éxito a gran escala con las membranas de microfiltración de 0,2 µm. Con una viscosidad inicial
tan alta, existe una necesidad aún mayor de utilizar la membrana más densa que pase eficazmente la proteína
objetivo. Las membranas más abiertas que trabajan con presiones de entrada altas darán como resultado que las
células queden atrapadas en la superficie de la membrana cerca de la entrada del cartucho. Las presiones de
entrada aumentarán y el proceso fallará. Las fibras de 1 mm con una longitud de paso de 30 cm se utilizan
exclusivamente con corrientes de alimentación de levadura viscosa. Además, la velocidad de corte rara vez supera
los 4000 a 6000 s-1 para mantener las lecturas de presión de entrada por debajo de 0,7 bar (10 psi). Debido a la alta
viscosidad de la corriente de alimentación, es fundamental que todas las pruebas de caracterización se realicen en
estado estable (con permeado reciclado al depósito de alimentación). Incluso un ligero aumento en la
concentración de sólidos dará como resultado un aumento significativo en la caída de presión.

vigilancia
Cuando se trabaja con la membrana de ultrafiltración de 750 kD, la tasa de flujo de circulación debe
mantenerse constante mientras se aumenta gradualmente la TMP para ver si hay un aumento
proporcional y estable en el flujo. Si el aumento de TMP solo proporciona un aumento parcial en el
flujo, el TMP no debe aumentarse ya que esto puede resultar en una caída en la transmisión de
proteínas, lo que requerirá un lavado extenso. Con las membranas de microfiltración de 0,1 o 0,2
μm, la tasa de flujo debe aumentarse gradualmente mientras se controla la TMP. Como en el
ejemplo anterior, si la TMP aumenta con el tiempo, la tasa de flujo debe ajustarse a una
configuración más baja hasta que permanezca estable. Las lecturas de TMP con estas membranas
de microfiltración probablemente permanecerán por debajo de 0,3 a 0,4 bar (4,5 a 6 psi) durante
todo el proceso. A menos que la densidad celular inicial sea bastante baja (<35 %),

6.4.3 Levadura
cualquier concentración inicial de la materia prima. En cambio, es mejor operar en un modo de lavado de
volumen constante desde el principio. Dado que hasta el 50 % de la alimentación son en realidad células,
los volúmenes de lavado duplican su eficacia. Es posible obtener altos rendimientos utilizando solo 2,5
veces los volúmenes de lavado. Además, debido a que la membrana funciona en condiciones de equilibrio,
las lecturas de caudal y presión deben permanecer constantes.
Las pruebas iniciales deben estar dirigidas a seleccionar la membrana con el mejor paso de la proteína
objetivo. Esta suele ser la membrana que también proporciona la tasa de flujo más alta. La optimización de
las condiciones de operación involucrará ajustes menores a las lecturas de presión y/o índices de flujo. La
capacidad será una función de la transmisión de proteínas, ya que esto conducirá a la determinación de los
volúmenes de lavado requeridos. Los procesos efectivos estarán entre 2,5 y 5 veces los volúmenes de
lavado. Las tasas de flujo pueden oscilar entre 15 y 60 LMH. Cuando se trabaja con flujos de alimentación
de alta densidad celular, es posible lograr rendimientos de 80 L/m2 basados en el material de partida.
Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB sesenta y cinco

7 Concentración y diafiltración

Este capítulo considera el uso de CFF para la concentración y diafiltración de productos.
En este capítulo
7.2 Consideraciones sobre productos y procesos 69
7.3 Selección de membrana 72

7.1 Introducción
7.1 Introducción
Los filtros CFF de ultrafiltración se usan para la concentración de macromoléculas de la misma manera que
los microfiltros se usan para recolectar células. En este proceso, el retenido se vuelve cada vez más
concentrado a medida que se elimina el permeado. Si se agrega un tampón de una composición diferente
al depósito de alimentación a la misma velocidad que se elimina el permeado, el proceso se denomina
diafiltración, donde el nuevo tampón reemplazará progresivamente al antiguo en el retenido sin cambios
en la concentración del producto.Figura 7.1muestra una comparación esquemática de los procesos de
concentración y diafiltración.
Inicio de la concentración Fin de la concentración
Alimento Filtrar Depósito de alimentación

Filtrar
reservorio
contiene concentrado
producto en original
buffer
Impregnar Impregnar
recopilación recopilación
buque buque
Inicio de la diafiltración Fin del diafiltrado ion
Depósito de alimentación con Filtrar

Ffiltrar
contiene producto
concentrado en el búfer de destino
producto en original
buffer
Impregnar Impregnar
recopilación recopilación
buque buque
Figura 7.1: Comparación de procesos de concentración y diafiltración en aguas abajo estoy procesando.
La concentración y la diafiltración a menudo van de la mano aguas abajo y pueden procesamiento, y
usarse en varias etapas de un proceso de purificación.Figura 7.2ilustran los pasos de califica la baja-
flujo en un esquema de purificación para IgG.

7.1 Introducción
Medios de crecimiento
o tampones
Eliminación de pirógenos
Desperdicio
Intercambiador de medios Cosecha de células

Concentración
Fermentación
Diafiltración
Pulido Purificación Captura
Concentración de muestra Concentración de muestra

Intercambio de búfer Intercambio de búfer
Membrana
Membrana
Concentración de muestra
Intercambio de búfer Eliminación de virus Esterilización Producto final
Figura 7.2: Pasos posteriores en la purificación de IgG.
68 r de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

Manual de métodos
7.2 Consideraciones sobre productos y procesos

El éxito de la concentración y diafiltración de proteínas con CFF se basa en especificar el producto previo y posterior
a la concentración de la siguiente manera:
• Las características de la proteína objetivo (tamaño y forma, solubilidad, sensibilidad al corte,

sensibilidad a la temperatura, condición iónica)
• Las características de las soluciones de partida y objetivo (pH, condición iónica, solubilidad,
compatibilidad con el siguiente paso del proceso)
• El volumen inicial y la concentración de la proteína objetivo
• La concentración y el volumen de acabado deseados, y la viscosidad de la solución final
• Tiempo y costo del proceso
• Volúmenes de diafiltración
• El rendimiento y la calidad (estabilidad) deseados de la proteína objetivo
Diseño de procesos de
concentración
La concentración retiene el producto en el retenido mientras elimina el agua y los componentes tampón
del permeado. La elección del tamaño de poro del filtro es crucial para evitar pérdidas de producto en el
permeado. El proceso general puede estar limitado por la solubilidad del producto o la tendencia a
agregarse en altas concentraciones. La viscosidad de la solución de proteína concentrada también puede
ser un factor importante. Es necesario ajustar el flujo, la tasa de flujo cruzado y la TMP para evitar la
formación de una capa similar a un gel de producto altamente concentrado en la superficie de la
membrana.
losfactor de concentraciónes la relación entre las concentraciones del producto final e inicial. El factor de
concentración máximo disponible está limitado por la relación entre el volumen inicial y el volumen
mínimo de trabajo. Además, la sobreconcentración de proteínas puede conducir a una diafiltración ineficaz
debido a los efectos de polarización de la membrana y a la precipitación de proteínas.
En un proceso que involucra tanto la concentración como la dialfiltración, la concentración a menudo se

realiza en dos pasos separados por el paso de diafiltración. Esto permite que la diafiltración se realice en
condiciones óptimas de bajo volumen y concentración moderada, mientras que el procesamiento hasta la
concentración objetivo final se completa en el tampón objetivo.

Diseño de procesos de diafiltración

La diafiltración es un proceso de intercambio de tampones. Desde una perspectiva operativa, el objetivo
es minimizar el consumo del tampón de diafiltración y reducir el tiempo de procesamiento. El proceso
general suele consistir en una concentración para reducir la cantidad de tampón necesaria para lograr un
factor de diafiltración específico, seguido de una diafiltración continua en la que el volumen de líquido en
el depósito de alimentación se mantiene constante.
losfactor de diafiltraciónrepresenta la medida en que el búfer original es reemplazado por un

nuevo búfer, y puede calcularse como:
Factor de diafiltración = Volumen de tampón/Volumen inicial
Ecuación (2)
Nota: La diafiltración nunca logra un intercambio de tampón completo ya que la concentración de

tampón de partida disminuye exponencialmente.
Un proceso de diafiltración puede diseñarse de varias maneras diferentes con respecto a cómo se agrega
un nuevo tampón a la alimentación para reemplazar el antiguo tampón. Los dos enfoques más comunes
soncontinuoydiscontinuodiafiltración El efecto de los métodos de dialfiltración continuos y discontinuos
en comparación con la dilución a granel única (donde simplemente se agrega un nuevo tampón a la
muestra antes de concentrarla) se ilustra enFigura 7.3.Secuencialla diafiltración, con dos o más pasos de
diafiltración en secuencia directa, también puede usarse en casos especiales.
diafiltración continua
En la diafiltración continua, el volumen de líquido en el depósito de alimentación se mantiene constante agregando
tampón nuevo desde un depósito de transferencia al mismo ritmo que se elimina el líquido en el permeado. Esta es
la forma más eficiente de diafiltración en términos del tiempo de proceso requerido para lograr un factor de
dialfiltración determinado.
diafiltración discontinua
La diafiltración discontinua es un proceso en el que la solución de proteínas se concentra y se
vuelve a diluir repetidamente. Es menos eficiente que la diafiltración continua porque se requiere
un mayor volumen de tampón de acabado para lograr el mismo factor de diafiltración.
diafiltración secuencial
Ocasionalmente, puede que no sea posible intercambiar el tampón existente con un nuevo tampón
directamente sin efectos dañinos para la proteína objetivo. En la diafiltración secuencial, varias
formulaciones de tampones, pasando de soluciones químicas más débiles a más fuertes, se introducen
secuencialmente en el producto para lograr el intercambio final de tampones.

Figura 7.3: Efecto de los métodos de diafiltración en la concentración de tampón.

7.3 Selección de membrana
7.3 Selección de membrana

La selección del tamaño de poro del filtro se basa en el tamaño de la molécula objetivo. Una membrana con poros
demasiado grandes permitirá el paso de la molécula objetivo y reducirá significativamente los rendimientos. Por el
contrario, una membrana con poros demasiado pequeños reducirá el flujo y conducirá a tiempos de procesamiento
más prolongados y sistemas sobredimensionados, con mayores costos de capital, requisitos de espacio de planta,
volumen de trabajo y volumen de retención.
Una pauta general para seleccionar una membrana para la concentración del producto es comenzar con
un NMWC que sea de 3 a 5 veces más pequeño que la molécula objetivo. Por ejemplo, una membrana de
50 kD o 30 kD sería una elección adecuada para retener IgG (peso molecular 160 kD), y una membrana de
30 kD o 10 kD sería una elección adecuada para albúmina (peso molecular 66 kD).

A Abreviaturas y glosario
Apéndice A Abreviaturas y glosario
abreviaturas
Abreviatura Sentido
CFF Filtración de flujo cruzado
CIP Limpieza en el lugar
ΔP Diferencial de presión entre el retenido y la alimentación
kD KiloDalton (=1000 Dalton)
LMH Litro por metro cuadrado de superficie de membrana por hora
NMWC Límite de peso molecular nominal
TFF Filtración de flujo tangencial
TMP Presión transmembrana
WFI Agua para inyección
Glosario
Término Sentido
Tasa de difusión de aire La velocidad a la que el aire se difunde a través de los poros húmedos de
una membrana a una presión diferencial dada. La medición de la tasa de
difusión del aire es un método que se utiliza para comprobar la integridad
de un filtro de membrana.
Punto burbuja La presión mínima requerida para superar las fuerzas capilares y la tensión
superficial de un líquido en un filtro de membrana completamente
humedecido. Esta prueba comprueba la integridad de un filtro.
El valor del punto de burbuja se determina observando cuándo comienzan a

emerger burbujas por primera vez en el lado de permeado (aguas abajo) de
un filtro de membrana completamente humedecido cuando se presuriza con
un gas en el lado de alimentación (aguas arriba) del filtro de membrana. Si
aparecen burbujas a una presión más baja que los criterios de aceptación, la
integridad del filtro se ve afectada.

Término Sentido
Prueba de punto de burbuja El procedimiento de prueba para determinar el punto de burbuja de una
membrana de microfiltración.
cartucho o cartucho El términocartuchose refiere a la unidad de filtro de fibra hueca, ya sea para
filtrar microfiltración o ultrafiltración.
Casete El términocasetese refiere a una unidad de filtro que contiene láminas

planas de membrana apiladas separadas por pantallas de soporte.
Los casetes de GE se utilizan exclusivamente para ultrafiltración.
Altura del canal La altura de la ruta por la que debe pasar la solución de
alimentación/retenido para un casete de membrana plana.
Concentrarse También llamado retenido. La parte de la solución del proceso que no

pasa a través de un filtro de flujo cruzado.
Filtración de flujo cruzado En la filtración de flujo cruzado, la solución de alimentación fluye paralela a
(CFF) la superficie de la membrana. Impulsada por la presión, parte de la solución
de alimentación pasa a través del filtro de membrana. El resto se hace
circular de regreso al tanque de alimentación. El movimiento de la solución
de alimentación a través de la superficie de la membrana ayuda a evitar la
acumulación de materiales en la superficie.
Tasa de flujo cruzado También llamado caudal de retenido.
La velocidad de flujo de la solución de alimentación que fluye a través

de la superficie del filtro y sale del filtro como retenido. Los caudales
cruzados más altos ayudan a "barrer" el material que de otro modo se
acumula en la superficie del filtro. La tasa de flujo cruzado se mide con
mayor frecuencia en la salida del retenido.
Cortar Ver Límite de peso molecular nominal (NMWC).
Filtración sin salida Ver filtración de flujo normal.
ΔP Diferencial de presión entre las líneas de alimentación y retenido. El ΔP

es igual a la presión de alimentación menos la presión del retenido.
Diafiltración Una operación que utiliza filtros de ultrafiltración para eliminar sales u
otros microsolutos de una solución. Las moléculas pequeñas pasan al
permeado mientras que las moléculas más grandes se retienen en el
retenido.
Los microsolutos generalmente se lavan tan fácilmente a través del filtro que
para una especie completamente permeada, aproximadamente tres
volúmenes de solución de diafiltración eliminarán el 95%-99% del
microsoluto.

Término Sentido
Intercambio de diafiltración Factor de intercambio de diafiltración = Volumen de tampón de diafiltración /
factor Volumen de muestra
Presión diferencial Véase ΔP.
Filtración de flujo directo Ver filtración de flujo normal.
Área de filtración efectiva El área activa de la membrana expuesta al flujo.
Extraíbles Sustancias que pueden disolverse o filtrarse de un filtro de

membrana durante la filtración y contaminar la solución del
proceso. Por ejemplo, estos pueden incluir agentes humectantes
en la membrana, soluciones de limpieza de membrana o
sustancias de los materiales utilizados para revestir la membrana.
Alimento Material o solución que se alimenta al filtro.
Presión de alimentación La presión medida en el puerto de entrada de un cartucho o

casete.
Área de filtro El área superficial de la membrana del filtro dentro de un filtro de

membrana.
Eficiencia del filtro La eficiencia del filtro representa el porcentaje de partículas de

un tamaño dado que el filtro elimina del fluido.
Longitud de ruta de flujo, La longitud total que recorre una solución de alimentación desde la entrada
longitud de ruta de flujo nominal hasta la salida. La longitud de la ruta de flujo es un parámetro importante a tener
en cuenta al realizar cualquier experimento de desarrollo de procesos, diseño de
sistemas o aumento o reducción de escala.
La longitud de la trayectoria del flujo y otras geometrías del canal de

fluido, como el diámetro de la luz o la altura del canal, pueden afectar
la dinámica de fluidos del sistema y afectarán directamente los
requisitos de la bomba y la presión diferencial del paso de filtración.
Flujo El flujo representa el volumen de solución que fluye a través de un área de

membrana determinada durante un tiempo determinado. Expresado como
LMH (litros por metro cuadrado por hora).
Abordaje Acumulación de material en la superficie de la membrana que reduce la tasa

de filtración. A diferencia de la capa de gel, este material no se redispersa en
la corriente a granel mediante caudales cruzados más altos.

Término Sentido
capa de gel Durante el proceso de filtración, se puede acumular una fina capa de
partículas o moléculas en la superficie de la membrana. En
circunstancias extremas, esta capa concentrada puede formar un gel,
bloqueando el flujo a través de la membrana y potencialmente dando
como resultado un aumento de TMP.
Operar a un flujo cruzado más alto puede reducir el espesor de la

capa de gel.
Volumen de retención Volumen de fluido en la tubería y el filtro del sistema.
Fibra hueca Un tubo de membrana, sellado dentro de un cartucho de flujo

cruzado. La corriente de alimentación fluye hacia el lumen de un
extremo de la fibra hueca y el retenido (el material que no
penetra a través de las paredes de la fibra hueca) fluye hacia
afuera por el otro extremo. El material que atraviesa la
membrana (paredes de la fibra hueca) se denomina permeado.
Alojamiento La estructura mecánica que rodea y soporta la membrana o elemento

filtrante. La carcasa normalmente tiene puertos de alimentación,
retenido y permeado que dirigen el flujo de fluidos del proceso hacia
adentro y hacia afuera del conjunto del filtro.
Presión de entrada La presión de un fluido en el puerto de alimentación de un filtro de membrana.
Cargando El volumen de solución que pasará a través de un filtro de

membrana antes de que la salida de permeado caiga a un nivel
inaceptable.
Recuperación de membrana El grado en que se puede restaurar el rendimiento original de

una membrana mediante la limpieza.
Microfiltración El proceso de remover partículas de un líquido pasándolo a través de

una membrana porosa bajo presión. La microfiltración generalmente
se refiere a la eliminación de partículas de tamaño submicrónico.
membrana microporosa Una película porosa delgada o fibra hueca que tiene poros que
brana varían de 0,1 a 10 μm. Los microfiltros de flujo cruzado suelen tener
poros que oscilan entre 0,1 y 1,0 μm.
Volumen mínimo de proceso También llamado volumen operativo mínimo. La menor cantidad de
ume fluido que un sistema de filtración puede manejar de manera efectiva.
Clasificación de filtro nominal Una calificación que indica el porcentaje de partículas de un tamaño
específico o moléculas de un peso molecular específico que serán
eliminadas por un filtro. No existe un estándar de la industria; por lo
tanto, las calificaciones de diferentes fabricantes no siempre son
comparables.

Término Sentido
molecular nominal La designación del tamaño de poro, generalmente en kiloDaltons (kD),

corte de peso (NMWC) para membranas de ultrafiltración. No existe un estándar de la industria;
por lo tanto, las calificaciones de NMWC de diferentes fabricantes no
siempre son comparables.
Filtración de flujo normal En la filtración de flujo normal, el líquido fluye perpendicular al

medio filtrante. El material que no pasa a través del filtro
permanece en la superficie del filtro.
Trayectoria de flujo nominal Consulte Longitud de ruta de flujo.
longitud
Agua normalizada por El flujo de agua a 20°C dividido por la presión. Unidades comunes
capacidad (NWP) LMH/psi, LMH/bar.
Impregnar También llamado filtrado. Cualquier componente de la solución de

alimentación que pase a través de la membrana.
Porosidad Una medida del espacio abierto en una membrana. Cuanto mayor sea
la porosidad de la membrana, más poros habrá y, por lo tanto, se
espera una mayor velocidad de flujo.
retenido La porción de la solución de alimentación que no pasa a

través del filtro. Cualquier componente que no pase a través
de la membrana sale del filtro y vuelve al recipiente de
alimentación.
Retencion La capacidad de un filtro de membrana para retener una entidad de un tamaño
determinado.
Tasa de corte La relación de velocidad y distancia expresada en unidades de s-1. La

tasa de corte para un cartucho de fibra hueca se basa en la tasa de
flujo a través del lumen de la fibra y se usa para controlar el flujo
cruzado.
Esfuerzo cortante Fuerza disruptiva que surge en relación con un gradiente de flujo pronunciado. El
estrés de cizallamiento puede alterar las células y desnaturalizar las proteínas.
Vapor en el lugar (SIP) El proceso de esterilización de una unidad de filtración, como un

cartucho de fibra hueca, con vapor sin retirar la unidad del
sistema de separación.
Exclusión de tamaño Mecanismo para eliminar partículas de una corriente de alimentación

basado estrictamente en el tamaño de las partículas. Las partículas retenidas
se retienen porque son más grandes que la apertura del poro.

Término Sentido
Filtración de flujo Consulte Filtración de flujo cruzado.
tangencial
presión transmembrana La caída de presión a través de la membrana de filtración.

Por supuesto
Ultrafiltración La separación de macrosolutos en función de su peso o

tamaño molecular.
Río arriba El lado de alimentación de un proceso de separación.
flujo de agua Medición de la cantidad de agua que fluye a través de un área de superficie de
membrana determinada en un tiempo determinado. Véase también Flujo. La
prueba de flujo de agua se usa comúnmente para evaluar la eficacia de la limpieza.

Índice
Índice
A D
abreviaturas, 73
filtración sin salida, 7
prueba de difusión de aire, 29
degradación, 40
sensores de aire, 11
desnaturalización, 40
Sistema ÄKTA Crossflow, 15
despirogenización, 21
Sistema ÄKTA flux, 15
diafiltración, 67
áreas de aplicación, 8
selección de membrana, 72
B diseño de procesos, 70
factor de diafiltración, 70 métodos
configuración básica, 10 prueba
de diafiltración, 70 filtración de
de punto de burbuja, 29
flujo directo, 7 diafiltración
C discontinua, 70
filtros de cartucho, 12 F
filtros de casete, 12
alimentar, 6
clarificación celular, 55
propiedades de alimentación, 17
recolección de células, 43
bomba de alimentación, 10
selección de cartuchos,
configuración del filtro, 12 volumen
47 concentración, 44
de retención del filtro, 14 ciclo de
selección de membrana, 47
vida del filtro, 28
método, 46
rendimiento del filtro
condiciones iniciales
comprobando, 28
típicas, 49
solución de problemas, 30
lavado, 45
selección de filtro
aclaración, 52
para concentración y
selección de cartuchos, 56
diafiltración, 72
selección de membranas, 56
sensores de flujo, 11
ejemplos de aclaración
producto de lavado, 26
células bacterianas, 62
fundente, 23
células de mamífero, 60
en función de TMP, 35
levadura, 64
control de flujo, 24
clarificación de células y lisados, 53
ensuciamiento, 20
agentes de limpieza, 29
concentración de células, 44 factor GRAMO
de concentración, 69 gradiente de
capa de gel, 34
concentración, 34
glosario, 78
acondicionamiento, 22
diafiltración continua, 70 H
modos de control, 24
recolección de células, 43
filtración de flujo cruzado, 6
volumen de retención, 14
tasa de flujo cruzado, 23
filtros de fibra hueca, 12
influencia en el flujo y
TMP, 36
k
sistemas personalizados, 15
características clave, 7

Índice
L bomba de retenido, 10
enjuague, 21
sensores de nivel, 11
clarificación de lisado, 55 S
METRO
desinfección, 21
ampliación, 32
microfiltración, 13
seleccionando un filtro, 19
volumen mínimo de trabajo, 14
seleccionando filtros
para la recolección de células, 47, 56
norte
selectividad, 19
NMWC, 13 sensores, 11
límite de peso molecular diafiltración secuencial, 70
nominal, 13 tasa de corte, 23
producto no recuperable, 40 esfuerzo cortante, 17, 23, 40
filtración de flujo normal, 7 dilución a granel única, 70
O solubilidad, 17
configuración del sistema, 10 volumen
optimización, 33 de retención del sistema, 14
optimizar el rendimiento, 40
T
PAGS filtración de flujo tangencial, 6
permear, 6 requisitos de tiempo, 17
bomba de permeado, 10 Control TMP, 24
tamaño de poro, 13, 20 excursiones TMP, 37
preparación de filtros, 21 exploración TMP, 37
presión, 23 bomba de transferencia, 11
sensores de presión, 11 presión transmembrana
capacidad de proceso, 14 (TMP), 23
modos de control de procesos, 24
diseño de procesos, 16 tu
optimización de procesos, 33
ultrafiltración, 13
ampliación de procesos, 32
sistema UniFlux, 15
tiempo de proceso, 17
optimización del tiempo de proceso, 38 V
concentración de producto, 67
válvulas, 11
diseño de procesos, 69
viscosidad, 17
pérdida de producto, 40
propiedades del producto, 17 W

recuperación de productos, 26
células de lavado, 45
unión de proteínas a filtros, 20
prueba de flujo de agua, 29
enzimas proteolíticas, 41
bombas, 10 Y
R rendimiento, 40
tasa de recirculación, 23 Δ
producto de recuperación, 26
ΔP, 23
retenido, 6

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Filtración de flujo cruzado

2 Sistemas de filtración de flujo cruzado ............................................. ............................... 9

3 Diseño y operación del proceso .................................................. ............................. dieciséis

3.1 Consideraciones del proceso ............................................... .................................................... ..................... 17

4 Optimización de procesos CFF ............................................... .................................... 33

5 Recolección de células .................................................. .................................................... .... 42

6 Clarificación de células y lisados ............................................... .................................... 52

7 Concentración y diafiltración ............................................................... ......................... 66

Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB 3

7.3 Selección de membrana ............................................... .................................................... .......................... 72

Apéndice A Abreviaturas y glosario ............................................... ................ 73

4 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

Acerca de este manual

Acerca de este capítulo

Sección Ver página

1.1 ¿Qué es la filtración de flujo cruzado? 6

1.2 Características clave de CFF 7

1.3 Áreas de aplicación de CFF 8

Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB 5

1.1 ¿Qué es la filtración de flujo cruzado?

Figura 1.1: Principio de filtración de flujo cruzado.

Otros términos utilizados en CFF se explican enApéndice A Abreviaturas y glosario, en la página

6 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

1.2 Características clave de CFF

Diferencias entre CFF y

• CFF admite la recirculación de la solución de retenido. En la filtración de flujo normal, la

Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB 7

1.3 Áreas de aplicación de CFF

Tabla 1.1resume las características de las aplicaciones típicas de CFF.

Tabla 1.1: Usos típicos de la filtración de flujo cruzado.

Solicitud Comentarios Utilizado en

Recolección de células Separación de células del caldo de fermentación. Procesamiento ascendente

Las células se recuperan en el retenido.

Clarificación de células o Separación de moléculas diana de células intactas,

Las moléculas diana se recuperan en el

fraccionamiento de productos Separación de componentes en base al Procesamiento en bajada

El producto se recupera en el retenido.

Diafiltración Intercambio de tampones.

El producto se recupera en el retenido.

8 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

2 sistemas de filtración de flujo cruzado

Acerca de este capítulo

Sección Ver página

2.1 Configuración del sistema 10

2.2 Filtros para filtración tangencial 12

2.3 Volúmenes del sistema y capacidad de proceso 14

Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB 9

2.1 Configuración del sistema

Tampón para diafiltración (opcional)

Figura 2.1: Configuración básica de un sistema CFF.

• ABomba de alimentaciónmantiene la f bajo de alimentar al filtro.

• Abomba de retenidopodemos ser nosotros el Ed a mantener y controlar el flujo de retenido de regreso a

10 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

Sensores de nivel de depósito

Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB 11

2.2 Filtros para filtración tangencial

Configuración del filtro

Figura 2.2: Configuración de cartuchos de fibra hueca y cassettes de hoja plana.

• Enfiltros de cartucho(llamado a menudofiltros de fibra hueca), la membrana forma un conjunto de

• Para microfiltración, 30 a 100 litros de alimentación por m2 de superficie de membrana

12 Manual de métodos de filtración de flujo cruzado 29-0850-76 AB

• Para ultrafiltración, 100 a 200 litros de alimentación por m2 de superficie de membrana