Clase2 REG Diap Post Grado Microbiota Roque

PARTE I
La Microbiota: una visión desde el

laboratorio
Dr. Roque Pastor-Ibáñez
La Microbiota: la visión desde el laboratorio Síguenos en nuestras redes:
Índice general:
I. Introducción a la metagenómica
II. Visión general de un estudio metagenómico
III. Estrategia a seguir: toma de decisiones
i. Selección de participantes
ii. Recogida de muestras
iii. Técnica extracción DNA
IV. Secuenciación del ADN
V. Interpretación de los datos en estudios metagenómicos
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II – VISIÓN GENERAL DE UN ESTUDIO METAGENÓMICO Síguenos en nuestras redes:
Estudio metagenómico basado en el gen rRNA 16S
Selección de los
participantes
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II – VISIÓN GENERAL DE UN ESTUDIO METAGENÓMICO Síguenos en nuestras redes:
Estudio metagenómico basado en el gen rRNA 16S
Selección de los
participantes
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III. ESTRATEGIA A SEGUIR: TOMA DE DECISIONES Síguenos en nuestras redes:
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La definición de los criterios exactos de inclusión y exclusión permite un mejor emparejamiento de los distintos grupos y limita los factores de
confusión.
Los factores de confusión son variables que producen un sesgo en la relación entre un factor de estudio y una enfermedad, modificando su
relación de forma homogénea para todos los estratos.
Implican un sesgo y deben ser encontradas y eliminadas.
Entre los factores de confusión más influyentes sobre la composición de la microbiota intestinal encontramos:
• Edad
• Sexo
• Índice de masa corporal
• Tipo de dieta
• Medicación
• Región geográfica
• Comorbilidades
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Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio
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Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:
• Estudios transversales (observacionales o analíticos):
Los observacionales son puramente descriptivos y se utilizan principalmente para investigar la composición de la microbiota en una
o más poblaciones.
Los analíticos se utilizan para explorar las asociaciones entre el microbioma y los resultados de salud.
Las asociaciones entre el microbioma y los resultados de salud pueden deberse a factores de confusión como el sexo, la edad, el índice de
masa corporal (IMC), la dieta, la estación del año, y la medicación.
Además, el microbioma y los resultados se miden simultáneamente, por lo que es difícil determinar las relaciones causales entre ellos.
Por lo general, el estudio transversal sólo se utiliza para explorar las características elementales del microbioma, y podría servir como
experimento preliminar para investigaciones posteriores.
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• Estudio longitudinal prospectivo:
Difícil debido a las exposiciones subyacentes.
Los patrones específicos del microbioma, que podrían servir para clasificar a los individuos como expuestos o no expuestos, no pueden
definirse fácilmente, por lo que es difícil determinar a un participante como individuo expuesto o no expuesto.
En la práctica, los participantes con o sin una enfermedad suelen servir como grupo de estudio o grupo de control, y las muestras que
contienen el microbioma se recogen de forma prospectiva en diferentes puntos temporales.
Es decir, los sujetos que participan en un estudio longitudinal prospectivo suelen agruparse en función de un resultado clínico y no de los
patrones específicos del microbioma.
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• Ensayos controlados con aleatorización:

Estudios experimentales para evaluar la eficacia de una intervención. La intervención puede ser un medicamento o la microbiota en sí mismo.
Por ejemplo, la intervención en un estudio de trasplante fecal, es la microbiota.
El grupo de control debe seleccionarse adecuadamente.
En estos estudios se deben emparejar por el máximo de factores de confusión posibles, para obtener resultados robustos sobre la intervención en estudio.
La selección del control es a veces difícil, especialmente cuando la intervención es el propio microbioma en un estudio clínico.
En este escenario, un ensayo controlado antes-después o un ensayo controlado histórico sería una buena opción si otros diseños de estudio pueden ser
inapropiados
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• Estudio de casos y controles:
Rara vez se utiliza en la investigación del microbioma porque la exposición previa (del microbioma) es difícil de obtener.
 Sin embargo, funciona si la exposición y el resultado se invierten.
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Exposición Resultado
Antibiótico Alteración de la microbiota hacia un patrón determinado
12
Conoceremos el factor de exposición Conocemos exactamente el tipo de patrón microbiano
Exposición Resultado
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ii. Método de recogida de muestras
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Los métodos de conservación y almacenamiento de las muestras deben adaptarse al método experimental y al tipo de muestra.
El método más versátil es la congelación directa de las muestras.
Se sugiere que:
las muestras se conserven a -20°C dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección, y luego se transfieran a un laboratorio en
hielo seco dentro de las 24 horas posteriores a la recolección y se almacenen a -80°C a partir de entonces.
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Los métodos de conservación y almacenamiento de las muestras deben adaptarse al método experimental y al tipo de muestra.
El método más versátil es la congelación directa de las muestras.
Se sugiere que:
las muestras se conserven a -20°C dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección, y luego se transfieran a un laboratorio en
hielo seco dentro de las 24 horas posteriores a la recolección y se almacenen a -80°C a partir de entonces.
Sin embargo, las muestras suelen recogerse en casa y no en entornos clínicos.

En estas circunstancias, el uso de kits de preservación es una alternativa.
Las muestras conservadas en los kits que usamos en REGENERA pueden almacenarse
a temperatura ambiente.
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ii. Método de recogida de muestras International Human Microbiome Standards (IHMS)
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ii. Método de recogida de muestras International Human Microbiome Standards (IHMS)
IHMS-SOP.03
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iii. Técnica extracción DNA.

Importancia de los controles negativos y positivos
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iii. Técnica extracción DNA - Importancia de los controles negativos y positivos
Las bacterias y hongos se encuentran en prácticamente cualquier ambiente y superficie.

Ejemplo: frotis y cultivo en placa.
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Las bacterias y hongos se encuentran en prácticamente cualquier ambiente y superficie.

Ejemplo: frotis y cultivo en placa.
Esto hace de vital importancia el uso de controles en los estudio metagenómicos para obtener resultados fiables.
Desgraciadamente, sólo el 30% de los estudios metagenómicos informaron del uso de controles negativos, y sólo el 10%
informaron del uso de controles positivos.
El uso de los controles es importante para caracterizar el microbioma, especialmente cuando las muestras tienen una
baja biomasa microbiana.
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Ejemplo práctico:
Estudios anteriores descubrieron que las muestras, como la placenta y el líquido sinovial, que se reconocían como
estériles en el pasado, podían estar colonizadas con microbioma.
Sin embargo, estos resultados positivos pueden estar causados por otros factores, como las contaminaciones.
Curiosamente, se ha demostrado que estos especímenes de baja biomasa son estériles en estudios recientes que
emplearon los controles negativos y/o positivos.
Por lo tanto, recomendamos que se consideren los controles negativos y positivos cuando las muestras sean especímenes
de baja biomasa como la sangre, el líquido amniótico, el líquido cefalorraquídeo, el líquido sinovial y la placenta.
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En este sentido, se definió el concepto KITOMA:
Las supuestas partes de un microbioma, que se introdujeron como contaminantes, de los kits utilizados en los
procedimientos experimentales.
Para minimizar el impacto del kitoma, se recomienda utilizar siempre la misma casa comercial para el conjunto de
muestras de un proyecto.
23
Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies.

Costea PI, Zeller G, Sunagawa S, Pelletier E, Alberti A, Levenez F, et al.
Nat Biotechnol. 2017
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Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies.

Costea PI, Zeller G, Sunagawa S, Pelletier E, Alberti A, Levenez F, et al.
Nat Biotechnol. 2017
25
Glycans affect DNA extraction and induces substantial differences in gut metagenomic studies.
Emmanouil Angelakis, Dipankar Bachar, Bernard Herissat.. Didier Raoult.
Scientific Reports. 2016
Método 5:
utilizó una digestión previa a la extracción del

DNA con enzimas con actividad sobre los
glicanos que forman la pared celular bacteriana
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Estas pruebas evidencian que la técnica de extracción del ADN bacteriano es crucial en los
resultados obtenido.
Todas aquellas bacterias que no consigamos lisar para liberar su ADN, no se detectarán en
las pruebas posteriores, siendo un factor de confusión de elevada importancia.
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La Microbiota: una visión desde el
laboratorio
Dr. Roque Pastor-Ibáñez
regenerapni
@regenera_pni
@regenera_pni
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PARTE I

La Microbiota: una visión desde el

II. Visión general de un estudio metagenómico

III. Estrategia a seguir: toma de decisiones

IV. Secuenciación del ADN

V. Interpretación de los datos en estudios metagenómicos

Estudio metagenómico basado en el gen rRNA 16S

Estudio metagenómico basado en el gen rRNA 16S

Implican un sesgo y deben ser encontradas y eliminadas.

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:

• Estudios transversales (observacionales o analíticos):

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:

• Estudio longitudinal prospectivo:

Difícil debido a las exposiciones subyacentes.

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:

• Ensayos controlados con aleatorización:

El grupo de control debe seleccionarse adecuadamente.

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:

• Estudio de casos y controles:

 Sin embargo, funciona si la exposición y el resultado se invierten.

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:

• Estudio de casos y controles:

 Sin embargo, funciona si la exposición y el resultado se invierten.

Los criterios de selección se han de adaptar al tipo de estudio:

• Estudio de casos y controles:

 Sin embargo, funciona si la exposición y el resultado se invierten.

Conoceremos el factor de exposición Conocemos exactamente el tipo de patrón microbiano

ii. Método de recogida de muestras

ii. Método de recogida de muestras

El método más versátil es la congelación directa de las muestras.

ii. Método de recogida de muestras

El método más versátil es la congelación directa de las muestras.

Sin embargo, las muestras suelen recogerse en casa y no en entornos clínicos.

ii. Método de recogida de muestras International Human Microbiome Standards (IHMS)

ii. Método de recogida de muestras International Human Microbiome Standards (IHMS)

iii. Técnica extracción DNA.

iii. Técnica extracción DNA - Importancia de los controles negativos y positivos

Las bacterias y hongos se encuentran en prácticamente cualquier ambiente y superficie.

iii. Técnica extracción DNA - Importancia de los controles negativos y positivos

Las bacterias y hongos se encuentran en prácticamente cualquier ambiente y superficie.

iii. Técnica extracción DNA - Importancia de los controles negativos y positivos

iii. Técnica extracción DNA - Importancia de los controles negativos y positivos

En este sentido, se definió el concepto KITOMA:

iii. Técnica extracción DNA

Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies.

iii. Técnica extracción DNA

Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies.

iii. Técnica extracción DNA

utilizó una digestión previa a la extracción del

iii. Técnica extracción DNA

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