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Biología de la reproducción, 2021, 104(5), 1114–1125

doi:10.1093/biolre/ioab009
Artículo de investigación

Acceso anticipado Fecha de publicación: 28 de enero de 2021

Artículo de investigación

La transferencia mitocondrial de células madre

pluripotentes inducidas rescata el potencial de
desarrollo de embriones fertilizados in vitro de hembras envejecidas‡
Chao Zhang†, Li Tao†, Yuan Yue, Likun Ren, Zhenni Zhang,
Xiaodong Wang, Jianhui Tian y Lei An*
Laboratorio Nacional de Ingeniería en Reproducción Animal, Laboratorio Clave de Genética Animal, Reproducción y
Reproducción del Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales; Facultad de Ciencia y Tecnología Animal, China
Universidad Agrícola, Beijing 100193, PR China

*Correspondencia: Laboratorio Nacional de Ingeniería en Reproducción Animal; Laboratorio Clave de Genética, Cría y Reproducción
Animal del Ministerio de Agricultura y Medio Rural; Facultad de Ciencia y Tecnología Animal, Universidad Agrícola de China, No. 2
Yuanmingyuan West Road, Beijing 100193, PR China. Correo electrónico: anleim@cau.edu.cn

†Estos autores contribuyeron igualmente al trabajo.

‡Apoyo de subvenciones: Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo
Clave (núms. 2017YFD0501905 y 2017YFD0501901), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (núms. 31972573
y 31672426).

Recibido el 9 de abril de 2020; Revisado el 9 de septiembre de 2020; Aceptado el 21 de enero de 2021

Resumen
La terapia de reemplazo mitocondrial heterólogo convencional se complica clínicamente por las preocupaciones éticas
"triparentales" y la fuente limitada de ovocitos o cigotos de donantes sanos. La transferencia mitocondrial autóloga es una
alternativa prometedora para rescatar la mala calidad de los ovocitos y el deterioro del potencial de desarrollo del embrión
asociado con los trastornos mitocondriales, incluido el envejecimiento. Sin embargo, la eficacia y la seguridad de la transferencia
mitocondrial desde las células somáticas sigue siendo en gran medida controvertida, y los resultados insatisfactorios pueden
deberse a un estado mitocondrial distinto en las células somáticas del de los ovocitos. Aquí, proponemos una estrategia potencial
para mejorar los resultados de la fertilización in vitro (FIV) de pacientes de sexo femenino mayores a través de la transferencia
mitocondrial de células madre pluripotentes inducidas (iPS). Usando ratones que envejecen naturalmente y líneas celulares bien
establecidas como modelos, encontramos que las células iPS y los ovocitos comparten morfología y funciones mitocondriales
similares, mientras que el estado mitocondrial en células somáticas diferenciadas es sustancialmente diferente. Mediante la
microinyección de mitocondrias aisladas en ovocitos fertilizados después de la FIV, nuestros resultados indican que la
transferencia mitocondrial de iPS, pero no de células MEF, puede rescatar el potencial de desarrollo deteriorado de los embriones
de ratones hembra envejecidos y obtener una tasa de implantación mejorada después de la transferencia de embriones. El
efecto beneficioso puede explicarse por el hecho de que la transferencia mitocondrial de las células iPS no solo compensa la
pérdida de mtDNA asociada con el envejecimiento, sino que también rescata el metabolismo mitocondrial de los embriones
previos a la implantación posteriores. Usando mitocondrias de células iPS como donante, nuestro estudio no solo propone una
estrategia prometedora para mejorar los resultados de FIV de mujeres mayores, sino que también destaca la importancia del
estado mitocondrial sincrónico para apoyar el potencial de desarrollo embrionario.

Oración resumida: Las células madre pluripotentes inducidas son donantes más preferidos para la transferencia mitocondrial
que las células somáticas diferenciadas, para rescatar el potencial de desarrollo deteriorado de los embriones de FIV de mujeres
envejecidas.

© The Author(s) 2021. Publicado por Oxford University Press en nombre de la Sociedad para el Estudio de la Reproducción. Reservados todos los derechos.
1114 Para obtener permisos, envíe un correo electrónico a: journals.permissions@oup.com
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iPS-la transferencia mitocondrial beneficia a los embriones de FIV, 2021, vol. 104, núm. 5 1115

Gráficamente abstracto

Palabras clave: transferencia mitocondrial, envejecimiento, ovocitos, embriones, células iPS, fecundación in vitro.

Introducción
La mitocondria es un orgánulo heredado de la madre que no solo proporciona
la energía para apoyar la supervivencia y el crecimiento celular, sino que
también participa en una variedad de procesos que son esenciales para
mantener la homeostasis celular, incluida la homeostasis de iones, el
metabolismo de aminoácidos, la transducción de señales y la apoptosis. , etc.
[1]. La mitocondria es el orgánulo más abundante en ovocitos y embriones tempranos.estrategias existentes para mejorar el estado mitocondrial siempre es menos
Dado que las mitocondrias de los ovocitos apoyan el desarrollo temprano del
embrión hasta la reanudación de la biogénesis mitocondrial y la replicación del
mtDNA que solo ocurren en la etapa posterior a la implantación, las mitocondrias
depositadas por la madre son determinantes fundamentales para el potencial
de desarrollo de los embriones tempranos [2, 3]. Nuestros estudios previos
también enfatizaron la importancia de la interacción compatible entre las
mitocondrias, el citoplasma y el núcleo en la orquestación de la embriogénesis [4, 5]. desarrollado para mejorar la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo
Los trastornos mitocondriales, como la mutación y el agotamiento del
mtDNA, el deterioro de la integridad de la membrana mitocondrial, la fosforilación
oxidativa deprimida (OXPHOS) y el aumento del estrés oxidativo mitocondrial,
están estrechamente asociados con una variedad de condiciones patológicas,
incluido el deterioro de la calidad del ovocito y el embrión.
potencial de desarrollo. La pérdida y las disfunciones mitocondriales son las
características más destacadas de los ovocitos o embriones de ratones y
humanos envejecidos, y se cree que desempeñan un papel fundamental en la
infertilidad femenina relacionada con la edad [6]. Sin embargo, los mecanismos
subyacentes a los defectos mitocondriales asociados con el envejecimiento son
extremadamente complicados [7-9], por lo que la eficacia práctica de las
satisfactoria. En particular, se informó que la suplementación con melatonina
[10, 11], resveratrol [12], putrescina [13], etc., durante la maduración in vitro
mejoró la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo embrionario de las
hembras envejecidas, pero la eficacia y seguridad terapéuticas sigue siendo
controvertido.
Durante la última década, la terapia de reemplazo mitocondrial se ha
del embrión que están asociados con los trastornos mitocondriales, incluido el
envejecimiento [14, 15]. Sin embargo, la transferencia pronuclear/GV o la
transferencia de ooplasma no pueden prevenir por completo el llamado
problema ético triparental debido a los procedimientos de transferencia
mitocondrial heteróloga; así como también se rastreó el uso de estas estrategias
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por la fuente limitada de ovocitos o cigotos de donantes sanos [14, 16]. Una
estrategia alternativa es la transferencia mitocondrial autóloga.
Aunque no se puede usar para tratar enfermedades mitocondriales que
contienen mutaciones de ADNmt, la transferencia mitocondrial autóloga es
prometedora para mejorar la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo
del embrión al aumentar el número mitocondrial y mejorar la producción de ATP
[16]. Un informe clínico demostró que la transferencia mitocondrial de células
autogranulares a ovocitos podría mejorar la calidad del embrión en mujeres de
edad avanzada y dar lugar a la generación de descendencia en mujeres con
embarazos fallidos repetidos [17]. Sin embargo, las evidencias de conflicto
también indicaron que la transferencia mitocondrial desde las células somáticas no es
suficiente para mejorar la calidad de los ovocitos y el posterior potencial de
desarrollo del embrión de ratones envejecidos. Los autores propusieron una
posible explicación de que las mitocondrias derivadas de células somáticas
pueden desempeñar diferentes funciones en los ovocitos [18]. Este resultado
corresponde a un informe anterior de que los ovocitos inyectados con
mitocondrias somáticas mostraron un desarrollo retrasado [19]. Estos resultados
recuerdan el hecho de que el estado mitocondrial en las células somáticas es
distinto al de los ovocitos: las mitocondrias en los ovocitos tienen una estructura
esférica inmadura con una matriz densa y solo unas pocas crestas, mientras
que las mitocondrias en las células somáticas tienen una estructura más
alargada o uniforme. estructura filamentosa con crestas transversales [2].
Curiosamente, las células pluripotentes, es decir, las células madre embrionarias
(ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) contienen mitocondrias
de forma redonda con cresta subdesarrollada y una morfología similar a la de
los ovocitos [20, 21]. Estos hechos nos llevaron a plantear la hipótesis de que
las células pluripotentes se pueden utilizar como donantes de transferencia
mitocondrial para mejorar la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo embrionario de las hembras que envejecen.
Dado que la generación de células ES autólogas necesita blastocistos de alta
calidad y también planteará cuestiones éticas, aquí utilizamos células iPS, pero
no células ES, como donante, para probar la viabilidad y eficacia de la
transferencia mitocondrial de células iPS para mejorar la resultado de la
fertilización in vitro (FIV) de hembras envejecidas, usando ratones envejecidos
naturalmente como modelo.
Materiales y métodos
Declaración de ética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de
acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales
de la Universidad Agrícola de China.
animales
Ratones hembra jóvenes (de 2 meses de edad) y ratones hembra mayores (de
8 a 10 meses de edad) del Instituto de Investigación del Cáncer (ICR), que
mostraron fallas reproductivas significativas y defectos mitocondriales como se
informó anteriormente [22], fueron alimentados con ad libitum y alojados bajo
condiciones de iluminación controlada (12 luz: 12 oscuridad). Se mantuvieron
en condiciones específicas libres de patógenos. La superovulación se indujo
mediante una inyección ip de 10 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada
y luego, 48 horas más tarde, una inyección ip de 10 UI de gonadotropina
coriónica humana (hCG). Los complejos ovocito-cúmulo se aislaron de los
oviductos de las hembras 14 a 16 h después de la administración de hCG.
Fertilización in vitro y transferencia de embriones Todos
los experimentos involucrados en la preparación de embriones se realizaron
como se describió anteriormente [23]. Se liberaron espermatozoides de ratones
ICR machos en medio de líquido tubárico humano (HTF) (SAGE, Bedminster,
NJ, EE. UU.) suplementado con 0,4 g/ml de BSA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO,
EE. Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los espermatozoides se suspendieron en
gotas de 200 ÿL del medio de FIV, se
C. Zhang et al., 2021, Vol. 104, No. 5
cubierto con aceite mineral e incubado a 37 ÿC durante 1 h en humidificado
atmósfera de 5% CO2 para capacitación. Los complejos de ovocito-cúmulo se
colocaron en gotas de 200 ÿl de medio HTF bajo aceite mineral.
Se añadió esperma capacitado a cada gota para obtener una concentración
de 1–2 × 106 espermatozoides móviles/mL. Después de la incubación conjunta
durante 6 h a 37 ÿ C, los ovocitos se extrajeron y lavaron en medio de
optimización simplex de potasio fresco que contenía aminoácidos (KSOM+AA;
Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) y se colocaron a 37 ÿ C en una solución al 5 % . CO2.
Los ovocitos fecundados se lavaron y cultivaron hasta el estadio de blastocisto
en medio KSOM+AA bajo aceite mineral a 37°C en CO2 al 5% .
Ratones hembra pseudopreñadas (receptoras) se enjaularon individualmente
con machos vasectomizados 3,5 días antes de la transferencia de embriones.
A la mañana siguiente del apareamiento, se comprobó la presencia de un tapón
vaginal en las receptoras. Se consideró como día de taponamiento el día 0,5
del pseudoembarazo. Los criterios para recolectar blastocistos para la
transferencia de embriones se basaron en el progreso del desarrollo y la
morfología, según lo informado por estudios previos [4, 24, 25]. Se tomaron
muestras de blastocistos de cavitación tardía bien desarrollados de morfología
similar para su posterior análisis o se seleccionaron para la transferencia de
embriones en cada grupo. En total, se transfirieron 12 blastocistos a cada
receptora, con seis embriones en cada cuerno uterino.
Preparación de fibroblastos de embrión de ratón y células iPS Dado que
nuestros estudios previos informaron que la eficiencia de inducción y la calidad
de las células iPS, especialmente las iPS femeninas, varían en gran medida
entre las diferentes líneas celulares [26, 27], utilizamos un iPS femenino de alto
potencial bien establecido línea de celda para excluir las posibles variables que
pueden afectar los resultados finales. La preparación de fibroblastos de embrión
de ratón (MEF) y células iPS se realizó como se informó anteriormente [26, 27].
En resumen, las células MEF se derivaron de embriones ICR femeninos en el
día embrionario (E) 13,5 y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) suplementado
con FBS al 10 % (Hyclone, South Logan, UT, EE. UU.), glutamina 1 mM (Thermo
Fisher Scientific) y 50 U/50 ÿg/mL de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher
Scientific). La línea celular iPS femenina se indujo a partir de MEF utilizando un
sistema de sobreexpresión inducible (TetO FUW-Oct4, Sox2, Klf4 y cMyc), y se
cultivó en DMEM suplementado con FBS al 15 %, l-glutamina 1 mM, aminoácidos
no esenciales al 1 %. (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), nucleósidos al 1 % (Milli
pore), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco) y factor inhibidor de la leucemia 1000
U/ml (Millipore).
Aislamiento de mitocondrias funcionales y microinyección El aislamiento de las
mitocondrias se realizó siguiendo las instrucciones del kit de aislamiento de
mitocondrias para células cultivadas (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.
UU.). En resumen, las células MEF e iPS recolectadas se resuspendieron en
800 ÿl de solución de reactivo de aislamiento de mitocondrias A que contenía
inhibidor de proteasa y luego se incubaron en hielo durante 2 min. A
continuación, transfirió la suspensión celular a Dounce Tissue Grinder y
homogeneizó las células en hielo. Vuelva a colocar las células lisadas en el
tubo original y agregue 800 ÿl de reactivo de aislamiento de mitocondrias C.
Enjuague el triturador de tejidos Dounce con 200 ÿl de reactivo de aislamiento
de mitocondrias A y agréguelo al tubo original. El tubo se invirtió varias veces y
luego se centrifugó dos veces a 700 g durante 10 min a 4°C.
El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 3000 g durante
15 min a 4ÿC. Después de la centrifugación, el sobrenadante (fracción de
citosol) se transfirió a un tubo nuevo, se agregó el Reactivo C de aislamiento
de mitocondrias al sedimento y se centrifugó a 12 000 g durante 15 min a 4 °C.
Después de descartar el sobrenadante, el precipitado mitocondrial se
resuspendió en KCl 150 mM y
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iPS-la transferencia mitocondrial beneficia a los embriones de FIV, 2021, vol. 104, núm. 5
Tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0). Dado que las células del cúmulo
desempeñan un papel importante en la protección de los ovocitos durante la
fecundación y el apoyo al desarrollo posterior y la denudación de los ovocitos
redujo significativamente la tasa de fertilización y desarrollo después de la FIV
[28–30], se realizó una microinyección mitocondrial en medio M2 (Sigma-
Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) utilizando ovocitos fertilizados como receptores.
En detalle, 6 h después de la adición de espermatozoides, los ovocitos
fertilizados se lavaron con KSOM+AA, aquellos con dos pronúcleos visibles se
sometieron a microinyección mitocondrial. Se inyectaron aproximadamente 5–
10 µL de una suspensión mitocondrial (colocada en hielo y utilizada dentro de
los 60 minutos) en el citoplasma de los ovocitos fertilizados siguiendo procesos
estándar de FIV utilizando un microscopio Olympus (IX71) equipado con un
microinyector FemtoJet (Eppendorf, Alemania).
El número de copias de mtDNA de cada inyección fue de ~700, que es
comparable al informado en estudios previos [31, 32]. Los ovocitos fertilizados
suplementados con o sin mitocondrias se cultivaron hasta la etapa de blastocisto
en medio KSOM+AA bajo aceite mineral a 37°C en CO2 al 5% .
Ensayo de
ATP El nivel de ATP se midió utilizando un kit de determinación de ATP de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Beyotime, Shanghái, China).
Los ovocitos o embriones se cultivaron en medio M2 con o sin inhibidores
específicos de OXPHOS (oligomicina 1 ÿM, Abmole Bio Science, Houston, TX,
EE. UU.) o glucólisis (oxamato de sodio 1 mM, Sigma-Aldrich) durante 20
minutos, luego se realizó el ensayo de ATP. realizado. Se detectó la osmolalidad
para asegurar que no cambiara significativamente debido a la suplementación.
Brevemente, los ovocitos o embriones tratados se digirieron con 20 ul de
tampón de lisis de ATP en hielo y el lisado se añadió a placas de 96 pocillos
que contenían 100 ul de dilución de trabajo de detección de ATP.
Luego se incubó la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente. La
luminiscencia fue detectada por un lector de microplacas multifuncional (Infinite
F200; TECAN, Mannedorf, Suiza). Los niveles de ATP se expresaron como
valores relativos a los del grupo de control.
Análisis de inmunofluorescencia Los
ovocitos o las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS a 4 ºC
durante la noche. Después de permeabilizar con Triton X-100 al 0,5 % en PBS
al 0,1 % PVA (PBST-PVA) durante 1 h a temperatura ambiente, los ovocitos se
bloquearon con BSA al 1 % en PBST-PVA a 4 °C durante 6 h. Los ovocitos se
incubaron con anticuerpo primario anti-TOM20 (1:400; Proteintech, Chicago,
IL, EE. UU.) durante la noche a 4 ÿC, seguido de anticuerpos secundarios
marcados con Alexa Fluor-594 (anti-rabbit; Invitrogen) durante 1 hora a
temperatura ambiente. . Para la tinción celular, las células fijadas se
permeabilizaron durante 15 minutos y se bloquearon con BSA al 2,5 % durante
1 hora a temperatura ambiente, y luego se incubaron con anticuerpo primario
anti-TOM20 (1:400; Proteintech) a temperatura ambiente durante 1 hora,
seguido de anticuerpo secundario durante 45 min. Finalmente, las muestras se
contrastaron con DAPI y se tomaron imágenes usando un microscopio de
escaneo láser confocal (Digital Eclipse C1; Nikon, Tokio, Japón).
Tinción de Mitotracker Se
prepararon soluciones madre de Mitotracker Red CMXRos 1 mM (Thermo
Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) o MitoTracker Green FM (Thermo
Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) usando DMSO.
Las mitocondrias aisladas se incubaron en solución Mitotracker 200 nM
ción durante 25 min a 37ÿC, y luego dejar caer la suspensión mitocondrial
teñida en un portaobjetos de vidrio. Las señales de fluorescencia se detectaron
utilizando un microscopio Olympus IX72 (Olympus Corporation, Tokio, Japón).
1117
Determinación de la mitocondrial
potencial de membrana El
potencial de membrana mitocondrial fue detectado por el kit de ensayo de
potencial de membrana mitocondrial JC-1 (Beyotime Biotechnology, Shanghai,
China). Los ovocitos y las células se tiñeron con 10 ÿg/mL de colorante JC-1
durante 20 min a 37 °C. La distribución de los monómeros JC-1 (fluorescencia
verde) y la fluorescencia del agregado J (fluorescencia roja) se determinó
mediante microscopía de epifluorescencia. Las imágenes capturadas se
procesaron con el software Image J (versión 1.43, NIH, Bethesda, MD, EE.
UU.; http://rsb.info.nih.gov/ij/). Los potenciales de membrana mitocondrial se
evaluaron midiendo las proporciones de fluorescencia roja a verde.
Análisis del número de copias de mtDNA El
gen de actina codificado nuclearmente, beta (Actb) y el gen NADH
deshidrogenasa 5 mitocondrial codificado por mitocondrias (mt-ND5) se
utilizaron para determinar los números de copias de nDNA y mtDNA,
respectivamente, como se describió previamente [4, 5]. Tanto el gen Actb como
el gen mt-Nd5 fueron amplificados por PCR. Los productos de PCR se
extrajeron con el kit de extracción de gel Tiangen (Tiangen Biotech, Beijing,
China) y se clonaron en el vector de clonación cero pEASYTM-T5 (TransGen
Biotech, Beijing, China). Las curvas estándar se determinaron utilizando
plásmidos recombinantes, que se diluyeron en serie con un rango de número
de copias de 101 a 108. Para cada muestra, los números de copias de mtDNA
y nDNA se calculan utilizando el número de ciclo umbral (Ct) y se corrigen a
partir de la curva estándar.
Para ovocitos, embriones de 2 y 8 células, el número de copias se generó
directamente a partir de la ecuación del valor de Ct frente al número de copias
de mtDNA para la curva estándar correspondiente. Para los blastocistos, el
número de copias de mtDNA por célula se calculó utilizando la siguiente
fórmula: copias de mtDNA por célula = número de copias de mt-Nd5/(número
de copias de Actb/2). Se utilizaron los siguientes cebadores (5 –3) para las
PCR: Actb (F: 5 -CTCAGCCACGCCCTTTCTCA-3 y R: 5
-GCTTTGTCACACGAGCCAT TGT-3); mt-ND5: (F: 5 -
ATAGCCTGGCAGACGAACAAGACA-3 y R: 5 -AATTAGTAGG
GCTCAGGCGTTGGT-3).
Microscopía electrónica de transmisión Los
ovocitos se fijaron en glutaraldehído al 2 % en PBS durante 2 horas y se
incluyeron en pequeños bloques de agar al 1 %, y se continuaron fijando
durante 46 horas a temperatura ambiente. Las células se digirieron con tripsina,
se centrifugaron y se fijaron en glutaraldehído al 2 % en PBS durante 48 h a
temperatura ambiente. Después de la fijación, las muestras se enjuagaron con
PBS durante 4 h y se reemplazaron con PBS nuevo cada 10 min. Luego, las
muestras se posfijaron con tetróxido de osmio al 1% en PBS durante 90 min y
se enjuagaron nuevamente en PBS. A continuación, las muestras se
deshidrataron en series ascendentes de etanol (30, 50, 70, 80, 90, 100 % dos
veces). Luego, las muestras se trataron durante 9 min con acetona, se infiltraron
en acetona/resina 1:1 durante la noche y finalmente se incluyeron en resina
fresca. Se cortaron secciones ultrafinas (80–100 nm) con un cuchillo de
diamante utilizando un ultramicrótomo (Ultracut UC6; Leica), y las secciones se
colocaron en rejillas de níquel. Las secciones se contrastaron con acetato de
uranilo y citrato de plomo, y luego se observaron y fotografiaron con un
microscopio electrónico HITACHI H-7500 (HITACHI, Tokio, Japón) a 80 KV.
Análisis estadístico Todos
los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó un análisis de varianza
unidireccional para comparar las diferencias entre los grupos utilizando SPSS
v.25.0 (IBM, Armonk, NY, EE. UU.). P < 0,05 se consideraron estadísticamente
significativos.
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1118
Resultados
El envejecimiento induce anormalidades funcionales y morfológicas
de las mitocondrias en ovocitos de ratón Para comprender los cambios
mitocondriales asociados con el envejecimiento que ocurren en los ovocitos,
primero examinamos las características morfológicas y funcionales de las
mitocondrias en ovocitos de ratones envejecidos.
Nuestra detección preexperimental indicó que una disminución significativa en el
número de copias de ADNmt del ovocito y el potencial de la membrana mitocondrial
ocurre inicialmente a los 8-10 meses de edad (Figura complementaria S1), por lo
que nos enfocamos en los ovocitos de ratones envejecidos en esta etapa.
Siguiendo los procedimientos estándar para la superovulación de ovocitos, se
comparó la ultraestructura de los ovocitos recuperados de ratones viejos y jóvenes
en base a observaciones microscópicas electrónicas. Tanto las mitocondrias de
los ovocitos viejos como los jóvenes presentaron una morfología esférica similar a
la inmadura, con una matriz uniforme y relativamente pocas crestas. Sin embargo,
en comparación con los ovocitos jóvenes, una gran proporción de ovocitos
envejecidos mostró mitocondrias morfológicamente anormales, es decir, pérdida
de crestas mitocondriales, matriz no uniforme, hinchazón y vacuolización de las
mitocondrias (Figura 1A).
A continuación, preguntamos si los ovocitos envejecidos están asociados con
disfunciones mitocondriales. Para probar esto, detectamos el número de copias de
mtDNA en ovocitos viejos y jóvenes, respectivamente. Los resultados mostraron
que el número de copias de mtDNA en los ovocitos envejecidos fue significativamente
menor que en los ovocitos jóvenes (Figura 1B). Además, los ovocitos envejecidos
también se asociaron con niveles de ATP significativamente más bajos (Figura
1C). Al tratar ovocitos jóvenes y envejecidos con inhibidores específicos de
OXPHOS (oligomicina) o glucólisis (oxamato de sodio), bloqueamos la producción
de ATP por OXPHOS y la glucólisis respectivamente [33], y descubrimos que la
producción de ATP en ovocitos jóvenes depende predominantemente de OXPHOS;
por el contrario, los ovocitos envejecidos mostraron una menor dependencia de la
producción de ATP por OXPHOS (Figura 1D), lo que sugiere funciones
mitocondriales deterioradas. Además, encontramos que este defecto se mantendría
en la etapa de 2 celdas (Figura 1E).
Además, la detección del potencial de la membrana mitocondrial utilizando sondas
fluorescentes JC-1 proporcionó evidencia directa de la disminución de las
disfunciones mitocondriales en los ovocitos envejecidos (Figura 1F). En conjunto,
estos resultados indican que los ovocitos envejecidos están asociados con defectos
morfológicos, cuantitativos y funcionales de las mitocondrias, que pueden ser
heredados por embriones tempranos posteriores.
Las células iPS comparten una morfología y funciones mitocondriales
similares con los ovocitos . Para seleccionar las células donantes preferidas
para la transferencia mitocondrial, comparamos la morfología y la actividad
mitocondrial entre diferentes tipos de células, es decir, ovocitos, pluripotentes
representativas y células diferenciadas. Los resultados de la observación con
microscopía electrónica indicaron que, de manera similar a los de los ovocitos
(Figura 1A), las mitocondrias en las células iPS también tenían una estructura
inmadura esférica representativa, mientras que las células MEF exhibieron
mitocondrias alargadas o filamentosas con crestas aumentadas (Figura 2A). La
observación también fue respaldada por la tinción inmunofluorescente de la
translocasa de la membrana mitocondrial externa 20 (TOM20) (Figura 2B). Además
de la detección morfológica, luego comparamos la actividad metabólica mitocondrial
de estos tipos de células a través de la evaluación del potencial de la membrana
mitocondrial. Las células iPS y los ovocitos tienen un potencial de membrana
mitocondrial similar, que fue significativamente menor que el de las células MEF
(Figura 2C). Juntos, estos resultados sugirieron que las mitocondrias en las células
iPS se asemejan morfológica y funcionalmente a las de los ovocitos, mientras que
las células somáticas diferenciadas tienen mitocondrias distintas.
C. Zhang et al., 2021, Vol. 104, No. 5
estados Este hecho plantea la posibilidad de que las células pluripotentes sean
donantes más preferidos para la transferencia mitocondrial autóloga que las células
somáticas diferenciadas.
Transferencia mitocondrial de rescates de células iPS
potencial de desarrollo de embriones de FIV de ratones
envejecidos Habiendo confirmado el parecido mitocondrial
entre los ovocitos y las células iPS, preguntamos si las células iPS pueden usarse
como donantes para la transferencia mitocondrial para rescatar el potencial de
desarrollo embrionario deteriorado de ratones envejecidos. Para probar esto,
aislamos mitocondrias de células iPS o MEF a través del procedimiento bien
establecido que mantiene la actividad mitocondrial (Figura 3A). Las mitocondrias
purificadas a partir de células MEF o iPS se inyectaron en ovocitos fertilizados
siguiendo un proceso de FIV estándar, y también se inyectó el mismo volumen de
tampón vehículo como control negativo (Figura 3B). Los resultados mostraron que
la transferencia mitocondrial ni de iPS ni de MEF
pueden mejorar la tasa de desarrollo previa a la implantación después de la FIV
(Figura 4A). Sin embargo, un análisis más detallado indicó que la transferencia de
mitocondrias derivadas de iPS podría acelerar la progresión del desarrollo de
preimplantación por etapa de blastocisto (Figura 4B). De acuerdo con esto,
después de la transferencia de embriones, se puede obtener una tasa de
implantación significativamente mayor después de inyectar mitocondrias derivadas
de células iPS, pero no con mitocondrias derivadas de células MEF (Figura 4C).
Luego, usando ovocitos fertilizados de ratones C57BL/6 envejecidos, confirmamos
aún más el efecto beneficioso de la transferencia mitocondrial
de células iPS no se limita a un genotipo específico (Figura 4D).
Además, en las etapas de implantación y postimplantación, la observación
histomorfológica reveló además que los embriones inyectados con mitocondrias
derivadas de células iPS mostraban puntos de referencia morfológicos
representativos de gastrulación (Figura 4E) y fetos en mitad de la gestación (Figura
4F), que son comparables a los de los embriones obtenidos de ratones jóvenes.
Finalmente, confirmamos que la transferencia mitocondrial de las células iPS, pero
no de las células MEF, puede rescatar significativamente la tasa de natalidad de
los ratones envejecidos (Figura 4G).
La transferencia mitocondrial de las células iPS mejora el
comportamiento mitocondrial en la etapa de preimplantación temprana Dado que
las mitocondrias depositadas por la madre en los ovocitos son críticas para apoyar
el desarrollo de preimplantación, especialmente antes del cambio de OXPHOS a
la glucólisis antes de la etapa de mórula [2], intentamos abordar si la transferencia
mitocondrial de las células iPS podría atenuar las anomalías mitocondriales
asociadas con el envejecimiento en embriones preimplantacionales tempranos. En
la etapa de escisión, los embriones generados a partir de ratones envejecidos
mostraron un nivel más bajo de número de copias de ADNmt que sus contrapartes
jóvenes, seguido de una disminución gradual en el ADNmt hasta la etapa de
blastocisto; por el contrario, la transferencia mitocondrial de las células iPS atenuó
significativamente la disminución y, por lo tanto, resultó en un mayor número de
copias de mtDNA en embriones de 2 células, que fue comparable al de sus
contrapartes jóvenes (Figura 5A).
Además, debido a que el metabolismo mitocondrial representa en gran medida
la producción de energía antes de la etapa de mórula, a continuación detectamos
la contribución de OXPHOS a la producción total de ATP en la etapa de escisión y
de 8 células. Encontramos una disminución significativa en la contribución de
OXPHOS tanto en la escisión como en los embriones de 8 células generados a
partir de ratones envejecidos, mientras que la disminución puede revertirse a los
niveles normales mediante la transferencia mitocondrial de las células iPS (Figura
5B y C). Estos resultados indican que la transferencia mitocondrial de las células
iPS no solo compensa la pérdida de mtDNA, sino que también rescata el
metabolismo mitocondrial en embriones de preimplantación generados a partir de ratones envejecidos.
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iPS-la transferencia mitocondrial beneficia a los embriones de FIV, 2021, vol. 104, núm. 5 1119

Figura 1. Los ovocitos envejecidos están asociados con anomalías funcionales y morfológicas de las mitocondrias. (A) Comparación morfológica de mitocondrias entre ovocitos jóvenes
y envejecidos basada en observaciones microscópicas electrónicas. Las puntas de flecha rojas indican imágenes representativas de vacuolización mitocondrial que se caracterizan por
una matriz no uniforme y pérdida de crestas. Columna derecha: cuantificaciones de la morfología mitocondrial en ovocitos jóvenes y envejecidos.
Barra de escala = 200 nm. (B–C) Comparaciones de los números de copias de mtDNA (B) y los niveles de ATP (C) entre ovocitos jóvenes y viejos. (D-E) Contribuciones relativas de
OXPHOS y la glucólisis a la producción de ATP en ovocitos jóvenes y envejecidos (D) o embriones de 2 células posteriores (E). (F) Detección del potencial de membrana mitocondrial en
ovocitos jóvenes y envejecidos. Columna derecha: potencial de membrana mitocondrial mediante la cuantificación de proporciones de fluorescencia roja: verde JC-1. ÿP < 0,05. ÿÿP < 0,01.

Discusión
Una de las características del envejecimiento del organismo es el deterioro y la
disfunción mitocondrial, que es común a diferentes tipos de células [34, 35].
Aunque existe una importante fuente alternativa de producción de ATP (p. ej.,
vía de recuperación de adenosina) [36, 37], los ovocitos son muy sensibles a
los trastornos mitocondriales relacionados con el envejecimiento, y se pensó
que esta era la razón principal del bajo rendimiento reproductivo de las mujeres
mayores. [38]. La disminución del número de copias de mtDNA es la
característica más destacada en los ovocitos y embriones de hembras
envejecidas de diferentes especies [6, 39–41]. En ratones, se informó una
granulares
disminución significativa en el número de copias de mtDNA en ovocitos de hembras mayores
de más de
10 meses [6, 41]. Nuestro estudio, sin embargo, sugiere que la pérdida de
mtDNA en ovocitos y embriones preimplantacionales tempranos puede ocurrir
tan pronto como a los 8 meses de edad. Además, la disminución del número
de copias de mtDNA es el biomarcador bien establecido de la mala calidad de
los ovocitos, y está altamente asociado con un potencial de desarrollo
embrionario deteriorado en condiciones de estrés físico o químico viral [42-44].
También informamos cambios en la ultraestructura mitocondrial en ovocitos de
ratones envejecidos: es decir, destrucción parcial o total de las crestas,
formación de vacuolas intramitocondriales, disminución de la densidad de la
matriz mitocondrial, que son similares a los informados en ovocitos envejecidos
[45] y otros tipos de células, que incluyen miocitos cardíacos [46], neuronas
del cerebelo
[47] y fibroblastos musculares [48].
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1120 C. Zhang et al., 2021, Vol. 104, No. 5

Figura 2. Las células iPS y los ovocitos comparten morfología y funciones mitocondriales similares. (A) Comparación morfológica de mitocondrias entre células iPS y MEF
basadas en observaciones microscópicas electrónicas. Imágenes representativas de mitocondrias esféricas inmaduras (b-d) y alargadas (f-j) en células iPS y MEF. ( d, f ) Mayor
aumento de las regiones encuadradas en ( a ) y ( e ), respectivamente. (B) Tinción inmunofluorescente de TOM20 en ovocitos, células iPS y MEF. (C) Detección del potencial
de membrana mitocondrial en ovocitos, células iPS y MEF utilizando sondas fluorescentes JC-1. Panel inferior: potencial de membrana mitocondrial mediante la cuantificación
de proporciones de fluorescencia JC-1 rojo:verde. ÿP < 0,05.

La disminución del número de copias de mtDNA, junto con la ultraestructura
mitocondrial desorganizada, nos llevó a probar si la función mitocondrial se interrumpe
en los ovocitos de ratones envejecidos. Nuestros resultados mostraron que la inhibición
asociada con el envejecimiento en OXPHOS mitocondrial puede contribuir en gran
medida a la menor producción total de ATP en los ovocitos.
Curiosamente, también encontramos que la glucólisis parece activarse de manera
aberrante en los ovocitos de ratones envejecidos y sus embriones tempranos
derivados, lo cual es similar a las observaciones en otras células envejecidas [49, 50],
lo que sugiere que el metabolismo mitocondrial interrumpido y la compensación
glucolítica pueden ser común entre las células somáticas, así como los gametos y las
células embrionarias tempranas durante el proceso de envejecimiento.
Hasta ahora, la transferencia de vesículas germinales o los procedimientos de
transferencia de mitocondrias heterólogas aún presentan grandes preocupaciones
éticas, por lo que la transferencia de mitocondrias autólogas aumenta la esperanza de
mejorar la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo del embrión,
especialmente para pacientes que sufren de disminución del número de mitocondrias
intraovocitos y producción de ATP, como el envejecimiento. mujeres subfértiles/
estériles. Aunque se ha informado el efecto beneficioso de las mitocondrias derivadas
de células somáticas en estudios clínicos y de laboratorio [17, 51], la eficacia de la
transferencia mitocondrial autóloga para mejorar la calidad de los ovocitos y el
potencial de desarrollo del embrión sigue siendo controvertida.
Utilizando mitocondrias aisladas de células de hígado de ratón, un estudio reciente
sugirió que la transferencia mitocondrial de células somáticas no es suficiente para
mejorar la calidad de los ovocitos y el potencial de desarrollo embrionario de ratones
envejecidos [18]. De acuerdo con esto, un estudio anterior, utilizando ovocitos
partenogenéticos como modelo, mostró que la microinyección de citoplasma o
mitocondrias derivadas de células somáticas
deterioro de la tasa de desarrollo [19]. Los autores presentaron dos explicaciones: (1)
la mala calidad de los ovocitos de mujeres ancianas puede no estar limitada a la
disfunción mitocondrial, porque otros orgánulos, como el retículo endoplásmico,
también se vieron afectados en los ovocitos de mujeres ancianas [52]; (2) las
mitocondrias derivadas de células hepáticas u otras células somáticas pueden
desempeñar diferentes funciones en los ovocitos debido a la diversidad de estructuras
y funciones mitocondriales entre los tipos de células [2].
Nuestros resultados sugieren que esto último puede contribuir en gran medida a la
observación de Igarashi et al., ya que la transferencia de mitocondrias de las células
iPS rescató significativamente los resultados de la FIV de los ratones envejecidos.
Nuestros resultados, junto con nociones previas [2, 20, 21], indican que las células
iPS comparten morfología y funciones mitocondriales similares con los ovocitos.
Además, considerando el papel esencial del estado mitocondrial apropiado para
determinar el potencial de desarrollo del embrión, parece racional que la calidad de
los ovocitos no se beneficie de complementar las mitocondrias que son asincrónicas
con el entorno citoplasmático y el estado nuclear del ovocito.
Nuestros resultados sugieren que si complementamos las mitocondrias o no, así
como las mitocondrias de células somáticas o células pluripotentes, no afectaría la
tasa de desarrollo de preimplantación. Sin embargo, en comparación con la
microinyección de mitocondrias derivadas de tampón y MEF, la transferencia
mitocondrial de las células iPS puede beneficiar el comportamiento mitocondrial al
atenuar la disminución del mtDNA asociada con el envejecimiento y la depresión de
OXPHOS y, por lo tanto, mejorar la tasa de implantación y el posterior crecimiento
fetal. Usando esta estrategia, la tasa de desarrollo y supervivencia del embrión
después de la transferencia mitocondrial iPS es comparable a la de los ovocitos
jóvenes.
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iPS-la transferencia mitocondrial beneficia a los embriones de FIV, 2021, vol. 104, núm. 5 1121

Figura 3. (A) Actividad mitocondrial de mitocondrias aisladas de células iPS y MEF determinada por tinción MitoTracker. (B) Ilustración esquemática del diseño
experimental para probar la eficacia de la transferencia mitocondrial de células iPS para rescatar el potencial de desarrollo embrionario deteriorado por el envejecimiento
hembras

informado en nuestros estudios previos [25, 53, 54]. Más recientemente, un
estudio de Li et al. [31] demostraron que ni la formación de blastocistos ni la tasa
de implantación mejorarían con la transferencia mitocondrial de las células iPS.
Cabe señalar que este estudio se realizó con ovocitos de ratones jóvenes (de 8
a 10 semanas de edad), de los cuales el número de mitocondrias intraovocitos
puede ser suficiente para el umbral crítico de desarrollo [3], y los autores también
mencionaron que queda por determinar si este método puede mejorar el desarrollo
embrionario, especialmente en ratones más viejos [31]. Estudios previos han
informado que el número de copias de mtDNA es significativamente mayor en
blastocistos de ratones y humanos en edad reproductiva [55–57]. Sin embargo,
esta observación no se detectó en nuestro estudio. Por el contrario, encontramos
un
Números de copias de mtDNA significativamente más bajos en embriones de 2
células de ratones envejecidos, lo cual está en línea con lo informado en
embriones en etapa de escisión de pacientes envejecidos [57]. Este resultado,
junto con la mayor contribución de OXPHOS a la producción total de ATP, sugiere
que la transferencia mitocondrial desde células iPS puede reducir sistemáticamente
los defectos mitocondriales en embriones tempranos derivados de hembras envejecidas.
Para excluir las posibles variables que pueden afectar los resultados finales,
en el presente trabajo se utilizó una línea celular iPS femenina de alto potencial
bien establecida. Sin embargo, las células iPS personalizadas de pacientes
mayores deberían ser una opción más racional para el uso clínico práctico.
Además, se ha informado que las células de envejecimiento diferenciadas
experimentarían un rejuvenecimiento epigenético y genético integral durante la inducción
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1122 C. Zhang et al., 2021, Vol. 104, No. 5

Figura 4. La transferencia mitocondrial de células iPS rescata el potencial de desarrollo de embriones de FIV de ratones envejecidos. (A) Efecto de la transferencia mitocondrial de células iPS o MEF
sobre la tasa de desarrollo de ovocitos envejecidos antes de la implantación. (B) Progresión del desarrollo durante la formación de blastocistos después de la transferencia mitocondrial desde células iPS.
(C y D) Efecto de la transferencia mitocondrial de células iPS o MEF sobre el potencial de implantación después de la transferencia de embriones, cuando se usaron ovocitos fertilizados con ICR (C) y
C57BL/6 (D) como receptores. Columna izquierda: imágenes representativas de los sitios de implantación de embriones en E7.5. Columna derecha: cuantificaciones de tasas de implantación de embriones
derivados de diferentes estrategias de transferencia mitocondrial. (E–F) Comparación morfológica de embriones E7.5 (E) y E10.5 (F).
(G) Efecto de la transferencia mitocondrial de células iPS o MEF en la tasa de nacidos vivos después de la transferencia de embriones. Columna izquierda: imágenes representativas de crías generadas
mediante transferencia mitocondrial. ÿP < 0,05, ÿÿP < 0,01.
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iPS-la transferencia mitocondrial beneficia a los embriones de FIV, 2021, vol. 104, núm. 5 1123

Figura 5. La transferencia mitocondrial de células iPS mejora el comportamiento mitocondrial en la etapa de preimplantación temprana. (A) Efecto de la transferencia mitocondrial de iPS en el
número de copias de mtDNA en ovocitos fertilizados y embriones de preimplantación posteriores. (B y C) Contribuciones relativas de OXPHOS a la producción de ATP en embriones de 2
células (B) y 8 células (C) derivados de ratones jóvenes y envejecidos. (D) Un flujo de trabajo esquemático para mejorar los resultados de la FIV de pacientes de edad avanzada a través de la
transferencia mitocondrial de sus células iPS autólogas inducidas.

la reprogramación [58–60] y los procesos de reprogramación también inducen el analizó los datos, escribió y finalizó el manuscrito. Todos los autores aprobaron
rejuvenecimiento mitocondrial [21, 61, 62]. A pesar de esto, será necesario el artículo.
detectar el estado mitocondrial de las células iPS derivadas de pacientes que
envejecen antes de la inyección.
Nuestro estudio actual, utilizando ratones que envejecen naturalmente como Material suplementario
modelo, demostró que inyectar mitocondrias derivadas de iPS en ovocitos Material suplementario está disponible en BIOLRE en línea.
fertilizados puede mejorar directamente el potencial de desarrollo embrionario de
las hembras que envejecen y, por lo tanto, mejorar la tasa de embarazo después
de los procesos de FIV. Nuestro estudio actual ha sugerido una estrategia Conflicto de intereses
potencial para mejorar los resultados de FIV de pacientes de edad avanzada a
Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.
través de la transferencia mitocondrial de sus células iPS autólogas inducidas
(Figura 5D), que también evita las preocupaciones éticas de la transferencia mitocondrial actual
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