Efecto del Cloruro de Guanidinio en la estructura secundaria de la proteína BSA

Giselle Acevedo, Rocio Balda, M. Victoria Batto.

ABSTRACT: Durante este trabajo se trabajó con soluciones proteicas de la proteína BSA con el objetivo de estudiar su es -
tructura segundaria en presencia de diferentes concentraciones de cloruro de guanidinio. Se pudo evidenciar un cambio en
la estructura secundaria global de la proteína al medir los espectros de dicroísmo de la BSA en presencia del desnaturalizan -
te y se corroboro la similitud con las estructuras reportadas de la BSA en bibliografía.

Introducción Data Pitch 0,1 nm

Scanning Mode Immediately
El Dicroísmo Circular es una técnica espectroscó-
Scanning Speed 100 nm/min
pica no destructiva destinada al análisis conformacional de
sustancias ópticamente activas. El DC mide la absorción di- D.I.T. 2 sec
ferencial de la luz polarizada circularmente hacia la dere- Bandwidth 4,00 nm
cha y hacia la izquierda. El DC es una de las técnicas más Acumulations 2
sensibles para la determinación de la conformación y la Tabla 1: Parámetros instrumentales utilizados en la medición de los es-
monitorización de cambios estructurales de biomoléculas. pectros de DC.
Permite interpretar directamente los cambios en
la estructura secundaria de un péptido o una proteína. El Resultados y Discusión
espectro de DC del ultravioleta lejano de proteínas es ex-
Los espectros de dicroísmo circular obtenidos
tremadamente sensible a la estructura de la proteína,
para las soluciones descriptas pueden observarse en la Fi-
mientras que el espectro del ultravioleta cercano refleja
gura 1.
las contribuciones de las cadenas laterales aromáticas,
puentes disulfuro y las bandas de DC inducidas por grupos
prostéticos. Todas estas medidas proporcionan informa- 30
ción acerca de la estructura global de una molécula protei-
ca así como su conformación local alrededor de los grupos 20
aromáticos y las uniones disulfuro.
10
El objetivo principal del trabajo es el estudio del
Elipticidad cruda (mdeg)

efecto de distintas concentraciones de del cloruro de gua- 0

nidinio en la estructura secundaria de la proteína seroal- 190 210 230 250 270 290 310
búmina bovina (BSA). Para lograr dicho objetivo se utilizó -10
la técnica de medición del dicroísmo circular que permite
el estudio la estructura y estabilidad de biomoléculas. -20
0M
-30 GdnCl
Materials and Methods 1M
GdnCl
-40 3M
Se prepararon 4 soluciones de BSA 5µM en buffer GdnCl
Tris pH= 7,4 dichas soluciones fueron incubadas por 1 hora -50 6M
GdnCl
con cloruro de guanidinio 0M, 1M, 3M y 6M. Luego se pro-
cedió a la medición del espectro de dicroísmo circular de -60
las 4 soluciones mencionadas. Longitud de onda (nm)
El equipo utilizado para las mediciones fue un po-
Figura 1: Espectro de DC de las soluciones evaluadas, elipticidad cruda en
larímetro Jasco J-815. Se eligieron los parámetros instru- función de la longitud de onda.
mentales adecuados para el estudio de la estructura se-
cundaria de la BSA a través de la medición del espectro di-
croísmo circular de la misma. Los parámetros instrumenta-
les utilizados para para las mediciones se pueden observan
en la Tabla 1. Se buscó que los parámetros instrumentales
den un espectro con una relación señal/ruido aceptable
manteniendo un tiempo de medición razonable.

Parámetros instrumentales
Photometric mode DC, HT
Figura 2: Estructura de la proteína BSA cristalizada obtenida por la técni-
Measure range 320 - 200 nm ca de Rayos X reportada en literatura.

Al evaluar el espectro de dicroísmo de la proteína
BSA nativa (solución con 0M GdnCl) se observan picos pro-
nunciados alrededor de 208nm y 222nm, estos picos son
característicos del espectro de DC de estructuras secunda-
rias de tipo α-hélice. Estos resultados son compatibles con
la información de la estructura secundaria de la BSA obte-
nida por técnicas como Rayos X o RMN. Como se puede
observar en la Figura 2, la estructura obtenida por Rayos X
muestra la presencia de muchas estructuras de tipo α-héli-
ce en concordancia con los resultados obtenidos en el es-
pectro de DC.
Al considerar la influencia de diferentes concen-
traciones de GdnCl en la estructura secundaria de la BSA
se observa una pérdida de la estructura secundaria ya que
la intensidad de la señal de DC disminuye considerable-
mente con el agregado de cantidades crecientes de GdnCl.
Se aprecia que el espectro de DC comienza a tender a una
estructura tipo random coil en vez de tener los picos carac-
terísticos de estructuras de tipo α-hélice. Estos resultados
son lógicos considerando que el GdnCl es un agente desna-
turalizante de proteínas, por lo tanto a mayor concentra-
ción del mismo las proteínas tienden a perder su estructu-
ra plegada.
950
0M GdnCl
850 1M GdnCl
3M GdnCl
750
6M GdnCl
650
HT (V)
550
450
350
250
150
190 210 230 250 270 290
Longitud de onda (nm)
Figura 3: Potencia del PMT: Potencia medida por el fotomultiplicador en
función de la longitud de onda de medición.
En el caso de querer estudiar el desplegado de la
BSA en función de GdnCl, sería conveniente tomar longitu-
des de onda alrededor de los 225nm. En la Figura 2 se pue-
de observar que a longitudes de onda cercanas a 225nm
se ve una variación considerable en la señal de DC de la
proteína. Es conveniente tomar una longitud de onda a las
cuales el cambio de señal sea lo más grande posible de for-
ma de minimizar el error relativo de la medición. Además,
es necesario considerar el rango de longitudes de onda en
las cuales los 4 espectros tengan una relación señal/ruido
aceptable. Para evaluar este parámetro se puede observar
en la Figura 3 un gráfico de la potencia del fotomultiplica-
dor utilizado para la medición en función de la longitud de
onda utilizada Este grafico muestra el punto de saturación
del fotomultiplicador para cada una de las soluciones eva-
luadas donde es necesario elegir longitudes de onda por
encima del punto de saturación del fotomultiplicador para
que la medición sea confiable. Por lo tanto, es necesario
que la longitud de onda elegida para el estudio del desple-
gado de la BSA este siempre por encima del límite de satu-
ración del fotomultiplicador. Teniendo en cuenta estas
consideraciones, longitudes de onda alrededor de 225nm
serían una buena elección para estudiar el efecto del Gdn-
Cl en el desplegado de la BSA.
Elipticidad molar (degxcm2xdmol-1x res-1)
10000
5000
0
190 210 230 250 270 290 310
-5000
0M GdnCl
-10000 1M GdnCl
3M GdnCl
-15000 6M GdnCl
-20000
Longitud de onda (nm)
Figura 4: Espectro de DC de las soluciones evaluadas, elipticidad molar en
función de la longitud de onda.
En el caso de disminuir a la mitad la concentra-
ción de BSA las intensidades mostradas en el gráfico de la
Figura 1 se reducirían a la mitad ya que se graficó la elipti-
sidad cruda la cual es dependiente de la concentración, del
paso óptico y del número de enlaces peptídicos presentes
310
en la proteína medida. Esto ocurre debido a que la técnica
de DC es una técnica de medición de absorbancia, y asu-
miendo que nos encontramos en el rango lineal, las medi-
ciones se rigen por la ley de Lambert-Beer por lo que si se
reduce la concentración a la mitad la absorbancia también
se reducirá a la mitad. En cambio si el grafico se realiza en
función de la Eliptisidad molar pesada por residuos, como
se observa en la Figura 4, la Eliptisidad se independiza de
los parámetros de concentración, del paso óptico y del nú-
mero de enlaces peptídicos presentes en la proteína media
por lo que la misma no cambiaría si la concentración se re-
duce a la mitad.
Conclusiones
 Los resultados obtenidos en este trabajo eviden-
ciaron la compatibilidad entre la estructura secundaria di-
lucidada por técnicas como Rayos X o RMN con la medida
por DC. Además se pudieron estudiar los efectos de dife-
rentes concentraciones de GdnCl en la estructura global de
la BSA, demostrando la utilidad de la técnica de DC a la
hora del estudio de cambios conformacionales en proteí-
nas.

Abreviaciones

DC = dicroísmo circular; BSA= seroalbúmina bovina; GdnCl

= cloruro de guanidinio; RMN = Resonancia magnética nu-
clear; PMT= photomultiplier o fotomultiplicador.

Referencias

Guia de Trabajos Practicos, Instrumentacion Biologica

2021.