UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE MARICULTURA

TRABAJO PRACTICO PROFESIONAL

LICECNCIADO EN BIOTECCNOLOGIA GENOMICA

PRESENTA:

CARLO ALFREDO RIVERA ABARCA

TITULO:

Evaluación de la acción inmunoestimulante de Pelvetia compressa en camarones

Litopenaeus vannamei.

DIRECTOR DE TRABAJO PRACTICO PROFESIONAL:

Dra. Martha Guadalupe Nieto López

LUGAR DE TRABAJO:
Programa de maricultura

San Nicolás de las Garza, N. L. a 20 de febrero de 2020

Resumen

En este estudio se evaluará la acción inmunoestimulante de la harina de Pelvetia

compressa en camarones Litopenaeus vannamei mediante la inmersión de los
organismos en agua salada con diferentes concentraciones del alga en harina (100,
300 y 500 mg/L) y extracto (50, 150, y 300 mg/L). Los organismos serán inmersos
durante 5 horas, y se tomaran muestras de la hemolinfa (100 μL en 200 μL de
Alsever) se tomaran muestras de hemolinfa a las hora 1, 3 y 5. Se medirá la
activación de profenoloxidasa y la generación de aniones superóxido de hemocitos
del camarón in vitro. Se medirán múltiples parámetros tales como cuenta de
hemocitos totales, células granulares actividad PO y RB. Finalmente se realizará un
desafío a los organismos después del periodo de inmunoestimulación contra Vibrio
alginolyticus y se medirá la tasa de supervivencia. Los datos obtenidos serán
procesados en una ANOVA bifactorial (tiempo y Tx) y comparación múltiple de
medias (Tukey).

Summary

In this study, the immunostimulant action of Pelvetia compresssa flour in shrimp

Litopenaeus vannamei will be evaluated by immersing the organisms in salt water
with different components of the algae in flour (100, 300 and 500 mg / L) and extract
(50, 150 , and 300 mg / L). The organisms will be immersed for 5 hours, and
hemolymph sample (100 μL in 200 μL of Alsever) will be taken, hemolymph samples
will be taken at 1, 3 and 5 hours. The activation of profenoloxidase and the
generation of superoxide anions will be measured. of shrimp hemocytes in vitro.
Multiple parameters are measured as total hemocyte counts, granular cells PO and
RB activity. Finally, a challenge was made to the organisms after the period of
immunostimulation against Vibrio alginolyticus and the survival rate will be
measured. The data obtained will be processed in a bifactorial ANOVA (time and Tx)
and multiple media comparison (Tukey).
Introducción

La producción de camarón blanco Litopenaus vannamei en México es una fuente

importante de ingresos, lamentablemente los niveles de producción de este
crustáceo han fluctuado tendiendo a su disminución en la producción, en 2016 se
produjeron 211mil toneladas mientras que en 2017 se cultivaron solo 150mil 76
toneladas (SAGARPA, 2018), esto debido a la presencia de diversas enfermedades
las cuales provocan una cosecha prematura, como respuesta se han comenzado a
investigar distintos métodos para aumentar su resistencia inmunológica tales como
cambios en la formulación del alimento o la adición de componentes al agua.

La vibriosis representa un serio problema en el cultivo de camarón ya que se han

registrado mortalidades masivas tanto en laboratorios de producción larvaria y en la
etapa de engorda, esto debido a la falta de medidas de control sanitarias suficientes,
tales como certificados de salud, cuarentena y análisis de riesgos de este patógeno,
esto ha ocasionado su dispersión, así como de otros patógenos de camarón dando
como resultado problemáticas económicas y sociales. (SENASICA, 2003; Goarant
et al., 2006; Jayasree et al., 2006).

Estos crustáceos no poseen respuesta inmune especifica contra agentes

infecciosos, pero cuentan con un sistema inespecífico altamente desarrollado y
eficiente, basado en hemocitos circulantes (hialinos, granulares y semigranulares)
quienes poseen capacidad citotóxica y comunicación intracelular que facilita la
función de coagulación, reconocimiento, fagocitosis, melanizacion, formación de
nódulos y encapsulación. (Aguirre-Guzmán et al., 2009), la destrucción de
patógenos es favorecida por el sistema profenoloxidasa y la cascada de
coagulación, sin embargo, no han desarrollado capacidad de memoria inmune, lo
que dificulta la prevención de enfermedades recurrentes en los cultivos. (Zhang et
al., 2015)

Se ha visto que compuestos contenidos en algas cafés (Macrocystis pyrifera,

Ascophillum nodosum, Turbinaria decurrens) tales como el alginato y fucoidan
administrados como alimento o agregados al agua donde están siendo criados los
organismos aumenta tanto la velocidad de crecimiento del organismo así como su
capacidad de respuesta inmune en peces y crustáceos, (Zhang et al, 2015;
Meenakshi et al, 2019) incluso se ha documentado que el co-cultivo de macroalgas
(G. vermiculophylla, D. dichotoma y Ulva Lactuca ) logra resultados positivos en la
mejora de la respuesta del sistema inmune de los camarones blancos(L. vannamei),
esto debido a que reduce el stress de los camarones y disminuye la concentración
de amonio en el agua, lo que les permite tener más energía disponible para combatir
las infecciones. (Anaya-Rosas et al, 2019)

El presente proyecto pretende evaluar la activación de profenoloxidasa y la

generación de aniones superóxido de hemocitos del camarón in vitro, examinar la
respuesta inmune del camarón blanco Litopenaeus vannamei, y su resistencia a
Vibrio alginolyticus cuando el camarón sea sumergido en agua salada con diferentes
concentraciones de Pelvetia compressa en harina y extracto. Se examinarán
múltiples parámetros tales como cuenta de hemocitos totales, células granulares
actividad PO y RB.
Antecedentes

Importancia del cultivo de Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)

Este es un crustáceo decápodo de la familia de los peneidos nativo del pacifico;

desde Sonora, México hasta Tumbes, Perú en áreas donde la temperatura del agua
es superior a 20°C en todo el año. Este fue introducido a las costas de México
gracias al cultivo acuícola, en 1988 de estableció la primera granja en Campeche.
(SAGARPA, 2018)

La producción de este crustáceo ha variado en los últimos años en México, en 2016

se logró alcanzar el noveno puesto de cultivo del crustáceo a nivel mundial, desde
el 2013 hasta el 2016 esta industria registro un aumento en la producción del 65.5%
pasando de cultivar 127 mil 517 toneladas en 2013 a 211 mil 96 toneladas en 2016,
sin embargo en 2017 se tuvo la mayor reducción registrada en la producción anual
del crustáceo, ya que en 2017 se cultivaron solo 150mil 76 toneladas, (SAGARPA,
2018) esto debido a la presencia de enfermedades que mermaron la producción
resultado de la falta de medidas sanitarias recomendadas por la SAGARPA en el
manual de buenas prácticas de producción acuícola de camarón.

Existen una gran cantidad de patógenos de los que es huésped L. vannamei, en la

actualidad de han identificado 20 tipos de virus diferentes que afectan de manera
directa o indirecta al camarón, los de mayor incidencia en América son; TSV (virus
del síndrome de Taura), IHHNV (virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética
infecciosa), YHV (virus de la cabeza amarilla), IMNV (virus de la mionecrosis
infecciosa) y WSSV (virus del síndrome de la mancha blanca). (Godinez-Siordia et
al., 2012) Este crustáceo es también afectado por enfermedades bacterianas las
cuales no representan un peligro sanitario para el humano, sin embargo, aumentan
la mortandad en los cultivos de manera alarmante, ejemplo de estos tenemos a
Vibrio alginolyticus y Vibrio harveyi. (Lavilla-Pigoto et al,. 1998)

Para evitar brotes de algún patógeno y su dispersión en el camarón y otros animales

utilizados en acuacultura se ha utilizado la inmunoestimulación mediada por algunos
compuestos, como lo son polisacáridos variados, lipopolisacáridos, peptidoglicano,
compuestos derivados de algas marinas como el alginato, fucoidan, carragenina y
laminarina, se ha comprobado la efectividad de estos en diversos estudios de
manera in vivo e in vitro. (Raa J., 1996; Sakai M., 1999; Smith V. et al., 2004)

Frente a la necesidad de fortalecer el sistema inmune de L. vannamei sin el uso de

medicamentos se han formulado diferentes dietas donde algas son incluidas, así
como protocolos donde el camarón es inmerso en agua salada con diferentes
concentraciones del harina y extracto del alga, entre algas probadas con resultados
satisfactorios de inmunoestimulacion esta Sargassum hemiphyllum, Sargassum
duplicatum, Sargassum glaucescens y Sargassum cristafolium, todas algas pardas,
este tipo de algas tienen un alto contenido de polisacáridos variados, fucoidan y
alginatos, compuestos que han sido utilizados de manera individual para la
inmunoestimulacion. Las cantidades utilizadas en los protocolos de inmersión son
muy similares en la mayor parte de los protocolos que han obtenido resultados
positivos, siendo de 0, 100, 300 y 500mg/L por 1, 3 y 5 horas, donde se han
observado reacciones inmunoestimulantes significativas desde los 300mg/L, se ha
reportado una tasa de supervivencia al desafío con patógenos en dos protocolos
que han utilizado estas concentraciones. (Huynh et al., 2011; Yeh et al., 2006;
Yudiati et al., 2016; Ghaednia et al., 2011)
Hipotesis del trabajo

Los camarones Litopenaeus vannamei inmersos en agua salada con extracto y

harina de Pelvetia compressa serán inmunoestimulados significativamente,
aumentando su producción de profenoloxidasa y la generación de aniones
superóxido de hemocitos, reduciendo su mortalidad contra Vibrio alginolyticus.
Objetivo general

Evaluar la actividad inmunoestimulante del harina y extracto de Pelvetia compressa

a camarones blancos Litopenaeus vanammei inmersos en agua salada mediante la
medición de la activación de profenoloxidasa y la generación de aniones superóxido
de hemocitos del camarón in vitro. Se medirán múltiples parámetros tales como
cuenta de hemocitos totales, células granulares actividad PO y RB. Comprobar la
inmunoestimulacion mediante un desafío a los organismos después del periodo de
inmunoestimulación contra Vibrio alginolyticus y se medirá la tasa de supervivencia
contra el tiempo.
Material y métodos

Diseño experimental: Se trabajará en las siguientes fases; análisis in vivo con

camarones juveniles de L. vannamei, evaluación in vitro de sus propiedades
inmunoestimulantes, desafío del camarón con Vibrio alginolyticus análisis de datos
por medio de ANOVA bifactorial (Tiempo y Tx) y comparación múltiple de medias
(Tukey).

Análisis in vivo: se utilizarían acuarios de 10L sin recambio de agua con 10

organismos por acuario (30 ± 10°C, 33 ± 0.5ppt y 6mg/L de oxígeno), estos tendrán
diferentes dosis de la harina del alga, siendo de 100, 300 y 500 mg/L disueltos en
el agua, la dosis del extracto será de 50, 150 y 300 mg/L. Los organismos serán
inmersos durante 5 horas, y se tomarán muestras de la hemolinfa (100 μL en 200
μL de Alsever) se tomarán muestras de hemolinfa a las hora 1, 3 y 5. Se medirá la
activación de profenoloxidasa y la generación de aniones superóxido de hemocitos
del camarón in vitro. Se medirán múltiples parámetros tales como cuenta de
hemocitos totales, células granulares actividad PO y RB.

Desafío de los organismos: Una vez concluido el bioensayo de contacto con el

inmunoestimulante, se tomarán 5 camarones por acuario para la prueba infecciosa,
se trabajará con patógeno bacteriano (Vibrio parahaemolyticus por contacto) y se
mantendrá un control no infectado. Los patógenos serán activados para provocar la
enfermedad y virulencia validando su actividad in vitro, se tomará muestra de
hemolinfa a diferentes tiempos y de los tratamientos para evaluar el comportamiento
de las enzimas de respuesta inmune.
 Cronograma

Actividad Mes

1 2 3 4 5

Creación de Evaluación Procesamiento Desafío de Análisis y

extractos de del camarón de la hemolinfa y los procesamiento
alga y harina. por obtención de organismos de
inmersión. datos. contra Vibrio datos/redacción
Spp. de producto.
Bibliografía

Aguirre-Guzmán, G., Meija Ruíz, H. and Ascencio, F. (2004) A review of extracellular

virulence product of Vibrio sp. important in disease of cultivated shrimp. Aquaculture
Res. 35, 1395-1404.

Ghaednia, B. et al. (2011) ‘Effect of hot-water extract of brown seaweed

Sargassum glaucescens via immersion route on immune responses of
Fenneropenaeus indicus’, Iranian Journal of Fisheries Sciencesdian Journal of
Fisheries Sciences, 10(4), pp. 616–630

Goarant, C., Y. Reynaud, D. Ansquer, S. Decker, D. Saulnier & F. Le Roux. (2006).

Molecular epidemiology of Vibrio nigripulchritudo, a pathogen of cultured penaeid
shrimp (Litopenaeus stylirostris) in New Caledonia. Syst. Appl. Microbiol., 29: 570-
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Huynh, T.-G. et al. (2011) ‘White shrimp Litopenaeus vannamei immersed in

seawater containing Sargassum hemiphyllum var. chinense powder and its extract
showed increased immunity and resistance against Vibrio alginolyticus and white
spot syndrome virus.’, Fish & shellfish immunology, 31, pp. 286–293.

Jayasree, L.; P. Janakiram y R. Madhavi. (2006). Characterization of Vibrio spp.

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Journal of the World Aquaculture Society

Sakai, M. (1999) ‘Current research status of fish immunostimulants’, Aquaculture.

Elsevier, 172(1– 2), pp. 63–92.

S. Meenakshi, R. Saravanan, T. Balasubramanian, & A. Palavesam (2017). In vivo

administration of fucoidan from Turbinaria decurrens protects shrimps from white
spot syndrome virus, Indian Journal of Geo Marine Sciences Vol. 48 (02), February
2019, pp. 212-216

Yeh, S.-T., Lee, C.-S. and Chen, J.-C. (2006) ‘Administration of hot-water extract of
brown seaweed Sargassum duplicatum via immersion and injection enhances the
immune resistance of white shrimp Litopenaeus vannamei.’, Fish & shellfish
immunology, 20(3), pp. 332–45.

Yudiati, E. et al. (2016) ‘Innate immune-stimulating and immune genes up-

regulating activities of three types of alginate from Sargassum siliquosum in Pacific
white shrimp, Litopenaeus vannamei’, Fish and Shellfish Immunology. Elsevier Ltd,
54, pp. 46–53.
Zhang, W., Oda, T., Yu, Q., & Jin, J. O. (2015). Fucoidan from Macrocystis pyrifera
has powerful immune-modulatory effects compared to three other fucoidans. Marine
drugs, 13(3), 1084–1104. https://doi.org/10.3390/md13031084