Teorico Antibiograma

Susceptibilidad a los antimicrobianos
Metodología de trabajo
Lectura e interpretación
Dra. Patricia Marchiaro

JTP, Área bacteriología – Departamento de Microbiología
Fac. de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas – UNR
2014
ANTIMICROBIANO (ATM)
DEFINICIÓN:
- Sustancia química producida por un microorganismo o derivada sintética de ella que
mata o impide el desarrollo de un microorganismo.
Condición que debe tener un ATM: toxicidad selectiva. Es decir, deben afectar o destruir una
bacteria sin dañar significativamente las células humanas en dosis habituales. Esto se debe a
distintas estructuras y metabolismos de las células bacterianas y humanas.
CLASIFICACIÓN (existen diferentes criterios)
I. SEGÚN SU ORIGEN:
NATURAL: sustancia producida por el metabolismo de organismos vivos (Ej.
antibiótico penicilina producido por hongos, Penicillum notatum).
SEMISINTÉTICO: (Ej. cefalosporinas)
SINTÉTICO: producido por medios químicos (Ej. nitrofuranos).
II. CLASIFICACIÓN según efecto antibacteriano:
BACTERIOSTÁTICOS: BACTERICIDAS:
Inhiben el crecimiento bacteriano. Producen muerte o lisis bacteriana
Efecto reversible (bacteriolítico).
(Ej. cloranfenicol; eritromicina y otros Efecto irreversible.
macrólidos; clindamicina; sulfonamidas; (Ej. aminoglucósidos; β-lactámicos;
trimetroprima; tetraciclinas; linezolida; vancomicina; quinolonas; polimixina;
quinupristina/dalfopristina) rifampicina)
III. CLASIFICACIÓN según su mecanismo de acción
1. Inhibición de la síntesis de la pared
2. Alteración de la membrana celular
3. Inhibición de síntesis proteica
4. Inhibición de síntesis de ácidos nucleídos
5. Competitividad metabólica o inhibición de otros procesos metabólicos
ANTIMICROBIANO (ATM): mecanismo de acción
1. Inhibición de la síntesis de la pared
● inhibidores de fase citoplasmática

-Fosfonopéptidos: fosfomicina (FOS). Inhibición de la síntesis del N- acetil murámico.
● inhibidores de la organización estructura del peptidoglicano

-Glucopéptidos (vancomicina, teicoplanina): inhiben la síntesis de la pared en sus primeras
etapas al unirse a los precursores (residuo D-ala-D-ala del pentapéptido disacárido ) impidiendo
que se una la enzima para realizar la transglicosilación.
-β-lactámicos (Penicilinas, cefalosporinas de 1ª a 4a generación, monobactamas y

carbapenemes). Impiden la síntesis de la pared en su última etapa al unirse a proteínas de unión
a las penicilinas o PBPs (con actividad de transpeptidasas) impidiendo que estas realicen el
entrecruzamiento de las cadenas del peptidoglicano.
2. Alteración de la membrana celular.

Los ATM que actúan sobre esta estructura producen alteración de la permeabilidad de la
membrana bacteriana permitiendo salida de los constituyentes celulares esenciales para la
supervivencia. La integridad de la membrana citoplasmática y externa (bacilos gram negativos)
es vital para las bacterias. Son ATM bactericidas y bacterioliticos.
-polimixinas: polimixina B (POL), polimixina E (colistin- CO)
3. Inhibición de la síntesis proteica. Estos ATM llegan a los ribosomas y alteran el
metabolismo celular.
● Inhibidores de la fase de activación

-Mupirocina
● Inhibidores del inicio de la síntesis proteica

- aminoglucósidos: amikacina (AKN), gentamicina (GEN). Se unen a subu 30S.
-oxazolidinonas: linezolid (LNZ). Se une al ARNr23S
● Inhibidores de la fijación del aminoacil-ARNt al ribosoma

- tetraciclinas: tetraciclina (TET), minociclina (MNO), doxiciclina (DOXI). Se unen a subu 30S.
-glicilclicinas: tigeciclina (TGC)
● Inhibidores de la elongación. se unen a subu 50S

-Grupo (MLS): Macrólidos (eritromicina, azitromicina y claritomicina)
Lincosamidas (clindamicina)
Estreptogramina B (quinipristina/dalfopristina)
-Cloramfenicol (CHL).
- Ác. fusídico
4. Inhibición se síntesis de ácido nucléico.
Alteran la estructura o metabolismo de los ác. Nucleicos
- rifamicinas: rifampicina (RIF). Inhiben ARN polimerasa.

- quinolonas: norfloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina. Inhiben DNA girasa y topoisomerasa IV.
- nitroimidazoles: metronidazol, ornidazol, timidazol. Dentro de la células son reducidos
formándose radicales libres que rompen el ADN.l
-nitrofuranos: nitrofurantoína (NIT)
5. Competitividad metabólica o inhibición de otros procesos metabólicos.

Inhibidores de la síntesis de precursores de ác. Nucléicos
-Trimetoprima/sulfametoxazol (TMS). Inhibe

en 2 pasos secuenciales la síntesis de ác
tetrahidrofólico precursor de purinas,
pirimidinas y ác. nucleíco.
Las sulfonamidas inhiben dehidropteroato
sintetasa y la trimetroprima a la dehidrofolato
reductasa.
Algunos ATM bloquean mecanismos de resistencia.

-Algunos agentes β-lactámicos (ác. clavulánico, sulbactam, tazobactam) carecen
de actividad antibacteriana franca.
-Son inhibidores irreversibles de las enzimas β-lactamasas producidas por ciertas
bacterias.
- Estos inhibidores se usan en combinación con un β-lactámico para recuperar la
actividad perdida por la presencia de β-lactamasas bacterianas:
PTZ : piperacilina/tazobactama
AMC: amoxicilina/clavulánico
AMS: aminopenicilina/sulbactama
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS. Bases genéticas.
La resistencia es la capacidad natural o adquirida de una bacteria de permanecer
refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostáticos de los ATM.
Tipos de RESISTENCIA
I. Natural o intrínseca. Estable, transmisión vertical (células hijas).
Ej. Familia Proteae y la R a nitrofurantoina, tetraciclinas y colistin.
II. Adquirida. Las vías de adquisición de la R :

A. Mutaciones en el cromosoma. Espontáneas, estables y de transmisión vertical .
B. Intercambio de genes R por transferencia horizontal :
-conjugación (vía plásmidos)
- traducción
- transformación
R inestable ante la ausencia del ATM.
-Ej. Staphylococcus aureus adquiere R a β-

lactámicos por ganancia de un gen que codifica
una β-lactamasa.
Mecanismos de resistencia bacteriana a los antimicrobianos
Enzimas inactivantes
Impermeabilidad
Alteración de porinas y/o
polisacárido.
Eflujo (Bombas de expulsión)
Modificación del sitio blanco
(diana), o hiper producción del sitio
blanco.
Vías metabólicas alternativas
Protección citoplasmática del sitio
blanco
La resistencia puede ser multifactorial:

R a una familia de ATM por más de 1 mecanismo de R.
EJ. Enterobacterias y R a β-lactámicos mediado por impermeabilidad, afinidad por
PBPs alteradas, eflujo y β-lactamasas .
Interacción paciente-bacteria-antimicrobiano
Un patógeno es capaz de causar un episodio

infeccioso dependiendo de características
propias (inoculo y patogenicidad), y de los
mecanismos inmunes del paciente.
El uso apropiado de antimicrobianos debe considerar

La compleja interacción que ocurre entre ATM-paciente (farmacocinética)
y entre ATM-bacteria (farmacodinamia).
La susceptibilidad in vitro demostrada o empírica del agente infeccioso al antibacteriano
USO DE LOS ATM
Tratamiento empírico
(Ej. conocimiento del agente etiológico más frecuente acorde a la infección)
Profilaxis
(Ej. prevención de endocarditis en paciente con daño válvula cardíaca y manipulación
odontológica; cirugía abdominal).
Tratamiento dirigido frente al microorganismo aislado (responsable de la infección).

La elección del ATM a usar depende de varios factores:
-Estado clínico del paciente y gravedad de la infección
-Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo identificado
- Costo y disponibilidad del ATM
- Toxicidad (baja)
- Vía de administración
- Concentración del ATM en el sitio de infección (según propiedades farmacocinéticas)
- Estado metabólico del paciente (función renal y hepática)
-Espectro. Dirigido al microorganismo sin afectar a la microbiota habitual.
-Estado inmunológico del paciente (inmunocomprometidos o en inf. graves: ATM bactericidas).
- Algunos ATMs están contraindicados durante lactancia, infancia o embarazo.
Estudios de susceptibilidad a los ATM
Objetivos:
- Interés terapéutico: medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la
responsable de una infección a uno o varios antibióticos
- Interés epidemiológico: seguir la evolución de las resistencias bacterianas.
¿Cuando realizar estudios de susceptibilidad?

- Cuando la sensibilidad antibacteriana del agente etiológico no puede ser preestablecida
a partir del género y especie bacteriana.
¿Ante qué microorganismos hay que hacer estudios de susceptibilidad?

- Microorganismos con susceptibilidad variable o impredecible.
- Microorganismos con susceptibilidad previamente predecible y resistencia emergente.
ATM Germen
I). Estudios directos de la sensibilidad:
Medición directa de la actividad de los ATM sobre la bacteria al ser reunidos en un medio in vitro.
1. Métodos de difusión en agar con discos (Método de kirby- Bauer):

“ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN”
2. Métodos para la determinación cuantitativa de sensibilidad a los ATM Métodos más
usados en los
- Dilución en agar laboratorios
- Macro y microdilución en caldo Métodos manuales clínicos
- Métodos epsilométricos
- Métodos automatizados.
3. Métodos de medición de la bactericidia.

Curva de muerte y concentración bactericida mínima (CBM). No se hace de rutina, se solicita
en infecciones graves y sin respuesta al tratamiento.
II). Estudios de pérdida de la sensibilidad. Detectan mecanismos de R bacteriana.

Indicaciones para realizar una prueba de susceptibilidad
Microorganismo que requiera tratamiento antimicrobiano y su susceptibilidad no

puede ser predicha a partir de su identidad.
Cuando el microorganismo infectante sea capaz de mostrar resistencia a los

antimicrobianos usados habitualmente para tratamiento.
Cuando aún conociendo la sensibilidad del microorganismo el paciente no puede

recibir la medicación normal.
Con fines epidemiológicos de resistencia.
En el estudio de nuevos antibióticos.
Se deben realizar a partir de cepa aislada.

Prueba de difusión en agar ó Antibiograma por difusión.
Método de Kirby-Bauer (K-B)
Es la prueba in vitro que se utiliza de rutina en los laboratorios clínicos para la
determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias comunes (aerobios o
anaerobios facultativos) de crecimiento rápido y algunas bacterias con requerimientos
nutricionales especiales.
Bacterias de desarrollo rápido Bacterias con requerimientos
•Enterobacterias nutricionales especiales
•Pseudomonas aeruginosa •S. pneumoniae
•Acinetobacter spp. •Streptococcus spp β-hemolíticos
•Burkhorderia cepacia •Streptococcus spp grupo viridans
•Stenotrophomonas maltophilia •Haemophilus influenzae y H. parainfluenzae
•Staphylococcus spp. •Neisseria gonorrhoeae
•Enterococcus spp. •Neisseria meningitidis
El organismo internacional CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)

adoptó los pasos básicos descriptos en el método de K-B como método de
referencia y deben seguirse en forma minuciosa para obtener resultados precisos,
Documento M2-A11(2012).
Antibiograma por difusión: Fundamento
Agar MH
Zona de inhibición
Consiste en la aplicación de una cantidad determinada de ATM en un reservorio (discos de
papel, pastillas con drogas en estado cristalino) sobre la superficie del agar Mueller-Hinton (o
medios especiales para bacterias exigentes nutricionales), se formará por difusión un gradiente
de concentración del ATM y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de
la zona de inhibición de la cepa alrededor del disco.
Los diámetros de inhibición

correlacionan con las concentraciones
inhibitorias mínimas (CIMs) para cepas con
sensibilidad o resistencia conocida a los
E. coli distintos ATM.
Antibiograma por difusión: Interpretación
Para considerar una cepa sensible (S), intermedia (I), resistentes (R) a un dado ATM, se miden
los halos de inhibición y se cotejan con tablas de instituciones internacionales (CLSI, anualmente
actualizadas, M100-S24, año 2014).
Las categorías (S, I, R) surgen de curvas de regresión que relacionan valores de los halos de
inhibición (en mm) con su correspondiente equivalencia en valores de CIM para cada ATM.
Gráfico de análisis de regresión
Categorías de interpretación del método de difusión (CLSI).
SENSIBLE (S):
Indica que una infección dada por la cepa en estudio tratada con la
dosis de ATM recomendada para el tipo de infección y la especie
infectante tiene buena probabilidad de éxito terapéutico.
RESISTENTE (R):
Indica que la cepa no va a ser inhibida por las concentraciones séricas normalmente
alcanzadas a dosis habituales.
INTERMEDIO (I):
Incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones de ATM más elevadas,
siempre que las dosis puedan ser aumentadas (β-lactámicos), o que la droga concentre en
el sitio de infección (quinolonas y β-lactámi en orina).
NO-SENSIBLE (NS):
Se usa para microorg. que solo se les ha asignado categoría de interpretación sensible
debido a la ausencia o rara aparición de cepas resistentes
SENSIBILIDAD DOSIS DEPENDIENTE (SDD):

Nueva categoría de interpretación (M100-S24, 2014). Implica que la susceptibilidad de un
aislamiento frente un ATM depende del regimen de dosificación del ATM que recibe el
paciente. Al presente, solo existe en esta categoría la combinación
cefepime/enterobacterias.
Antibiograma por difusión
Importante:
Respeto de la metodología estandarizada!!
Única forma de que los diámetro de inhibición correlacionen con las Concentraciones
Inhibitorias Mínimas (CIMs) para cepas con sensibilidad (S) o resistencia (R) conocida a los
distintos antimicrobianos.
ANTIBIOGRAMA TABLA DE INTERPRETACION

(CLSI M100-S24/año 2014)
Informe
Clínico
E. coli
Antibiograma por difusión (Método de Kirby-Bauer): Metodología
I. Preparación y estandarización del inoculo bacteriano
II. Inoculación de las placas
III. Aplicación de los discos
IV. Incubación (tiempo, atmósfera y temperatura)
V. Medida de las zonas de inhibición (en mm)
VI. Interpretación de resultados (según tablas CLSI, anualmente actualizadas)
VII. Realizar controles de calidad periódicos (cada 15 días o a cambio de lote)
La reproducibilidad del método depende del seguimiento explícito de la

metodología descripta en el documento de la CLSI (M2-A11).
I. Preparación del inóculo
a. Utilizar colonias bien aisladas
b. El inóculo estandarizado se prepara logrando turbidez

equivalente al patrón de turbidez 0,5 de la escala de Mc
Farland. La misma representa 1,5 x 108 de bacterias por
ml (UFC/ml), y una OD685nm entre 0,08-0,1.
Suspensión directa en solución fisiológica o

caldo.
Crecimiento previo en caldo (cepas con más
de 24hs ; o escasas)
II. Inoculación o siembra de las placas
- Dentro de los 15 min de preparado el inúculo siembre las placas con hisopo
estéril.
- Antes de sembrar presione el hisopo sobre las paredes del tubo para sacarle el
exceso de líquido. Hisopar la placa en 3/4 direcciones para lograr crecimiento
confluente, la placa no debe estar mojada.
- Espesor del agar: 4 mm (25-30 ml en placas de 10mm de diámetro).
Inoculo
III. Aplicación de los discos
- Aplicar los discos entre los 5 y antes de los 15 min posteriores a la inoculación.
Manual Multi-inoculador
-No usar más de 6 discos
por placa para evitar
solapamiento de halos.
- Distancia entre discos:
No < a 24 mm de centro a
centro
Selección de los ATM a probar

-Decisión del laboratorio, cuerpo médico, comité de infecciones y comité de farmacia.
-CLSI propone diferentes grupos de ATM:
grupo A, incluyen ATM que deben ser probados de rutina; grupo B, ATM usados en
infecciones hospitalarias o por falla al tratamiento con drogas del grupo A; grupo U, ATM
de infecciones urinarias; grupo C, alternativos ante R a los de primera elección; grupo O,
ATM específicos para microorganismos determinados.
IV. Incubación: 35 +/- 2 ºC, atmósfera normal, 16-18 h o 24 h

- Colocar las placas en la estufa dentro de los 15 min de colocados los discos.
IV. Medida de las zonas de inhibición
a. Leer con regla o calibre en la base de la placa sobre fondo
negro y luz reflejada.
b. Crecimiento confluente y zonas de inhibición uniformes y

circulares. No tener en cuenta velos o colonias que puedan
verse con mucha dificultad dentro del halo .
c. Algunas de las consideraciones especiales:

c.1. Los Proteus spp pueden presentar “swarming” y generar
una zona de turbidez dentro del halo de inhibición por su
movilidad, ignorar este efecto. Leer los halos donde la
inhibición sea obvia.
c.2. TMS puede generar un crecimiento en forma de niebla
dentro del halo, utilice el margen más obvio de inhibición.
c.3 Leer con luz transmitida el halo para la vancomicina en
Enterococcus spp y cefoxitina en Staphylococcus spp.
c.4. En medio MH con agregado de sangre, medir halo de
inhibición y no la hemólisis.
IV. Medida de las zonas de inhibición
c.5. Colonias intra-halo: discriminar entre una sub-pobación resistente o cultivo mixto
Algunas limitaciones del método de difusión
- No es recomendado para anaerobios, micobacterias ni microoganismos de

crecimiento lento
-No mide bactericidia
- No es apropiado para evaluar la sensibilidad a vancomicina en Staphylococcus spp.
- No determina la sensibilidad a polimixinas en enterobacterias y Acinetobacter spp.

Factores que influyen en el método de difusión
Servicio antimicrobianos, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.

Taller WHONET 2008
Causa de error del ANTIBIOGRAMA
Inapropiada preparación del inoculo

No medir el pH
Uso de placas envejecidas o no refrigeradas
Variabilidad en el lote de MH y no control del mismo
Conservación inapropiada de los discos.
Inapropiada preparación del patrón de turbidez
Excesiva siembra del inoculo por NO escurrir el hisopo
Excesivo retardo entre el ajuste del inoculo y la siembra
Excesivo retardo en la aplicación de los discos e inoculación de placas
Incubación a menor o mayor temperatura
Retardo en la lectura
Errores de lectura
Utilizar cepas control de calidad incorrectas o mal conservadas
1. Mueller-Hinton (MH)
- Medio de cultivo nutritivo no selectivo.
- Recomendado por CLSI para las pruebas de sensibilidad por tener buena reproducibilidad lote
a lote, contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas y trimetroprima, adecuado desarrollo
de la mayoría de las bacterias patógenas.
Agregado de suplementos para microorganismos exigentes:

-5% de sangre de carnero
- HTM: Haemophilus test medium (HTM)
- Agar base GC + 1% suplementos de crecimiento
a. En el caso que ante un lote el desarrollo de los microorganismos estuviese
afectada los halos de inhibición podrían ser mayores quedando fuera de los límites
del control de calidad. Se sugiere cambiar el lote de MH.
b. Conservación: ante cada lote controlar la esterilidad incubando una placa 24-
48hs a 35ºC.
c. Humedad: en heladera hasta 7 días, o ponerlas en bolsas para evitar la

desecación. Antes de usar, si se observan gotas en la superficie, secar incubando
a 35ºC 10-30 min
d. Controlar la Esterilidad del lote.

e. pH del MH (7,2-7,4)
< Actividad a pH ácido:

Macrólidos (ERY)
Aminoglucósidos (ej. GEN, AKN)
Quinolonas (CIP)
> Actividad a pH ácido:

Tetraciclinas
Nitrofurantoína
Ampicilina
f. Efecto de la timidina o timina del MH
El exceso de ambas pueden revertir los efectos inhibitorios
de las sulfonamidas y trimetroprima produciendo halos
más pequeños (e incluso nulos) ó menos nítidos, que
pueden dar como resultado falsa resistencia.
Cada lote de MH se controla probando el disco de TMS y la
cepa control Enterococcus faecalis ATCC 29212 . Debe dar
halo claro y definido > o = 20 mm.
g. Concentración de cationes bivalentes

timidina/timidina
Exceso de Zn++: halos menores a carbapenemes (FR)
ADN
CC de Ca++ y Mg++ afecta Aminog.
aminoglucósidos, tetraciclinas ,
colistin frente a Ps. aeruginosa:
en exceso, reducción del halo
(FR); en defecto, aumento del
halo (FS)
Tetra.
Cada lote controlar con cepa Reducción del halo
Pseudomonas aeruginosa ATCC (Pueden causar Falsa R)
27853.
2. Altura de la placa: 4 mm
Controlar la altura con calibre o regla.
>4mm
Falsa S
< 4mm
Falsa R MENOR Halo Altura correcta MAYOR Halo
4 mm
3. Densidad del inoculo: 1-2 x 108 UFC/ml (p/ E. coli).
(Falsa S) (Falsa R)
Bajo inoculo: Alto inoculo:
-Crecimiento NO Disminución del halo
confluente (FR)
-Aumenta el halo (FS)
INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Taller

WHONET 2008
4. Calidad de los discos
- Respetar condiciones de almacenamiento según indique el fabricante y verifique

vencimiento.
- Para mantener la potencia de los discos conservarlos en freezer (-14ºC o menos), y el

stock diario refrigeradas a 4ºC (heladera). Las drogas inestables (como carbapenemes
y los que contengan inhibidores de β-lactamasas) se deben mantener congelados.
-Sacar del frío 1 o 2 hs antes de usarlos y no abrirlos hasta que se equilibre la

temperatura a fin de minimizar la condensación.
- Los contenedores de los discos deben tener sustancias desecantes.
- Use discos con contenido especificado por el CLSI (FDA-ANMAT).
- No reubique un disco una vez que éste ha tocado la superf. del agar
5. Tiempo de aplicación de los discos
- 5 min después de haber hisopado las placas y no > a 15 min.
- No aplicar en placas con superficie húmeda
6. Incubación
Temperatura:
-35 ºC +/-2ºC. Controlar continuamente esta variable.
- Incubar a los 15 min de haber colocado los discos.
Atmósfera
- Normal. Algunos microorganismos exigentes necesitan 5% CO2 (lata con vela),
como (Streptococcus spp, Haemophilus spp, N. gonorrhoeae, N. meningitidis) .
- Tiempo de incubación 16-18 hs. Algunas combinaciones microorganismo/ATM

requiere 24 hs (Ej. VAN/Enterococcus spp).
Antibiograma por difusión
Bacterias con requerimientos nutricionales especiales
- Haemophilus spp.: Haemophilus test medium (HTM)

35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; 16-18 h
Tabla 2E M100 S24 M2-A11
- Neisseria gonorrhoeae: agar base GC + 1% suplementos
36 ºC +/- 1 ºC; 5% CO2; 20-24 h
Tabla 2F M100 S24 M2-A11
- S. pneumoniae: agar M-H + 5% sangre carnero
35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; 20-24 h
Tabla 2G M100 S22 M2-A11
- Streptococcus β-hemolíticos: agar M-H + 5% sangre carnero
35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; 20-24 h
Tabla 2H-1 M100 S2 M2-A11
- Streptococcus grupo viridans: agar M-H + 5% sangre carnero
35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; 20-24 h
Tabla 2H-2 M100 S24 M2-A11
Antibiograma por difusión: Control de calidad
• Objetivos
- la exactitud y precisión del método de sensibilidad a los antimicrobianos
- la calidad de los reactivos usados
-el desempeño de las personas que realizan el método y la lectura de los resultados.
Control de calidad interno:

control estufas
control heladeras y freezers
control pHchímetro
control autoclave
control metodología: cepas ATCC (American Type Culture Colletion)
Microorganismos no Para microorganismos con

fastidiosos : requerimientos nutricionales
S. aureus ATCC 25923 especiales:
E. coli ATCC 25922 H. influenzae ATCC 49247
E. coli ATCC 35218 H. influenzae ATCC 49766
P. aeruginosa ATCC 27853 N. gonorrhoeae ATCC 49226
E. faecalis ATCC 29212 S. pneumoniae ATCC 49619
(Tabla 4A, documento M100S24) (Tabla 4B, documento M100S24)
ATM Germen
1. Métodos de difusión en agar (Método de kirby- Bauer):

2. Métodos para la determinación cuantitativa de sensibilidad a los ATM
Determinan la concentración inhibitoria mínima (CIM).
- Dilución en agar
- Macro y microdilución en caldo Métodos manuales


Estudios de susceptibilidad a los antimicrobianos
2. Métodos por dilución, determina la concentración inhibitoria mínima (CIM).
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)

Método cuantitativo de la actividad in vitro de un ATM frente a un microorganismo.
Es la mínima concentración que inhibe el crecimiento bacteriano.
Casos en que se justifica realizar una prueba cuantitativa (CIM):

1. ausencia de metodología más sencilla
2. Si un ATM tiene categoría de intermedio por difusión y es el tratamiento de elección
3. falta de estandarización de método de difusión (Ej. BNF como Pseudomonas putida)
4. uso de nuevos antibióticos
5. falla inesperada de tratamiento
6. infecciones severas que requieran concentraciones bactericidas (meningitis, endocarditis, sepsis)
7. confirmación de perfiles de susceptibilidad inusuales obtenidos por difusión
8. vigilancia cuantitativa de resistencia
9. Pruebas bactericidas como la curva de muerte, se requiere valor de CIM para elegir las cc de
trabajo.
10. ATM que no esté estandarizado el método de difusión y solo requiera dilución
(colistin/Acinetobacter spp)
Métodos para la determinación cuantitativa de sensibilidad a los ATM
● Macrodilución en caldo
● Microdilución en caldo
● Dilución en agar
Metodología de referencia propuesto por CLSI
Para bacterias que crecen aeróbicas y facultativas de

desarrollo rápido, M7-A9 del CLSI (2012); y tablas de
interpretación en el documento M100-S24.
Realizar controles de calidad periódicos, como los

realizados en el método de difusión.
En la actualidad, a fines clínicos y por practicidad algunos laboratorios utiliza

• métodos epsilométricos (E-test o MICE) ó
• métodos automatizados (Vitek, Phoenix, MicroScan).
(Para cualquier método es aceptable una variación +/- 1)
Metodología de dilución. Fundamento
Primer tubo límpido

CIM 4 ug/ml
Macrodilución en caldo
“CIM: 1 ATM y 1 microorganismo”
1 0,5 2 4 8 16 32 64 128 256

Concentraciones crecientes de un ATM (ug/ml)
Cada columna: diferentes aislamientos
(Ej. Pseudomonas aeruginosa)
Gradiente de Concentración de un ATM

Microdilución en caldo
Microdilución en caldo
“CIM: 1 ATM y varios microorganismos”
CIM
Dilución en agar
Se preparan placas conteniendo cada una diferentes concentraciones de ATM.
I- Multinoculador cargando los inóculos bacterianos.
II. Siembra en placa de agar MH que contiene una determinada concentración del ATM.
III y IV. CIM : placa con mínima cc del ATM donde no hay desarrollo bacteriano.
Metodología de dilución. Factores que afectan la técnica
Realizar controles de calidad periódicos
Medio de cultivo:
Bacterias de desarrollo rápido Medio MH
Bacterias con requerimientos nutricionales especiales:
Otras metodologías para obtener CIM
Método epsilométrico o E-test

Tira plástica con
un ATM en un
Método simple: inoculo, siembra e incubación gradiente de
concentración
semejante al K-B.
predeterminado
CIM: Donde la elipse de inhibición y estable.
intercepta la tira (márgenes nítidas)
CIM
Otras metodologías para obtener CIM
Métodos automatizados
(Vitek, Phoenix, MicroScan).
Concentración Bactericida Mínima (CBM)
Método cuantitativo de la actividad in vitro de un ATM frente a un microorganismo.
Es la mínima concentración de ATM que mata el 99,9 % de las bacterias del inoculo.
ATM Germen
1. Métodos de difusión en agar (Método de kirby- Bauer):

2. Métodos para la determinación cuantitativa de sensibilidad a los ATM
Determinan la concentración inhibitoria mínima (CIM).
- Dilución en agar
- Macro y microdilución en caldo Métodos manuales


Estudios de susceptibilidad a los antimicrobianos
II). Estudios de pérdida de sensibilidad.

Detectan distintos mecanismos de R como por ejemplo:
β-lactamasas o penicilinasas plasmídicas en Enterococcus spp. Método de Nitrocefin.
β-lactamasas cromosómicas inducibles tipo AmpC (en BGN como enterobacterias)
β-lactamasas de espectro extendido ó BLEE (en BGN como enterobacterias, BNF)
Carbapenemasas (en BGN como enterobacterias, BNF)
Alteración de las PBPs. Estudio de la meticilino resistencia (MR) en género Staphylococcus.
Resistencia inducible a clindamicina (efecto MLSi) en Staphylococcus y Streptococcus.
Numerosos métodos descriptos (varios de ellos propuestos por el CLSI)

Método de Nitrocefin (cefalosporina cromogénica)
Detecta penicilinasas plasmídicas (β-lactamasas) en Enterococcus spp.
Es más sensible que el método de K-B.
Un resultado positivo (+) predice R a penicilina, ampicilina, amoxicilina y ureídopenicilinas.
+ -
Estrategias de colocación de discos para detección de Mecanismos de R cocos G (+)
Meticilino resistencia en Staphylococcus spp.
Estrategia: se debe utilizar un disco de FOX (cefoxitina)
En base al halo de FOX (S ó R) se informa Meticilino sensible (MS) ó Meticilino resistente
(MR), pero nunca se informa como FOX.
Informar:
MS: Considerar como S a penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes, β-
lactámicos/inhibidores de β-lactamasas (AMS, AMC, TAZ).
MR: Considerar R a todos los β-lactámicos. Exc. en S. aureus MR (MRSA) debe
ensayarse la susceptibilidad frente a nuevas cefalosporinas (como la ceftarolina).
(Tabla 2, MO2 y
MO7; CLSI-2014)
Cefalosporina de amplio espectro c/ activ. bactericida contra MRSA

Estrategias de colocación de discos para detección de Mecanismos de R cocos G (+)
Resistencia a Macrólidos, Lincosamidas y Streptogramina
Efecto MLS inducible (MLSi)
(Staphylococcus spp, Streptococcus β hemolíticos y S. pneumoniae)
- Síntesis de una metilasa inducible frente a macrólidos.

-Esta enzima modifica el sitio blanco (23S rARN) de los ATM.
-La bacteria produce un mRNA que codifica la metilasa pero es INACTIVO en ausencia de
inductor.
Efecto MLSi: Estrategia
Colocar discos eritromicina (ERY: macrólido) y clindamicina-CLI (lincosamida)
próximos para ver inducción:
a 25 mm (15 a 26 mm) en Staphylococcus
spp (MH, 16-18 hs)
a 12 mm en S. pneumoniae y Streptococcus
β hemolíticos (MH-sangre carnero 5%, 20 hs
de incubación)
CLI ERY
CLI: En el antibiograma se lee sensible a CLI y resistente a ERY.
Las infecciones causadas por cepas con resistencia inducible a clindamicina (MLSi),
pueden tener falla de tratamiento si se usa como terapia clindamicina (sensibilidad
in vitro) por selección de mutantes constitutivas.
INFORMAR: ERY y CLI resistentes “R”

Estrategias de colocación de discos para detectar
mecanismos de R en Bacilos Gram negativos (BGN)
i. β-lactamasa de espectro extendido (BLEE)
ii. Cefalosporinasa cromosómica inducible (tipo AmpC)
iii. Carbapenemasas ó metalo-β-lactamasas inhibibles por EDTA/SMA
iv. Sensibilidad disminuida a quinolonas en enterobacterias

β-lactamasa de espectro extendido (BLEE): detección
-Determinante de resistencia adquirido por asociación a plásmidos. Mec de R de ↑ diseminación!!
- Son inhibibles por Sulbactama, Clavulánico, Tazobactama.
En enterobacterias el CLSI propone:
1) Sospecha de BLEE en el antibiograma 2) Método confirmatorio:

por difusión según puntos de corte
Ensayos de sinergia con Discos combinados:
Δ CTX /CTC (cefotaxima combinada con clavulánico)
Δ CAZ/CAC (ceftazidima combinada con clavulánico)
Interpretación: Una diferencia mayor o igual a 5
mm entre CTX /CTC o CAZ/CAC → BLEE +.
Informe, si se confirma BLEE:

RESISTENTE : Penicilinas (AMN); Cefalosporinas 1º, 2º y 3º generación (CEF, CFM, CTX, CAZ);
Cefalosporinas de 4º generación (FEP) y Monobactamas (ATM).
FOX, AMS, AMC, TZP y carbapenemes como de en el antibiograma.
β-lactamasa de espectro extendido (BLEE): detección
Otra Estrategia:
Doble disco o Test de doble sinergia:
Colocar próximos (25 mm) discos de cefalosporinas de 3ª generación (CTX , CAZ, CRO) e
inhibidores de β-lactamasas ( AMC).
Interpretación:
Efecto de sinergia (“huevo”) entre CTX-AMC o CAZ-AMC o CRO-AMC→ BLEE +.
CAZ CTX
CRO
Cefalosporinasa cromosómica inducible (tipo AmpC): detección
CROMOSOMICAS
( Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Providencia spp)
Inducibles, puede haber desrepresión y producirse en alto nivel.
Confieren resistencia a la AMP, FOX , C1G y C2G
Sensibilidad a C3G (CAZ, CTX) y C4G (FEP)
No son inhibibles por Sulbactama, Clavulánico, Tazobactama
Se inhiben con Ac Borónico y Cloxacilina
Achatamiento del halo
Estrategia: No hay un método estandarizado por el CLSI. de inhibición del mal
Amp-C se debería observar siempre que se coloquen inductor.
próximos discos de un buen inductor S o R (FOX, IMP) y un mal IMP
inductor lábil a la enzima (CAZ, CTX).
FOX R MARCADOR
enzimas tipo Amp-C de los distintos microorganismos tienen
características distintas y se expresan en distintos modos…
AmpC desrep. C3G Resistentes!!! CAZ
Informe:
AmpC inducible con cefalosporinas de 3ª (CAZ, CTX) S
Informar cef. de 3ª SENSIBLE con “probable falla de tratamiento” y FEP (cef. de 4ª) SENSIBLE.
Sensibilidad disminuida a quinolonas en enterobacterias
Estrategia: colocar un disco de NAL y correlacionar con disco de CIP
NAL CIP E. coli S a ambos ATM

(sin mutaciones en sitio blanco)
E. coli Nal R, CIP S: Sensibilidad disminuida

mutación en gyrA. a ciprofloxacina
E. coli Nal R, CIP R:

mutación en gyrA y parC
Estrategia: colocar un disco de NAL y correlacionar con disco de CIP
Halo de NAL ≤ 13 mm (R) ó

Halo de NAL entre 14 y 20 mm (I) y CIP halo S (nuevos
mecanismos plasmídicos de R)
Sensibilidad disminuida a ciprofloxacina

Como se informa:
NAL no se informa
En infecciones severas causadas por enterobacterias
informar “sensibilidad disminuida a CIP”.
En infección urinaria baja no complicada de la
comunidad informar “sensibilidad disminuida a CIP,
probable éxito de tratamiento”
En caso de infecciones extra intestinales por
Salmonella spp. se debe aclarar “probable fracaso del
tratamiento con fluoroquinolonas”.
Carbapenemasas (CBPs): Definición
Nuevas β-lactamasas
Determinante de R adquirido por asociación a plásmidos. Mec de R de ↑ diseminación!!
Carbapenemasas adquiridas
CARBAPENEMES
(BGN)
Imipenem/1985, Meropenem/1996,
Principal mecanismo de R a
Ertapenem/2001; Doripenem/2005
carbapenemes.
CBPs incluyen a una versatil flia de enzimas (ß-lactamasas) que tienen en común
la capacidad de hidrolizar carbapenemes como Imipenem, Meropenem, junto con
otras penicilinas y/o cefalosporinas.
Clasificación molecular (según Ambler)
Serino-carbapenemasas Metalo-β-lactamasas
tipo KPC, GES Tipo IMP, VIM, SPM,

Inhibidores: Inhibidores (quelantes):
- Ac. clavulánico, EDTA, Ac. Dipicolínico (ADP),
Tazobactama (variable) Mercaptoacético de sodio
-Ac. Borónico (SMA)
Carbapenemasas: estrategias de detección
De rutina:
Ensayos de Sinergia (ES)
Doble disco A I A
A: ATMs
I: Inhibidor
Discos combinado AI: ATM + inhibidor
A AI
Carbapenemasas: estrategias de detección
Serino-carbabenemasas Metalo-β-lactamasa
Tienen Zn++ en su sitio activo, se inhiben con
quelantes
Doble disco Doble disco
Sustratos: Imipenem , meropenem .
Sustratos: Carbapenemes como Ertapenem
(Ert) , Imipenem (Imp), o meropenem (Mer). Inhibidor: Ac. Dipicolínico (Disco comercial)
Inhibidor: Ac. Borónico 300 μg (APB). Disco Sinergia positiva

comercial.
0.5 cm
Ert APB Imp
Inhibidor: EDTA / Mercaptoacetato de
sodio(SMA) (Disco comercial)
Sinergia positiva
Sinergia positiva
15 mm (centro a centro)
INFORME
“No se recomienda el uso de penicilinas, cefalosporinas (todas las generaciones)
ni carbapenemes independiente de su sensibilidad in vitro.
Se recomienda aislar al paciente.”
Medios cromogénicos
Evaluation of CHROMagar KPC for Rapid Detection of Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae
Pseudomonas Carbapenem R
Cream, translucent;
S 100% and E 98.4%
Existen diferentes medios cromogénicos que permiten el aislamiento selectivo y la

identificación presuntiva de BGN productoras de BLEE, o de carbapenemasas.
• Requieren posterior confirmación con ensayos de sinergia.

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Susceptibilidad a los antimicrobianos

Dra. Patricia Marchiaro

CLASIFICACIÓN (existen diferentes criterios)

● inhibidores de fase citoplasmática

● inhibidores de la organización estructura del peptidoglicano

-β-lactámicos (Penicilinas, cefalosporinas de 1ª a 4a generación, monobactamas y

2. Alteración de la membrana celular.

● Inhibidores de la fase de activación

● Inhibidores del inicio de la síntesis proteica

● Inhibidores de la fijación del aminoacil-ARNt al ribosoma

● Inhibidores de la elongación. se unen a subu 50S

- rifamicinas: rifampicina (RIF). Inhiben ARN polimerasa.

5. Competitividad metabólica o inhibición de otros procesos metabólicos.

-Trimetoprima/sulfametoxazol (TMS). Inhibe

Algunos ATM bloquean mecanismos de resistencia.

II. Adquirida. Las vías de adquisición de la R :

-Ej. Staphylococcus aureus adquiere R a β-

La resistencia puede ser multifactorial:

Un patógeno es capaz de causar un episodio

El uso apropiado de antimicrobianos debe considerar

Tratamiento dirigido frente al microorganismo aislado (responsable de la infección).

¿Cuando realizar estudios de susceptibilidad?

¿Ante qué microorganismos hay que hacer estudios de susceptibilidad?

1. Métodos de difusión en agar con discos (Método de kirby- Bauer):

3. Métodos de medición de la bactericidia.

II). Estudios de pérdida de la sensibilidad. Detectan mecanismos de R bacteriana.

Microorganismo que requiera tratamiento antimicrobiano y su susceptibilidad no

Cuando el microorganismo infectante sea capaz de mostrar resistencia a los

Cuando aún conociendo la sensibilidad del microorganismo el paciente no puede

Con fines epidemiológicos de resistencia.

En el estudio de nuevos antibióticos.

Se deben realizar a partir de cepa aislada.

El organismo internacional CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)

Los diámetros de inhibición

SENSIBILIDAD DOSIS DEPENDIENTE (SDD):

ANTIBIOGRAMA TABLA DE INTERPRETACION

I. Preparación y estandarización del inoculo bacteriano

II. Inoculación de las placas

III. Aplicación de los discos

IV. Incubación (tiempo, atmósfera y temperatura)

V. Medida de las zonas de inhibición (en mm)

VI. Interpretación de resultados (según tablas CLSI, anualmente actualizadas)

VII. Realizar controles de calidad periódicos (cada 15 días o a cambio de lote)

La reproducibilidad del método depende del seguimiento explícito de la

a. Utilizar colonias bien aisladas

b. El inóculo estandarizado se prepara logrando turbidez

Suspensión directa en solución fisiológica o

- Espesor del agar: 4 mm (25-30 ml en placas de 10mm de diámetro).

Selección de los ATM a probar

IV. Incubación: 35 +/- 2 ºC, atmósfera normal, 16-18 h o 24 h

b. Crecimiento confluente y zonas de inhibición uniformes y

c. Algunas de las consideraciones especiales:

- No es recomendado para anaerobios, micobacterias ni microoganismos de

-No mide bactericidia

- No es apropiado para evaluar la sensibilidad a vancomicina en Staphylococcus spp.

- No determina la sensibilidad a polimixinas en enterobacterias y Acinetobacter spp.

Servicio antimicrobianos, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.

Inapropiada preparación del inoculo

Agregado de suplementos para microorganismos exigentes:

c. Humedad: en heladera hasta 7 días, o ponerlas en bolsas para evitar la

d. Controlar la Esterilidad del lote.

< Actividad a pH ácido:

> Actividad a pH ácido:

g. Concentración de cationes bivalentes