UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD CIENCIAS
BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO MICROBIOLOGÌA -
PARASITOLOGÌA

ASIGNATURA VIRTUAL
CURSO DE BACTERIOLOGIA

Informe de Práctica N° 7: Aislamiento e identificación de los géneros

Listeria y Corynebacterium

GRUPO DE PRACTICA: 01
SUBGRUPO :03
ESTUDIANTES:
Caucha Montalvan Karen Fiorella
Idrogo Torres Ruth Elizabeth
Fernandez Cortez Patrick Diego

DOCENTE: Dra.Olga V. Francia Arana

 I. INTRODUCCIÓN:

Las listerias, son bacilos Gram positivos cortos, regulares, no esporulados ni

ramificados, con extremos redondeados, de 0,4-0,5 x 0,5-2,0 m; se disponen aislados o

en cortas cadenas. En cultivos viejos pueden aparecer formando filamentos de 6 a 20 nm

de longitud, no desarrollan cápsula, pero son móviles por pocos flagelos peritricos, de 1

a 5 que le confieren movilidad a 28C mientras que las bacterias del género

Corynebacterium son bacilos Gram positivos, cortos, rectos o ligeramente curvos,

plemórficos, delgados y a veces en forma de clava en un extremo; pueden contener

gránulos metacromáticos formando bandas o hileras. En frotís teñidos aparecen en

empalizada o como celulas individuales, formando ángulos agudos unos con otros, en

formaciones en ‘V’ o ‘L’, que son formas adoptadas después de la división celular en

saltos.

Las colonias de Listeria son pequeñas, de 1 a 2 mm después de 24 a 48 horas de

incubación, lisas, al observarse a la lupa con epiluminación, con un ángulo de la luz de

45 a 60 se observan reflejos de color azul verdoso sobre una superficie finamente

granular. Su temperatura de crecimiento está entre 30C y 37C, pero pueden crecer a

4C en pocos días.

Los bacilos de Listeria son anaerobios facultativos, quimioorganótrofos y tienen

un metabolismo fermentativo. Son catalasa positivos y oxidasa negativos. Las reacciones

de Voges Proskawer y rojo de metilo son positivas, hidrolizan la esculina en pocas horas,

pero no la úrea ni la gelatina, no producen indol ni H2S. Producen ácido de D-glucosa y

de otros azúcares. Los bacilos de Corynebacterium igual que Listeria no forman esporas;

son aerobios o anaerobios facultativos, catalasa positivos con excepción de C. pyogenes

y C. haemolyticum. Además, no producen cápsula y son inmóviles. En este género hay

muchas especies saprófitas, otras patógenas de humanos (C. diphtheriae), animales y

plantas. Probablemente ampliamente distribuidos en la naturaleza, son comunes en suelo

y agua y residen en piel y mucosas de humanos y animales

La naturaleza ubicua de Listeria, su capacidad para multiplicarse a temperaturas

de refrigeración, su tolerancia térmica y su resistencia a bajos pHs así como, su tolerancia

a altas concentraciones de sal, hacen difícil el control del potencial patogénico de estas

bacterias en los productos alimenticios.

El género Corynebacterium incluye bacilos Gram positivos no formadores de

esporas, no ácido-alcohol resistentes, pleomorfos, no encapsulados e inmóviles. La

primera especie descrita como patógeno humano es Corynebacterium difteriae.

El género incluye más de 68 especies, 53 de las cuales pueden producir infección

oportunista en el hombre o ser transmitidas por contacto con animales (zoonosis). Muchas

de ellas forman parte de la microbiota de piel y mucosas (tracto respiratorio, digestivo o

genitourinario), algunas están en nichos específicos (C.amycolatum o C. jeikeium) y las

especies lipofílicas tienen resistencia amplia a distintos antimicrobianos.

Corynebacterium difteriae es considerado un modelo clásico de virulencia

bacteriana por la producción de exotoxina dependiente de la presencia del fago ` que lleva

el gen de la toxina. Esta es extremadamente potente y está formada por dos segmentos

proteicos, uno de unión a receptores específicos y el segmento activo, que cataliza la

inactivación de la translocasa de RNA de transferencia (tRNA), factor de elongación ,

impidiendo la interacción de RNAm y tRNA y deteniendo la síntesis proteica. Actúa en

todas las células del organismo, especialmente en corazón, nervios y riñón. Las cepas

carentes de fago no producen toxina, pero pueden adquirir el gen de una cepa portadora .

Localmente se produce una membrana faríngea característica formada por fibrina,

leucocitos, eritrocitos, células epiteliales y bacterias que puede extenderse al árbol

bronquial, produciendo edema, adenitis cervical o aspiración de la misma.

 II. COMPETENCIA DE LA PRACTICA:

El alumno:

▪ Aísla e identifica por lo menos una especie de Listeria y una especie de

Corynebacterium haciendo uso correcto de las técnicas de siembra, aislamiento e

identificación

III. MATERIALES:

Para el aislamiento:

Género Listeria

• Muestra: carne de pollo, quesos, pescado

• Medio de cultivo: agar Listeria

• Placas Petri estériles

• Asa bacteriológica

• Agua peptonada al 0,1%

• Tubo o vial con agar tripticasa soya

• Jarra de Brewer

• Microscopio compuesto
 Figura 1 Carne de pollo y pescado para muestra

Figura 2 Agar selectivo para Listeria

Figura 3 Placas Petri Figura 4 Asas bacteriológicas

Figura 5 Agua peptonada Figura 6 Jarra de Brewer

Figura 7 Tubo con Agar tripticasa soya

Género Corynebacterium

• Muestra: secreción nasofaríngea

• 1 placa Petri con medio Löffler (A.L.)

• 1 hisopo estéril

• Asa bacteriológica,

• 1 tubo con agar suero-telurito

Figura 8 Muestra de secreción nasofaríngea con hisopo estéril

Figura 9 Medio Löeffler

Figura 10 Tubo con Agar suero-telurito

Para la identificación

Listeria monocytogenes

• Batería de Gram

• Lámina y solución de peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa

• Una placa con agar sangre

• Tubo con caldo manitol

• Tubo con caldo hipurato

• Tubo con caldo xilosa

• Tubo con caldo ramnosa

• Una placa con agar almidón

Figura 11 Batería Gram

Figura 12 Lámina con solución de peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa

 Figura 13 Placa Petri con Agar sangre

Figura 14 Tubos con caldo manitol, hipurato, xilosa y ramnosa

Figura 15 Placa Petri con agar almidón

 Corynebacterium diphtheriae

• Lámina y solución de peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa

• 1 tubo con caldo nitrato

• 2 tubos con medio O - F glucosa

• Tubos con caldo glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa

• 1 tubo con caldo glucosao para la prueba de Voges - Proskawer

• 1 tubo con medio gelatina

• 1 tubo con caldo urea

• 1 tubo con caldo arginina

IV. METODOLOGÍA:

Género Listeria

1. Enriquecimiento

• Preparar un homogenizado de la muestra con caldo de

enriquecimiento de Listeria utilizando 5 g de muestra con 45 ml de

caldo.

• Incubar a 37 °C durante 24 horas

• Confirmar crecimiento con una tinción de Gram.

2. Aislamiento

• Sembrar una asada del cultivo líquido en la superficie del medio,

agar Listeria aplicando la técnica del estriado,

• Incubar la placa dentro de la jarra de Brewer en la estufa

bacteriológica a 37 °C por 48 horas

• Evaluar el crecimiento: Observar colonias convexas, de borde

entero, de 0,8 a 1,0 mm de diámetro, amarillas, brillantes.

 • Hacer la tinción de Gram de las colonias características para

observar morfología bacilar y reacción tintorial

• Separar las colonias características a un tubo o vial con ATS para

mantener la cepa y proceder a su identificación.

3. Identificación

• Hacer una tinción de Gram de la colonia para observar los bacilos

característicos

• Hacer la prueba de catalasa para confirmar la positividad

• Determinar la hemólisis en la placa de agar sangre

• Hacer las pruebas de fermentación de los carbohidraatos: manitol,

arabinosa, xilosa y ramnosa y observar el viraje del indicador rojo de

fenol a color amarillo si la prueba es positiva

• Realizar las pruebas de reducción de los nitratos, de hidrólisis del

hipurato y de hidrólisis del almidón.

• Hacer las Pruebas de CAMP y de RM-VP

Género Corynebacterium

Identificación

• Hacer la Prueba de catalasa

• Sembrar en una placa con agar sangre para observar el tipo de hemólisis

• Hacer la Prueba de Oxidación - Fermentación (O - F) de la glucosa

• Prueba de reducción del nitrato

• Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa,

maltosa, manitol y xilosa y observar el viraje del indicador rojo de fenol

• Prueba de Voges - Proskawer (V - P)

• Prueba de ureasa
 • Prueba de la gelatinasa.

Comparar resultados con tablas de identificación (Manual de Bergey)

V. RESULTADOS:

Tabla 1
Características macroscópicas
COLONIAS EN PLACA
MORFOLOGÍA COLONIA 1 COLONIA 2
Listeria Corynebacterium
Forma Circular Circular
Color Celeste Negro
Tamaño 1 mm 1.3 mm
Bordes Entero Entero
Elevación Convexa Convexa
Consistencia Lisa Lisa

Tabla 2
Características microscópicas
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
MORFOLOGÍA Listeria Corynebacterium
Forma Bacilo Bacilo
Disposición Aisladas y agrupadas Aisladas
Extremos Romos Romos
Reacción tintorial Gram positivas Gram positivas

Tabla 3
Identificación de Listeria
IDENTIFICACIÓN Listeria
Catalasa Positivo
Hemólisis + (β)
Ramnosa Positivo
Xilosa Negativo
Manitol Negativo
Prueba de CAMP Positivo
Prueba de movilidad Positivo (forma de paraguas)
 Tabla 4
Identificación de Corynebacterium
IDENTIFICACIÓN Corynebacterium
Catalasa Positivo
Hemólisis + (β)
Lactosa Negativo
Sacarosa Negativo
Prueba (V-P) Negativo
Ureasa Negativo
Gelatinasa Negativo

INTERPRETACIÓN:
En la tabla 1 tenemos las mismas características macroscópicas de las
colonias de Listeria y Corynebacterium, excepto el color ya que las colonias de
Listeria la observamos de color celeste y consultando con el Manual de Prácticas
es de color amarillo brillante. En cuando a las colonias de Corynebacterium son
de color de gris a negro igual (Cosnilla y Guerra, 2019).
En la tabla 2 observamos las características microscópicas iguales de los
géneros Listeria y Corynebacterium, con una diferencia en que las colonias de
Listeria no solo se observan aisladas sino una pequeña parte agrupadas según
(Benadof, 2008).
En la tabla 3 identificamos al género Listeria con las pruebas catalasa (+),
una hemólisis tipo β, ramnosa (+), xilosa (-), manitol (-), prueba de CAMP (+),
movilidad (+) de acuerdo con los autores (Benadof, 2008).
En la tabla 4 identificamos al género Corynebacterium con las pruebas
catalasa (+), una hemólisis tipo β, lactosa (-), sacarosa (-), prueba de VP (-),
ureasa (-) y gelatinasa (-). Donde solo la catalasa dio positivo de la misma manera
que los autores (Tapia et al., 2018); (Fernández, 2010).

VI. CONCLUSIONES:

➢ Se pudieron aislar e identificar correctamente haciendo uso de las técnicas

a genero Listeria.

➢ Se logró identificar correctamente al género Corynebacterium con las

respectivas pruebas bioquímicas.

VII. BIBLIOGRAFÍA:

M. Fernández-Alonso*, G. R. (2018). Infecciones por Corynebacterium spp.,Bacillus

spp. y Listeria spp. Servicio de Microbiología Clínica. Clínica Universidad de
Navarra., Pamplona. España. Obtenido de
https://residenciamflapaz.com/Articulos%20Residencia%2017/265%20Infeccion
es%20por%20Corynebacterium,%20bacillus,%20listeria.pdf

Benadof, D. (2008). Listeria monocytogenes. Revista Chilena de Infectología, 25(5),

350. http://doi.org/10.4067/S0716-10182008000500005
Conislla, A., y Guerra, R. (2019). Resistencia microbiana y capacidad de formación de
biopelículas de cepas de Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes
aisladas de carnes frescas provenientes de mercados de Lima Metropolitana.
[tesis de pregrado, Universidad Nacional Mayor de San Marcos]. Repositorio
Institucional UNMSM.
https://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/handle/20.500.12672/11445/Conislla
_va.pdf?sequence=3
Fernández, M. (2010). Identificación y poder patógeno de microrganismos del género
“Corynebacterium” aislados de muestras clínicas [tesis de doctorado,
Universidad Complutense de Madrid]. Repositorio BUCM.
https://eprints.ucm.es/id/eprint/11115/1/T31895.pdf
Rondón, O. (1944). Investigación de portadores de Corynebacterium diphtheriae.
Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica, 3(1), 36-58.
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S172646341944000
100003
Tapia, C., Stuardo, C., Troncoso, R., y Vargas, P. (2018). Corynebacterium diphtheriae
no toxigénico. Revista Chilena de Infectología, 35(2), 189-190.
http://doi.org/10.4067/s0716-10182018000200189
VIII. ANEXO

CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué se emplea medio Löffler para aislar Corynebacterium? Fundamente.

Se emplea el medio Löffler debido al contenido en suero, este medio se
puede usar para la actividad proteolítica y la hidrólisis enzimática de proteínas,
siendo un medio apropiado para el crecimiento óptimo de este género de
bacterias. Asimismo, la superficie gris-blanca es un fondo excepcional para la
detección de la pigmentación del microorganismo.
2. ¿En qué otros medios podrían desarrollar Corynebacterium? ¿Fundamente?
Esta bacteria se desarrolla en el medio Löffler, asimismo, también puede
desarrollarse en agar sangre, agar chocolate, agar triptona-soja (TSA) y telurito
potásico formando colonias pequeñas grisáceas de aspecto granuloso, traslúcidas
con centros opacos, convexas con bordes continuos. La reducción del telurito de
potasio por C. diphtheriae produce colonias negras.
3. ¿Corynebacterium produce hemolisinas solubles? Explique.
No produce hemolisinas solubles, pero sobre medio sólido con sangre,
puede ocurrir la hemólisis. Algunas bacterias producen hemolisinas que causan
la lisis de los hematíes en medios que contienen sangre. Esta hemólisis puede ser
beta zona clara alrededor de la colonia o alfa halo de color verdoso alrededor de
la colonia.
En cambio, Corynebacterium se cultiva en agar sangre telurito, donde las colonias
presentan coloraciones que van del gris al negro, debido a que el telurito es
reducido intracelularmente, pero forma un halo pardo/marrón alrededor de las
colonias y en el medio de suero coagulado de Löffler, las colonias son pequeñas,
granulares y grisáceas, con bordes irregulares que no forman halo.
4. Qué características hacen que Listeria sea considerada como un contaminante
peligroso de los quesos y otros alimentos?
- Es una bacteria que se encuentra en diversos ambientes como la tierra,
aguas frescas, residuales y la vegetación.
- Puede encontrarse en una variedad de alimentos crudos, así como en
alimentos procesados y hechos con leche no pasteurizada.
- La Listeria es distinta a muchas otras bacterias, porque los gérmenes
pueden crecer y diseminarse incluso dentro de las temperaturas frías de un
refrigerador ya que tiene la capacidad de crecer hasta a 4℃.
- Es un patógeno intracelular facultativo, por lo que presenta una compleja
patogenia como contaminante alimentario.
- Esta bacteria tiene la habilidad de atravesar la barrera intestinal, la
placenta y la barrera hemato-encefálica produciendo cuadros de gastroenteritis,
infecciones materno-fetales y meningoencefalitis en quienes consumen alimentos
contaminados.
5. Cree Ud. ¿Que las pruebas utilizadas para la identificación de Listeria, son
suficientes? Explique.
En realidad, las pruebas para la identificación de Listeria son varias, pero
no suficientes porque esta bacteria puede crecer en los macrófagos, las células
epiteliales y los fibroblastos en cultivo ya que tras la ingesta de alimentos
contaminados Listeria puede sobrevivir a la exposición a enzimas proteolíticas,
ácido gástrico y sales biliares. Por ello las pruebas de identificación deben ser
más precisas y confiables para obtener el diagnóstico de contaminación por
Listeria (Listeriosis).