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PUNTO 1 2 3 4 Del 270921
PUNTO 1 2 3 4 Del 270921
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA
CURSO DE LABORATORIO
2021
1. ELISA Y WESTERN BLOT
1.1. ELISA
DEFINICIÓN
Abreviatura del término inglés Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Es un inmunoensayo
marcado que se considera el estándar de oro de los inmunoensayos. Esta
prueba inmunológica es muy sensible y se utiliza para detectar y cuantificar
sustancias, incluidos anticuerpos, antígenos, proteínas, glicoproteínas y
hormonas.
La formación de complejos de anticuerpos y antígenos para producir un
resultado medible. Esta interacción se utiliza en las pruebas ELISA y
permite identificar anticuerpos y antígenos proteicos específicos, con solo
pequeñas cantidades de una muestra de prueba.
FUNDAMENTO
La prueba de Elisa se basa en varias teorías:
- El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora
insoluble y retener su reactividad inmunológica.
- Las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad
relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite
detectar concentraciones muy bajas del ligando.
- La actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se
preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento.
- Las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a
analizar.
TIPOS
-Elisa directo:
Tanto los ELISA directos como los indirectos comienzan con el
recubrimiento de antígeno de las placas de ELISA. El primer paso de unión
implica la adición de antígeno a las placas, que se incuban durante una
hora a 37 grados C o se pueden incubar a 4 grados C durante la noche. El
siguiente paso es lavar las placas de cualquier posible anticuerpo no unido
y bloquear cualquier sitio no unido en la placa ELISA usando agentes como
BSA, ovoalbúmina, aprotinina u otras proteínas animales. Después de
agregar el tampón, la placa se vuelve a lavar y se agrega un anticuerpo de
detección primario conjugado con enzima seleccionado. La placa se incuba
adicionalmente durante una hora. En un ELISA directo, el anticuerpo de
detección primario se une directamente a la proteína de interés. La placa se
vuelve a lavar para eliminar cualquier anticuerpo no unido y, a continuación,
se agrega un sustrato / cromóforo, como fosfatasa alcalina (AP) o
peroxidasa de rábano picante (HRP) a la placa, lo que da como resultado
un cambio de color. El cambio de color de la muestra se produce por
hidrólisis de grupos fosfato del sustrato por AP o por oxidación de sustratos
por HRP.
Las ventajas de usar ELISA directo incluyen la eliminación de la reactividad
cruzada de anticuerpos secundarios y, debido a menos pasos, es rápido en
comparación con ELISA indirecto. Sus desventajas incluyen su baja
sensibilidad en comparación con los otros tipos de ELISA y su alto costo de
reacción.
-Elisa indirecto:
Los pasos del ELISA indirecto son idénticos a los del ELISA directo, excepto
por un paso de lavado adicional y los tipos de anticuerpos añadidos
después de eliminar el tampón. El ELISA indirecto requiere dos anticuerpos,
un anticuerpo de detección primario que se adhiere a la proteína de interés
y un anticuerpo secundario ligado a enzima complementario al anticuerpo
primario. Primero se agrega el anticuerpo primario, seguido de un paso de
lavado, y luego se agrega y se incuba el anticuerpo secundario conjugado
con enzima. Después de esto, los pasos son los mismos que los del ELISA
directo, que incluye un paso de lavado, la adición de sustrato y la detección
de un cambio de color.
El ELISA indirecto tiene una mayor sensibilidad en comparación con el
ELISA directo. También es menos costoso y más flexible debido a la gran
cantidad de posibles anticuerpos primarios que se pueden usar. La única
gran desventaja de este tipo de ELISA es el riesgo de re actividad cruzada
entre los anticuerpos de detección secundarios.
-Elisa sándwich:
Comienza con un anticuerpo de captura que recubre los pocillos de la placa.
Se llama "sándwich “porque los antígenos están intercalados entre dos
capas de anticuerpos (anticuerpos de captura y detección). Después de
agregar el anticuerpo de captura a las placas, las placas se cubren y se
incuban durante la noche a 4 C. Una vez que se completa el paso de
recubrimiento, las placas se lavan con PBS y luego se tamponan / bloquean
con BSA. Los lavados con tampón se llevan a cabo durante al menos 1-2
horas a temperatura ambiente. Finalmente, la placa se lava nuevamente
con PBS antes de la adición del antígeno. Luego, el antígeno de interés se
agrega a las placas para unirse al anticuerpo de captura y se incuba
durante 90 min a 37 grados C. La placa se vuelve a lavar, y el anticuerpo de
detección primario se agrega a la placa y se incuba durante. Luego se
agrega el anticuerpo secundario conjugado con enzima y se incuba durante
otras 1 a 2 horas. 1 a 2 horas a temperatura ambiente, seguido de un
lavado con tampón. La placa se vuelve a lavar, y el anticuerpo de detección
primario se agrega a la placa y se incuba durante otras 1 a 2 horas a
temperatura ambiente, seguido de un lavado con tampón.
El ELISA sándwich tiene la sensibilidad más alta entre todos los tipos de
ELISA. Las principales desventajas de este tipo de ELI SA son el tiempo y
el gasto y el uso necesario de "par emparejado" (antígeno divalente /
multivalente) y anticuerpos secundarios
-Elisa competitivo:
Para detectar el antígeno en ELISA competitivo, se usa un antígeno
marcado con enzima para competir con los antígenos diana contra el
anticuerpo inmovilizado. Por lo tanto, cuanto mayor es la cantidad de
antígeno en la muestra, menor es la cantidad de antígeno marcado con
enzima que se une al anticuerpo. Es decir, con una cantidad creciente de
antígeno diana, la señal disminuye. En este caso, el ELISA competitivo es
adecuado para medir macromoléculas solo porque se requiere una enzima
marcadora para medir el antígeno.
Para detectar el anticuerpo, se inmoviliza el antígeno y se observa la
competencia entre el anticuerpo en la muestra y el anticuerpo marcado con
enzima. La presencia de un cambio de color significa que la prueba es
negativa porque el anticuerpo/antígeno conjugado con enzima se une a los
antígenos/anticuerpos. La ausencia de color indica una prueba positiva y la
presencia de anticuerpos/antígenos en el suero de prueba.
1.2. WESTERN BLOT
DEFINICIÓN
El nombre, "western“ blot , fue acuñado por primera vez por el Dr. Burnette
en 1981 después del homónimo Southern blot para el ADN, y la
consiguiente acuñación del northern blot en 1977 para el ARN. El western
blot (WB) es un inmunoensayo eficaz y ampliamente utilizado que confiere
un análisis selectivo de la expresión de proteínas. WB selecciona una
proteína individual entre un medio potencialmente significativo
aprovechando la especificidad de la unión del antígeno (Ag) anticuerpo
(Ab).
FUNDAMENTO Y APLICACIONES:
QUIMIOLUMINISCENCIA
Con el término quimioluminiscencia se entiende el fenómeno por el que, en
algunas reacciones químicas, la energía liberada no solo se emite en forma de
calor o de energía química, sino también en forma de luz.
La quimioluminiscencia es un fenómeno que acompaña a algunas reacciones
químicas y bioquímicas que sucede porque un electrón que estaba en un nivel
superior baja a un nivel inferior; al bajar necesita menos energía para poder dar
una vuelta alrededor del núcleo por lo que libera la energía sobrante en forma
de fotones que al ser libres producen luz.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Habitualmente en las reacciones de quimioluminiscencia se liberan moléculas
en estado excitado (por ejemplo oxígeno en estado de singlete) que al bajar en
el estado fundamental (el estado de triplete en el ejemplo del oxígeno) emiten
la diferencia de energía en forma de luz.
PERFIL TIROIDEO
Las pruebas sanguíneas para medir la TSH, T4, T3 y T4 libre están fácilmente
disponibles y son usadas ampliamente. Las pruebas para valorar la función
tiroidea incluyen las siguientes:
PRUEBA DE TSH
La mejor manera de medir inicialmente la función tiroidea es medir el nivel de
TSH en una muestra de sangre. Un nivel de TSH elevado indica que la
glándula tiroides está fallando debido a un problema que afecta directamente a
la glándula (hipotiroidismo primario). La situación opuesta, en la cual el nivel de
TSH está bajo, generalmente indica que la persona tiene una glándula
hiperactiva que está produciendo demasiada hormona tiroidea (hipertiroidismo).
Ocasionalmente, una TSH baja puede ser el resultado de una anormalidad en
la glándula pituitaria, que previene que esta produzca suficiente TSH para
estimular a la tiroides (Hipotiroidismo secundario). En la mayoría de los
individuossanos, un valor de TSH normal indica que la tiroides está
funcionando normalmente.
PRUEBAS DE T4
La T4 circula en la sangre de dos maneras:
1.T4 unida a proteínas, lo que previene que la T4 entre en los tejidos que
necesitan hormona tiroidea
2.T4 libre, la cual entra los tejidos apropiados para ejercer sus funciones. La
fracción de T4 libre es la más importante para determinar cómo está
funcionando la tiroides, y las pruebas que miden esta fracción se llaman T4
libre (FT4) y el Índice de T4 libre (FT4I o FTI). Las personas con hipertiroidismo
tendrán FT4 o FTI elevados, mientras que los pacientes con hipotiroidismo
tendrán un nivel bajo de FT4 o FTI.
La combinación de la TSH y la FT4 o FTI ayuda a determinar en forma exacta
como está funcionando la glándula tiroides. El hallazgo de una TSH alta y FT4
o FTI baja indica hipotiroidismo primario debido a enfermedad de la glándula
tiroides. Una TSH baja combinada con FT4 or FTI bajas indica hipotiroidismo
debido a un problema que afecta la glándula pituitaria. Una TSH baja y FT4 o
FTI elevada se encuentra en personas con hipertiroidismo.
PRUEBAS DE T3
Las pruebas de T3 suelen ser útiles para diagnosticar hipertiroidismo o para
determinar la severidad del hipertiroidismo. Los pacientes hipertiroideos
tendrán niveles elevados de T3. En algunos individuos con TSHbaja, sólo la T3
está elevada, y la T4 libre o FTI estaránnormales. La prueba de T3 rara vez es
útil en pacientes con hipotiroidismo, ya que esta es la última prueba en
alterarse. Los pacientes pueden tener hipotiroidismo severo con niveles de
TSH elevados y FT4 o FTI bajos, pero tener niveles de T3 en rango normal. En
algunas situaciones, como puede ser durante el embarazo o cuando se está
tomando píldoras anticonceptivas, pueden existir niveles elevados de T4 y T3
totales. Esto es debido a que el estrógeno aumenta el nivel de proteínas de
unión. En estas situaciones es mejor solicitar ambos niveles de TSH y de T4
libre (FT4) para evaluación de la tiroides.
PRUEBAS DE ANTICUERPOS CONTRA LA TIROIDES.
El sistema inmune del cuerpo normalmente nos protege contra invasores
extraños como son las bacterias y los virus, destruyendo estos invasores con
sustancias conocidas como anticuerpos, los cuales son producidos por las
células sanguíneas llamadas linfocitos. En muchos pacientes con
hipotiroidismo o hipertiroidismo, los linfocitos producen anticuerpos contra su
propia tiroides, que o bien estimulan o dañan la glándula. Dos anticuerpos
comunes que causan problemas de tiroides están dirigidos contra proteínas de
las células tiroideas: La Tiroperoxidasa (TPO) y la tiroglobulina. La medición de
los niveles de anticuerpos contra la tiroides puede ayudar a diagnosticar la
causa de los problemas de tiroides. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos
antitiroperoxidasa y/o anti-tiroglobulina en un paciente con hipotiroidismo puede
ayudar a establecer el diagnóstico de tiroiditis de Hashimoto. Si los anticuerpos
son positivos en un paciente hipertiroideo, el diagnóstico más probable es
enfermedad autoinmune de la tiroides.
TIROGLOBULINA.
La tiroglobulina (Tg) es una proteína producida por lascélulas tiroideas
normales y también por las células tiroideas cancerosas. No es una medida de
la función tiroidea y no ayuda a diagnosticar cáncer de tiroides cuando la
glándula tiroides está todavía presente. Seutiliza con más frecuencia en
pacientes que han tenido cirugía para tratar el cáncer de tiroides, con el fin de
monitorearlos después del tratamiento. La Tg está incluida en este folleto sobre
pruebas de función tiroidea paraindicar que, aunque se mide con frecuencia en
ciertas situaciones e individuos, la Tg no es una medida primaria de la función
de la hormona tiroidea.
REACCION DE WIDAL
DEFINICION
La reacción de Widal, test basado en el principio de aglutinación antígeno-
anticuerpo, fue desarrollada por Georges Fernand Isadore Widal, prestigioso
médico francés, en junio de 1896, para el diagnóstico serológico de la fiebre
tifoidea. Existe 3 tipos de antígenos:
1. Antígeno somático (O): está conformado por una cadena repetida
de polisacáridos, que hace parte del lipopolisacárido (LPS) de la
pared celular.
2. Antígeno flagelar (H): es una proteína termolábil.
3. Antígeno capsular o de envoltura (Vi): denominado así por ser el
determinante en la virulencia de esta bacteria, ya que confiere
resistencia contra la respuesta inmune celular y humoral del
huésped.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
1. Suero: Se extrae sangre del paciente, el cual debe tener las
siguientes características:
Recolección: debe obtenerse suero límpido en forma estéril.
No inactivar ni calentar ya que los anticuerpos son
termolábiles.
Aditivos: no se requieren.
Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis visible y los
quilomicrones pueden dar reacciones inespecíficas.
Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras
pueden conservarse 7 días en refrigerador (2-10°C).
2. COLOCACION DE
SUERO Y ANTIGENOS
Se utiliza placas de vidrio con excavaciones, que se marcan
adecuadamente según el antígeno
Se coloca 0,4 ml del suero
Se coloca una gota de cada uno de los antígenos febriles
Mezclar en cada excavación, con un aplicador de madera
3. INTERPRETACION
Se puede considerar un diagnóstico de fiebre tifoidea si el título inicial
se cuadruplica entre una y cuatro semanas. Sin embargo, el clínico
no puede esperar hasta este punto para establecer un tratamiento,
por lo que se debe considerar la posibilidad de que esta entidad
tenga un título específico distinto. Este umbral depende de la
prevalencia de salmonelosis en la población de estudio, por lo que se
han establecido procedimientos de diagnóstico en diferentes países,
teniendo en cuenta los estudios realizados en sus regiones.
En general, recomiendo tener en cuenta la fiebre tifoidea con título de
AntiO 1: 160-200 y / o H ≥160-200 en áreas endémicas (ej.
Colombia); En áreas no endémicas, debe tenerse en cuenta un título
de AntiO inferior a ≥1: 50100.
PRUEBA DE BETA-HCG
DEFINICION:
La gonadotropina coriónica humana (hCG) es una glicoproteína
secretada por la placenta en desarrollo poco después de la implantación
de la GCH pueden ser detectados en la sangre y orina de las mujeres
embarazadas hasta 6 a 15 días después de la concepción. La
concentración de hCG aumenta a 50 mIU/ml una semana post
implantación y alcanza a unos 100 mIU/ml en el momento de la primera
falta de la menstruación y el pico a 100.000 -200.000 mIU/ml en el
primer trimestre.
Valores de referencia
La hormona se detecta durante toda la gestación, pero los valores van
variando conforme avanza el embarazo. Durante el primer trimestre, va
aumentando hasta un pico de concentración en la semana 12-14 de
embarazo que puede superar las 200.000 mUI/ml.
Así, se establecen intervalos de referencia del valor de la hormona en
sangre según las semanas de embarazo desde la última regla:
9-130 mUI/ml: 3-4 semanas de embarazo
75-2600 mUI/ml: 4-5 semanas de embarazo
850-20800 mUI/ml: 5-6 semanas de embarazo
4000-100200 mUI/ml: 6-7 semanas de embarazo
11500-289000 mUI/ml: 7–12 semanas de embarazo
18300-137000 mUI/ml: 12-16 semanas de embarazo
1400-53000 mUI/ml: 16–19 semanas de embarazo (2º trimestre)
940-60000 mUI/ml: 19-41 semanas de embarazo (3º trimestre)
PRUEBA ELISA PARA LA DETECCION DE BETA-HCG
En la etapa I
En la etapa II
En la etapa III
En la etapa IV
FACTOR REUMATOIDE
VALORES DE REFERENCIA
- 0 - 20 UI/ml
ANTICUERPOS ANTIGLIADINA
· inmunoglobulina A (IgA)
· inmunoglobulina G (IgG)
La IgA resulta más útil para detectar la enfermedad celíaca, ya que se genera
en el intestino delgado, el órgano donde se produce la inflamación e irritación
en la gente que es sensible al gluten. Los niveles de IgG, por otro lado, son
menos precisos para detectar la enfermedad celíaca, pero resultan útiles en el
diagnóstico de enfermedades autoinmunes, especialmente en la gente que
presenta una deficiencia de IgA
IMPORTANCIA:
PREPARACIÓN
Para que los resultados sean precisos, el niño debe estar haciendo una dieta
que contenga gluten, como panes con trigo, pastas y productos de pastelería.
El cuerpo sólo produce anticuerpos cuando se lo expone a la gliadina. Si la
dieta de su hijo no contiene gliadina, no se podrá medir la reacción ante el
anticuerpo.
PROCEDIMIENTO
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Abraham E. Reacción de Widal, Interpretación clínica. Rev
Panam Infectol 2006;8(2):40-44
2. Lenton EA, LM Neal, R Sulaiman "concentración plasmática de la
gonadotropina coriã³nica humana desde el momento de
implantación hasta la segunda semana de embarazo", Mane.
Esteril Asi. 1982; 37 (6): 773-778.
3. Alhajj M, Farhana A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay .
Updated 2021 Feb 6]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island
(FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan --. Available from :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK555922/?
fbclid=IwAR2axFfpZH2
DRfbbO73bEEf8imTLfT7DKJz5F8rPCtbpBcBIHhw852hO70
4. Guzmán Vázquez E. V. Las pruebas de Elisa. Gac Med Mex .
2004;140(3):48 49.
5. Sakamoto S, Putalun W, Vimolmangkang S, Phoolcharoen W,
Shoyama Y, Tanaka H, etal . Enzyme linked immunosorbent
assay for the quantitative qualitative analysis of plant secondary
metabolites . J Nat Med . 2018 Jan;72(1):32 42.
6. Prieto J, Yuste J. Balcells . La clínica y el laboratorio. 22a ed.
Barcelona: Elsevier Masson
7. Ríos J, Mercadillo P, Yuil E, Ríos M. ELISA y sus aplicaciones en
dermatología. Dermatología CMQ2012;10(3):212 222
8. Gwozdz T, Dorey K. Blot occidental. Métodos científicos básicos
para investigadores clínicos. 2017; 99 117. doi:10.1016/b978 0 12
803077 6.00006 0
9. GmbH RD. cobas e 411 Compendio de información básica.
(1):88.
10. Sampedro CFF. Carla Tamara Suasnavas Rosales. Validación del
método ECLIA para cuantificación de tiroglobulina en solución de
lavado de aguja de aspirado de punción ganglionar cervical en
pacientes con cáncer de tiroides tipo papilar del Hospital
Oncológico SOLCA, Núcleo-Quito, durante el periodo
agostoseptiembre 2018
11. Crispín BH, Irma D, Cruz BPS. Utilidad diagnóstica del método d
electroquimioluminiscencia frente al PCR en tiempo real, para el
diagnóstico de Hepatitis C en un centro de diálisis de Lima,
2018. :84.
12. Basualdo, Juan A., Coto, Celia E., de Torres, Ramón A.
Microbiología Biomédica. Bacteriología, Micología, Virología,
Parasitología, Inmunología. Buenos Aires, Editorial Atlante S.R.L,
2006.
13. Murray, Patrick R., Rosenthal, Ken S., Pfaller, Michael A.
Microbiología Médica. Barcelona, Elsevier España S. L., 2009.
14. Tortora G., Funke B., Case C., Introducción a la Microbiología,
Madrid, Editorial médica panamericana, 2007.
15. Velázquez FR.(2009), Protective effects of natural rotavirus
infection Pediatr Infect Dis J. 2009 Mar; 28(3 Suppl):S54-6.