Q.F.

Orlando Agustín Rivera Benavente

CQFP - 01157

Docente AXTC, ESFB, FACS, UNJBG.

Tacna – Perú , 2017
CONCEPTOS:
 Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de
información que puede obtenerse de un individuo es muy limitada.
Por ello es necesario el estudio de poblaciones, que contienen miles

o millones de individuos. Estas poblaciones se obtienen al hacer
crecer los microorganismos bajo condiciones más o menos bien
definidas, se conocen como cultivos.
 La mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas, que permite
el crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que
permite mantener su viabilidad es lo que conocemos como Medio
de Cultivo
Medio
de
cultivo

Cultivo

 El agar es un elemento solidificante muy empleado para la

preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la
temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40
grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen
en él.
  Facilitar
el crecimiento y el aislamiento de las
bacterias presentes en una muestra clínica.

 Determinar qué bacterias entre las que se desarrollan

tienen más probabilidades de ser las causantes de la
infección y cuales son sus posibles contaminantes o
colonizadores.

 Obtenerun desarrollo suficiente de las bacterias de

importancia clínica para permitir su identificación y su
caracterización.
 AGAR
DISUELTO

AGAR
PRESIPITADO
( SIN DISOLVER)
 También se añaden colorantes que actúan como
indicadores para detectar, por ejemplo, la
formación de ácido o como inhibidores del

crecimiento de unas bacterias y no de otras (el
Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo
en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta
de Genciana se usa como inhibidor ya que
impide el crecimiento de la mayoria de las
bacterias Gram-positivas).
CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO
DE MICROORGANISMOS
El desarrollo adecuado de los microorganismos en

un medio de cultivo se ve afectado por una serie
de factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.

TEMPERATUR
A

NUTRIENTES
Y FACTORES
GRADO DE
DE
HUMEDAD
CRECIMIENT
O

ACIDEZ O
PRESIÓN DE
ALCALINIDA
OXÍGENO
D
 •Un medio de cultivo adecuado ha de contener como mínimo, carbono,
nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas, vitaminas y otras sustancia
inductoras del crecimiento; sustancias adecuadas para ejercer de donantes o
captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.
DISPONIBILIDAD •Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios


DE NUTRIENTES es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible
ADECUADOS
de nitrógeno y carbóno.

•Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido
•Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
CONSISTENCIA comodidad, su inconveniente es que muchos microorganismos no se desarrollan
ADECUADA DEL adecuadamente sino a temperaturas inferiores al punto de fusión de este
MEDIO solidificante

•Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente
en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los
PRESENCIA (O microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
AUSENCIA) DE parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
OXÍGENO Y OTROS anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
GASES las citadas condiciones.
 

MEDIO DE CULTIVO SOLIDO MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO

MEDIO DE CULTIVO
SEMI SOLIDO
 • Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de
CONDICIONES
estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de
ADECUADAS DE agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque
HUMEDAD el medio.

LUZ AMBIENTAL 
• La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos

• La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La

mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios
más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden
el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos
normales
pH

• Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los
psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En
líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor
de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
TEMPERATURA

• Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de
vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los
especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el
ESTERILIDAD autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)
DEL MEDIO
 Tipos de medios de cultivo


* MEDIOS DE * MEDIOS DE MEDIOS DE MEDIOS DE
CULTIVO CULTIVO CULTIVO ENRIQUECIMIENTO.
GENERALES. SELECTIVOS. DIFERENCIALES. •son aquellos medios
• Permiten el •llevan • incorpora en los cuales a un
crecimiento de una incorporadas determinadas medio base se le
gran variedad de determinadas sustancias que nos añaden determinadas
microorganismos. sustancias que permiten diferenciar sustancias nutritivas
Pertenecen a esta inhiben el entre dos tipos de que son necesarias
categoría las crecimiento de un microorganismos. para el crecimiento de
infusiones de microorganismo y Ej. El agar manitol un microorganismo
extractos de carne y facilita el salado: nos permite exigente.. Por ejemplo
peptona, una crecimiento del diferenciar en el el caldo selenito cistina
mezcla de microorganismo caso de los o el caldo agar sangre.
composición similar que nos interesa. staphylococos, los
a la de los líquidos Pertenecen a esta que utilizan el
orgánicos, que se categoría el caldo manitol en su
utiliza para muchas lactosa bilis verde metabolismo de los
bacterias patógenas brillante, el agar que no.
Salmonella-Shigella.
semisólido
Caldo nutritivo

Caldos de enriquecimiento

Caldos revitalizadores
 Enriquecimiento

Nutritivo

Selectivo y
diferencial

Clasificación de los medios

de cultivo según utilización
MEDIOS NUTRITIVOS

Contienen nutrientes que

favorecen el desarrollo de la
mayoría de los
microorganismos sin
requerimientos especiales de
cultivo.

No promueven el
crecimiento de ningún
agente en particular
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
MEDIOS SELECTIVOS

Contienen uno o más agentes que inhiben el

crecimiento de los microorganismos que no se
quieren estudiar

Agentes inhibidores: colorantes, sales biliares,

alcoholes, ácidos y antibióticos
 MEDIOS DIFERENCIALES

Contienen un factor o factores que permite que las colonias de

una especie o un tipo bacteriano exhiban ciertas características
metabólicas o de cultivo que puedan utilizarse para
diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar

Los medios de diferenciacion mas usados son:

• Agar TSI.
• Agar LIA.
• Agar Citrato
• Prueba del Indol, etc
MEDIOS ESPECIALES

MEDIOS CROMÓGENOS

MEDIOS DE TRANSPORTE

MEDIOS DE CONSERVACIÓN
Sustancias cromogénicas:
- Son productos químicos de síntesis que son incoloros
cuando se unen a sustratos naturales por enlaces que son
hidrolizados por enzimas microbianas específicas.
- Cuando la enzima microbiana hidroliza el enlace, se
libera el compuesto cromogénico, que adquiere un color
intenso.
- Ejemplo: Cromo agar (agentes uropatógenos), se pone
en evidencia la actividad enzimática de la B- glucoronidasa o
B- galactosidasa de las bacterias formándose colonias de
diferentes colonias según la especie.
- Identificación presuntiva, haciendo innecesaria la
realización de pruebas bioquímicas.
Medios para bacterias no exigentes
- agar
- extracto de carne
- peptona
- NACL
- leche descremada (congelar cepas)

NORMATIVA ISP, entregar

 CONTROL DE CALIDAD

 El Control de Calidad en la preparación y evaluación de

los medios de cultivo es considerado como una esencial y
buena práctica de laboratorio, necesaria para mantener el
nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica.

Proceso continuo que se extiende desde las materias

primas ; a través del productor hasta el producto final
utilizado en los diferentes departamentos de análisis y
diagnóstico microbiológico.
▪ Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
(Productividad)
▪ Inhibición o suspensión de los microorganismos no deseados.
(Selectividad)
▪ Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
▪ Propiedades físicas (por ejemplo, pH, Volumen)
▪ Sea estéril .... etc.

 El Jefe inmediato responsable del área

* Deberá analizar mensualmente los resultados de las pruebas
realizadas por el responsable del departamento de control de calidad
* Evaluará el cumplimiento de objetivos a través de los resultados
 RECONSTRUCCIÓN DEL MEDIO
DE CULTIVO
DESHIDRATADO
• Cumplir con las instrucciones de preparación del medio de cultivo
indicado en la etiqueta del envase

• Cumplir con los procedimientos técnicos de fórmulas enviadas por

el cliente

• Utilizar agua destilada de calidad

• Determinar el pH del M de C

• Esterilización del medio de cultivo

• Procedimiento escrito

• Control de esterilidad del Medio de Cultivo

MEDIO DE LOWENSTEIN JENSEN


AGAR SANGRE


 ERRORES EN LA PREPARACIÓN

Apelmazamiento del producto deshidratado

 DEFECTO

 El envase no fue cerrado correctamente después de su
uso.
El envase permaneció
 Apelmazamiento del abierto por largo rato.
El producto
 Producto sobrepasó la fecha de vencimiento.
deshidratado

El valor de pH no coincide con el indicado

• No fue empleada agua destilada

• El medio fue sobrecalentado durante su preparación
• El Ph no fue determinado correctamente
• ElEl
valor de pH
medio no coincide
estaba vencido.
 Con el indicado
Aparición de turbiedad o precipitados:

 El medio preparado perdió agua por evaporación

 El medio se calentó en exceso


 El medio no se calentó lo suficiente.

 No fue empleada la cantidad del medio o suplemento recomendada.

El color del medio no coincide con el indicado:

 El medio fue sobrecalentado durante su preparación.

 El pH no fue ajustado correctamente.

 El recipiente empleado estaba sucio.

 Los azúcares contenidos en el medio se caramelizaron

El gel se obtiene más blando que lo característico para el
medio:

 No fue garantizada la disolución total del agar durante la preparación

del medio.

 No fue empleada la cantidad del medio recomendada o se añadió agua
en exceso.

El crecimiento de los microorganismos es

pobre:

 El medio fue sobrecalentado

 El valor del pH no fue ajustado correctamente.
 La adición de suplementos al medio se efectuó a excesiva temperatura.
 El medio no fue mezclado correctamente.
El crecimiento de los microorganismos es atípico:

 Quedaron residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento

no deseables, en los recipientes donde se preparó o distribuyó
el medio.

 El medio de cultivo fue preparado de manera incorrecta.
 El producto sobrepasa la fecha de vencimiento.
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar

en envases sellados bajo las condiciones que señale el
fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar
fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos
de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca
de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Cada lote de medio de culti
vo, una
vez preparado, esterilizado,
revisado
y en su presentación final,
se identifica mediante una
etiqueta con el nombre del
medio de
cultivo correspondiente, el
número de lote y la fecha de
caducidad. Se almacenan
en frigorífico a 4ºC
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO


REVISIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Es importante comprobar que el medio se comporta correctamente.
Las pruebas que debes hacer para tener seguridad son:


Revisión macroscópica: Se examina el medio a simple vista,
atendiendo a su color, a su opalescencia y transparencia, a la
humedad en las placas ya preparadas y a la posible aparición de
precipitados.
Vigilancia de Ph: Porque la mayoría de los microorganismos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro.
Vigilancia de la esterilidad: Se lleva a cabo incubando a 30 ºC durante
72 horas una pequeña porción, representativa del lote de medio
preparado, para comprobar que allí no crecen gérmenes.
Prueba de la eficacia: En una pequeña porción representativa del medio
preparado, se
inocula un microorganismo normalmente el propio fabricante acon
seja el más adecuado y se cultiva. Así se comprueba si en el medio
de cultivo preparado ese microorganismo se desarrolla
correctamente.

MÉTODO DE SIEMBRA POR ESTRÍA
 Se toma una muestra de la población mixta

 Se hacen estrías sobre la superficie de un
medio sólido preparado en una placa Petrí.
Conforme se van haciendo estrías en zigzag
con el asa, cada vez se van depositando en la
superficie del medio menos microorganismos.
Se flamea el asa, se toca en la región donde se
han realizado las últimas estrías y se continúa
la siembra con la misma técnica, en la
superficie de medio sin sembrar aún.
Repitiendo este proceso varias veces se logra
separar células individuales.
Se incuba a temperatura adeucuada 37°C.

 MÉTODO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

A partir de las diluciones seriadas


preparadas tomamos 1mL de cada una de
ellas y lo depositamos en distintas placas de
Petri vacías y estériles.
Después añadimos un determinado volumen
del medio de cultivo (10-20 mL) que tenemos
en un baño María para evitar que se
solidifique.
Dejamos solidificar y luego incubamos en la
estufa durante 24 horas a 37ºC.
Transcurrido el tiempo realizamos el
recuento

 MÉTODO DE SIEMBRA EN SUPERFICIE

El medio de cultivo ya está solidificado en

la placa.

Preparamos las diluciones seriadas y
añadimos a cada placa 1 mL
Para extender sobre la superficie de la
placa la muestra se utiliza un asa de vidrio
I. Siembra con rastrillo

II. Siembra con asa de cultivo

- Diseminación en superficie
- Agotamiento en superficie
- Tubos en superficie
- Tubos en profundidad o picada

III. Siembra con tórula

 Figura 12: Siembra con rastrillo
Manual de microbiología 2011, U. Mayor
Figura 13: Siembra de diseminación en
superficie
Manual de microbiología 2011, U Mayor
Figura 14: Siembra semi-cuantitativa de
agotamiento en superficie.
Manual de microbiología 2011, U Mayor
 Figura 15: Siembra de tubo en superficie.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

Figura 16: Siembra de tubo profundidad.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

 RECUENTO

MICROBIANO
Para el recuento de microorganismos
presentes en una muestra de agua,
suelo, aire, alimento, cultivos, entre

otros, existen diferentes métodos o
técnicas: Algunas técnicas son directas
y permiten un recuento de todas las células,
tanto las vivas como las muertas.
Las medidas directas incluyen los recuentos directos al
microscopio o recuento electrónico, el recuento en placa, o
el cálculo del número más probable (NMP).
Otras son medidas indirectas y miden una propiedad
de la masa de las células como son la turbidez, el peso
seco, o una actividad metabólica.
 RECUENTOS DIRECTOS AL
MICROSCOPIO
Se basa en colocar un volumen determinado de células y realizar el

conteo utilizando un microscopio. Para ello se utiliza la cámara
de recuento de Petroff-Hauser o de Neubauer: consistente en un
portaobjetos con una excavación de 0.02 mm de profundidad en
un área de 1 milímetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25
cuadrados grandes los cuales a su vez se subdividen en 16
cuadrados de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400
celdillas. El recuento celular se calcula así: n x 25 x 50 x 1000 =
concentración de células/ml
 RECUENTOS EN PLACA
 Generalmente la muestra original se diluye para que el


número de colonias no exceda las 300 unidades

 Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se

realiza contando las colonias en aquellas placas que
tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el
factor de dilución; Los resultados se expresan en
unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de
UFC es un valor que expresa el número relativo de
microorganismos de un taxón determinado en un
volumen de un metro cúbico de muestra.
 Para el recuento de
colonias se emplean


equipos que consiste
en una pantalla
iluminada la cual
posee una gran lente
de aumento; pueden
ser: contadores de
colonias en los cuales
la caja de petri se
ajusta en una
plataforma y se
ilumina por debajo y
al mismo tiempo la
CUENTA COLONIAS lente aumenta 1.5
veces el tamaño del
 recuentos en filtros de membrana
Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son
filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias.


Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una
placa del medio de cultivo apropiado.
RECUENTO DE NUMERO MAS
PROBABLE
Basado en un método estadístico. Dependiendo del

número de m.o que sospechamos que puede tener
la muestra existen distintas tablas de trabajo de
números más probables. Se utiliza sobre todo en la
industria, para el análisis de agua.
Es importante destacar que la transición exitosa de un microorganismo in
vivo a un ambiente in vitro va a depender de:
Disponibilidad de nutrientes esenciales

Condiciones ambientales adecuadas

pH

Temperatura

Oxígeno y CO2

Presión

Luz
 1 minuto 1 minuto

Decolorar 30
con alcohol- 15segundo segundo
acetona s s
 DIRECTOS

Primera aproximación
al posible diagnóstico

Técnicas rápidas y
baratas

Diagnósticos rápidos y
certeros
 EXAMEN AL FRESCO
MATERIA GENITAL

Secreción
Semen, Orina de
vaginal
secreción primer
y/o
prostática chorro
uretral
LEVADURAS

BACTERIAS

CLUE CELLS

LEUCOCITOS

TRICHOMONAS
MUCHAS GRACIAS POR SU
ATENCION